JP2008048607A - Ｆｃ結合ドメインとカルシウム結合発光蛋白質との融合蛋白質、それをコードする遺伝子およびそれらの用途 - Google Patents
Ｆｃ結合ドメインとカルシウム結合発光蛋白質との融合蛋白質、それをコードする遺伝子およびそれらの用途 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】ＩｇＧとの結合能力が高く、より感度よくＩｇＧを検出することができる、ＩｇＧ結合能を有するカルシウム結合発光蛋白質を提供すること。
【解決手段】ＩｇＧのＦｃ領域に対する結合能を有するＺＺドメインと、カルシウム結合発光蛋白質であるアポイクオリンとの融合蛋白質を用いる。本発明の融合蛋白質などは、カルシウムイオンの検出または測定、ＩｇＧの検出などに利用することができる。
【選択図】なし
【解決手段】ＩｇＧのＦｃ領域に対する結合能を有するＺＺドメインと、カルシウム結合発光蛋白質であるアポイクオリンとの融合蛋白質を用いる。本発明の融合蛋白質などは、カルシウムイオンの検出または測定、ＩｇＧの検出などに利用することができる。
【選択図】なし
Description
本発明は、抗体結合ドメインとカルシウム結合発光蛋白質との融合蛋白質、それをコードする遺伝子およびそれらの用途に関する。より具体的には、ＩｇＧのＦｃ領域に対する結合能を有するＺＺドメインと、カルシウム結合発光蛋白質であるアポイクオリンとの融合蛋白質、それをコードする遺伝子およびそれらの用途に関する。
カルシウム結合発光蛋白質は、アポ蛋白質と、発光基質のペルオキシドとが複合体を形成した状態で存在する発光蛋白質である。カルシウム結合発光蛋白質は、カルシウムイオンと結合すると瞬間的に発光するという性質を有している。
カルシウム結合発光蛋白質としては、イクオリン、オべリン、クライチィン、マイトロコミン、ミネオプシンおよびベルボインなどが知られている。なかでもイクオリンはカルシウム結合発光蛋白質の代表的なものであり、その高次構造および発光メカニズムなどが詳細に報告されている（例えば、非特許文献１：Inouye et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3154-3158、非特許文献２：Head et al. (2000) Nature 405, 372-376など参照）。イクオリンのカルシウムイオンに対する感受性は非常に高いので、微量カルシウムイオンの検出・定量や細胞内カルシウムイオンの濃度変化の測定などに利用されている。
イクオリンは、アポイクオリンと、発光基質セレンテラジンのペルオキシドとが複合体を形成した状態で存在している。イクオリンにカルシウムイオンが結合すると、瞬間的な発光を示し、セレンテラジンの酸化物であるセレンテラミドと二酸化炭素を生成する。
カルシウム結合発光蛋白質としては、イクオリン、オべリン、クライチィン、マイトロコミン、ミネオプシンおよびベルボインなどが知られている。なかでもイクオリンはカルシウム結合発光蛋白質の代表的なものであり、その高次構造および発光メカニズムなどが詳細に報告されている（例えば、非特許文献１：Inouye et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3154-3158、非特許文献２：Head et al. (2000) Nature 405, 372-376など参照）。イクオリンのカルシウムイオンに対する感受性は非常に高いので、微量カルシウムイオンの検出・定量や細胞内カルシウムイオンの濃度変化の測定などに利用されている。
イクオリンは、アポイクオリンと、発光基質セレンテラジンのペルオキシドとが複合体を形成した状態で存在している。イクオリンにカルシウムイオンが結合すると、瞬間的な発光を示し、セレンテラジンの酸化物であるセレンテラミドと二酸化炭素を生成する。
プロテインＡは、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）細胞壁由来の蛋白質であり、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃ領域と特異的に結合することが知られている。プロテインＡとイクオリンの融合蛋白質はイムノアッセイ法に使用できることが報告されている。プロテインＡとイクオリンの融合蛋白質を用いたIgGの測定可能な最低濃度は、アッセイ当たり20 ng/mlである（例えば、非特許文献３：Biochem. Biophys. Res. Commun. (1990) 171: 169-174など参照）。
ＺＺドメインは、プロテインＡのＩｇＧ結合領域を基に開発された合成のＩｇＧ結合領域である（例えば、非特許文献４：Nilsson B. et al., Protein Eng. (1987) 1: 107-113など参照）。ＺＺドメインと、カルシウム結合発光蛋白質であるオベリンとの融合蛋白質が、イムノアッセイに使用できることが報告されている。ＺＺドメインとオベリンとの融合蛋白質を用いた、IgGの測定可能な最低濃度は10 ng／mlである（例えば、非特許文献５：Biochem. Biophys. Res. Commun. (1996) 219: 475-479など参照）。
Inouye, S. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3154-3158 Head, J. F. et al. (2000) Nature 405, 372-376 Zenno, S and Inouye, S. Biochem. Biophys. Res. Commun. (1990) 171: 169-174 Nilsson B. et al, Protein Eng. (1987) 1: 107-113 Frank, L. A. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. (1996) 219: 475-479
Inouye, S. et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3154-3158 Head, J. F. et al. (2000) Nature 405, 372-376 Zenno, S and Inouye, S. Biochem. Biophys. Res. Commun. (1990) 171: 169-174 Nilsson B. et al, Protein Eng. (1987) 1: 107-113 Frank, L. A. et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. (1996) 219: 475-479
上記状況において、従来の融合蛋白質よりＩｇＧとの結合能力が高く、より感度よくＩｇＧを検出することができるカルシウム結合発光蛋白質が望まれていた。
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、ＩｇＧのＦｃ領域に対する結合能を有するＺＺドメインと、カルシウム結合発光蛋白質であるイクオリンとの融合蛋白質を効率良く作成し、従来の融合蛋白質より感度よくＩｇＧを検出することができる（すなわち、ＩｇＧの検出限界が低い）ことを見出した。これらの知見に基づいてさらに検討を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は、
〔１〕 （１）以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される第１の領域：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、および
（ｄ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域；と、
（２）以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される第２の領域：
（ｅ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域、
（ｆ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、および
（ｈ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域；と、
を含有する融合蛋白質、
〔２〕 （１）第１の領域が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、および
（ｄ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域；
から選択され、
（２）第２の領域が、以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群：
（ｅ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域、
（ｆ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、および
（ｈ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域；
から選択される、上記〔１〕記載の融合蛋白質、
〔３〕（１）配列番号：１で表される第１のアミノ酸配列からなる領域と、
（２）配列番号：３で表される第２のアミノ酸配列からなる領域
とを含有する融合蛋白質、
〔４〕 さらに、翻訳促進のためのアミノ酸配列および／または精製のためのアミノ酸配列を含有する、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の融合蛋白質、
〔５〕 配列番号：５のアミノ酸配列からなる融合蛋白質、
〔６〕 上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシドまたはセレンテラジン誘導体のペルオキシドとからなるホロ蛋白質、
〔７〕 上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
〔８〕 （１）以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される第１のコード配列：
（ａ）配列番号：２の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｄ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；と、
（２）以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される第２のコード配列：
（ｅ）配列番号：４の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｈ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
とを含有するポリヌクレオチド、
〔９〕 （１）第１のコード配列が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群：
（ａ）配列番号：２の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｄ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；から選択され、
（２）第２のコード配列が、以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群：
（ｅ）配列番号：４の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｈ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
から選択される、上記〔８〕に記載のポリヌクレオチド、
〔１０〕 配列番号：６の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
〔１１〕 上記〔７〕〜〔１０〕のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
〔１２〕 上記〔１０〕記載の組換えベクターが導入された形質転換体、
〔１３〕 上記〔１２〕記載の形質転換体を培養し、上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の融合蛋白質を生成させる工程を含む、上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の融合蛋白質の製造方法、
〔１４〕 上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の融合蛋白質または上記〔６〕に記載のホロ蛋白質を含むキット、
〔１５〕 上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の融合蛋白質または上記〔６〕に記載のホロ蛋白質を含むイムノアッセイ用キット。
〔１６〕 上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の融合蛋白質または上記〔６〕に記載のホロ蛋白質を使用してカルシウムイオンを検出または定量する方法
〔１７〕 上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の融合蛋白質または上記〔６〕に記載のホロ蛋白質を用いたイムノアッセイ法
などを提供する。
〔１〕 （１）以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される第１の領域：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、および
（ｄ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域；と、
（２）以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される第２の領域：
（ｅ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域、
（ｆ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、および
（ｈ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域；と、
を含有する融合蛋白質、
〔２〕 （１）第１の領域が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、および
（ｄ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域；
から選択され、
（２）第２の領域が、以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群：
（ｅ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域、
（ｆ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、および
（ｈ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域；
から選択される、上記〔１〕記載の融合蛋白質、
〔３〕（１）配列番号：１で表される第１のアミノ酸配列からなる領域と、
（２）配列番号：３で表される第２のアミノ酸配列からなる領域
とを含有する融合蛋白質、
〔４〕 さらに、翻訳促進のためのアミノ酸配列および／または精製のためのアミノ酸配列を含有する、上記〔１〕〜〔３〕のいずれかに記載の融合蛋白質、
〔５〕 配列番号：５のアミノ酸配列からなる融合蛋白質、
〔６〕 上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシドまたはセレンテラジン誘導体のペルオキシドとからなるホロ蛋白質、
〔７〕 上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
〔８〕 （１）以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される第１のコード配列：
（ａ）配列番号：２の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｄ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；と、
（２）以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される第２のコード配列：
（ｅ）配列番号：４の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｈ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
