JP5359155B2 - システインが導入された新規ガウシアルシフェラーゼ変異体 - Google Patents
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Description
本発明は、アミノ末端領域にシステイン残基を導入した新規ガウシアルシフェラーゼ変異体に関する。また、検出すべき物質に特異的に結合するリガンドを、該システインのチオール基を介して結合させた複合体、その複合体を発光性標識として用いる物質の検出方法等に関する。
ガウシアルシフェラーゼは、深海コペポーダであるガウシア・プリンセス（Gaussia princeps）が産生する酵素であって、ホタルルシフェラーゼなどに比較して強い青光を放つので今後の利用が期待されている。ガウシアルシフェラーゼはアミノ酸１６８から構成される蛋白であって、一分子中に１０個のシステインを有している。ガウシアルシフェラーゼを大腸菌を宿主として産生させた場合には、大部分が封入体（inclusion body）となるためその生産効率はきわめて低い。さらに、ガウシアルシフェラーゼにビオチンのようなリガンドを、そのアミノ基またはチオール基を介して結合させることが試みられてきたが、何れの方法によっても、リガンドを導入することができていない。そこで、大腸菌で産生させる場合に生じるビオチニル化ペプチドを介してビオチンを結合させたものが市販されている（特許文献１）。しかし、このようにして製造されるビオチンを結合させたガウシアルシフェラーゼの収率は低く大量生産には難点がある。
一方、本発明者等はプロテインＡのＩｇＧ結合領域を基に開発された合成のＩｇＧ結合領域であるＺＺドメインに目的タンパク質を結合させたＺＺ融合蛋白質を可溶性蛋白質として発現させ、ＺＺドメインと目的蛋白質の間に導入したプロテアーゼ切断部位を切断して目的タンパク質を得る方法を開発し、この方法を用いてガウシアルシフェラーゼを製造することに成功した（特許文献２）。
米国特許第５,７２３,５８４号
特開２００８−９９６６９号
本発明は、ビオチンのようなリガンドが結合することができるガウシアルシフェラーゼ変異体を提供することである。また、そのガウシアルシフェラーゼ変異体にビオチンなどのリガンドを結合させた複合体を得ること、この複合体を用いて物質の測定を行うことである。
本発明は、天然のガウシアルシフェラーゼのＮ−末端から３番目のアミノ酸（Thr）をシステイン(Cys)で置換した蛋白質を含む新規なガウシアルシフェラーゼ変異体を製造する。天然のガウシアルシフェラーゼのＮ−末端から３番目のアミノ酸（Thr）をシステイン(Cys)で置換した蛋白質を配列番号：１で示す。配列番号：１の蛋白質は、ＺＺドメインとの融合蛋白質として発現させた後、ＺＺドメインと配列番号：１の蛋白質の間に導入されている、プロテアーゼ切断部位を有するリンカーペプチドをプロテアーゼで切断して採取される。したがって、本発明のガウシアルシフェラーゼ変異体は、そのＮ−末端側にプロテアーゼで切断した際に配列番号：１の蛋白質側に結合してくるアミノ酸残基を含んでいる。
更に、プロテアーゼ切断部位を有するリンカーペプチドと配列番号：１の蛋白質の間には発現ベクター構築に必要な制限酵素サイトに由来するアミノ酸配列が存在するがこれも配列番号：１の蛋白質に結合する。したがって、この制限酵素サイト由来のアミノ酸配列もガウシアルシフェラーゼ変異体に含まれる。この制限酵素サイトは、ＺＺドメインに結合したプロテアーゼ切断部位を有するリンカーペプチドをコードするヌクレオチドと配列番号：１の蛋白質のＮ−末端のヌクレオチドを結合するものであれば如何なる制限酵素サイトであっても良い。
したがって、本発明の態様は以下のとおりである。
１．配列番号：１のアミノ酸配列の蛋白質を含むガウシアルシフェラーゼ変異体。
２．（１）ＺＺドメインにプロテアーゼ切断部位を有するリンカーペプチドを介して配列番号：１のアミノ酸配列の蛋白質を結合させた融合蛋白質を発現させてプロテアーゼで切断する際、配列番号：１のアミノ酸配列の蛋白質側に結合するアミノ酸残基、
（２）上記（１）のリンカーペプチドと配列番号：１のアミノ酸配列の蛋白質を結合させる制限酵素サイト由来のアミノ酸残基、及び
（３）配列番号：１のアミノ酸配列の蛋白質
からなる１記載のガウシアルシフェラーゼ変異体。
１．配列番号：１のアミノ酸配列の蛋白質を含むガウシアルシフェラーゼ変異体。
２．（１）ＺＺドメインにプロテアーゼ切断部位を有するリンカーペプチドを介して配列番号：１のアミノ酸配列の蛋白質を結合させた融合蛋白質を発現させてプロテアーゼで切断する際、配列番号：１のアミノ酸配列の蛋白質側に結合するアミノ酸残基、
（２）上記（１）のリンカーペプチドと配列番号：１のアミノ酸配列の蛋白質を結合させる制限酵素サイト由来のアミノ酸残基、及び
（３）配列番号：１のアミノ酸配列の蛋白質
からなる１記載のガウシアルシフェラーゼ変異体。
３．配列番号：２のアミノ酸配列の蛋白質である１記載のガウシアルシフェラーゼ変異体。
ただし１番目と２番目のXaa-Xaaはプロテアーゼで切断する場合に配列番号：１のアミノ酸配列の蛋白質側に結合するアミノ酸残基であり、３番目と４番目のXaa-Xaaは制限酵素サイト由来のアミノ酸残基である。
ただし１番目と２番目のXaa-Xaaはプロテアーゼで切断する場合に配列番号：１のアミノ酸配列の蛋白質側に結合するアミノ酸残基であり、３番目と４番目のXaa-Xaaは制限酵素サイト由来のアミノ酸残基である。
