JPH02154688A - 特異的結合能を有するタンパク質と融合したエクオリン及びその製造法 - Google Patents
特異的結合能を有するタンパク質と融合したエクオリン及びその製造法Info
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- JPH02154688A JPH02154688A JP30842488A JP30842488A JPH02154688A JP H02154688 A JPH02154688 A JP H02154688A JP 30842488 A JP30842488 A JP 30842488A JP 30842488 A JP30842488 A JP 30842488A JP H02154688 A JPH02154688 A JP H02154688A
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
［技術の分野］
本発明は、特異的結合能を有するタンパク質の遺伝子と
融合したエクオリン遺伝子及びその製造法、並びに特異
的結合能を有するタンパク質と融合したエクオリン及び
その製造法に関する。
融合したエクオリン遺伝子及びその製造法、並びに特異
的結合能を有するタンパク質と融合したエクオリン及び
その製造法に関する。
［従来の技術とその問題点］
発光蛋白エクオリンは、米国ワシントン州フライデーハ
ーバ−島近郊の海洋に生息する発光オワンクラゲより単
離されたカルシウム結合タンパク質である。エクオリン
は、自然界においてはタンパク質部分の７ボエクオリン
と、基質部分であるセレンテラジンが、分子状酸素を介
して複合体を形成しており、この複合体にカルシウムが
結合することにより発光することを特徴とする。この発
光を利用してカルシウム濃度を測定することができる。
ーバ−島近郊の海洋に生息する発光オワンクラゲより単
離されたカルシウム結合タンパク質である。エクオリン
は、自然界においてはタンパク質部分の７ボエクオリン
と、基質部分であるセレンテラジンが、分子状酸素を介
して複合体を形成しており、この複合体にカルシウムが
結合することにより発光することを特徴とする。この発
光を利用してカルシウム濃度を測定することができる。
本発明者は組換えＤＮＡの手法を用いて、発光オワンク
ラゲより７ボエクオリンのｃＤＮＡをクローニングし、
その１次構造を決定した（特開昭８１−１３５．５８８
） 、次いで、このｃ［ｌＮＡを用いて大腸菌を宿主
とし、その菌体内及び菌体外でのアポエクオリンの生産
に成功した（特開昭８２−１７１，８９５．８３−１０
２．８９５ ） さらに、機能遺伝子と結合したエクオリン遺伝子を作成
し、その融合タンパク質の生産に成功した（特願昭６２
−１９８，０３１ ） 、またエクオリンの発光を利用
した金属の検出方法を開発した（特願昭８１−１０３，
８４９） 、該発明は特異的結合タンパク質と融合した
エクオリンを用いた検出技術への応用を実証した報告で
ある。
ラゲより７ボエクオリンのｃＤＮＡをクローニングし、
その１次構造を決定した（特開昭８１−１３５．５８８
） 、次いで、このｃ［ｌＮＡを用いて大腸菌を宿主
とし、その菌体内及び菌体外でのアポエクオリンの生産
に成功した（特開昭８２−１７１，８９５．８３−１０
２．８９５ ） さらに、機能遺伝子と結合したエクオリン遺伝子を作成
し、その融合タンパク質の生産に成功した（特願昭６２
−１９８，０３１ ） 、またエクオリンの発光を利用
した金属の検出方法を開発した（特願昭８１−１０３，