とを含有するポリヌクレオチド、
〔９〕 （１）第１のコード配列が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群：
（ａ）配列番号：２の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｄ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；から選択され、
（２）第２のコード配列が、以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群：
（ｅ）配列番号：４の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｈ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
から選択される、上記〔８〕に記載のポリヌクレオチド、
〔１０〕 配列番号：６の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
〔１１〕 上記〔７〕〜〔１０〕のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター、
〔１２〕 上記〔１０〕記載の組換えベクターが導入された形質転換体、
〔１３〕 上記〔１２〕記載の形質転換体を培養し、上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の融合蛋白質を生成させる工程を含む、上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の融合蛋白質の製造方法、
〔１４〕 上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の融合蛋白質または上記〔６〕に記載のホロ蛋白質を含むキット、
〔１５〕 上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の融合蛋白質または上記〔６〕に記載のホロ蛋白質を含むイムノアッセイ用キット。
〔１６〕 上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の融合蛋白質または上記〔６〕に記載のホロ蛋白質を使用してカルシウムイオンを検出または定量する方法
〔１７〕 上記〔１〕〜〔５〕のいずれかに記載の融合蛋白質または上記〔６〕に記載のホロ蛋白質を用いたイムノアッセイ法
などを提供する。
本発明の融合蛋白質は、発光基質であるセレンテラジンと接触させることによって、容易に本発明の融合蛋白質とセレンテラジンのペルオキシドを含有するホロ蛋白質を形成することができる。本発明のホロ蛋白質は、セレンテラジンと酸素の存在下において、本発明の融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシドとが複合体を形成した状態で存在する。前記複合体にカルシウムイオンが結合すると、瞬間的な発光を示す。したがって、本発明の融合蛋白質、本発明のホロ蛋白質などは、カルシウムイオンの検出または測定に好適に利用することができる。
また、本発明の融合蛋白質は、ＩｇＧとの高い結合能力を有している。そして、上述のように、本発明の融合蛋白質と発光基質であるセレンテラジンのペルオキシドとからなるホロ蛋白質は、カルシウムイオンによって発光させることができる。したがって、本発明の融合蛋白質、本発明のホロ蛋白質などは、ＩｇＧの検出に好適に利用することができる。
さらに、本発明の融合蛋白質は、組換え蛋白質の発現系として広く用いられている原核細胞を宿主として用いることによって、細胞質中に可溶性タンパク質として発現させることができるので、効率的に製造することができる。
また、本発明の融合蛋白質は、ＩｇＧとの高い結合能力を有している。そして、上述のように、本発明の融合蛋白質と発光基質であるセレンテラジンのペルオキシドとからなるホロ蛋白質は、カルシウムイオンによって発光させることができる。したがって、本発明の融合蛋白質、本発明のホロ蛋白質などは、ＩｇＧの検出に好適に利用することができる。
さらに、本発明の融合蛋白質は、組換え蛋白質の発現系として広く用いられている原核細胞を宿主として用いることによって、細胞質中に可溶性タンパク質として発現させることができるので、効率的に製造することができる。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
１．本発明の融合蛋白質
本発明の融合蛋白質とは、配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域および配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能を有する領域から選択される第１の領域と、配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域および配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能を有する領域から選択される第２の領域とを含有する融合蛋白質を意味する。
１．本発明の融合蛋白質
本発明の融合蛋白質とは、配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域および配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能を有する領域から選択される第１の領域と、配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域および配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能を有する領域から選択される第２の領域とを含有する融合蛋白質を意味する。
本明細書中、配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域および配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能を有する領域から選択される第１の領域を、「ＺＺドメイン」と称することがある。配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域および配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能を有する領域から選択される第２の領域を、「アポイクオリン」または「アポＡＱ」と称することがある。
本発明の融合蛋白質はさらに翻訳促進のためのアミノ酸配列および／または精製のためのペプチド配列を含んでいてもよい。翻訳促進のためのアミノ酸配列としては、当技術分野において用いられているペプチド配列を使用することができる。翻訳促進のためのアミノ酸配列としては、例えば、ＴＥＥ配列などが挙げられる。精製のためのペプチド配列としては、当技術分野において用いられているペプチド配列を使用することができる。精製のためのペプチド配列としては、例えば、ヒスチジン残基が４残基以上、好ましくは６残基以上連続したアミノ酸配列を有するヒスチジンタグ配列、グルタチオン Ｓ−トランストランスフェラーゼのグルタチオンへの結合ドメインのアミノ酸配列などが挙げられる。
本発明の融合蛋白質の取得方法については特に制限はない。本発明の融合蛋白質としては、化学合成により合成した融合蛋白質でもよいし、遺伝子組換え技術により作製した組換え融合蛋白質であってもよい。本発明の融合蛋白質を化学合成する場合には、例えば、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（t-ブチルオキシカルボニル法）等により合成することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。本発明の融合蛋白質を遺伝子組換え技術により作製する場合には、通常の遺伝子組換え手法により作製することができる。より具体的には、本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を適当な発現系に導入することにより、本発明の融合蛋白質を作製することができる。本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド、本発明の融合蛋白質の発現系での発現などについては、後記する。
本発明の融合蛋白質を、発光基質であるセレンテラジンまたはその誘導体（例えば、h-セレンテラジン、e-セレンテラジン、cl-セレンテラジン、ch-セレンテラジン、hcp-セレンテラジンなど）と、酸素存在下に接触させることにより、本発明の融合蛋白質とセレンテラジンのペルオキシドまたはセレンテラジン誘導体のペルオキシドとからなるホロ蛋白質を得ることができる。以下、「セレンテラジンまたはその誘導体」を、単に「セレンテラジン」と称することがある。本明細書中、本発明の融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドとからなるホロ蛋白質を、「本発明のホロ蛋白質」または「ＺＺ−イクオリン」もしくは「ＺＺ−ＡＱ」と称することがある。また、本発明の融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドとからなるホロ蛋白質を、「本発明の発光蛋白質」と称することもある。
本発明のホロ蛋白質としては、（１）本発明の融合蛋白質とセレンテラジンのペルオキシドとからなるホロ蛋白質、（２）本発明の融合蛋白質とセレンテラジン誘導体のペルオキシドとからなるホロ蛋白質などが挙げられる。本発明の融合蛋白質とセレンテラジン誘導体のペルオキシドとからなるホロ蛋白質としては、例えば、本発明の融合蛋白質とh-セレンテラジンのペルオキシドとからなるホロ蛋白質、本発明の融合蛋白質とe-セレンテラジンのペルオキシドとからなるホロ蛋白質、本発明の融合蛋白質とcl-セレンテラジンのペルオキシドとからなるホロ蛋白質、本発明の融合蛋白質とch-セレンテラジンのペルオキシドとからなるホロ蛋白質、本発明の融合蛋白質とhcp-セレンテラジンのペルオキシドとからなるホロ蛋白質などが挙げられる。本発明のホロ蛋白質は、本発明の融合蛋白質とセレンテラジンとから、公知のカルシウム結合発光蛋白質（例えば、イクオリンなど）と同様にして製造することができる。より具体的には、本発明のホロ蛋白質は、例えば、Biochem. J. 261, 913-920 (1989)などに記載の製造方法に準じる方法によって製造することができる。本発明のホロ蛋白質は、本発明の融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシドとが複合体（本発明の発光蛋白質）を形成した状態で存在する。前記複合体（本発明の発光蛋白質）にカルシウムイオンが結合すると、瞬間的な発光を示し、セレンテラジンの酸化物であるセレンテラミドと二酸化炭素を生成する。
（第１の領域）
第１の領域とは、配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域または配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能を有する領域を意味する。
配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能とは、例えば、ＩｇＧのＦｃ領域に結合することができる活性もしくは機能を意味する。ＩｇＧのＦｃ領域に結合することができる活性もしくは機能は、例えば、ウエスタンブロティング法、後述の実施例に記載の方法などに従って測定することができる。
第１の領域とは、配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域または配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能を有する領域を意味する。
配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能とは、例えば、ＩｇＧのＦｃ領域に結合することができる活性もしくは機能を意味する。ＩｇＧのＦｃ領域に結合することができる活性もしくは機能は、例えば、ウエスタンブロティング法、後述の実施例に記載の方法などに従って測定することができる。
第１の領域としては、より具体的には、例えば（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域；（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性もしくは機能を有する領域などが挙げられる。
本明細書において、「１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列」における「１〜複数個」の範囲は、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個（１〜数個）、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、１個である。欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸の数は、一般的に少ないほど好ましい。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。このような領域は、「モレキュラークローニング第３版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
本明細書において、「１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列」における「１〜複数個」の範囲は、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個（１〜数個）、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、１個である。欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸の数は、一般的に少ないほど好ましい。上記アミノ酸残基の欠失、置換、挿入および付加のうち２種以上が同時に生じてもよい。このような領域は、「モレキュラークローニング第３版」、「カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー」、“Nuc. Acids. Res., 10, 6487 (1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982)”、“Gene, 34, 315 (1985)”、“Nuc. Acids. Res., 13, 4431 (1985)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)”等に記載の部位特異的変異導入法を用いて、取得することができる。
また、第１の領域としては、例えば、（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列と約７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性もしくは機能を有する領域も挙げられる。さらに、第１の領域としては、より具体的には、例えば、配列番号：１のアミノ酸配列と約７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる活性もしくは機能を有する領域が挙げられる。上記同一性の数値は、一般的に大きいほど好ましい。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、ＢＬＡＳＴ（例えば、Altzshul S. F. et al., J. Mol. Biol. 215, 403 (1990)、など参照）やＦＡＳＴＡ（Pearson W. R., Methods in Enzymology 183, 63 (1990)、など参照）等の解析プログラムを用いて決定できる。ＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡを用いる場合は、各プログラムのデフォルトパラメーターを用いる。
さらに、第１の領域には、（ｄ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性もしくは機能を有する領域も含まれる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドについては、後記する。
（第２の領域）
第２の領域とは、配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域または配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能を有する領域を意味する。