４．１番目と２番目のXaa-XaaがGly-ProまたはGly-Serである３記載のガウシアルシフェラーゼ変異体。
５．３番目と４番目のXaa-XaaがGlu-Pheである３記載のガウシアルシフェラーゼ変異体。
６．配列番号：３で示される１記載のガウシアルシフェラーゼ変異体。
７．配列番号：４で示される１記載のガウシアルシフェラーゼ変異体。
８．１〜７のいずれかに記載のガウシアルシフェラーゼ変異体にリガンドを結合させた複合体。
９．リガンドがビオチンである８記載の複合体。
１０．１〜７のいずれかに記載のガウシアルシフェラーゼ変異体にリガンドを結合させた複合体を用いるリガンドに特異的な物質の測定方法。
１１．リガンドがビオチンである１０記載の物質の測定方法。
１２．１〜７のいずれかに記載のガウシアルシフェラーゼ変異体にリガンドを結合させた複合体を構成成分とするリガンドに特異的な物質を測定するためのキット。
１３．リガンドがビオチンである１２記載のキット。
５．３番目と４番目のXaa-XaaがGlu-Pheである３記載のガウシアルシフェラーゼ変異体。
６．配列番号：３で示される１記載のガウシアルシフェラーゼ変異体。
７．配列番号：４で示される１記載のガウシアルシフェラーゼ変異体。
８．１〜７のいずれかに記載のガウシアルシフェラーゼ変異体にリガンドを結合させた複合体。
９．リガンドがビオチンである８記載の複合体。
１０．１〜７のいずれかに記載のガウシアルシフェラーゼ変異体にリガンドを結合させた複合体を用いるリガンドに特異的な物質の測定方法。
１１．リガンドがビオチンである１０記載の物質の測定方法。
１２．１〜７のいずれかに記載のガウシアルシフェラーゼ変異体にリガンドを結合させた複合体を構成成分とするリガンドに特異的な物質を測定するためのキット。
１３．リガンドがビオチンである１２記載のキット。
本発明のガウシアルシフェラーゼ変異体は、天然のガウシアルシフェラーゼとは異なり、新たに挿入されたシステインを介してビオチンなどのリガンドと複合体を形成しうるので、分析などの用途に用いられる。
ガウシアルシフェラーゼにその遊離の−ＮＨ2を介してビオチンを結合させようとするとその発光活性が消失してしまう。また、ガウシアルシフェラーゼはそれ自身で１０個のシステインを有しているが、その−ＳＨ基を介してビオチンと結合させようとすると、発光活性が消失してしまう。本発明はガウシアルシフェラーゼに更にもう一つのシステインを挿入したことにより、意外にもビオチンと結合させることに成功したものである。
本発明のガウシアルシフェラーゼ変異体は、ＺＺドメインに目的タンパク質を結合させて目的タンパク質を可溶性蛋白質として発現させる方法（特許文献２参照）を用いて製造することにより大腸菌により安価に大量に生産することができる。したがって、その生産においては、非特許文献２に記載のあらゆる事項、例えばプロモーター、精製のためのアミノ酸配列、ベクターの構築、融合蛋白質の分離などに関連する事項が本発明においても応用できる。
ＺＺドメインと配列番号：１の目的蛋白質の融合蛋白質を水溶性蛋白質として発現させた後、目的蛋白質であるガウシアルシフェラーゼ変異体は、プロテアーゼによって切断されて採取される。ＺＺドメインと配列番号：１の蛋白質の間に挿入される、プロテアーゼが認識するリンカーペプチドは、特異性が高く容易に入手可能なプロテアーゼで切断できるものであることが好ましい。ヒトレノウイルス３Ｃプロテアーゼが認識する部位、トロンビンが認識する部位であることが実用的であるが、これに限定されることはない。ヒトレノウイルス３Ｃプロテアーゼで切断した場合、配列番号：１の蛋白質の側にはGly-Proが結合する。トロンビンで切断した場合、配列番号：１の蛋白質の側にはGly-Serが結合する。
ＺＺドメインと配列番号：１の目的蛋白質の融合蛋白質を水溶性蛋白質として発現させた後、目的蛋白質であるガウシアルシフェラーゼ変異体は、プロテアーゼによって切断されて採取される。ＺＺドメインと配列番号：１の蛋白質の間に挿入される、プロテアーゼが認識するリンカーペプチドは、特異性が高く容易に入手可能なプロテアーゼで切断できるものであることが好ましい。ヒトレノウイルス３Ｃプロテアーゼが認識する部位、トロンビンが認識する部位であることが実用的であるが、これに限定されることはない。ヒトレノウイルス３Ｃプロテアーゼで切断した場合、配列番号：１の蛋白質の側にはGly-Proが結合する。トロンビンで切断した場合、配列番号：１の蛋白質の側にはGly-Serが結合する。
更に発現ベクターを構築する上で制限酵素サイトが必要とされるがその制限酵素サイトは公知の如何なるものも使用可能である。
以下に実施例により本発明を説明するが、実施例は本発明を制限するものではない。以下の実施例において「Cys-ガウシアルシフェラーゼ」とは、配列番号：１のアミノ酸配列の蛋白質を意味するが厳格なものではない。また「ガウシアルシフェラーゼ変異体」とは、（１）プロテアーゼによって切断した際配列番号：１のアミノ酸配列の蛋白質側に結合するアミノ酸配列、（２）制限酵素サイトに由来するアミノ酸配列及び（３）配列番号：１のアミノ酸配列の蛋白質からなるものを意味する。
実施例１ Cys-ガウシアルシフェラーゼ発現ベクターの構築
（１）ＺＺ融合蛋白質発現ベクターpCold-ZZ-P-Xの調製はつぎのとおりである。発現ベクターとしてpColdIIベクター（タカラバイオ社製）を使用した。ＩｇＧ結合ドメインであるＺＺドメインをコードするＺＺ遺伝子は、pEZZ18（アマシャムバイオサイエンス社製）からＰＣＲ法により調製した。ＺＺドメインに目的蛋白質を結合させるリンカーペプチドとしてヒトレノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断認識部位を用いた融合蛋白質発現ベクターpCold-ZZ-P-Xを図１で示した。また、図１におけるＴＥＥからＸｂａＩの間のアミノ酸配列は、配列番号：５に記載されている。