８４９） 、該発明は特異的結合タンパク質と融合した
エクオリンを用いた検出技術への応用を実証した報告で
ある。
ところで、エクオリンの有用性は当業者に予測され得る
処であり、エクオリンを特異的結合タンパク質を介して
標的物に結合せしめることにより、標的物を特異的に発
光で検出することができる。ここで、特異的結合とは抗
原抗体反応、酵素反応、レセプターへの特異的結合、核
酸とタンパク質の特異的結合等を利用した結合である。
処であり、エクオリンを特異的結合タンパク質を介して
標的物に結合せしめることにより、標的物を特異的に発
光で検出することができる。ここで、特異的結合とは抗
原抗体反応、酵素反応、レセプターへの特異的結合、核
酸とタンパク質の特異的結合等を利用した結合である。
そして、特異的結合能を有するタンパク質と融合したエ
クオリンは、上述した機部から診断薬等の検査薬として
有用であることは自明である。
クオリンは、上述した機部から診断薬等の検査薬として
有用であることは自明である。
本発明者は上述の技術的事情にかんがみ、研究の結果、
組換えＤＮＡの手法により抗体結合能を有するタンパク
質と融合したエクオリンの製造を可能にすることができ
た０以上の説明から明らかなように、本発明の目的はエ
クオリン活性を保持した特異的結合能を有するタンパク
質と融合したエクオリンとその応用物または応用方法を
提供することである。
組換えＤＮＡの手法により抗体結合能を有するタンパク
質と融合したエクオリンの製造を可能にすることができ
た０以上の説明から明らかなように、本発明の目的はエ
クオリン活性を保持した特異的結合能を有するタンパク
質と融合したエクオリンとその応用物または応用方法を
提供することである。
［問題を解決するための手段］
本発明（２発明）は、それぞれ下記（１）〜（４）の構
成を有する。
成を有する。
（１）組換えＤＮＡの手法を用いることを特徴とする特
異的結合能を有するタンパク質の遺伝子とエクオリン遺
伝子の融合遺伝子の製造法。
異的結合能を有するタンパク質の遺伝子とエクオリン遺
伝子の融合遺伝子の製造法。
（２）前記第１項に記載の製造法により生産されてなる
特異的結合能を有するタンパク質の遺伝子とエクオリン
遺伝子の融合遺伝子。
特異的結合能を有するタンパク質の遺伝子とエクオリン
遺伝子の融合遺伝子。
（３）組換えＤＮＡの手法を用いることを特徴とする特
異的結合能を有するタンパク質とエクオリンの融合タン
パク質の製造法。
異的結合能を有するタンパク質とエクオリンの融合タン
パク質の製造法。
（４）前記第３項に記載の製造法により生産されてなる
特異的結合能を有するタンパク質とエクオリンの融合タ
ンパク質。
特異的結合能を有するタンパク質とエクオリンの融合タ
ンパク質。
本発明の構成と効果につき以下に詳述する０本発明はエ
クオリン活性を保持した特異的結合能を有するタンパク
質と融合したエクオリン及びその製造法によるものであ
り、例えば後述の実施例に示す方法で行うことができる
。
クオリン活性を保持した特異的結合能を有するタンパク
質と融合したエクオリン及びその製造法によるものであ
り、例えば後述の実施例に示す方法で行うことができる
。
本発明を添付図面によって説明すると第１図はプロティ
ンＡと融合したエクオリンの発現ベクターの構築工程を
示す。
ンＡと融合したエクオリンの発現ベクターの構築工程を
示す。
すなわち、エクオリン発現ベクターｐｉＰＨＥ （特
開昭８３−１０２，８９５ ）からＥｃｏＲＩ消化によ
りエクオリンｃＯＮＡの断片を分離する０次にその断片
をプロティンＡ融合発現ベクターｐＲＩＴ５ （ファル
