CN114437199B - 高稳定性重组降钙素原及其表达载体和应用 - Google Patents

高稳定性重组降钙素原及其表达载体和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了高稳定性重组降钙素原及其表达载体和应用，重组PCT的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明的重组降钙素原，具有很好的稳定性，同时保持有天然PCT的抗原性，可以作为替代天然PCT的PCT标准品使用，用于PCT抗原浓度的检测。

Description

高稳定性重组降钙素原及其表达载体和应用
技术领域
本发明属于蛋白领域，具体涉及高稳定性重组降钙素原及其表达载体和应用。
背景技术
PCT（降钙素原，procalcitonin）是血清降钙素 (Calcitonin ，CT)无活性的前肽物质 ，由位于11号染色体 (11p1514)上的Calc-I基因编码，通过选择性剪接(编码1～4外显子)生成Calc-ImRNA ，正常条件下，PCT mRNA在甲状腺滤泡旁细胞粗面内质网内翻译成含141个氨基酸残基的前PCT ，分子质量为16kD。前PCT进入内质网膜，经糖基化和特异性酶切除N-末端的信号肽，生成含 116个氨基酸残基的PCT，在高尔基体中，经系列水解酶作用最终形成PCT氨基多肽 (1- 57aa)、降钙素(60-91aa)及降钙蛋白(96-116aa)。由此可以看出58-59aa ，92-95aa分别为水解位点，这些水解酶的存在可能是导致PCT参考品的不稳定的重要因素。
在局部感染、病毒感染、慢性非特异性炎症等患者的血清PCT浓度不增加或轻微增加。这就决定了PCT 的高度特异性，因此可用于此类疾病的鉴别诊断；并且PCT 浓度和疾病严重程度成正相关，并随着病情的发展变化而变化，因而PCT 又可作为判断病情与预后以及疗效观察的可靠指标。如PCT 升高对细菌感染导致的脓毒症特异性很高，其在人体内的浓度高低可作为诊断脓毒症和鉴别严重细菌感染的生物标志物。
目前检测PCT的方法有很多，但均需要以PCT制备梯度浓度的标准品，以此计算样本中PCT的含量，而天然PCT中含有水解位点导致其不稳定极易降解，影响检测结果的准确性和可靠性。为此，需要开发一种高稳定性的重组PCT，以替代天然PCT，获得更准确、可靠的检测结果。
CN104610443A公开了一种高稳定性重组降钙素原、制备方法及用途，其利用柔性肽链连接臂-GG-与-SGGG-替换了PCT中易于降解的58-59aa，92-95aa两部分肽链，获得高稳定性PCT抗原，破坏7天后，该重组PCT的稳定性为62.53±0.41%，在实际使用中仍难以满足要求。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供高稳定性重组降钙素原及其表达载体和应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
一种重组降钙素原，其氨基酸序列为：APFRSALESSPADPATLSEDEARLLLAALVQDYVQMKASELEQEQEREGSSLDSPRSKKCGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAPGKKKDMSSDLERDHRPHVSMPQNAN。
在一些重组降钙素原的实例中，其C端或N端还连接有蛋白分离标签。
在一些重组降钙素原的实例中，所述蛋白分离标签通过柔性肽连接在所述重组降钙素原的C端或N端。
在一些重组降钙素原的实例中，所述蛋白分离标签为组氨酸分离标签。
在一些重组降钙素原的实例中，所述柔性肽由2～4个甘氨酸组成。
在一些重组降钙素原的实例中，所述蛋白分离标签连接在重组降钙素原的C端。
本发明的第二个方面，提供：
一种表达载体，其插入有表达本发明第一个方面所述重组降钙素原的核苷酸序列。
在一些表达载体的实例中，所述核苷酸序列经密码子偏好优化。
在一些表达载体的实例中，所述核苷酸序列为：ATGGCTCCCTTCCGGTCAGCGTTGGAAAGTAGCCCGGCTGACCCGGCGACATTGAGCGAGGACGAAGCCCGGCTGCTGCTGGCAGCCTTGGTCCAGGATTATGTTCAGATGAAGGCATCGGAGTTAGAACAGGAGCAAGAACGTGAGGGTAGCTCATTGGATTCTCCACGCTCTAAACGCTGTGGCAATTTATCGACTTGTATGTTAGGAACTTATACGCAGGATTTTAATAAATTCCATACGTTTCCTCAGACGGCAATAGGGGTGGGCGCTCCCGGAAAGAAGCGCGATATGTCAAGCGACCTGGAGCGTGATCACCGGCCACACGTTAGTATGCCTCAGAACGCAAACGGGGGCCACCACCATCATCACCACTAG。
本发明的第三个方面，提供：
本发明第一个方面所述重组降钙素原在制备PCT检测试剂中的应用。
本发明的第四个方面，提供：
一种PCT检测试剂，其PCT标准品为本发明第一个方面所述的重组降钙素原。
本发明的有益效果是：
本发明的重组降钙素原，具有很好的稳定性，同时保持有天然PCT的抗原性，可以作为替代天然PCT的PCT标准品使用，用于PCT抗原浓度的检测。
附图说明
图1是本发明重组PCT的电泳图；
图2是现有技术柔性肽PCT的电泳图；
图3是本发明重组PCT生物活性浓度的线性曲线。