（注）pCold-ZZ-P-Xのｐはヒトレノウイルス３Ｃプロテアーゼの商品名「プレシジョン」に由来する。
（１）ＺＺ融合蛋白質発現ベクターpCold-ZZ-P-Xの調製はつぎのとおりである。発現ベクターとしてpColdIIベクター（タカラバイオ社製）を使用した。ＩｇＧ結合ドメインであるＺＺドメインをコードするＺＺ遺伝子は、pEZZ18（アマシャムバイオサイエンス社製）からＰＣＲ法により調製した。ＺＺドメインに目的蛋白質を結合させるリンカーペプチドとしてヒトレノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断認識部位を用いた融合蛋白質発現ベクターpCold-ZZ-P-Xを図１で示した。また、図１におけるＴＥＥからＸｂａＩの間のアミノ酸配列は、配列番号：５に記載されている。
（注）pCold-ZZ-P-Xのｐはヒトレノウイルス３Ｃプロテアーゼの商品名「プレシジョン」に由来する。
（２）ＺＺドメインをコードするＺＺ遺伝子と、ＺＺ融合蛋白質よりＺＺ蛋白質部分を切断除去するためのヒトレノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位を有し、Cys-ガウシアルシフェラーゼ遺伝子発現ベクターの構築は以下の通りである。pcDNA3-hGL (LUX社製)を鋳型として２種のＰＣＲプライマー：GL21N-T3C/EcoRI（5' gcc GAA TTC AAG CCC TGC GAG AAC AAC GAA 3'（配列番号：１１）；EcoRI制限酵素部位はアンダーライン）およびGL-7C/XbaI（5' gcc TCT AGA TTA GTC ACC ACC GGC CCC CTT 3'（配列番号：１２）；ＸｂａＩ制限酵素部位はアンダーライン）を用いて、ＰＣＲキット（タカラバイオ社製）にてＰＣＲ（サイクル条件25サイクル；1分／94℃、1分／50℃、1分／72℃）を実施して、所望のＤＮＡ領域を増幅した。得られた断片をＰＣＲ精製キット（キアゲン社製）で精製し、常法により制限酵素EcoRI／XbaIにて消化した後、pCold-ZZ-P-XのEcoRI-XbaI 部位に連結することによって、図２に示す発現ベクターpCold-ZZ-P-GL-T3Cを構築した。発現したCys-ガウシアルシフェラーゼ（配列番号：１の蛋白質）は、天然のガウシアルシフェラーゼの３番目のスレオニンがシステインにより置換されているので、ＤＮＡシークエンサー（ABI社製）により塩基配列を決定することにより、インサートＤＮＡの確認を行った。
（注）pCold-ZZ-P-GL-T3CのGLはガウシアルシフェラーゼ（Gaussia luciferase）に由来するＧＬであり、Ｔ３Ｃは天然のガウシアルシフェラーゼの３番目のスレオニンがシステインに置換されていることを意味している。
（注）pCold-ZZ-P-GL-T3CのGLはガウシアルシフェラーゼ（Gaussia luciferase）に由来するＧＬであり、Ｔ３Ｃは天然のガウシアルシフェラーゼの３番目のスレオニンがシステインに置換されていることを意味している。
実施例２ ZZ-P-Cys-ガウシアルシフェラーゼの大腸菌での発現
大腸菌においてZZ-P-Cys-ガウシアルシフェラーゼを発現させるために、実施例１で作製した組換えプラスミドpCold-ZZ-P-GL-T3Cを用いた。常法により大腸菌BL21株に導入し、得られた形質転換株をアンピシリン（50μg／ml）を含有する１０ｍｌのＬＢ液体培地（水1リットルあたり、バクトトリプトン10g、イーストエクストラクト5g、塩化ナトリウム5g、pH7.2）に植菌し、３７℃で１８時間培養を行った。次いで、その培養物を新たなＬＢ液体培地４００ｍｌ×５本（総量2L）に添加して３７℃で５時間培養した後、氷水上で冷却して、イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（IPTG、和光純薬工業社製）を最終濃度０.２ｍＭになるように培養液に添加し、１５℃で１７時間培養を行った。培養後、菌体を遠心回収（5,000rpm、5分）し、蛋白質抽出の出発材料とした。
大腸菌においてZZ-P-Cys-ガウシアルシフェラーゼを発現させるために、実施例１で作製した組換えプラスミドpCold-ZZ-P-GL-T3Cを用いた。常法により大腸菌BL21株に導入し、得られた形質転換株をアンピシリン（50μg／ml）を含有する１０ｍｌのＬＢ液体培地（水1リットルあたり、バクトトリプトン10g、イーストエクストラクト5g、塩化ナトリウム5g、pH7.2）に植菌し、３７℃で１８時間培養を行った。次いで、その培養物を新たなＬＢ液体培地４００ｍｌ×５本（総量2L）に添加して３７℃で５時間培養した後、氷水上で冷却して、イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（IPTG、和光純薬工業社製）を最終濃度０.２ｍＭになるように培養液に添加し、１５℃で１７時間培養を行った。培養後、菌体を遠心回収（5,000rpm、5分）し、蛋白質抽出の出発材料とした。
実施例３ 培養菌体からのZZ-P-Cys-ガウシアルシフェラーゼの抽出および精製