配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能とは、例えば、（i）前記領域がセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合することができる機能、（ii）前記領域がセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合して、カルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を意味する。なお、発光の測定は、例えば、Shimomura 0.et al (1988) Biochem. J.251,405-410 およびShimomura 0.et al. Biochem. J. (1989)261, 913-920などに記載の方法によって測定することができる。 具体的には、例えば、酸素存在下、前記領域にセレンテラジンもしくはセレンテラジン誘導体を結合させ、カルシウム溶液を加えることにより発光反応を開始させることができる。さらに、発光測定装置を用いて発光活性または発光パターンを測定することができる。発光測定装置としては、市販されている装置、例えば、AB-2200(アトー社製)、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ９６０（ベルトール社製）などを使用することができる。
第２の領域とは、配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域または配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能を有する領域を意味する。
配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同一の活性もしくは機能とは、例えば、（i）前記領域がセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合することができる機能、（ii）前記領域がセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合して、カルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を意味する。なお、発光の測定は、例えば、Shimomura 0.et al (1988) Biochem. J.251,405-410 およびShimomura 0.et al. Biochem. J. (1989)261, 913-920などに記載の方法によって測定することができる。 具体的には、例えば、酸素存在下、前記領域にセレンテラジンもしくはセレンテラジン誘導体を結合させ、カルシウム溶液を加えることにより発光反応を開始させることができる。さらに、発光測定装置を用いて発光活性または発光パターンを測定することができる。発光測定装置としては、市販されている装置、例えば、AB-2200(アトー社製)、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ９６０（ベルトール社製）などを使用することができる。
第２の領域としては、より具体的には、例えば（ｅ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域；（ｆ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性もしくは機能を有する領域などが挙げられる。ここで、「１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列」における「１〜複数個」の範囲は、例えば、１〜２０個、１〜１５個、１〜１０個、１〜９個、１〜８個、１〜７個、１〜６個（１〜数個）、１〜５個、１〜４個、１〜３個、１〜２個、１個である。欠失、置換、挿入もしくは付加したアミノ酸の数は、一般的に少ないほど好ましい。
また、第２の領域としては、例えば、（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列と約７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性もしくは機能を有する領域も挙げられる。さらに、第２の領域としては、より具体的には、例えば、配列番号：３のアミノ酸配列と約７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、８８％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ（i）セレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合することができる機能、または（ii）セレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合して、カルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域が挙げられる。上記同一性の数値は、一般的に大きいほど好ましい。
さらに、第２の領域には、（ｈ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつ配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域と実質的に同質の活性もしくは機能を有する領域も含まれる。ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドについては、後記する。
２．本発明のポリヌクレオチド
本発明は、前述した本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドも提供する。本発明のポリヌクレオチドとしては、本発明の融合蛋白質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよいが、好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、細胞・組織由来のｃＤＮＡ、細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡなどが挙げられる。ライブラリーに使用するベクターは、特に制限はなく、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織からtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction（以下、RT-PCR法と略称する）によって増幅することもできる。
本発明は、前述した本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドも提供する。本発明のポリヌクレオチドとしては、本発明の融合蛋白質をコードする塩基配列を含有するものであればいかなるものであってもよいが、好ましくはＤＮＡである。ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリー、細胞・組織由来のｃＤＮＡ、細胞・組織由来のｃＤＮＡライブラリー、合成ＤＮＡなどが挙げられる。ライブラリーに使用するベクターは、特に制限はなく、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。また、前記した細胞・組織からtotalＲＮＡまたはｍＲＮＡ画分を調製したものを用いて直接 Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction（以下、RT-PCR法と略称する）によって増幅することもできる。
本発明のポリヌクレオチドには、（１）以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される第１のコード配列：
（ａ）配列番号：２の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｄ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；と、
（２）以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される第２のコード配列：
（ｅ）配列番号：４の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｈ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
とを含有するポリヌクレオチドなどが含まれる。
（ａ）配列番号：２の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｄ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；と、
（２）以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される第２のコード配列：
（ｅ）配列番号：４の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｈ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
とを含有するポリヌクレオチドなどが含まれる。
ここで、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）」とは、配列番号：２または４の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドまたは配列番号：１または３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドの全部または一部をプローブとして、コロニーハイブリダイゼーション法、プラークハイブリダイゼーション法またはサザンハイブリダイゼーション法などを用いることにより得られるポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）をいう。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のポリヌクレオチドを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（Saline-sodium citrate）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ塩化ナトリウム、１５ｍｍｏｌ／Ｌクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドをあげることができる。
ハイブリダイゼーションは、Sambrook J. et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)（以下、モレキュラー・クローニング第３版と略す）、Ausbel F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1〜38, John Wiley and Sons (1987-1997)、Glover D. M. and Hames B. D., DNA Cloning 1: Core Techniques, A practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995)等の実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。
本明細書でいう「ストリンジェントな条件」は、低ストリンジェントな条件、中ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件のいずれでもよい。「低ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％(w/v)SDS、50％(v/v)ホルムアミド、32℃の条件である。また、「中ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％(w/v)SDS、50％(v/v)ホルムアミド、42℃の条件である。「高ストリンジェントな条件」は、例えば、5×SSC、5×デンハルト溶液、0.5(w/v)％SDS、50％(v/v)ホルムアミド、50℃の条件である。条件を厳しくするほど、二本鎖形成に必要とする相補性が高くなる。具体的には、例えば、これらの条件において、温度を上げるほど高い相同性を有するポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）が効率的に得られることが期待できる。ただし、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響する要素としては温度、プローブ濃度、プローブの長さ、イオン強度、時間、塩濃度など複数の要素が考えられ、当業者であればこれら要素を適宜選択することで同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
なお、ハイブリダイゼーションに市販のキットを用いる場合は、例えばAlkphos Direct Labelling Reagents（アマシャムファルマシア社製）を用いることができる。この場合は、キットに添付のプロトコールにしたがい、標識したプローブとのインキュベーションを一晩行った後、メンブレンを55℃の条件下で0.1% (w/v) SDSを含む1次洗浄バッファーで洗浄後、ハイブリダイズしたＤＮＡを検出することができる。
これ以外にハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとしては、FASTA、BLAST等の解析プログラムにより、デフォルトのパラメータを用いて計算したときに、配列番号：１または３のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと約60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上、88％以上、90％以上、92％以上、95％以上、97％以上、98％以上、99％以上、99.3％以上、99.5％以上、99.7％以上、99.8％以上、99.9％以上の同一性を有するDNAをあげることができる。なお、アミノ酸配列や塩基配列の同一性は、前述した方法を用いて決定できる。
あるアミノ酸配列に対して、１もしくは複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列を有する領域をコードするポリヌクレオチドは、部位特異的変異導入法（例えば、Gotoh, T. et al., Gene 152, 271-275 (1995)、Zoller, M.J., and Smith, M., Methods Enzymol. 100, 468-500 (1983)、Kramer, W. et al., Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456 (1984)、Kramer W, and Fritz H.J., Methods. Enzymol. 154, 350-367 (1987)、Kunkel,T.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492 (1985)、Kunkel, Methods Enzymol. 85, 2763-2766 (1988)、など参照）、アンバー変異を利用する方法（例えば、Gapped duplex法、Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456 (1984)、など参照）などを用いることにより得ることができる。
また目的の変異（欠失、付加、置換および／または挿入）を導入した配列をそれぞれの５’端に持つ１組のプライマーを用いたＰＣＲ（例えば、Ho S. N. et al., Gene 77, 51 (1989)、など参照）によっても、ポリヌクレオチドに変異を導入することができる。
また欠失変異体の一種である蛋白質の部分断片をコードするポリヌクレオチドは、その蛋白質をコードするポリヌクレオチド中の作製したい部分断片をコードする領域の５’端の塩基配列と一致する配列を有するオリゴヌクレオチドおよび３’端の塩基配列と相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて、その蛋白質をコードするポリヌクレオチドを鋳型にしたＰＣＲを行うことにより取得できる。