マシア社（株）製）のＥｃｏＲＩサイトに挿入し、ｐＡ
ＡＱ １を作成する。さらに、 ｐＡＡＱｌをＳ腸ａｌ
／ＰｖｕｌＩ消化した後、セルフライゲーションし、ｐ
ＡＡＱ ２を作成する。被構築物の方向付けのため、プ
ロモーターシグナルシーケンス、アンピシリン耐性遺伝
子並びに二、三の制限酵素サイトを示す。
開昭８３−１０２，８９５ ）からＥｃｏＲＩ消化によ
りエクオリンｃＯＮＡの断片を分離する０次にその断片
をプロティンＡ融合発現ベクターｐＲＩＴ５ （ファル
マシア社（株）製）のＥｃｏＲＩサイトに挿入し、ｐＡ
ＡＱ １を作成する。さらに、 ｐＡＡＱｌをＳ腸ａｌ
／ＰｖｕｌＩ消化した後、セルフライゲーションし、ｐ
ＡＡＱ ２を作成する。被構築物の方向付けのため、プ
ロモーターシグナルシーケンス、アンピシリン耐性遺伝
子並びに二、三の制限酵素サイトを示す。
第２図はプロティンＡ遺伝子とエクオリン遺伝子の接合
付近の塩基配列及びそれに対応するアミノ酸配列を示す
。
付近の塩基配列及びそれに対応するアミノ酸配列を示す
。
第３図はウェスタン・ブロッティグによるプロティンＡ
融合エクオリンの同定結果を示す、Ａがエクオリンに対
するポリクローナル抗体を用いた場合、Ｂがパーオキシ
ダーゼ標識抗体を用いた場合である。レーンｌはｐＡＡ
Ｑ １ ／ＪＭ８３株、レーン２はｐＡＡＱ ２ ／Ｊ
Ｍ８３株、レーン３はＪＭ８３株である。
融合エクオリンの同定結果を示す、Ａがエクオリンに対
するポリクローナル抗体を用いた場合、Ｂがパーオキシ
ダーゼ標識抗体を用いた場合である。レーンｌはｐＡＡ
Ｑ １ ／ＪＭ８３株、レーン２はｐＡＡＱ ２ ／Ｊ
Ｍ８３株、レーン３はＪＭ８３株である。
上述のようにして得られた本発明（第１発明）の特異的
結合能を有するタンパク質の遺伝子と融合したエクオリ
ン遺伝子を用いることにより本発明（第２発明）の特異
的結合能を有するタンパク質と融合したエクオリンの製
造が可能となった。
結合能を有するタンパク質の遺伝子と融合したエクオリ
ン遺伝子を用いることにより本発明（第２発明）の特異
的結合能を有するタンパク質と融合したエクオリンの製
造が可能となった。
該製造は、第１発明の遺伝子を用いる以外は公知の発現
方法による。
方法による。
［発明の効果］
本発明のエクオリン活性を保持した特異的結合能を有す
るタンパク質と融合したエクオリン並びにその製造法の
有用性は、当業者に自明である。
るタンパク質と融合したエクオリン並びにその製造法の
有用性は、当業者に自明である。
該融合タンパク質のもつ特異的結合能と発光能を利用す
ることにより、発光の有無を用いた検出法に応用できる
。また、適当な宿主１例えば大腸菌を宿主とすることに
より該融合タンパク質を大量に調製することが可能にな
る。このような宿主は当業者に周知である。
ることにより、発光の有無を用いた検出法に応用できる
。また、適当な宿主１例えば大腸菌を宿主とすることに
より該融合タンパク質を大量に調製することが可能にな
る。このような宿主は当業者に周知である。
上記の開示により、当業者は特許請求された本発明を実
施できる。しかし、この技術の理解を増すために本発明
に重要なエリフォリン活性を有するプロティンＡと融合
したエクオリンの製造及び同定に使われる手順を以下に
明らかにする。
施できる。しかし、この技術の理解を増すために本発明
に重要なエリフォリン活性を有するプロティンＡと融合
したエクオリンの製造及び同定に使われる手順を以下に
明らかにする。
［実施例］
実施例１ ［プロティンＡ融合エクオリン発現ベクター
の構築］ エクオリン発現ベクターｐｉＰＨＥ（特開昭８３−１０