集菌した培養菌体を２００ｍｌの５０ｍＭ Tris-HCl（pH7.6）で懸濁し、氷冷下で超音波破砕処理（ブランソン社製、Sonifier model cycle 250）を３分間、３回行い、その菌体破砕液を１０,０００ｒｐｍ（12,000×g）で４℃、２０分間遠心した。得られた可溶性画分を、５０ｍＭ Tris-HCl（pH7.6）で平衡化したニッケルキレートカラム（アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ：直径2.5×6.5cm）に供しZZ-P-Cys-ガウシアルシフェラーゼを吸着させた。３５０ｍｌの５０ｍＭ Tris-HCl（pH7.6）で洗浄後、０.１Ｍイミダゾール（和光純薬工業社製）によりZZ-P-Cys-ガウシアルシフェラーゼを溶出した。精製蛋白質濃度を、ウシ血清アルブミン（ピアス社製）を標品としてBradford法にもとづく市販のキット（バイオラッド社製）を用いて決定したところ、２Ｌの培養菌体より１０２ｍｇのZZ-P-Cys-ガウシアルシフェラーゼを得た。SDS-PAGE分析の結果、純度は９５％以上であった。
集菌した培養菌体を２００ｍｌの５０ｍＭ Tris-HCl（pH7.6）で懸濁し、氷冷下で超音波破砕処理（ブランソン社製、Sonifier model cycle 250）を３分間、３回行い、その菌体破砕液を１０,０００ｒｐｍ（12,000×g）で４℃、２０分間遠心した。得られた可溶性画分を、５０ｍＭ Tris-HCl（pH7.6）で平衡化したニッケルキレートカラム（アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ：直径2.5×6.5cm）に供しZZ-P-Cys-ガウシアルシフェラーゼを吸着させた。３５０ｍｌの５０ｍＭ Tris-HCl（pH7.6）で洗浄後、０.１Ｍイミダゾール（和光純薬工業社製）によりZZ-P-Cys-ガウシアルシフェラーゼを溶出した。精製蛋白質濃度を、ウシ血清アルブミン（ピアス社製）を標品としてBradford法にもとづく市販のキット（バイオラッド社製）を用いて決定したところ、２Ｌの培養菌体より１０２ｍｇのZZ-P-Cys-ガウシアルシフェラーゼを得た。SDS-PAGE分析の結果、純度は９５％以上であった。
実施例４ ヒトレノウイルス３ＣプロテアーゼによるＺＺドメイン部位の切断およびガウシアルシフェラーゼ変異体の精製
ニッケルキレートゲルから溶出したZZ-P-Cys-ガウシアルシフェラーゼの一部（34mg）からＺＺドメイン部位を切断するために、１０.５ｍｌのヒトレノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断バッファー（50mM Tris-HCl（pH7.0），150mM 塩化ナトリウム、1mM EDTA, 1mM DTT）にニッケルキレートゲルから溶出したZZ-P-Cys-ガウシアルシフェラーゼ９ｍｌ（34mg）を加えて氷上にて５分置き、次いでヒトレノウイルス３Ｃプロテアーゼ 7.8μｌ（23.4μg）を加えて静かに混和させ、４℃で18時間反応させた。SDS-PAGEにてＺＺドメインの切断を確認した後、反応溶液を５０ｍＭ Tris-HCl（pH7.6）で平衡化したニッケルキレートカラム（直径 0.5×6cm）に供し、吸着せずに溶出したガウシアルシフェラーゼ変異体を回収した。SDS-PAGE分析により、精製したガウシアルシフェラーゼ変異体画分に、切断除去したＺＺドメインが含まれていないことを確認した。精製したガウシアルシフェラーゼ変異体における活性回収率は９２.５％、収量１７.６ｍｇを得た。得られたガウシアルシフェラーゼ変異体のアミノ酸配列は配列番号：３に記載されている。
各精製過程画分について、還元状態で、１２％ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEによる分析を行った。各精製過程画分の精製収率は表１のとおりである。また、図４に示すように、最終精製画分は分子量２２ＫＤａ蛋白質に相当する単一バンドが検出され、純度９５％以上であることが明らかとなった。
ニッケルキレートゲルから溶出したZZ-P-Cys-ガウシアルシフェラーゼの一部（34mg）からＺＺドメイン部位を切断するために、１０.５ｍｌのヒトレノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断バッファー（50mM Tris-HCl（pH7.0），150mM 塩化ナトリウム、1mM EDTA, 1mM DTT）にニッケルキレートゲルから溶出したZZ-P-Cys-ガウシアルシフェラーゼ９ｍｌ（34mg）を加えて氷上にて５分置き、次いでヒトレノウイルス３Ｃプロテアーゼ 7.8μｌ（23.4μg）を加えて静かに混和させ、４℃で18時間反応させた。SDS-PAGEにてＺＺドメインの切断を確認した後、反応溶液を５０ｍＭ Tris-HCl（pH7.6）で平衡化したニッケルキレートカラム（直径 0.5×6cm）に供し、吸着せずに溶出したガウシアルシフェラーゼ変異体を回収した。SDS-PAGE分析により、精製したガウシアルシフェラーゼ変異体画分に、切断除去したＺＺドメインが含まれていないことを確認した。精製したガウシアルシフェラーゼ変異体における活性回収率は９２.５％、収量１７.６ｍｇを得た。得られたガウシアルシフェラーゼ変異体のアミノ酸配列は配列番号：３に記載されている。