本発明のポリヌクレオチドの具体例としては、例えば、配列番号：５のアミノ酸配列からなる融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドなどがあげられる。配列番号：５に記載のアミノ酸配列からなる融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドとしては、例えば、配列番号：６に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドなどが挙げられる。
本発明のポリヌクレオチドは、翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドおよび／または精製のためのペプチド配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを含んでいてもよい。翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドとしては、当技術分野において用いられている翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを使用することができる。翻訳促進のためのアミノ酸配列としては、前記したものなどが挙げられる。精製のためのペプチド配列をコードするポリヌクレオチドとしては、当技術分野において用いられている精製のためのペプチド配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを使用することができる。精製のためのペプチド配列としては、前記したものなどが挙げられる。
３．本発明の組換えベクターおよび形質転換体
さらに、本発明は、上述した本発明のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび形質転換体を提供する。
さらに、本発明は、上述した本発明のポリヌクレオチドを含有する組換えベクターおよび形質転換体を提供する。
（１）組換えベクターの作製
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を連結(挿入)することにより得ることができる。より具体的には、精製されたポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入して、ベクターに連結することにより得ることができる。本発明のポリヌクレオチドを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、動物ウイルス等が挙げられる。プラスミドとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えばpBR322, pBR325, pUC118, pUC119等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110, pTP5等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13, YEp24, YCp50等)などがあげられる。バクテリオファージとしては、例えば、λファージなどがあげられる。動物ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、昆虫ウイルス（例えば、バキュロウイルスなど）などがあげられる。
本発明の組換えベクターは、適当なベクターに本発明のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を連結(挿入)することにより得ることができる。より具体的には、精製されたポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を適当な制限酵素で切断し、適当なベクターの制限酵素部位またはマルチクローニングサイトに挿入して、ベクターに連結することにより得ることができる。本発明のポリヌクレオチドを挿入するためのベクターは、宿主中で複製可能なものであれば特に限定されず、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、動物ウイルス等が挙げられる。プラスミドとしては、例えば、大腸菌由来のプラスミド（例えばpBR322, pBR325, pUC118, pUC119等）、枯草菌由来のプラスミド（例えばpUB110, pTP5等)、酵母由来のプラスミド（例えばYEp13, YEp24, YCp50等)などがあげられる。バクテリオファージとしては、例えば、λファージなどがあげられる。動物ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、昆虫ウイルス（例えば、バキュロウイルスなど）などがあげられる。
また、本発明においては、pCold Iベクター、pCold IIベクター、pCold IIIベクター、pCold IVベクター（以上、タカラバイオ社製）なども好適に使用することができる。後述の実施例などに具体的に示されているように、これらのベクターを使用して、原核細胞を宿主として発現させた場合、本発明の融合蛋白質を宿主細胞の細胞質中に可溶性タンパク質として産生させることができる。
本発明のポリヌクレオチドは、通常、適当なベクター中のプロモーターの下流に、発現可能なように連結される。用いられるプロモーターとしては、形質転換する際の宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスのプロモーター、メタロチオネインプロモーター、ヒートショックプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが好ましい。宿主がエシェリヒア属菌である場合は、Ｔｒｐプロモーター、Ｔ７プロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーター、ｌｐｐプロモーターなどが好ましい。宿主がバチルス属菌である場合は、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。宿主が酵母である場合は、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬプロモーターなどが好ましい。宿主が昆虫細胞である場合は、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
本発明の組換えベクターには、以上の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、リボソーム結合配列（SD配列）、選択マーカーなどを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子などがあげられる。
また、本発明の組換えベクターは、翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドおよび／または精製のためのペプチド配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを含んでいてもよい。翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドとしては、当技術分野において用いられている翻訳促進のためのアミノ酸配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを使用することができる。翻訳促進のためのアミノ酸配列としては、前記したものなどが挙げられる。精製のためのペプチド配列をコードするポリヌクレオチドとしては、当技術分野において用いられている精製のためのペプチド配列をコードする塩基配列を含有するポリヌクレオチドを使用することができる。精製のためのペプチド配列としては、前記したものなどが挙げられる。
（２）形質転換体の作成
このようにして得られた、本発明のポリヌクレオチド（すなわち、本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド）を含有する組換えベクターを、適当な宿主中に導入することによって、形質転換体を作成することができる。宿主としては、本発明のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を発現できるものであれば特に限定されるものではなく、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、シュードモナス属菌、リゾビウム属菌、酵母、動物細胞または昆虫細胞などがあげられる。エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli）などがあげられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などがあげられる。シュードモナス属菌としては、例えば、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)などがあげられる。リゾビウム属菌としては、例えば、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)などがあげられる。酵母としては、例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)などがあげられる。動物細胞としては、例えば、COS細胞、CHO細胞などがあげられる。昆虫細胞としては、例えば、Sf9、Sf21などがあげられる。
このようにして得られた、本発明のポリヌクレオチド（すなわち、本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド）を含有する組換えベクターを、適当な宿主中に導入することによって、形質転換体を作成することができる。宿主としては、本発明のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）を発現できるものであれば特に限定されるものではなく、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、シュードモナス属菌、リゾビウム属菌、酵母、動物細胞または昆虫細胞などがあげられる。エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli）などがあげられる。バチルス属菌としては、例えば、バチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)などがあげられる。シュードモナス属菌としては、例えば、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)などがあげられる。リゾビウム属菌としては、例えば、リゾビウム・メリロティ(Rhizobium meliloti)などがあげられる。酵母としては、例えば、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)などがあげられる。動物細胞としては、例えば、COS細胞、CHO細胞などがあげられる。昆虫細胞としては、例えば、Sf9、Sf21などがあげられる。
組換えベクターの宿主への導入方法およびこれによる形質転換方法は、一般的な各種方法によって行うことができる。組換えベクターの宿主細胞への導入方法としては、例えば、例えばリン酸カルシウム法（Virology, 52, 456-457 (1973)）、リポフェクション法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)）、エレクトロポレーション法（EMBO J., 1, 841-845 (1982)）などがあげられる。エシェリヒア属菌の形質転換方法としては、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)、Gene, 17, 107 (1982)などに記載の方法などがあげられる。バチルス属菌の形質転換方法としては、例えば、Molecular ＆ General Genetics，168, 111 (1979)に記載の方法などがあげられる。酵母の形質転換方法としては、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,７５,1929 (1978)に記載の方法などがあげられる。動物細胞の形質転換方法としては、例えば、Virology,52, 456 (1973)に記載の方法などがあげられる。昆虫細胞の形質転換方法としては、例えば、Bio/Technology, 6, 47-55 (1988)に記載の方法などがあげられる。このようにして、本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド（本発明のポリヌクレオチド）を含有する組換えベクターで形質転換された形質転換体を得ることができる。
４．本発明の融合蛋白質の製造
また、本発明は、前記形質転換体を培養し、本発明の融合蛋白質を生成させる工程を含む、本発明の融合蛋白質の製造方法を提供する。本発明の融合蛋白質は、前記形質転換体を本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ）が発現可能な条件下で培養し、本発明の融合蛋白質を生成・蓄積させ、分離・精製することによって製造することができる。
また、本発明は、前記形質転換体を培養し、本発明の融合蛋白質を生成させる工程を含む、本発明の融合蛋白質の製造方法を提供する。本発明の融合蛋白質は、前記形質転換体を本発明の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド（ＤＮＡ）が発現可能な条件下で培養し、本発明の融合蛋白質を生成・蓄積させ、分離・精製することによって製造することができる。
（形質転換体の培養）
本発明の形質転換体の培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。該培養によって、形質転換体によって本発明の融合蛋白質が生成され、形質転換体内または培養液中などに本発明の融合蛋白質が蓄積される。
本発明の形質転換体の培養は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。該培養によって、形質転換体によって本発明の融合蛋白質が生成され、形質転換体内または培養液中などに本発明の融合蛋白質が蓄積される。
宿主がエシェリヒア属菌、バチルス属菌である形質転換体を培養する培地としては、該形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行うことができる培地であれば、天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。炭素源としては、グルコース、フラクトース、スクロース、デンプンなどの炭水化物、酢酸、プロピオン酸などの有機酸、エタノール、プロパノール等のアルコール類が用いられる。窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機酸もしくは有機酸のアンモニウム塩またはその他の含窒素化合物のほか、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーなどが用いられる。無機塩類としては、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅、炭酸カルシウムなどが用いられる。培養中は必要に応じてアンピシリンやテトラサイクリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。プロモーターとして誘導性のプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Lacプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)などを、trpプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養するときにはインドールアクリル酸(IAA)などを培地に添加してもよい。
宿主がエシェリヒア属菌の場合、培養は通常約１５〜４３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加える。宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加える。
宿主が酵母である形質転換体を培養する培地としては、たとえばバークホールダー（Burkholder）最小培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4505 (1980)）や０.５％(w/v)カザミノ酸を含有するＳＤ培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 5330 (1984)）があげられる。培地のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する培地としては、たとえば約５〜２０％(v/v)の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地（Science, 122, 501 (1952)），ＤＭＥＭ培地（Virology, 8, 396 (1959)）などが用いられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