２゜６９５）をＥｃｏＲＩで消化した後、−８０℃テ１
０分間処理した。
の構築］ エクオリン発現ベクターｐｉＰＨＥ（特開昭８３−１０
２゜６９５）をＥｃｏＲＩで消化した後、−８０℃テ１
０分間処理した。
被処理物を７ガロース電気泳動にかけ、エクオリンｃＤ
ＮＡを有する断片をＤＥＡＥペーパーに回収した。 Ｄ
ＥＡＥペーパーを０．ＩＭ Ｎａ１ｌ、ＴＥ緩衝液（Ｉ
ＯＩＩＭ トリス塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８，０
）で２回洗節した後、ＩＭＮａＣｌ、ＴＥ！１１衝液（
ｐＨ８，０） テ４回溶出した。溶出したＤＮＡをフェ
ノールで２回抽出した後、エタノール沈殿した。
ＮＡを有する断片をＤＥＡＥペーパーに回収した。 Ｄ
ＥＡＥペーパーを０．ＩＭ Ｎａ１ｌ、ＴＥ緩衝液（Ｉ
ＯＩＩＭ トリス塩酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ８，０
）で２回洗節した後、ＩＭＮａＣｌ、ＴＥ！１１衝液（
ｐＨ８，０） テ４回溶出した。溶出したＤＮＡをフェ
ノールで２回抽出した後、エタノール沈殿した。
プロティンＡ融合発現ベクターｐＲＩＴ５ （ファルマ
シア社（株）製）をＥｃｏＲＩで消化した後、−８０℃
で１０分間処理した。さらに、大腸菌のアルカリホスフ
ァターゼ処理を８５℃で３時間行った後、フェノールで
３回抽出し、エタノール沈殿した。
シア社（株）製）をＥｃｏＲＩで消化した後、−８０℃
で１０分間処理した。さらに、大腸菌のアルカリホスフ
ァターゼ処理を８５℃で３時間行った後、フェノールで
３回抽出し、エタノール沈殿した。
回収した上述のエクオリンｃＤＮＡ断片とプロティンＡ
融合発現ベクターと少量ずつ一緒にし、Ｔ４ＤＮＡ リ
ガーゼによって連結した。
融合発現ベクターと少量ずつ一緒にし、Ｔ４ＤＮＡ リ
ガーゼによって連結した。
反応液の一部を大腸菌ＪＭ８３に形質転換し、Ｌプレー
トに広げ、３７℃で一晩培養した。
トに広げ、３７℃で一晩培養した。
形質転換株に対してエクオリン活性を測定し、活性の有
無で選択した。さらに、活性を有する形質転換株に対し
て、プラスミドＤＮＡを調製し制限酵素消化により、イ
ンサー） ＤＮＡのサイズ並びに挿入方向を確認した。
無で選択した。さらに、活性を有する形質転換株に対し
て、プラスミドＤＮＡを調製し制限酵素消化により、イ
ンサー） ＤＮＡのサイズ並びに挿入方向を確認した。
これが第１図に示すプロティンＡ融合エクオリン発現ベ
クターｐＡＡＱ １に相当する。
クターｐＡＡＱ １に相当する。
ｐＡＡＱ １プラスミドＤＮＡをＳｍａＩ／Ｐｖｕｌｌ
消化した後、−８０℃で１０分間処理した。その反応液
の一部をＴ４ＩＩＮＡリガーゼによって連結し、形質転
換した後、Ｌプレートに広げ、３７℃で一晩培養した。
消化した後、−８０℃で１０分間処理した。その反応液
の一部をＴ４ＩＩＮＡリガーゼによって連結し、形質転
換した後、Ｌプレートに広げ、３７℃で一晩培養した。
得られた形質転換株に対してプラスミドＤＮＡを調製し
、制限酵素消化によりサイズの確認をした。
、制限酵素消化によりサイズの確認をした。
サイズが小さくなったプラスミドが第１図に示すプロテ
ィンＡ融合エクオリン発現ベクターｐＡＡＱ ２に相当
し、実際的にはｐＡＡＱ ｌから５ｔａｐｈｙｌａｃｏ
ｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに対するシャトルベクタ一部分
を除いた構造と成っている。
ィンＡ融合エクオリン発現ベクターｐＡＡＱ ２に相当