各精製過程画分について、還元状態で、１２％ポリアクリルアミドゲルを用いたSDS-PAGEによる分析を行った。各精製過程画分の精製収率は表１のとおりである。また、図４に示すように、最終精製画分は分子量２２ＫＤａ蛋白質に相当する単一バンドが検出され、純度９５％以上であることが明らかとなった。
以上の結果から、ZZ-P-Cys-ガウシアルシフェラーゼのヒトレノウイルス３Ｃプロテアーゼ認識配列は９５％以上切断されており、得られた精製ガウシアルシフェラーゼ変異体の回収率も９５％以上であることが明らかである。
実施例５ 発光活性の測定法
精製過程でのガウシアルシフェラーゼ変異体の発光測定は、ガウシアルシフェラーゼ変異体１μｌを０.１ｍｌの１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ Tris-HCl（pH7.6）に溶解し、エタノールに溶解した基質セレンテラジン（1μg／μl）を混合して発光反応を開始させ、発光測定装置Luminescencer-PSN AB2200（アトー社製）で３０秒間発光活性を測定した。発光活性は、最大値（Imax）で示した。
精製過程でのガウシアルシフェラーゼ変異体の発光測定は、ガウシアルシフェラーゼ変異体１μｌを０.１ｍｌの１０ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ Tris-HCl（pH7.6）に溶解し、エタノールに溶解した基質セレンテラジン（1μg／μl）を混合して発光反応を開始させ、発光測定装置Luminescencer-PSN AB2200（アトー社製）で３０秒間発光活性を測定した。発光活性は、最大値（Imax）で示した。
実施例６ 精製ガウシアルシフェラーゼ変異体の分子量測定
実施例４で調製した精製ガウシアルシフェラーゼ変異体を、Matrix assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometory（MALDI-TOF-MS）法で、AutoFLEX (Buruker Daktonics社)により行った。分子量のスタンダードとして、アンジオテンシンＩ（m/z 1296.69）、インシュリン（m/z 5734.59）、アポミオグロビン（m/z 16952.60）、アポイクオリン（m/z 2163.20）を用いた。マトリックスはシナピン酸（インビトロジェン社製）を用いた。測定の結果、ガウシアルシフェラーゼ変異体の測定値１８５９５は、ガウシアルシフェラーゼ変異体の平均質量計算値１８６０２と非常に良い一致を示したことより、プレシジョンプロテアーゼ認識配列は正確に切断されていることが明らかとなった。得られたガウシアルシフェラーゼ変異体は、アミノ酸１６８個を有する配列番号：１の蛋白質と、そのＮ−末端に結合している、ヒトレノウイルス３Ｃプロテアーゼで切断した際に生じるGly-Pro及び制限酵素EcoRIに由来するアミノ酸配列Glu-Pheからなる合計１７２個のアミノ酸（配列番号：３）により構成されている。
実施例４で調製した精製ガウシアルシフェラーゼ変異体を、Matrix assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometory（MALDI-TOF-MS）法で、AutoFLEX (Buruker Daktonics社)により行った。分子量のスタンダードとして、アンジオテンシンＩ（m/z 1296.69）、インシュリン（m/z 5734.59）、アポミオグロビン（m/z 16952.60）、アポイクオリン（m/z 2163.20）を用いた。マトリックスはシナピン酸（インビトロジェン社製）を用いた。測定の結果、ガウシアルシフェラーゼ変異体の測定値１８５９５は、ガウシアルシフェラーゼ変異体の平均質量計算値１８６０２と非常に良い一致を示したことより、プレシジョンプロテアーゼ認識配列は正確に切断されていることが明らかとなった。得られたガウシアルシフェラーゼ変異体は、アミノ酸１６８個を有する配列番号：１の蛋白質と、そのＮ−末端に結合している、ヒトレノウイルス３Ｃプロテアーゼで切断した際に生じるGly-Pro及び制限酵素EcoRIに由来するアミノ酸配列Glu-Pheからなる合計１７２個のアミノ酸（配列番号：３）により構成されている。
実施例７ マレイミド活性化ビオチンによるビオチン化ガウシアルシフェラーゼ変異体の調製
５００μｌのＰＢＳ溶液（シグマ社製；0.137M塩化ナトリウム、0.0027M塩化カリウム、pH7.4）に、ＰＢＳで溶解したマレイミド活性化ビオチン（ピアス社製、EZ-Link PEO- Maleimide- activated Biotin、スペーサーの長さ：29.1オングストローム）５μｌ（50nmol）を加え、次いでガウシアルシフェラーゼ変異体５００μｌ（10nmol）を添加して修飾反応を開始させ、暗所で２０℃にて一晩反応を行った。システイン溶液を最終濃度０.２ｍＭ加えて室温にて３０分静置させ、未反応のマレイミド活性化ビオチンを反応させた。修飾反応の確認は、反応液を１μｌ取り出し、ニトロセルロース膜（バイオラッド社製）にてドットブロットを行い、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼ（シグマ社製）を用いたドットブロット発色法によりビオチン化を確認した。
マレイミド活性化ビオチン試薬の除去、ビオチン化ガウシアルシフェラーゼ変異体の単離および緩衝液交換は、４℃にてアミコンウルトラカラム(キアゲン社製)を用いて行った。