具体实施方式
本发明的第一个方面，提供：
一种重组降钙素原，其氨基酸序列为：APFRSALESSPADPATLSEDEARLLLAALVQDYVQMKASELEQEQEREGSSLDSPRSKKCGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAPGKKKDMSSDLERDHRPHVSMPQNAN。
为了更好地分离纯化重组蛋白，在一些重组降钙素原的实例中，其C端或N端还连接有蛋白分离标签。在分离纯化后，可以进一步通过酶解去除分离标签。可以根据分离标签的特性进行选择将其连接在重组PCT的C端或N端。分离标签可以是各种常用的分离标签，本身无特殊要求。
在一些重组降钙素原的实例中，所述蛋白分离标签通过柔性肽连接在所述重组降钙素原的C端或N端。这样既利于去除蛋白分离标签，也可以避免或减少蛋白分离标签对重组PCT性能可能的影响。
在一些重组降钙素原的实例中，所述蛋白分离标签为组氨酸分离标签。His-tag的成熟度高，分离效果好。
在一些重组降钙素原的实例中，所述柔性肽由2～4个甘氨酸组成。
在一些重组降钙素原的实例中，所述蛋白分离标签连接在重组降钙素原的C端。这样更有利于去除，同时不影响重组PCT性质。
本发明的第二个方面，提供：
一种表达载体，其插入有表达本发明第一个方面所述重组降钙素原的核苷酸序列。
在一些表达载体的实例中，所述核苷酸序列经密码子偏好优化。
在一些表达载体的实例中，所述核苷酸序列为：ATGGCTCCCTTCCGGTCAGCGTTGGAAAGTAGCCCGGCTGACCCGGCGACATTGAGCGAGGACGAAGCCCGGCTGCTGCTGGCAGCCTTGGTCCAGGATTATGTTCAGATGAAGGCATCGGAGTTAGAACAGGAGCAAGAACGTGAGGGTAGCTCATTGGATTCTCCACGCTCTAAACGCTGTGGCAATTTATCGACTTGTATGTTAGGAACTTATACGCAGGATTTTAATAAATTCCATACGTTTCCTCAGACGGCAATAGGGGTGGGCGCTCCCGGAAAGAAGCGCGATATGTCAAGCGACCTGGAGCGTGATCACCGGCCACACGTTAGTATGCCTCAGAACGCAAACGGGGGCCACCACCATCATCACCACTAG。
本发明的第三个方面，提供：
本发明第一个方面所述重组降钙素原在制备PCT检测试剂中的应用。
本发明的第四个方面，提供：
一种PCT检测试剂，其PCT标准品为本发明第一个方面所述的重组降钙素原。
下面结合实例，进一步说明本发明的技术方案。
一、重组PCT抗原的制备
通过在天然PCT氨基酸序列（SEQ ID NO.1），采用-Lys-Lys-和-Lys-Lys-Lys分别替换天然PCT位于58-59aa水解位点(-Lys-Arg-)和位于93-95aa水解位点(-Lys-Lys-Arg-)，获得本发明高稳性重组PCT的氨基酸序列（序列如SEQ ID NO.2），采用大肠杆菌优势密码子将氨基酸序列SEQ ID NO.2(不含分离标签)反向翻录成核苷酸序列如SEQ ID NO.3(含分离标签)，采用PCR技术，获得PCT基因，然后基因克隆、表达，先构建质粒，将制备好的质粒转化进入大肠杆菌BL21感受态细胞，得到目的基因菌种进行培养，表达纯化获得高稳定性的重组降钙素原。
天然PCT蛋白序列SEQ ID NO.1：APFRSALESSPADPATLSEDEARLLLAALVQDYVQMKASELEQEQEREGSSLDSPRSKRCGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAPGKKRDMSSDLERDHRPHVSMPQNAN；
重组PCT蛋白序列SEQ ID NO. 2：APFRSALESSPADPATLSEDEARLLLAALVQDYVQMKASELEQEQEREGSSLDSPRSKKCGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAPGKKKDMSSDLERDHRPHVSMPQNAN，其C端通过柔性肽GG连接有组氨酸分离标签HHHHHH，电泳图见图1。
重组PCT的基因序列（SEQ ID NO. 3）：ATGGCTCCCTTCCGGTCAGCGTTGGAAAGTAGCCCGGCTGACCCGGCGACATTGAGCGAGGACGAAGCCCGGCTGCTGCTGGCAGCCTTGGTCCAGGATTATGTTCAGATGAAGGCATCGGAGTTAGAACAGGAGCAAGAACGTGAGGGTAGCTCATTGGATTCTCCACGCTCTAAACGCTGTGGCAATTTATCGACTTGTATGTTAGGAACTTATACGCAGGATTTTAATAAATTCCATACGTTTCCTCAGACGGCAATAGGGGTGGGCGCTCCCGGAAAGAAGCGCGATATGTCAAGCGACCTGGAGCGTGATCACCGGCCACACGTTAGTATGCCTCAGAACGCAAACGGGGGCCACCACCATCATCACCACTAG。
柔性肽PCT蛋白序列SEQ ID NO. 4：APFRSALESSPADPATLSEDEARLLLAALVQDYVQMKASELEQEQEREGSSLDSPRSGGCGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAPSGGGDMSSDLERDHRPHVSMPQNAN (CN104610443A公开的SEQ ID NO.：1) ，电泳图见图2。