し、実際的にはｐＡＡＱ ｌから５ｔａｐｈｙｌａｃｏ
ｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに対するシャトルベクタ一部分
を除いた構造と成っている。
結果的に、プロティンＡ融合エクオリン発現ベクターｐ
ＡＡＱ １及びｐＡＡＱ ２は、第２図に示すように、
プロティンＡのシグナルペプチドが切断された型で、大
腸菌のペリプラズム中へ、プロティンＡに由来する２７
１アミノ酸とアボエクリンに由来する １８８アミノ酸
をリンカ−に由来するＧｌ！・Ａｓｎ・Ｓｅｔを介して
融合した４６２アミノ醜から成る分子量５２，２９３の
プロティンＡ融合エクオリンを発現すると思われる。
ＡＡＱ １及びｐＡＡＱ ２は、第２図に示すように、
プロティンＡのシグナルペプチドが切断された型で、大
腸菌のペリプラズム中へ、プロティンＡに由来する２７
１アミノ酸とアボエクリンに由来する １８８アミノ酸
をリンカ−に由来するＧｌ！・Ａｓｎ・Ｓｅｔを介して
融合した４６２アミノ醜から成る分子量５２，２９３の
プロティンＡ融合エクオリンを発現すると思われる。
また、タラム陽性菌のＳｔａ ｈ Ｉｏｃｏｃｃｕｓ
ａｕｒｅｕｓにｐＡＡＱ １を形質転換することにより
得られる形質転換株を用いれば、上記したプロティンＡ
融合エクオリン（ＭＷ ５２，２９３）を培地中に分泌
生産することも可能になると考えられる。
ａｕｒｅｕｓにｐＡＡＱ １を形質転換することにより
得られる形質転換株を用いれば、上記したプロティンＡ
融合エクオリン（ＭＷ ５２，２９３）を培地中に分泌
生産することも可能になると考えられる。
さらに該融合タンパク質はプロティンＡの持つＩｇＧへ
の特異的結合を利用して、ＩｇＧセファロースカラムを
用いることにより一段階でたやすく精製できると思われ
る。
の特異的結合を利用して、ＩｇＧセファロースカラムを
用いることにより一段階でたやすく精製できると思われ
る。
実施例２［プロティンＡ融合エクオリン発現ベクターの
プラスミドＤＮＡの調製］ コロニーを５ ｍｌ ＬＢ培地に植え、３７℃で１晩培
養した。上記培養液１．５ｍＪ１をエッペンドルフチュ
ーブに移し、遠心（１２，００Ｏｒｐｍ、２分）した。
プラスミドＤＮＡの調製］ コロニーを５ ｍｌ ＬＢ培地に植え、３７℃で１晩培
養した。上記培養液１．５ｍＪ１をエッペンドルフチュ
ーブに移し、遠心（１２，００Ｏｒｐｍ、２分）した。
上清を除き、ペレットをｅｏＩＬｉのグルコース溶液（
５０＋ｍＭグルコース、２５１ＩＭトリス・塩酸（ｐＨ
８，０）、１０＋ｓＭ ＥＤＴＡに懸濁した。４０ル文
の１０ｍｇ／ｍ交リゾチーム溶液（使用直前にグルコー
ス溶液にて調製）を加え、穏やかに混合し、室温で５分
間放置した。２００ＩＬｌの０．２Ｎ ＮａＯＨ１１％
ＳＤＳ溶液を加え、穏やかに混合し、水中で５分間放置
した。
５０＋ｍＭグルコース、２５１ＩＭトリス・塩酸（ｐＨ
８，０）、１０＋ｓＭ ＥＤＴＡに懸濁した。４０ル文
の１０ｍｇ／ｍ交リゾチーム溶液（使用直前にグルコー
ス溶液にて調製）を加え、穏やかに混合し、室温で５分
間放置した。２００ＩＬｌの０．２Ｎ ＮａＯＨ１１％
ＳＤＳ溶液を加え、穏やかに混合し、水中で５分間放置
した。
１５０ＩＬｕの５Ｍ酢酸カリウム溶液を加え、穏やかに
混合し、水中で少なくとも５分間放置した。
混合し、水中で少なくとも５分間放置した。
遠心（１２，０ＯＯｒｐｓｅ、１０分、４℃）した後、
上清を別のエッペンドルフチューブに移し、フェノール
で１回抽出し、エタノール沈殿した。遠心（１２，００
Ｏｒｐｍ、５分）し、ペレットを７０％エタノールで洗