宿主が昆虫細胞である形質転換体を培養する培地としては、Grace's Insect Medium（Nature,195,788(1962)）に非働化した１０％(v/v)ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは約６．２〜６．４に調整するのが好ましい。培養は通常約２７℃で約３〜５日間行い、必要に応じて通気や撹拌を加える。
（本発明の融合蛋白質の分離・精製）
上記培養物から、本発明の融合蛋白質を分離・精製することによって、本発明の融合蛋白質を得ることができる。ここで、培養物とは、培養液、培養菌体もしくは培養細胞、または培養菌体もしくは培養細胞の破砕物のいずれをも意味する。本発明の融合蛋白質の分離・精製は、通常の方法に従って行うことができる。
上記培養物から、本発明の融合蛋白質を分離・精製することによって、本発明の融合蛋白質を得ることができる。ここで、培養物とは、培養液、培養菌体もしくは培養細胞、または培養菌体もしくは培養細胞の破砕物のいずれをも意味する。本発明の融合蛋白質の分離・精製は、通常の方法に従って行うことができる。
具体的には、本発明の融合蛋白質が培養菌体内もしくは培養細胞内に蓄積される場合には、培養後、通常の方法（例えば、超音波、リゾチーム、凍結融解など）で菌体もしくは細胞を破砕した後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により本発明の融合蛋白質の粗抽出液を得ることができる。本発明の融合蛋白質がペリプラズムスペース中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば浸透圧ショック法など）により目的蛋白質を含む抽出液を得ることができる。本発明の融合蛋白質が培養液中に蓄積される場合には、培養終了後、通常の方法（例えば、遠心分離、ろ過など）により菌体もしくは細胞と培養上清とを分離することにより、本発明の融合蛋白質を含む培養上清を得ることができる。
このようにして得られた抽出液もしくは培養上清中に含まれる本発明の融合蛋白質の精製は、通常の分離・精製方法に従って行うことができる。分離・精製方法としては、例えば、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相高速液体クロマトグラフィー、透析法、限外ろ過法などを単独で、または適宜組み合わせて用いることができる。本発明の融合蛋白質が上述した精製のためのペプチド配列を含有する場合、これを用いて精製するのが好ましい。具体的には、本発明の融合蛋白質がヒスチジンタグ配列を含有する場合にはニッケルキレートアフィニティークロマト法、Ｓ−トランストランスフェラーゼのグルタチオンへの結合ドメインを含有する場合にはグルタチオン結合ゲルによるアフィニティークロマト法、プロテインＡのアミノ酸の配列を含有する場合には抗体アフィニティークロマト法を用いることができる。
精製した本発明のアポ蛋白質を、還元剤（たとえばメルカプトエタノール、ジチオスレイトールなど）および酸素の存在下、発光基質であるセレンテラジンもしくはその誘導体と低温でインキュベーションすることにより、カルシウムイオン濃度依存的に発光する本発明のホロ蛋白質（発光蛋白質）を調製することができる。
５．本発明の融合蛋白質などの利用
（カルシウムイオンの検出または定量）
上述したように、本発明の融合蛋白質（アポ蛋白質）は、セレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合して、カルシウムイオンの作用によって発光しうるホロ蛋白質（発光蛋白質）を形成することができる。また、本発明のホロ蛋白質は、酸素存在下、カルシウムイオンの作用によって発光しうる複合体（本発明の発光蛋白質）として存在する。よって、本発明の融合蛋白質および本発明のホロ蛋白質は、カルシウムイオンの検出または定量に使用することができる。カルシウムイオンの検出または定量は、カルシウムイオンによる本発明の発光蛋白質の発光を、発光測定装置を用いて測定することにより行うことができる。発光測定装置としては、市販されている装置、例えば、Centro LB９６０（ベルトール社製）などを使用することができる。カルシウムイオン濃度の定量は、ホロ蛋白質を用いて、既知のカルシウムイオン濃度に対する発光標準曲線を作成することにより、測定可能である。
（カルシウムイオンの検出または定量）
上述したように、本発明の融合蛋白質（アポ蛋白質）は、セレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合して、カルシウムイオンの作用によって発光しうるホロ蛋白質（発光蛋白質）を形成することができる。また、本発明のホロ蛋白質は、酸素存在下、カルシウムイオンの作用によって発光しうる複合体（本発明の発光蛋白質）として存在する。よって、本発明の融合蛋白質および本発明のホロ蛋白質は、カルシウムイオンの検出または定量に使用することができる。カルシウムイオンの検出または定量は、カルシウムイオンによる本発明の発光蛋白質の発光を、発光測定装置を用いて測定することにより行うことができる。発光測定装置としては、市販されている装置、例えば、Centro LB９６０（ベルトール社製）などを使用することができる。カルシウムイオン濃度の定量は、ホロ蛋白質を用いて、既知のカルシウムイオン濃度に対する発光標準曲線を作成することにより、測定可能である。
（発光による検出マーカーとしての利用）
本発明の融合蛋白質は、上述のように、カルシウムイオンの作用によって発光しうるホロ蛋白質（発光蛋白質）を形成することができ、かつ、ＩｇＧに結合する機能を有するので、例えば、イムノアッセイにおけるＩｇＧの検出に利用することができる。このようなＩｇＧの検出は、通常の方法によって行うことができる。具体的には、本発明の融合蛋白質をＩｇＧに結合させ、カルシウムイオンによって発光させることによりＩｇＧを検出することができる。また、本発明の融合蛋白質をＩｇＧに結合させた後、酸素存在下、本発明の融合蛋白質をセレンテラジンまたはセレンテラジン誘導体と接触させることにより、本発明の発光蛋白質を形成させ、カルシウムイオンによって発光させてもよい。
本発明の融合蛋白質は、上述のように、カルシウムイオンの作用によって発光しうるホロ蛋白質（発光蛋白質）を形成することができ、かつ、ＩｇＧに結合する機能を有するので、例えば、イムノアッセイにおけるＩｇＧの検出に利用することができる。このようなＩｇＧの検出は、通常の方法によって行うことができる。具体的には、本発明の融合蛋白質をＩｇＧに結合させ、カルシウムイオンによって発光させることによりＩｇＧを検出することができる。また、本発明の融合蛋白質をＩｇＧに結合させた後、酸素存在下、本発明の融合蛋白質をセレンテラジンまたはセレンテラジン誘導体と接触させることにより、本発明の発光蛋白質を形成させ、カルシウムイオンによって発光させてもよい。
６．本発明のキット
本発明は、本発明の融合蛋白質、本発明のホロ蛋白質、本発明のポリヌクレオチド、本発明の組換えベクターおよび本発明の形質転換体から選択されるいずれかを含むキットも提供する。本発明のキットには、さらにセレンテラジンもしくはその誘導体を含んでいてもよい。本発明のキットは、通常用いられる材料および方法で製造することができる。本発明のキットは、例えば、サンプルチューブ、プレート、キット使用者に対する指示書、溶液、バッファー、試薬、標準化のために好適なサンプルまたは対照サンプルを含んでもよい。
本発明は、本発明の融合蛋白質、本発明のホロ蛋白質、本発明のポリヌクレオチド、本発明の組換えベクターおよび本発明の形質転換体から選択されるいずれかを含むキットも提供する。本発明のキットには、さらにセレンテラジンもしくはその誘導体を含んでいてもよい。本発明のキットは、通常用いられる材料および方法で製造することができる。本発明のキットは、例えば、サンプルチューブ、プレート、キット使用者に対する指示書、溶液、バッファー、試薬、標準化のために好適なサンプルまたは対照サンプルを含んでもよい。
本発明のキットは、上述したカルシウムイオンの検出または定量、ＩｇＧの検出または定量などに利用することができる。
発明を実施するための最良の形態及び実施例に特に説明がない場合には、J. Sambrook, E. F. Fritsch & T. Maniatis (Ed.), Molecular cloning, a laboratory manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (2001); F. M. Ausubel, R. Brent, R. E. Kingston, D. D. Moore, J.G. Seidman, J. A. Smith, K. Struhl (Ed.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Ltd.などの標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変した方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
なお、本発明の目的、特徴、利点、及びそのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば、容易に本発明を実施できる。発明を実施するための最良の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をそれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図ならびに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々に修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
参考例１
プロテインＡ−アポイクオリン融合蛋白質の調製は、以下に記載の方法により行った。まず、プロテインＡ−アポイクオリン（以下、アポイクオリンを「アポＡＱ」と略記することがある。）融合蛋白質の発現は、本発明者らが以前に出願した特開平２−１５４６８８号公報（特願昭６３−３０８４２４）記載の発現ベクターおよび発現法を用いて行った。プロテインＡ−アポＡＱ融合蛋白質の精製は、本発明者らの報告論文 Biochem. Biophys. Res. Commun. 171：169-174 (1990) 記載の方法により行った。具体的には、プロテインＡ−アポＡＱ融合蛋白質発現ベクターpAAQ-1は、36残基からなるプロテインＡの分泌シグナル、271残基よりなるプロテインＡのIgG 結合ドメインを含む領域と、アポイクオリン（188残基）からなる融合蛋白質を発現する。大腸菌でのプロテインＡ−アポＡＱ融合蛋白質の発現量は、発光活性から算出したところ、200 ml培養菌体では約8 mgであった。この菌体の粗抽出液からIgG セファロース カラムクロマトグラフ法、セファロース１２ゲルクロマトグラフ法、逆相クロマトグラフ法の組み合わせにより精製したプロテインＡ−アポＡＱ融合蛋白質は、分子量42 Kと 43Kのヘテロな蛋白であった。得られた精製プロテインＡ−アポＡＱ融合蛋白質の純度は95％以上であり、収量は約30マイクログラムであった。実施例３と同様の方法に従い、還元剤存在下に、発光基質セレンテラジンと、４℃で、一昼夜インキュベーションすることにより、プロテインＡ−アポＡＱからプロテインＡ−ＡＱへ再生した。再生効率は95％以上であった。
プロテインＡ−アポイクオリン融合蛋白質の調製は、以下に記載の方法により行った。まず、プロテインＡ−アポイクオリン（以下、アポイクオリンを「アポＡＱ」と略記することがある。）融合蛋白質の発現は、本発明者らが以前に出願した特開平２−１５４６８８号公報（特願昭６３−３０８４２４）記載の発現ベクターおよび発現法を用いて行った。プロテインＡ−アポＡＱ融合蛋白質の精製は、本発明者らの報告論文 Biochem. Biophys. Res. Commun. 171：169-174 (1990) 記載の方法により行った。具体的には、プロテインＡ−アポＡＱ融合蛋白質発現ベクターpAAQ-1は、36残基からなるプロテインＡの分泌シグナル、271残基よりなるプロテインＡのIgG 結合ドメインを含む領域と、アポイクオリン（188残基）からなる融合蛋白質を発現する。大腸菌でのプロテインＡ−アポＡＱ融合蛋白質の発現量は、発光活性から算出したところ、200 ml培養菌体では約8 mgであった。この菌体の粗抽出液からIgG セファロース カラムクロマトグラフ法、セファロース１２ゲルクロマトグラフ法、逆相クロマトグラフ法の組み合わせにより精製したプロテインＡ−アポＡＱ融合蛋白質は、分子量42 Kと 43Kのヘテロな蛋白であった。得られた精製プロテインＡ−アポＡＱ融合蛋白質の純度は95％以上であり、収量は約30マイクログラムであった。実施例３と同様の方法に従い、還元剤存在下に、発光基質セレンテラジンと、４℃で、一昼夜インキュベーションすることにより、プロテインＡ−アポＡＱからプロテインＡ−ＡＱへ再生した。再生効率は95％以上であった。
実施例１ ＺＺ−アポＡＱ融合遺伝子発現ベクターの構築
大腸菌において組換えＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質を発現させるために、ＺＺ遺伝子およびイクオリン遺伝子を以下に記載する方法に従って調製した。IgG結合ドメインであるＺＺドメインをコードする ZZ遺伝子はpEZZ18（アマシャムバイオサイエンス社）から、ＰＣＲ法により調製した。アポイクオリンをコードするイクオリン遺伝子はpAQ440(特開昭61-135586号公報参照)のコーディング領域であるHindIII-EcoRI フラグメントを含むpAM-HEよりPCR法により調製した。発現ベクターとしてpCold II ベクター(タカラバイオ社)を使用した。ＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質発現ベクターの構築法は以下の通りである。
まず、pAM-HEを鋳型として2種のPCRプライマー：
AQ-EcoRI-Met（5' CCGGAATTC-ATG-AAA-CTT-ACA-TCA-GAC-TTC-GAC-AAC 3'（配列番号：７）；EcoRI制限酵素部位はアンダーライン）および
AQ-C-SalI（5' CGCGTCGAC-TTA-GGG-GAC-AGC-TCC-ACC-GTA-GAG-CTT 3'（配列番号：８）；SalI制限酵素部位はアンダーライン）を用いて、PCRキット（タカラバイオ社製）にてPCR（サイクル条件25サイクル；1分／94℃、1分／50℃、1分／72℃）を実施して、所望のイクオリン遺伝子領域を増幅した。得られたDNA断片をPCR精製キット（キアゲン社製）で精製した。前記の精製されたDNA断片を常法により制限酵素EcoRI／SalIにて消化した後、pColdIIの制限酵素EcoRI／SalI部位に連結することによって、発現ベクターpCold-AQを構築した。
一方、pEZZ18を鋳型として2種のPCRプライマー：
6ZZ-N-NdeI（5' CCG CAT ATG GCG CAA CAC GAT GAA GCC GTG 3'（配列番号：９）；NdeI制限酵素部位はアンダーライン）および
7ZZ-C-BamHI（5' GGC GGA TCC CGA GCT CGA ATT TGC GTC TAC 3'（配列番号：１０）；BamHI制限酵素部位はアンダーライン）を用いて、PCRキット（タカラバイオ社製）にてPCR（サイクル条件25サイクル；1分／94℃、1分／50℃、1分／72℃）を実施して、所望のDNA領域を増幅した。得られたDNA断片をPCR精製キット（キアゲン社製）で精製した。前記の精製されたDNA断片を常法により制限酵素NdeI／BamHIにて消化した後、pCold-AQの制限酵素NdeI／BamHI部位に連結することによって、図１に示す発現ベクターpCold-ZZ-AQを構築した。本発現ベクターは、低温で誘導可能なであり、発現したZZ-apoAQは、アミノ末端にヒスチジンダグを有する。
大腸菌において組換えＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質を発現させるために、ＺＺ遺伝子およびイクオリン遺伝子を以下に記載する方法に従って調製した。IgG結合ドメインであるＺＺドメインをコードする ZZ遺伝子はpEZZ18（アマシャムバイオサイエンス社）から、ＰＣＲ法により調製した。アポイクオリンをコードするイクオリン遺伝子はpAQ440(特開昭61-135586号公報参照)のコーディング領域であるHindIII-EcoRI フラグメントを含むpAM-HEよりPCR法により調製した。発現ベクターとしてpCold II ベクター(タカラバイオ社)を使用した。ＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質発現ベクターの構築法は以下の通りである。