二、天然PCT、柔性肽PCT、本发明重组PCT抗原的稳定性对比检测
天然PCT、柔性肽PCT、本发明重组PCT，分别置于4℃环境保存，每隔一段时间采用贝克曼400自动生化仪进行PCT浓度的检测。检测时间点为：0d、1d、3d、7d、10d、21d；三种PCT稳定性检测所得数据分别如表1所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
从表1可看出：
1)天然PCT在4℃环境下，仅仅只存放了1天便由11.09ng/ml降解为0.13ng/ml，几乎全部降解，说明天然PCT的稳定性极差，在实验室保存困难；
2)对比柔性肽PCT与本发明的重组PCT，同样在4℃条件下保存，在放置第7天时，柔性肽回收率为89.1%，而重组PCT回收率为98.7%，几乎没有降解，比柔性肽PCT回收率高；
3)在4℃放置21天后，柔性肽PCT回收率只剩25.3%，而重组PCT依然有77.7%的回收率。
综上可知，本发明的重组PCT其稳定性显著优于柔性肽PCT，具有意料之外的效果。
考虑到在实验过程中PCT无法一直置于4℃环境，对重组PCT增加一组37℃下的7天加速稳定性实验，分别在加速第0、1、3、7、10天检测其浓度，其实验数据如表2所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE002
表2的数据表明本发明重组PCT在37℃条件下，加速7天后仍能有74.9%的回收率，在第10天时才开始明显降解，本发明重组PCT具有良好的稳定性。
三、重组PCT抗原性验证
外购金斯瑞PCT单抗16A1： 12.2mg/ml 对重组PCT进行免疫原检测，采用ELISA检测重组PCT免疫原性。具体操作如下：
S1) 抗原包被：重组PCT抗原按照5µg/ml的浓度进行包被，100µl/孔，从上往下依次对倍稀释，最后1孔加100µl抗体稀释液，4℃包被过夜；洗液洗涤三次，每次1min；
S2) 封闭：将板条拍干，加入封闭液，200µl/孔，37℃封闭2h，拍干备用；
S3) 加抗体：PCT抗体先稀释至1mg/ml，然后从左往右按梯度进行稀释，100µl/孔；
S4) 加羊抗鼠HRP:用抗体稀释液1:5000稀释， 100µl/孔，室温振荡1h；洗板6次，拍干；
S5) 显色：加显色液（A液：B液=10：1）100µl/孔，室温避光振荡5min，加终止液100µl/孔终止反应，450nm/630nm测OD值。
检测结果如表3所示。
Figure 61154DEST_PATH_IMAGE003
表3的数据表明，重组PCT与外购PCT抗体反应良好，在抗原78.1ng/ml包被，抗体稀释32w倍下仍有效价。
四、生物活性验证
使用BCA试剂盒测定本发明的重组PCT蛋白浓度，将其浓度调整至2ng/ml，然后使用罗氏的降钙素检测试剂盒（电化学发光法）测定重组PCT蛋白的生物活性浓度。结果如表4所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE004
根据罗氏的试剂盒的结果，2ng/ml蛋白浓度的重组PCT的生物活性浓度赋值为1.6ng/ml，即每1ng/ml蛋白浓度赋值为0.8ng/ml生物活性浓度。
按照上述赋值结果，将重组PCT的生物活性浓度稀释至50、10、2、0.5、0.1、0ng/ml，使用罗氏PCT检测试剂盒再对其生物活性进行检测。结果如表5和图3所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE005
由表5和图3可知，重组PCT在罗氏PCT检测试剂盒中，在检测范围0.1-50ng/ml区间，线性相关为0.9999；因此本发明的重组PCT可溯源至罗氏的降钙素检测试剂盒（电化学发光法），量值可靠、准确。
以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。
<110> 广州市雷德生物科技有限公司
<120> 高稳定性重组降钙素原及其表达载体和应用
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 116
<212> PRT
<213> 人类(human)
<400> 1
Ala Pro Phe Arg Ser Ala Leu Glu Ser Ser Pro Ala Asp Pro Ala Thr
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Leu Ser Glu Asp Glu Ala Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Val Gln Asp
20 25 30
Tyr Val Gln Met Lys Ala Ser Glu Leu Glu Gln Glu Gln Glu Arg Glu
35 40 45
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65 70 75 80
Phe Pro Gln Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro Gly Lys Lys Arg Asp