浄した後、真空乾燥した。ペレットを５０１ＬｕのＴＥ
Ｉｌ衝液（ｐＨ８，０）に溶解し１０ＪＬｇ／ｓ文濃度
になるようにＲＮａｓｅＡ（０，５ｍｇ／ＩＪＬ溶液を
１ｊＬ見加え、３７℃で３０分間保温した。
上清を別のエッペンドルフチューブに移し、フェノール
で１回抽出し、エタノール沈殿した。遠心（１２，００
Ｏｒｐｍ、５分）し、ペレットを７０％エタノールで洗
浄した後、真空乾燥した。ペレットを５０１ＬｕのＴＥ
Ｉｌ衝液（ｐＨ８，０）に溶解し１０ＪＬｇ／ｓ文濃度
になるようにＲＮａｓｅＡ（０，５ｍｇ／ＩＪＬ溶液を
１ｊＬ見加え、３７℃で３０分間保温した。
２０％ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）８０００／２
．５ＭＮａｃｌを３０ＪＬｌ加え、よく混合し水中で少
なくとも１時間放置した。遠心（１２０Ｏｒｐｍ、５分
）し、上清を除いた。ペレットを７０％エタノールで１
回洗浄し、真空乾燥した。ペレットを適当量のＴＥ（ｐ
Ｈ８，０）に溶解した。
．５ＭＮａｃｌを３０ＪＬｌ加え、よく混合し水中で少
なくとも１時間放置した。遠心（１２０Ｏｒｐｍ、５分
）し、上清を除いた。ペレットを７０％エタノールで１
回洗浄し、真空乾燥した。ペレットを適当量のＴＥ（ｐ
Ｈ８，０）に溶解した。
実施例３［エクオリン活性の測定］
形質転換株をＬＢ培培地１０見見植菌し、３７℃で１晩
培養した。この培養液を・最終濃度が５０％グリセロー
ルになるように調製し、−２０℃に保存した。
培養した。この培養液を・最終濃度が５０％グリセロー
ルになるように調製し、−２０℃に保存した。
ＬＢＢ地１０膳文に５０％グリセロール・ストックを５
０終見植菌し３７℃で１晩培養した。上記培養液１．５
鳳見をエツペンドルフチューブに移し、遠心（１２，０
００ｒｐ■、２分）した、上清を除き、ペレットを３０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＧｕ （ｐＨ７，８）、１０＋ｓＭ
ＥＤＴＡ（ｐＨ７，１３）１９衝液に、懸濁した後、
超音波で細胞を破砕し、さらに遠心（１２，００Ｏｒｐ
ｍ＋、５分）した。
０終見植菌し３７℃で１晩培養した。上記培養液１．５
鳳見をエツペンドルフチューブに移し、遠心（１２，０
００ｒｐ■、２分）した、上清を除き、ペレットを３０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＧｕ （ｐＨ７，８）、１０＋ｓＭ
ＥＤＴＡ（ｐＨ７，１３）１９衝液に、懸濁した後、
超音波で細胞を破砕し、さらに遠心（１２，００Ｏｒｐ
ｍ＋、５分）した。
その上清につき、エクオリン活性を測定した。
反応液２０ＯｐＪＬ中ニ３０ｍ）Ｉ Ｔｒｉｓ−ＨＣＪ
ｌ （ｐＨ７，８）、１０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７，Ｅｌ
） １ｍ衝液、 Ｌａｇ／ｍｌセレ：ｙテ９シｙＩＩ
ＬＪｌ、２−メルカプトエタノール４ｐＪＬ、粗酵素抽
出液を含む。
ｌ （ｐＨ７，８）、１０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７，Ｅｌ
） １ｍ衝液、 Ｌａｇ／ｍｌセレ：ｙテ９シｙＩＩ
ＬＪｌ、２−メルカプトエタノール４ｐＪＬ、粗酵素抽
出液を含む。
４℃に一晩放置した後、反応液の一部をルミフォトメー
ター（ＴＤ−４０００、ラボサイエンス社）のキュベツ
ト中に移し、３０ｍＭ ＣａＣＡ、ｚを１００ｕＪＬ注
入し、その発光量を測定した。
ター（ＴＤ−４０００、ラボサイエンス社）のキュベツ