また、上述のようにして得られたビオチン化ガウシアルシフェラーゼ変異体と、未反応のガウシアルシフェラーゼ変異体の発光活性を比較したところ、ビオチン化による発光活性の低下はほとんど見られず、ビオチン化ガウシアルシフェラーゼ変異体は９８％以上の発光活性を保持していた。
５００μｌのＰＢＳ溶液（シグマ社製；0.137M塩化ナトリウム、0.0027M塩化カリウム、pH7.4）に、ＰＢＳで溶解したマレイミド活性化ビオチン（ピアス社製、EZ-Link PEO- Maleimide- activated Biotin、スペーサーの長さ：29.1オングストローム）５μｌ（50nmol）を加え、次いでガウシアルシフェラーゼ変異体５００μｌ（10nmol）を添加して修飾反応を開始させ、暗所で２０℃にて一晩反応を行った。システイン溶液を最終濃度０.２ｍＭ加えて室温にて３０分静置させ、未反応のマレイミド活性化ビオチンを反応させた。修飾反応の確認は、反応液を１μｌ取り出し、ニトロセルロース膜（バイオラッド社製）にてドットブロットを行い、ストレプトアビジン−アルカリフォスファターゼ（シグマ社製）を用いたドットブロット発色法によりビオチン化を確認した。
マレイミド活性化ビオチン試薬の除去、ビオチン化ガウシアルシフェラーゼ変異体の単離および緩衝液交換は、４℃にてアミコンウルトラカラム(キアゲン社製)を用いて行った。
また、上述のようにして得られたビオチン化ガウシアルシフェラーゼ変異体と、未反応のガウシアルシフェラーゼ変異体の発光活性を比較したところ、ビオチン化による発光活性の低下はほとんど見られず、ビオチン化ガウシアルシフェラーゼ変異体は９８％以上の発光活性を保持していた。
実施例８ ビオチン化ガウシアルシフェラーゼ変異体の定量性
ビオチン化ガウシアルシフェラーゼ変異体を検出用プローブとして使用するためには、蛋白量と発光量とが直線性を示すことが必要である。ビオチン化ガウシアルシフェラーゼ変異体の濃度を１０ナノグラムから１００フェムトグラムとして、基質セレンテラジン（0.5 ng／μl）５０μｌを注入し、発光測定装置Centro LB960（ベルトール社製）で発光活性を測定した。発光活性の最大値（Imax）と蛋白質濃度の相関を図５に示した。発光強度とビオチン化ガウシアルシフェラーゼ変異体との間に直線性の相関が認められた。この結果から、ビオチン化ガウシアルシフェラーゼ変異体の量を、発光によって定量することが可能であることが示された。
ビオチン化ガウシアルシフェラーゼ変異体を検出用プローブとして使用するためには、蛋白量と発光量とが直線性を示すことが必要である。ビオチン化ガウシアルシフェラーゼ変異体の濃度を１０ナノグラムから１００フェムトグラムとして、基質セレンテラジン（0.5 ng／μl）５０μｌを注入し、発光測定装置Centro LB960（ベルトール社製）で発光活性を測定した。発光活性の最大値（Imax）と蛋白質濃度の相関を図５に示した。発光強度とビオチン化ガウシアルシフェラーゼ変異体との間に直線性の相関が認められた。この結果から、ビオチン化ガウシアルシフェラーゼ変異体の量を、発光によって定量することが可能であることが示された。
実施例９ ビオチン化ガウシアルシフェラーゼを用いたα-フェトプロテイン（AFP）の標準曲線
１）抗−フェトプロテイン抗体(抗−AFP抗体)のコーティング
抗−AFP抗体（日本医学臨床検査研究所製、クローンNo.6D2、サブクラスIgG2a−κ、以下「6D2」と記載）を、０.０５％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ炭酸緩衝液（pH9.6）にて５μg／ｍｌに調製し、９６穴マイクロプレート（Nunc社製、#437796）に１００μｌ／ウェル分注し、室温にて一晩静置してコートした。静置後、炭酸緩衝液を除去し、１５０ｍＭ NaCl（和光純薬工業）、２０ｍＭ Tris-HCl（和光純薬工業）（以降TBSと記載）に１％牛血清アルブミン（生化学工業、以下BSAと記載）、２ｍＭ EDTA（EDAT・2Na、同仁化学研究所）、０.０５％アジ化ナトリウム（和光純薬工業）を含む溶液（以降ポストコーティング溶液と記載）を２００μｌ／ウェル分注し、４℃にて一晩静置した。
１）抗−フェトプロテイン抗体(抗−AFP抗体)のコーティング
抗−AFP抗体（日本医学臨床検査研究所製、クローンNo.6D2、サブクラスIgG2a−κ、以下「6D2」と記載）を、０.０５％アジ化ナトリウムを含む５０ｍＭ炭酸緩衝液（pH9.6）にて５μg／ｍｌに調製し、９６穴マイクロプレート（Nunc社製、#437796）に１００μｌ／ウェル分注し、室温にて一晩静置してコートした。静置後、炭酸緩衝液を除去し、１５０ｍＭ NaCl（和光純薬工業）、２０ｍＭ Tris-HCl（和光純薬工業）（以降TBSと記載）に１％牛血清アルブミン（生化学工業、以下BSAと記載）、２ｍＭ EDTA（EDAT・2Na、同仁化学研究所）、０.０５％アジ化ナトリウム（和光純薬工業）を含む溶液（以降ポストコーティング溶液と記載）を２００μｌ／ウェル分注し、４℃にて一晩静置した。
２）ビオチン化ガウシアルシフェラーゼ変異体の発光の測定