まず、pAM-HEを鋳型として2種のPCRプライマー：
AQ-EcoRI-Met（5' CCGGAATTC-ATG-AAA-CTT-ACA-TCA-GAC-TTC-GAC-AAC 3'（配列番号：７）；EcoRI制限酵素部位はアンダーライン）および
AQ-C-SalI（5' CGCGTCGAC-TTA-GGG-GAC-AGC-TCC-ACC-GTA-GAG-CTT 3'（配列番号：８）；SalI制限酵素部位はアンダーライン）を用いて、PCRキット（タカラバイオ社製）にてPCR（サイクル条件25サイクル；1分／94℃、1分／50℃、1分／72℃）を実施して、所望のイクオリン遺伝子領域を増幅した。得られたDNA断片をPCR精製キット（キアゲン社製）で精製した。前記の精製されたDNA断片を常法により制限酵素EcoRI／SalIにて消化した後、pColdIIの制限酵素EcoRI／SalI部位に連結することによって、発現ベクターpCold-AQを構築した。
一方、pEZZ18を鋳型として2種のPCRプライマー：
6ZZ-N-NdeI（5' CCG CAT ATG GCG CAA CAC GAT GAA GCC GTG 3'（配列番号：９）；NdeI制限酵素部位はアンダーライン）および
7ZZ-C-BamHI（5' GGC GGA TCC CGA GCT CGA ATT TGC GTC TAC 3'（配列番号：１０）；BamHI制限酵素部位はアンダーライン）を用いて、PCRキット（タカラバイオ社製）にてPCR（サイクル条件25サイクル；1分／94℃、1分／50℃、1分／72℃）を実施して、所望のDNA領域を増幅した。得られたDNA断片をPCR精製キット（キアゲン社製）で精製した。前記の精製されたDNA断片を常法により制限酵素NdeI／BamHIにて消化した後、pCold-AQの制限酵素NdeI／BamHI部位に連結することによって、図１に示す発現ベクターpCold-ZZ-AQを構築した。本発現ベクターは、低温で誘導可能なであり、発現したZZ-apoAQは、アミノ末端にヒスチジンダグを有する。
実施例２ 組換えＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質の調製法
組換えＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質の調製は、以下に記載するように、組換えＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質を大腸菌で発現させた後、発現された該融合蛋白質を抽出し、抽出した該融合蛋白質を各種クロマトグラフ法を用いて精製することによって行った。
なお、精製過程における融合蛋白質の発光活性の測定は、以下のようにして行った。まず、50mM Tris-HCl (pH7.6)の緩衝液１ml 中で、粗ＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質溶液、2-メルカプトエタノール(1μl)、エタノールに溶解した基質セレンテラジン（1μg／μl）を混合した後、氷上(4℃)で2時間放置することにより発光活性を持つＺＺ−ＡＱ融合蛋白質を調製した。得られたＺＺ−ＡＱ融合蛋白質溶液に50mM CaCl2 100μlを加えることにより発光反応を開始させ、発光測定装置PSN AB2200（アトー社製）で10秒間発光活性の測定を行った。発光活性（最大値（Imax）など）は、相対発光強度（rlu）で評価した。
組換えＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質の調製は、以下に記載するように、組換えＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質を大腸菌で発現させた後、発現された該融合蛋白質を抽出し、抽出した該融合蛋白質を各種クロマトグラフ法を用いて精製することによって行った。
なお、精製過程における融合蛋白質の発光活性の測定は、以下のようにして行った。まず、50mM Tris-HCl (pH7.6)の緩衝液１ml 中で、粗ＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質溶液、2-メルカプトエタノール(1μl)、エタノールに溶解した基質セレンテラジン（1μg／μl）を混合した後、氷上(4℃)で2時間放置することにより発光活性を持つＺＺ−ＡＱ融合蛋白質を調製した。得られたＺＺ−ＡＱ融合蛋白質溶液に50mM CaCl2 100μlを加えることにより発光反応を開始させ、発光測定装置PSN AB2200（アトー社製）で10秒間発光活性の測定を行った。発光活性（最大値（Imax）など）は、相対発光強度（rlu）で評価した。
１） 組換えＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質の大腸菌での発現
実施例１で得た発現ベクターpCold-ZZ-AQをポリエチレングリコール法により大腸菌BL21株に導入し、形質転換株を得た。得られた形質転換株を37℃で18時間培養した。培養後、その形質転換株をアンピシリン（100μg／ml）を含有する10mlのLB液体培地（水1リットルあたり、バクトトリプトン10g、イーストエクストラクト5g、塩化ナトリウム5g、pH7.2）に植菌し、さらに37℃で18時間培養を行った。次いで、その培養菌体液を新たなLB液体培地２リットル（400mlx５本）に添加して、37℃で4.5時間培養した。培養後、その培養菌体液を氷水上で冷却して、イソプロピル-β-Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（IPTG、和光純薬工業社製）を最終濃度0.1mMになるように培養液に添加し、15℃にて17時間培養を行った。培養菌体を、冷却遠心機により５分間、5,000rpm（6000×g）で集菌した。
実施例１で得た発現ベクターpCold-ZZ-AQをポリエチレングリコール法により大腸菌BL21株に導入し、形質転換株を得た。得られた形質転換株を37℃で18時間培養した。培養後、その形質転換株をアンピシリン（100μg／ml）を含有する10mlのLB液体培地（水1リットルあたり、バクトトリプトン10g、イーストエクストラクト5g、塩化ナトリウム5g、pH7.2）に植菌し、さらに37℃で18時間培養を行った。次いで、その培養菌体液を新たなLB液体培地２リットル（400mlx５本）に添加して、37℃で4.5時間培養した。培養後、その培養菌体液を氷水上で冷却して、イソプロピル-β-Ｄ（−）−チオガラクトピラノシド（IPTG、和光純薬工業社製）を最終濃度0.1mMになるように培養液に添加し、15℃にて17時間培養を行った。培養菌体を、冷却遠心機により５分間、5,000rpm（6000×g）で集菌した。
２） 培養菌体からのＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質の抽出
上記１）で集菌した菌体を200 ml（40mlx５本）の50mM Tris-HCl (pH7.6)で懸濁し、氷冷下で超音波破砕処理（ブランソン社製、ソニファイアーモデル250）を各2分間、3回行った。その菌体破砕液を10,000rpm（12,000×g）で20分間遠心分離後、得られた溶解性画分をＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質精製の出発材料とした。
上記１）で集菌した菌体を200 ml（40mlx５本）の50mM Tris-HCl (pH7.6)で懸濁し、氷冷下で超音波破砕処理（ブランソン社製、ソニファイアーモデル250）を各2分間、3回行った。その菌体破砕液を10,000rpm（12,000×g）で20分間遠心分離後、得られた溶解性画分をＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質精製の出発材料とした。
３） Q-セファロースカラムクロマトグラフ法によるＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質の精製
上記２）で得られた溶解性画分（200 ml）を、50mM Tris-HCl (pH7.6)で平衡化したQ-セファロースカラム（アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ：直径2.5×6ｃｍ）に添加して吸着させた後、カラムを250 mlの50mM Tris-HCl (pH7.6)で洗浄した。カラムに吸着した蛋白質を全量100mlで、塩化ナトリウム濃度0〜1.0Mの直線濃度勾配により溶出した。塩化ナトリウム濃度0.45〜0.65Mにて発光活性を有するＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質の溶出が確認された（25 ml;ＺＺ−アポＡＱ活性画分）。
上記２）で得られた溶解性画分（200 ml）を、50mM Tris-HCl (pH7.6)で平衡化したQ-セファロースカラム（アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ：直径2.5×6ｃｍ）に添加して吸着させた後、カラムを250 mlの50mM Tris-HCl (pH7.6)で洗浄した。カラムに吸着した蛋白質を全量100mlで、塩化ナトリウム濃度0〜1.0Mの直線濃度勾配により溶出した。塩化ナトリウム濃度0.45〜0.65Mにて発光活性を有するＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質の溶出が確認された（25 ml;ＺＺ−アポＡＱ活性画分）。
４） ニッケルキレートカラムクロマトグラフ法によるＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質の精製
Q-セファロースカラムから溶出したＺＺ−アポＡＱ活性画分を、50mM Tris-HCl (pH7.6)で平衡化したニッケルキレートカラム（アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ：直径1.5×5cm）に添加してＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質を吸着させた。吸着したＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質を、全量100mlで、イミダゾール濃度0〜0.3M（和光純薬工業社製）の直線濃度勾配により溶出した。イミダゾール濃度0.06〜0.12Mにて、発光活性を有するＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質の溶出が確認された（26 ml;ＺＺ−アポＡＱ活性画分）。
Q-セファロースカラムから溶出したＺＺ−アポＡＱ活性画分を、50mM Tris-HCl (pH7.6)で平衡化したニッケルキレートカラム（アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ：直径1.5×5cm）に添加してＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質を吸着させた。吸着したＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質を、全量100mlで、イミダゾール濃度0〜0.3M（和光純薬工業社製）の直線濃度勾配により溶出した。イミダゾール濃度0.06〜0.12Mにて、発光活性を有するＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質の溶出が確認された（26 ml;ＺＺ−アポＡＱ活性画分）。
５） IgG-セファロースカラムクロマトグラフ法によるＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質の精製
ニッケルキレートカラムから溶出したＺＺ−アポＡＱ活性画分の一部を、アミコンウルトラ-4 遠心フィルターデバイス（分子量１０，０００カット；ミリポア社製）を用いて濃縮した。濃縮した溶液４mlを、IgG-セファロース 6FastFlowカラム（アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ：直径1.5×4cm）に添加して、ＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質を吸着させた。吸着したＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質を、0.5Mの酢酸アンモニウム（pH3.4）（和光純薬工業社製）にて溶出した。
12%SDS-ポリアクリルアミド電気泳動法により、図２に示すように純度は95%以上であることを確認した。
精製の収率を、表１にまとめた。IgG-セファロースクロマトグラフ法により、純度95％以上で7.8mgの精製ＺＺ−アポＡＱを得た。
ニッケルキレートカラムから溶出したＺＺ−アポＡＱ活性画分の一部を、アミコンウルトラ-4 遠心フィルターデバイス（分子量１０，０００カット；ミリポア社製）を用いて濃縮した。濃縮した溶液４mlを、IgG-セファロース 6FastFlowカラム（アマシャムバイオサイエンス社、カラムサイズ：直径1.5×4cm）に添加して、ＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質を吸着させた。吸着したＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質を、0.5Mの酢酸アンモニウム（pH3.4）（和光純薬工業社製）にて溶出した。
12%SDS-ポリアクリルアミド電気泳動法により、図２に示すように純度は95%以上であることを確認した。
精製の収率を、表１にまとめた。IgG-セファロースクロマトグラフ法により、純度95％以上で7.8mgの精製ＺＺ−アポＡＱを得た。
実施例３ ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質の調製法
ＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質からＺＺ−ＡＱ融合蛋白質への変換は、以下の条件で行った。
実施例２で得た精製ＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質（1mg）を10mM DTTおよび、10mM EDTAを含む50mM Tris-HCl (pH7.6) 5mlに溶解し、エタノールに溶解した1.2倍当量のセレンテラジン 24μgを加え、4℃で一昼夜放置し、ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質へと変換した。得られたＺＺ−ＡＱ融合蛋白質は、アミコンウルトラ‐4（分子量10,000カット）で濃縮後、10mM EDTAを含む50mM Tris-HCl (pH7.6) 8ml（２mlで４回）で洗浄し、余剰のセレンテラジンを除いた。活性の回収率95%でＺＺ−ＡＱ融合蛋白質を得た。
ＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質からＺＺ−ＡＱ融合蛋白質への変換は、以下の条件で行った。
実施例２で得た精製ＺＺ−アポＡＱ融合蛋白質（1mg）を10mM DTTおよび、10mM EDTAを含む50mM Tris-HCl (pH7.6) 5mlに溶解し、エタノールに溶解した1.2倍当量のセレンテラジン 24μgを加え、4℃で一昼夜放置し、ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質へと変換した。得られたＺＺ−ＡＱ融合蛋白質は、アミコンウルトラ‐4（分子量10,000カット）で濃縮後、10mM EDTAを含む50mM Tris-HCl (pH7.6) 8ml（２mlで４回）で洗浄し、余剰のセレンテラジンを除いた。活性の回収率95%でＺＺ−ＡＱ融合蛋白質を得た。
実施例４ ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質と天然型イクオリンの発光活性の比較
ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質とイクオリンの発光性能を比較するために、カルシウム添加による発光パターンを比較した。図３に示すように、ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質と、天然型イクオリンの発光パターンを、時間に対する相対発光活性値で比較したところ、同様のパターンを示した。すなわち、ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質において、ＺＺドメインを融合したイクオリン部分は、天然型イクオリンと同様のS／N比を示すことが明らかとなった。
ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質とイクオリンの発光性能を比較するために、カルシウム添加による発光パターンを比較した。図３に示すように、ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質と、天然型イクオリンの発光パターンを、時間に対する相対発光活性値で比較したところ、同様のパターンを示した。すなわち、ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質において、ＺＺドメインを融合したイクオリン部分は、天然型イクオリンと同様のS／N比を示すことが明らかとなった。
実施例５ ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質の、蛋白質量と発光量との直線性
ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質を検出用プローブとして使用するためには、蛋白量と発光量とが直線性を示すことが必要である。ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質の濃度を１ピコグラムから1ナノグラムとして、50mM CaCl2 100μlを注入し、発光測定装置PSN AB2200（アトー社製）で発光を測定した。発光活性の最大値（Imax）と蛋白質濃度の相関を図４に示した。発光強度とＺＺ−ＡＱ融合蛋白質との間に直線性の相関が認められた。この結果から、ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質の蛋白質量を、発光によって定量することが可能であることが示された。
ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質を検出用プローブとして使用するためには、蛋白量と発光量とが直線性を示すことが必要である。ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質の濃度を１ピコグラムから1ナノグラムとして、50mM CaCl2 100μlを注入し、発光測定装置PSN AB2200（アトー社製）で発光を測定した。発光活性の最大値（Imax）と蛋白質濃度の相関を図４に示した。発光強度とＺＺ−ＡＱ融合蛋白質との間に直線性の相関が認められた。この結果から、ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質の蛋白質量を、発光によって定量することが可能であることが示された。
実施例６ ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質およびプロテインＡ−ＡＱ融合蛋白質を用いたヒト ＩｇＧの検出法
１） ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質を用いたヒト ＩｇＧの検出法
ヒト ＩｇＧ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ社製）を５０ｍＭ 炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）にて希釈し、５μｇ／ｍｌに調製した。得られた５μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ溶液を、９６マイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ製、＃４３７７９６）に１００μｌ／ウェル分注し、４℃にて一晩静置して、プレートをヒトＩｇＧでコートした。静置後、プレートからヒトＩｇＧ溶液を除去した。次に、１５ｍＭ ＮａＣｌを含む２ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）（以下ＴＢＳと記載）を３４０μｌ／ウェル分注し、前記プレートを洗浄した後、ＴＢＳを除去した。前記洗浄操作を更に２回繰り返して前記プレートを洗浄した。洗浄後、１％牛血清アルブミン（生化学工業社製、以下ＢＳＡと記載）を含有したＴＢＳを３００μｌ／ウェル分注し、３７℃で１時間静置した。前記１％ＢＳＡ含有ＴＢＳを除去後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（バイオラッド社製）、２ｍＭ ＥＤＴＡ（和光純薬社製）含有ＴＢＳ（以下ＴＢＳＴ−Ｅと記載）を３４０μｌ／ウェル分注して前記プレートを洗浄した後、前記ＴＢＳＴ−Ｅを除去した。前記洗浄操作を更に２回繰り返してプレートを洗浄した。洗浄後、０．１％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＴＢＳにて０．２、２、２０、２００ｎｇ／ｍｌに希釈調製したＺＺ−ＡＱ融合蛋白質（実施例３で得られたもの）を１００μｌ／ウェル分注し、３７℃で３０分静置した。静置後、ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質溶液を除去した。次に、プレートにＴＢＳＴ−Ｅを ３４０μｌ／ウェル分注して洗浄した後、前記ＴＢＳＴ−Ｅを除去した。前記洗浄操作を更に２回繰り返してプレートを洗浄した。洗浄後、９６マイクロウェルプレートに５０ｍＭ ＣａＣｌ2を含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を１００μｌ／ウェル 注入して、発光プレートリーダーＣｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製）を用いて発光強度を５秒間測定した。発光強度は、最大発光強度値（Ｉｍａｘ）で評価した。
１） ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質を用いたヒト ＩｇＧの検出法
ヒト ＩｇＧ（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ社製）を５０ｍＭ 炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）にて希釈し、５μｇ／ｍｌに調製した。得られた５μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ溶液を、９６マイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ製、＃４３７７９６）に１００μｌ／ウェル分注し、４℃にて一晩静置して、プレートをヒトＩｇＧでコートした。静置後、プレートからヒトＩｇＧ溶液を除去した。次に、１５ｍＭ ＮａＣｌを含む２ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）（以下ＴＢＳと記載）を３４０μｌ／ウェル分注し、前記プレートを洗浄した後、ＴＢＳを除去した。前記洗浄操作を更に２回繰り返して前記プレートを洗浄した。洗浄後、１％牛血清アルブミン（生化学工業社製、以下ＢＳＡと記載）を含有したＴＢＳを３００μｌ／ウェル分注し、３７℃で１時間静置した。前記１％ＢＳＡ含有ＴＢＳを除去後、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２０（バイオラッド社製）、２ｍＭ ＥＤＴＡ（和光純薬社製）含有ＴＢＳ（以下ＴＢＳＴ−Ｅと記載）を３４０μｌ／ウェル分注して前記プレートを洗浄した後、前記ＴＢＳＴ−Ｅを除去した。前記洗浄操作を更に２回繰り返してプレートを洗浄した。洗浄後、０．１％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＴＢＳにて０．２、２、２０、２００ｎｇ／ｍｌに希釈調製したＺＺ−ＡＱ融合蛋白質（実施例３で得られたもの）を１００μｌ／ウェル分注し、３７℃で３０分静置した。静置後、ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質溶液を除去した。次に、プレートにＴＢＳＴ−Ｅを ３４０μｌ／ウェル分注して洗浄した後、前記ＴＢＳＴ−Ｅを除去した。前記洗浄操作を更に２回繰り返してプレートを洗浄した。洗浄後、９６マイクロウェルプレートに５０ｍＭ ＣａＣｌ2を含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を１００μｌ／ウェル 注入して、発光プレートリーダーＣｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ社製）を用いて発光強度を５秒間測定した。発光強度は、最大発光強度値（Ｉｍａｘ）で評価した。
２） プロテインＡ−ＡＱ融合蛋白質を用いたヒトＩｇＧの検出法
ヒト ＩｇＧを５０ｍＭ 炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）にて希釈し、５μｇ／ｍｌに調製した。得られた５μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ溶液を、９６マイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ製、＃４３７７９６）に１００μｌ／ウェル分注し、４℃にて一晩静置して、プレートをヒトＩｇＧでコートした。静置後、プレートからヒトＩｇＧ溶液を除去した。次に、ＴＢＳを３４０μｌ／ウェル分注し、前記プレートを洗浄した後、ＴＢＳを除去した。前記洗浄操作を更に２回繰り返して前記プレートを洗浄した。洗浄後、前記プレートに、１％ＢＳＡを含有したＴＢＳを３００μｌ／ウェル分注し、３７℃で１時間静置した。前記１％ＢＳＡ含有ＴＢＳを除去後、ＴＢＳＴ−Ｅを ３４０μｌ／ウェル分注して前記プレートを洗浄した後、前記ＴＢＳＴ−Ｅを除去した。前記洗浄操作を更に２回繰り返してプレートを洗浄した。洗浄後、０．１％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＴＢＳにて０．２、２、２０、２００ｎｇ／ｍｌに希釈調製したプロテインＡ−ＡＱ融合蛋白質（参考例１で得られたもの）を１００μｌ／ウェル分注し、３７℃で３０分静置した。静置後、プロテインＡ−ＡＱ融合蛋白質溶液を除去した。次に、プレートにＴＢＳＴ−Ｅを ３４０μｌ／ウェル分注して洗浄した後、前記ＴＢＳＴ−Ｅを除去した。前記洗浄操作を更に２回繰り返してプレートを洗浄した。洗浄後、前記プレートに５０ｍＭ ＣａＣｌ2を含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を１００μｌ／ウェル注入して、発光プレートリーダーＣｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０を用いて発光強度を５秒間測定した。発光強度は、最大発光強度値（Ｉｍａｘ）で評価した。
ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質とプロテインＡ−ＡＱ融合蛋白質の測定結果を図５に示した。プロテインＡ−ＡＱ融合蛋白質は１０ｎｇ／ｍｌで発光強度が一定に達したのに対し、ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質は２００ｎｇ／ｍｌまで発光強度の上昇が確認された。これはＺＺ−ＡＱ融合蛋白質のＩｇＧへの結合がＰｒｏｔｅｉｎ Ａ−ＡＱ融合蛋白質の場合より強いことを示唆している。さらに、発光強度の比較からＺＺ−ＡＱ融合蛋白質によるＩｇＧの結合力はＰｒｏｔｅｉｎ Ａ−ＡＱの約５倍であることも明らかとなった。以上の結果から、ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質を使用した場合の方が、プロテインＡ−ＡＱ融合蛋白質を使用した場合よりも、ＩｇＧの検出感度が高いことが明らかとなった。
ヒト ＩｇＧを５０ｍＭ 炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）にて希釈し、５μｇ／ｍｌに調製した。得られた５μｇ／ｍｌのヒトＩｇＧ溶液を、９６マイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ製、＃４３７７９６）に１００μｌ／ウェル分注し、４℃にて一晩静置して、プレートをヒトＩｇＧでコートした。静置後、プレートからヒトＩｇＧ溶液を除去した。次に、ＴＢＳを３４０μｌ／ウェル分注し、前記プレートを洗浄した後、ＴＢＳを除去した。前記洗浄操作を更に２回繰り返して前記プレートを洗浄した。洗浄後、前記プレートに、１％ＢＳＡを含有したＴＢＳを３００μｌ／ウェル分注し、３７℃で１時間静置した。前記１％ＢＳＡ含有ＴＢＳを除去後、ＴＢＳＴ−Ｅを ３４０μｌ／ウェル分注して前記プレートを洗浄した後、前記ＴＢＳＴ−Ｅを除去した。前記洗浄操作を更に２回繰り返してプレートを洗浄した。洗浄後、０．１％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＴＢＳにて０．２、２、２０、２００ｎｇ／ｍｌに希釈調製したプロテインＡ−ＡＱ融合蛋白質（参考例１で得られたもの）を１００μｌ／ウェル分注し、３７℃で３０分静置した。静置後、プロテインＡ−ＡＱ融合蛋白質溶液を除去した。次に、プレートにＴＢＳＴ−Ｅを ３４０μｌ／ウェル分注して洗浄した後、前記ＴＢＳＴ−Ｅを除去した。前記洗浄操作を更に２回繰り返してプレートを洗浄した。洗浄後、前記プレートに５０ｍＭ ＣａＣｌ2を含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を１００μｌ／ウェル注入して、発光プレートリーダーＣｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０を用いて発光強度を５秒間測定した。発光強度は、最大発光強度値（Ｉｍａｘ）で評価した。
ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質とプロテインＡ−ＡＱ融合蛋白質の測定結果を図５に示した。プロテインＡ−ＡＱ融合蛋白質は１０ｎｇ／ｍｌで発光強度が一定に達したのに対し、ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質は２００ｎｇ／ｍｌまで発光強度の上昇が確認された。これはＺＺ−ＡＱ融合蛋白質のＩｇＧへの結合がＰｒｏｔｅｉｎ Ａ−ＡＱ融合蛋白質の場合より強いことを示唆している。さらに、発光強度の比較からＺＺ−ＡＱ融合蛋白質によるＩｇＧの結合力はＰｒｏｔｅｉｎ Ａ−ＡＱの約５倍であることも明らかとなった。以上の結果から、ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質を使用した場合の方が、プロテインＡ−ＡＱ融合蛋白質を使用した場合よりも、ＩｇＧの検出感度が高いことが明らかとなった。
実施例７ ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質を使用した場合のＩｇＧの検出限界
実施例６のＺＺ−ＡＱ融合蛋白質を用いたＩｇＧ検出法において、0.1ng/mlから100 ng/mlのＩｇＧ溶液を用いてその検出限界を測定した。その結果、直線性から判断して、ＩｇＧの検出限界は、0.1ng/ml以下であることが明らかとなった (図６)。この結果は、ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質のIgG測定可能な最低濃度は、アッセイ当たり１ng/ml以下であることを示している。以上の結果から、ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質を使用した場合には、プロテインＡとイクオリンの融合蛋白質を用いた場合（ＩｇＧの測定可能な最低濃度は20 ng/ml；Biochem. Biophys. Res. Commun. (1990) 171: 169-174）、およびＺＺドメインとオベリンとの融合蛋白質を用いた場合（ＩｇＧの測定可能な最低濃度は10 ng／ml；Biochem. Biophys. Res. Commun. (1996) 219: 475-479）に比べて、１０〜２０倍以上の感度でＩｇＧを検出できることが明らかとなった。
実施例６のＺＺ−ＡＱ融合蛋白質を用いたＩｇＧ検出法において、0.1ng/mlから100 ng/mlのＩｇＧ溶液を用いてその検出限界を測定した。その結果、直線性から判断して、ＩｇＧの検出限界は、0.1ng/ml以下であることが明らかとなった (図６)。この結果は、ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質のIgG測定可能な最低濃度は、アッセイ当たり１ng/ml以下であることを示している。以上の結果から、ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質を使用した場合には、プロテインＡとイクオリンの融合蛋白質を用いた場合（ＩｇＧの測定可能な最低濃度は20 ng/ml；Biochem. Biophys. Res. Commun. (1990) 171: 169-174）、およびＺＺドメインとオベリンとの融合蛋白質を用いた場合（ＩｇＧの測定可能な最低濃度は10 ng／ml；Biochem. Biophys. Res. Commun. (1996) 219: 475-479）に比べて、１０〜２０倍以上の感度でＩｇＧを検出できることが明らかとなった。