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Met Ser Ser Asp Leu Glu Arg Asp His Arg Pro His Val Ser Met Pro
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<210> 2
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Ala Pro Phe Arg Ser Ala Leu Glu Ser Ser Pro Ala Asp Pro Ala Thr
1 5 10 15
Leu Ser Glu Asp Glu Ala Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Val Gln Asp
20 25 30
Tyr Val Gln Met Lys Ala Ser Glu Leu Glu Gln Glu Gln Glu Arg Glu
35 40 45
Gly Ser Ser Leu Asp Ser Pro Arg Ser Lys Lys Cys Gly Asn Leu Ser
50 55 60
Thr Cys Met Leu Gly Thr Tyr Thr Gln Asp Phe Asn Lys Phe His Thr
65 70 75 80
Phe Pro Gln Thr Ala Ile Gly Val Gly Ala Pro Gly Lys Lys Lys Asp
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Met Ser Ser Asp Leu Glu Arg Asp His Arg Pro His Val Ser Met Pro
100 105 110
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115
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<211> 378
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggctccct tccggtcagc gttggaaagt agcccggctg acccggcgac attgagcgag 60
gacgaagccc ggctgctgct ggcagccttg gtccaggatt atgttcagat gaaggcatcg 120
gagttagaac aggagcaaga acgtgagggt agctcattgg attctccacg ctctaaacgc 180
tgtggcaatt tatcgacttg tatgttagga acttatacgc aggattttaa taaattccat 240
acgtttcctc agacggcaat aggggtgggc gctcccggaa agaagcgcga tatgtcaagc 300
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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Ala Pro Phe Arg Ser Ala Leu Glu Ser Ser Pro Ala Asp Pro Ala Thr
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Tyr Val Gln Met Lys Ala Ser Glu Leu Glu Gln Glu Gln Glu Arg Glu
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100 105 110
Gln Asn Ala Asn
115

Claims (9)

1.一种重组降钙素原，其特征在于：其氨基酸序列为：APFRSALESSPADPATLSEDEARLLLAALVQDYVQMKASELEQEQEREGSSLDSPRSKKCGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAPGKKKDMSSDLERDHRPHVSMPQNAN。
2.根据权利要求1所述的重组降钙素原，其特征在于：其C端或N端还连接有蛋白分离标签。
3.根据权利要求2所述的重组降钙素原，其特征在于：所述蛋白分离标签通过柔性肽连接在所述重组降钙素原的C端或N端。
4.根据权利要求3所述的重组降钙素原，其特征在于：所述蛋白分离标签为组氨酸分离标签；和/或所述柔性肽由2～4个甘氨酸组成。
5.根据权利要求2～4任一项所述的重组降钙素原，其特征在于：所述蛋白分离标签连接在重组降钙素原的C端。
6.一种表达载体，其特征在于：其插入有表达权利要求1～5任一项所述重组降钙素原的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的表达载体，其特征在于：所述核苷酸序列经密码子偏好优化。
8.权利要求1～5任一项所述重组降钙素原在制备降钙素原检测试剂中的应用。
9.一种降钙素原检测试剂，其特征在于：其降钙素原标准品为权利要求1～5任一项所述重组降钙素原。
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