静置後、ポストコーティング溶液を捨て洗浄した後、０.１％ ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有したＴＢＳにて、０.０１２５ｎｇ／ｍｌから１２５ｎｇ／ｍｌに希釈調製したα−フェトプロテイン（Ｄａｋｏ社製、ＡＦＰと記載）を９６穴マイクロプレートに５０μｌ／ウェル分注し、さらに７４.９ｎｇ／ｍｌに希釈調製したビオチン化抗−ＡＦＰ抗体（日本医学臨床検査研究所製、クローンNo.1D5、サブクラスIgG1−κ、以下1D5と記載）を５０μｌ／ウェル分注し、３０℃にて１時間静置した。前記プレートから反応溶液を除去し、よく洗浄した。１０％ BlockAce（雪印乳業社製）、０.０１％ Tween20（バイオラッド社製）、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ（以下PBSE-TBと記載）にて５０ｐｍｏｌ／ｍｌに希釈調製したストレプトアビジン（以下STAと記載）５０μlと、５０ｐｍｏｌ／ｍｌに希釈調製したビオチン化ガウシアルシフェラーゼ変異体５０μｌを混合し、室温にて３０分反応させた後、PBSE-TBにて８０倍希釈した溶液を前記プレートに１００μｌ／ウェル分注し、３０℃にて３０分静置した。反応溶液を除去し、洗浄した後、０.０１％ Tween20、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ（以下PBSE-Tと記載）５０μｌ／ウェル分注し、発光プレートリーダーCentro LB960（ベルトール社製）にて、基質セレンテラジン（0.5 ng／μl）５０μｌを注入して発光強度を０.１秒間隔で1秒間の積算値（Integration）を算出した。求めた積算値とＡＦＰの濃度よりＡＦＰの標準曲線を描き、図６に示した。
静置後、ポストコーティング溶液を捨て洗浄した後、０.１％ ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有したＴＢＳにて、０.０１２５ｎｇ／ｍｌから１２５ｎｇ／ｍｌに希釈調製したα−フェトプロテイン（Ｄａｋｏ社製、ＡＦＰと記載）を９６穴マイクロプレートに５０μｌ／ウェル分注し、さらに７４.９ｎｇ／ｍｌに希釈調製したビオチン化抗−ＡＦＰ抗体（日本医学臨床検査研究所製、クローンNo.1D5、サブクラスIgG1−κ、以下1D5と記載）を５０μｌ／ウェル分注し、３０℃にて１時間静置した。前記プレートから反応溶液を除去し、よく洗浄した。１０％ BlockAce（雪印乳業社製）、０.０１％ Tween20（バイオラッド社製）、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ（以下PBSE-TBと記載）にて５０ｐｍｏｌ／ｍｌに希釈調製したストレプトアビジン（以下STAと記載）５０μlと、５０ｐｍｏｌ／ｍｌに希釈調製したビオチン化ガウシアルシフェラーゼ変異体５０μｌを混合し、室温にて３０分反応させた後、PBSE-TBにて８０倍希釈した溶液を前記プレートに１００μｌ／ウェル分注し、３０℃にて３０分静置した。反応溶液を除去し、洗浄した後、０.０１％ Tween20、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ（以下PBSE-Tと記載）５０μｌ／ウェル分注し、発光プレートリーダーCentro LB960（ベルトール社製）にて、基質セレンテラジン（0.5 ng／μl）５０μｌを注入して発光強度を０.１秒間隔で1秒間の積算値（Integration）を算出した。求めた積算値とＡＦＰの濃度よりＡＦＰの標準曲線を描き、図６に示した。
本発明のガウシアルシフェラーゼ変異体は、導入されたシステインのチオール基を介してビオチンなどのリガンドと結合することができるため、リガンドに特異的な物質の検出に応用することができる。
[配列番号：１] 天然のガウシアルシフェラーゼの３番目のスレオニンをシステインで置換したガウシアルシフェラーゼ変異体の本体部分を構成する蛋白質のアミノ酸配列である。
[配列番号：２] （１）ＺＺドメインにプロテアーゼ切断部位を有するリンカーペプチドを介して配列番号：１のアミノ酸配列の蛋白質を結合させた融合蛋白質を発現させてプロテアーゼで切断する際配列番号：１のアミノ酸配列の蛋白質側に結合するアミノ酸残基(Xaa-Xaa)、
（２）上記（１）のリンカーペプチドと配列番号：１のアミノ酸配列の蛋白質を含むガウシアルシフェラーゼ変異体を結合させる制限酵素サイト由来のアミノ酸残基(Xaa-Xaa)、及び
（３）配列番号：１のアミノ酸配列の蛋白質からなるガウシアルシフェラーゼ変異体を示すアミノ酸配列である。
[配列番号：３] 実施例４で生産されたガウシアルシフェラーゼ変異体を示すアミノ酸配列である。
[配列番号：４] 実施例１におけるヒトレノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位をトロンビン切断部位に変更した場合に得られるガウシアルシフェラーゼ変異体を示すアミノ酸配列である。
[配列番号：５] ＺＺドメインと配列番号：１の蛋白質と間にヒトレノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位を有する実施例１で作成したpCold-ZZ-P-XのＴＥＥからＸｂａＩまでのアミノ酸配列である。
[配列番号：６] 実施例１で作成した発現ベクターpCold-ZZ-P-GL-T3Cに挿入された、ヒトレノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位を有するＺＺドメインと融合した配列番号：１の蛋白質をコードする塩基配列である。
[配列番号：７] 実施例１で作成した発現ベクターpCold-ZZ-P-GL-T3Cに挿入された、ヒトレノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位を有するＺＺドメインと融合した配列番号：１の蛋白質のアミノ酸配列である。