実施例８ ＺＺ−ＡＱ融合蛋白質を用いた競合法によるビオチンの定量法
ビオチン化BSA（シグマ社製）を５０ｍＭ 炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）にて希釈し、５μｇ／ｍｌに調製した。得られた５μｇ／ｍｌのビオチン化BSA溶液を、９６マイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ製、＃４３７７９６）に１００μｌ／ウェル分注し、４℃にて一晩静置して、プレートをビオチン化BSAでコートした。静置後、前記プレートからビオチン化BSA溶液を除去した。次に、前記プレートにＴＢＳを３４０μｌ／ウェル分注し、プレートを洗浄した後、前記プレートからＴＢＳを除去した。前記洗浄操作を更に２回繰り返した。洗浄後、前記プレートに、１％ＢＳＡを含有するＴＢＳを３００μｌ／ウェル分注し、３７℃で１時間静置した。前記プレートから１％ＢＳＡ含有ＴＢＳを除去した後、ＴＢＳＴ−Ｅを ３４０μｌ／ウェル分注してプレートを洗浄した後、ＴＢＳＴ−Ｅを除去した。前記洗浄操作を更に２回繰り返した。洗浄後、０.１％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有したＴＢＳにて、８ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌに希釈調製したビオチン溶液５０μｌ、または、１０ｎｇ／ｍｌから１００００ｎｇ／ｍｌに希釈調製したビオシチン（ビオチンのアナログの一種）溶液５０μｌと抗ビオチンモノクローナル抗体溶液（シグマ社製、１２０００倍希釈溶液を使用）５０μｌを順次添加し、２５℃で２時間静置した。静置後、反応液を除去し、ＴＢＳＴ−Ｅを ３４０μｌ／ウェル分注してプレートを洗浄した後、ＴＢＳＴ−Ｅを除去した。前記洗浄操作を更に２回繰り返した。次に、前記プレートにＺＺ−ＡＱ融合蛋白質（２５０ｎｇ／ｍｌ）１００μｌを加え、２５℃で１時間静置した。静置後、反応液を除去し、ＴＢＳＴ−Ｅを ３４０μｌ／ウェル分注してプレートを洗浄した後、ＴＢＳＴ−Ｅを除去した。前記洗浄操作を更に２回繰り返してプレートを洗浄した。洗浄したプレートに、５０ｍＭ ＣａＣｌ2を含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を１００μｌ／ウェル注入して、発光プレートリーダーＣｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０にて発光強度を５秒間測定した。発光強度は、最大発光強度値（Ｉｍａｘ）で評価した。その結果を図７に示した。この結果は、ＺＺ−ＡＱ融合タンパク質によって、ビオチンまたはビオシチンに結合している抗ビオチンモノクローナル抗体が定量的に検出されたことを示している。すなわち、遊離ビオチン（または遊離ビオシチン）と固定化したビオチンとの間の、抗ビオチンモノクローナル抗体への結合の競合反応を利用することにより、遊離ビオチンまたは遊離ビオシチンの定量が可能であることが明らかとなった。
ビオチン化BSA（シグマ社製）を５０ｍＭ 炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）にて希釈し、５μｇ／ｍｌに調製した。得られた５μｇ／ｍｌのビオチン化BSA溶液を、９６マイクロウェルプレート（Ｎｕｎｃ製、＃４３７７９６）に１００μｌ／ウェル分注し、４℃にて一晩静置して、プレートをビオチン化BSAでコートした。静置後、前記プレートからビオチン化BSA溶液を除去した。次に、前記プレートにＴＢＳを３４０μｌ／ウェル分注し、プレートを洗浄した後、前記プレートからＴＢＳを除去した。前記洗浄操作を更に２回繰り返した。洗浄後、前記プレートに、１％ＢＳＡを含有するＴＢＳを３００μｌ／ウェル分注し、３７℃で１時間静置した。前記プレートから１％ＢＳＡ含有ＴＢＳを除去した後、ＴＢＳＴ−Ｅを ３４０μｌ／ウェル分注してプレートを洗浄した後、ＴＢＳＴ−Ｅを除去した。前記洗浄操作を更に２回繰り返した。洗浄後、０.１％ＢＳＡ、２ｍＭ ＥＤＴＡを含有したＴＢＳにて、８ｎｇ／ｍｌから１０００ｎｇ／ｍｌに希釈調製したビオチン溶液５０μｌ、または、１０ｎｇ／ｍｌから１００００ｎｇ／ｍｌに希釈調製したビオシチン（ビオチンのアナログの一種）溶液５０μｌと抗ビオチンモノクローナル抗体溶液（シグマ社製、１２０００倍希釈溶液を使用）５０μｌを順次添加し、２５℃で２時間静置した。静置後、反応液を除去し、ＴＢＳＴ−Ｅを ３４０μｌ／ウェル分注してプレートを洗浄した後、ＴＢＳＴ−Ｅを除去した。前記洗浄操作を更に２回繰り返した。次に、前記プレートにＺＺ−ＡＱ融合蛋白質（２５０ｎｇ／ｍｌ）１００μｌを加え、２５℃で１時間静置した。静置後、反応液を除去し、ＴＢＳＴ−Ｅを ３４０μｌ／ウェル分注してプレートを洗浄した後、ＴＢＳＴ−Ｅを除去した。前記洗浄操作を更に２回繰り返してプレートを洗浄した。洗浄したプレートに、５０ｍＭ ＣａＣｌ2を含有する５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）を１００μｌ／ウェル注入して、発光プレートリーダーＣｅｎｔｒｏ ＬＢ９６０にて発光強度を５秒間測定した。発光強度は、最大発光強度値（Ｉｍａｘ）で評価した。その結果を図７に示した。この結果は、ＺＺ−ＡＱ融合タンパク質によって、ビオチンまたはビオシチンに結合している抗ビオチンモノクローナル抗体が定量的に検出されたことを示している。すなわち、遊離ビオチン（または遊離ビオシチン）と固定化したビオチンとの間の、抗ビオチンモノクローナル抗体への結合の競合反応を利用することにより、遊離ビオチンまたは遊離ビオシチンの定量が可能であることが明らかとなった。
本発明の融合蛋白質は、発光基質であるセレンテラジンと接触させることによって、容易に本発明の融合蛋白質とセレンテラジンのペルオキシドを含有するホロ蛋白質を形成することができる。本発明のホロ蛋白質は、セレンテラジンと酸素の存在下において、本発明の融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシドとが複合体を形成した状態で存在する。前記複合体にカルシウムイオンが結合すると、瞬間的な発光を示す。したがって、本発明の融合蛋白質、本発明のホロ蛋白質などは、カルシウムイオンの検出または測定に好適に利用することができる。
また、本発明の融合蛋白質は、ＩｇＧとの高い結合能力を有している。そして、上述のように、本発明の融合蛋白質と発光基質であるセレンテラジンのペルオキシドとからなるホロ蛋白質は、カルシウムイオンによって発光させることができる。したがって、本発明の融合蛋白質、本発明のホロ蛋白質などは、ＩｇＧの検出に好適に利用することができる。
また、本発明の融合蛋白質は、ＩｇＧとの高い結合能力を有している。そして、上述のように、本発明の融合蛋白質と発光基質であるセレンテラジンのペルオキシドとからなるホロ蛋白質は、カルシウムイオンによって発光させることができる。したがって、本発明の融合蛋白質、本発明のホロ蛋白質などは、ＩｇＧの検出に好適に利用することができる。
［配列番号：１］ＺＺドメインのアミノ酸配列を示す。
［配列番号：２］配列番号：１で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：３］アポイクオリンのアミノ酸配列を示す。
［配列番号：４］配列番号：３で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：５］実施例１で作製した発現ベクターｐＣｏｌｄ−ＺＺ−ＡＱに挿入された、ＺＺ−アポイクオリン融合蛋白質をコードするＤＮＡにコードされている、ＺＺ−アポイクオリン融合蛋白質のアミノ酸配列を示す。
［配列番号：６］実施例１で作製した発現ベクターｐＣｏｌｄ−ＺＺ−ＡＱに挿入された、ＺＺ−アポイクオリン融合蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：７］実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：８］実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：９］実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：１０］実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：２］配列番号：１で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：３］アポイクオリンのアミノ酸配列を示す。
［配列番号：４］配列番号：３で表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：５］実施例１で作製した発現ベクターｐＣｏｌｄ−ＺＺ−ＡＱに挿入された、ＺＺ−アポイクオリン融合蛋白質をコードするＤＮＡにコードされている、ＺＺ−アポイクオリン融合蛋白質のアミノ酸配列を示す。
［配列番号：６］実施例１で作製した発現ベクターｐＣｏｌｄ−ＺＺ−ＡＱに挿入された、ＺＺ−アポイクオリン融合蛋白質をコードするＤＮＡの塩基配列を示す。
［配列番号：７］実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：８］実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：９］実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
［配列番号：１０］実施例１で用いられたプライマーの塩基配列を示す。
Claims (17)
- （１）以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される第１の領域：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、および
（ｄ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域；と、
（２）以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される第２の領域：
（ｅ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域、
（ｆ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列に対して７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、および
（ｈ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域；と、
を含有する融合蛋白質。 - （１）第１の領域が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群：
（ａ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域、
（ｂ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域、および
（ｄ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域；
から選択され、
（２）第２の領域が、以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群：
（ｅ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域、
（ｆ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域、および
（ｈ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域；
から選択される、請求項１記載の融合蛋白質。 - （１）配列番号：１で表される第１のアミノ酸配列からなる領域と、
（２）配列番号：３で表される第２のアミノ酸配列からなる領域
とを含有する融合蛋白質。 - さらに、翻訳促進のためのアミノ酸配列および／または精製のためのアミノ酸配列を含有する、請求項１〜３のいずれかに記載の融合蛋白質。
- 配列番号：５のアミノ酸配列からなる融合蛋白質。
- 請求項１〜５のいずれかに記載の融合蛋白質と、セレンテラジンのペルオキシドまたはセレンテラジン誘導体のペルオキシドとからなるホロ蛋白質。
- 請求項１〜５のいずれかに記載の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
- （１）以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群から選択される第１のコード配列：
（ａ）配列番号：２の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｄ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；と、
（２）以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群から選択される第２のコード配列：
（ｅ）配列番号：４の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｈ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
とを含有するポリヌクレオチド。 - （１）第１のコード配列が、以下の（ａ）〜（ｄ）からなる群：
（ａ）配列番号：２の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：２の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：１のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｄ）配列番号：１のアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＩｇＧのＦｃ領域と結合することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；から選択され、
（２）第２のコード配列が、以下の（ｅ）〜（ｈ）からなる群：
（ｅ）配列番号：４の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｆ）配列番号：４の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、
（ｇ）配列番号：３のアミノ酸配列からなる領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド、および
（ｈ）配列番号：３のアミノ酸配列において１〜複数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつセレンテラジンのペルオキシドもしくはセレンテラジン誘導体のペルオキシドと結合してカルシウムイオンの作用によって発光するホロ蛋白質を形成することができる機能を有する領域をコードするポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド；
から選択される、請求項８に記載のポリヌクレオチド。 - 配列番号：６の塩基配列からなるポリヌクレオチドを含有するポリヌクレオチド。
- 請求項７〜１０のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含有する組換えベクター。
- 請求項１０記載の組換えベクターが導入された形質転換体。
- 請求項１２記載の形質転換体を培養し、請求項１〜５のいずれかに記載の融合蛋白質を生成させる工程を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の融合蛋白質の製造方法。
- 請求項１〜５のいずれかに記載の融合蛋白質または請求項６に記載のホロ蛋白質を含むキット。
- 請求項１〜５のいずれかに記載の融合蛋白質または請求項６に記載のホロ蛋白質を含むイムノアッセイ用キット。
- 請求項１〜５のいずれかに記載の融合蛋白質または請求項６に記載のホロ蛋白質を使用してカルシウムイオンを検出または定量する方法。
- 請求項１〜５のいずれかに記載の融合蛋白質または請求項６に記載のホロ蛋白質を用いたイムノアッセイ法。
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