[配列番号：８] ＺＺドメインと配列番号：１の蛋白質と間にトロンビンプロテアーゼ切断部位を有するpCold-ZZ-T-GL-XのＴＥＥからＸｂａＩまでのアミノ酸配列である。
[配列番号：９] 発現ベクターpCold-ZZ-T-GL-T3Cに挿入された、トロンビンプロテアーゼ切断部位を有するＺＺドメインと融合した配列番号：１の蛋白質をコードする塩基配列である。
[配列番号：１０] 発現ベクターpCold-ZZ-T-GL-T3Cに挿入された、トロンビンプロテアーゼ切断部位を有するＺＺドメインと融合した配列番号：１の蛋白質のアミノ酸配列である。
[配列番号：１１] 実施例１で使用したＰＣＲプライマーGL21N-T3C/EcoRIである。
[配列番号：１２] 実施例１で使用したＰＣＲプライマーGL-7C/XbaIである。
[配列番号：２] （１）ＺＺドメインにプロテアーゼ切断部位を有するリンカーペプチドを介して配列番号：１のアミノ酸配列の蛋白質を結合させた融合蛋白質を発現させてプロテアーゼで切断する際配列番号：１のアミノ酸配列の蛋白質側に結合するアミノ酸残基(Xaa-Xaa)、
（２）上記（１）のリンカーペプチドと配列番号：１のアミノ酸配列の蛋白質を含むガウシアルシフェラーゼ変異体を結合させる制限酵素サイト由来のアミノ酸残基(Xaa-Xaa)、及び
（３）配列番号：１のアミノ酸配列の蛋白質からなるガウシアルシフェラーゼ変異体を示すアミノ酸配列である。
[配列番号：３] 実施例４で生産されたガウシアルシフェラーゼ変異体を示すアミノ酸配列である。
[配列番号：４] 実施例１におけるヒトレノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位をトロンビン切断部位に変更した場合に得られるガウシアルシフェラーゼ変異体を示すアミノ酸配列である。
[配列番号：５] ＺＺドメインと配列番号：１の蛋白質と間にヒトレノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位を有する実施例１で作成したpCold-ZZ-P-XのＴＥＥからＸｂａＩまでのアミノ酸配列である。
[配列番号：６] 実施例１で作成した発現ベクターpCold-ZZ-P-GL-T3Cに挿入された、ヒトレノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位を有するＺＺドメインと融合した配列番号：１の蛋白質をコードする塩基配列である。
[配列番号：７] 実施例１で作成した発現ベクターpCold-ZZ-P-GL-T3Cに挿入された、ヒトレノウイルス３Ｃプロテアーゼ切断部位を有するＺＺドメインと融合した配列番号：１の蛋白質のアミノ酸配列である。
[配列番号：８] ＺＺドメインと配列番号：１の蛋白質と間にトロンビンプロテアーゼ切断部位を有するpCold-ZZ-T-GL-XのＴＥＥからＸｂａＩまでのアミノ酸配列である。
[配列番号：９] 発現ベクターpCold-ZZ-T-GL-T3Cに挿入された、トロンビンプロテアーゼ切断部位を有するＺＺドメインと融合した配列番号：１の蛋白質をコードする塩基配列である。
[配列番号：１０] 発現ベクターpCold-ZZ-T-GL-T3Cに挿入された、トロンビンプロテアーゼ切断部位を有するＺＺドメインと融合した配列番号：１の蛋白質のアミノ酸配列である。
[配列番号：１１] 実施例１で使用したＰＣＲプライマーGL21N-T3C/EcoRIである。
[配列番号：１２] 実施例１で使用したＰＣＲプライマーGL-7C/XbaIである。
Claims (10)
- 配列番号：１のアミノ酸配列の蛋白質を含むガウシアルシフェラーゼ変異体。
- （１）ＺＺドメインにプロテアーゼ切断部位を有するリンカーペプチドを介して配列番号：１のアミノ酸配列の蛋白質を結合させた融合蛋白質を発現させてプロテアーゼで切断する際、配列番号：１のアミノ酸配列の蛋白質側に結合するアミノ酸残基、
（２）上記（１）のリンカーペプチドと配列番号：１のアミノ酸配列の蛋白質を結合させる制限酵素サイト由来のアミノ酸残基、及び
（３）配列番号：１のアミノ酸配列の蛋白質
からなる請求項１記載のガウシアルシフェラーゼ変異体。 - 配列番号：２のアミノ酸配列の蛋白質である請求項１記載のガウシアルシフェラーゼ変異体。
ただし１番目と２番目のXaa-Xaaはプロテアーゼで切断する場合に配列番号：１のアミノ酸配列の蛋白質側に結合するアミノ酸残基であり、３番目と４番目のXaa-Xaaは制限酵素サイト由来のアミノ酸残基である。 - １番目と２番目のXaa-XaaがGly-ProまたはGly-Serである請求項３記載のガウシアルシフェラーゼ変異体。
- ３番目と４番目のXaa-XaaがGlu-Pheである請求項３記載のガウシアルシフェラーゼ変異体。
- 配列番号：３で示される請求項１記載のガウシアルシフェラーゼ変異体。
- 配列番号：４で示される請求項１記載のガウシアルシフェラーゼ変異体。
- 請求項１〜７のいずれかに記載のガウシアルシフェラーゼ変異体にビオチンを結合させた複合体。
- 請求項１〜７のいずれかに記載のガウシアルシフェラーゼ変異体にビオチンを結合させた複合体を用いるリガンドに特異的な物質の測定方法。
- 請求項１〜７のいずれかに記載のガウシアルシフェラーゼ変異体にビオチンを結合させた複合体を構成成分とするリガンドに特異的な物質を測定するためのキット。
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