ト中に移し、３０ｍＭ ＣａＣＡ、ｚを１００ｕＪＬ注
入し、その発光量を測定した。
プラスミドｐＡＡＱ ｌ及びｐＡＡＱ ２に由来するエ
クオリン活性が検出された。その活性量は、ｐＡＡＱ
１で９．３ Ｘ １０５ ｒ、１．ｕ、／ｍｌ培養液、
ｐＡＱＱ２ テ２．０ Ｘ１０５ ｒ、 １．ｕ、／ｓ
ｆＬ培養液であった。これは、に末端側にプロティンＡ
を融合したエクオリンの産生を示し、七の融合タンパク
質がエクオリン活性を有することを示すものである。
クオリン活性が検出された。その活性量は、ｐＡＡＱ
１で９．３ Ｘ １０５ ｒ、１．ｕ、／ｍｌ培養液、
ｐＡＱＱ２ テ２．０ Ｘ１０５ ｒ、 １．ｕ、／ｓ
ｆＬ培養液であった。これは、に末端側にプロティンＡ
を融合したエクオリンの産生を示し、七の融合タンパク
質がエクオリン活性を有することを示すものである。
実施例４［ウェスタン嗜ブロッティングによるプロティ
ンＡ融合エクオリンの同定］ ｐＡＡＱ ｌ ／ＪＭ８３株及びｐＡＡＱ ２ ／Ｊ）
１８３株の１晩培養液をＬａｓｍｍｌｉ 法 （Ｌａｓ
ｍｍｌｉ、 Ｏ，に、（１８７０） Ｎａｔｕｒｅ
２７７．８８０）によるＳＯＳポリアクリルアミド電気
泳動にかけ分離した。このゲルをＴｏｗｂｉｎらの方法
（Ｔｏｗｂｉｎ、Ｈ，、５ｔａｅｈｌｉｎ、 Ｔ、 ａ
ｎｄ Ｇｏｒｄｏｎ、Ｊ、、Ｐｒｏｃ。
ンＡ融合エクオリンの同定］ ｐＡＡＱ ｌ ／ＪＭ８３株及びｐＡＡＱ ２ ／Ｊ）
１８３株の１晩培養液をＬａｓｍｍｌｉ 法 （Ｌａｓ
ｍｍｌｉ、 Ｏ，に、（１８７０） Ｎａｔｕｒｅ
２７７．８８０）によるＳＯＳポリアクリルアミド電気
泳動にかけ分離した。このゲルをＴｏｗｂｉｎらの方法
（Ｔｏｗｂｉｎ、Ｈ，、５ｔａｅｈｌｉｎ、 Ｔ、 ａ
ｎｄ Ｇｏｒｄｏｎ、Ｊ、、Ｐｒｏｃ。
Ｗａｔｔ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、ｔＩＳＡ、７Ｅｔ
４３５０（１９７９））によりウェスタン嗜ブロッティ
ングにかけた。
４３５０（１９７９））によりウェスタン嗜ブロッティ
ングにかけた。
すなわち、ゲル上のバンドをニレクロドロプロッターで
ニトロセルロース上に移行させた後、そのニトロセルロ
ースフィルターを抗体と反応させ、さらに４−クロロ−
１−ナフトールをパーオキシダーゼにより発色させるこ
とにより行なった。
ニトロセルロース上に移行させた後、そのニトロセルロ
ースフィルターを抗体と反応させ、さらに４−クロロ−
１−ナフトールをパーオキシダーゼにより発色させるこ
とにより行なった。
抗体としては、常法により調製した組換えエクオリンに
対するウサギＩｇＧ （ポリクローナル抗体）及び西
洋ワサビパーオキシダーゼ（）ＩＲＰ）標識ヤギ抗ウサ
ギＩｇＧを用いた。
対するウサギＩｇＧ （ポリクローナル抗体）及び西
洋ワサビパーオキシダーゼ（）ＩＲＰ）標識ヤギ抗ウサ
ギＩｇＧを用いた。
ＨＲＰ標識抗体を用いた発色検出システムのキット（イ
ミュンプロット）は市販品（バイオラッド社から購入）
を用いた。
ミュンプロット）は市販品（バイオラッド社から購入）
を用いた。
第３図にウェスタン・ブロッティングの結果を示したが
、Ａがエクオリン抗体を用いた場合、ＢがＨＲＰ標識Ｉ
ｇＧを用いた場合である０両方ともｐＡＡＱｌ （レー
ン１）及びＰＡＡＱ２ （レーン２）に約４８キロダル
トンのバンドを示した。またコントロールのＪＭ８３株
（レーン３）には有意義なバンドを検出しなかった。
、Ａがエクオリン抗体を用いた場合、ＢがＨＲＰ標識Ｉ
ｇＧを用いた場合である０両方ともｐＡＡＱｌ （レー
ン１）及びＰＡＡＱ２ （レーン２）に約４８キロダル
トンのバンドを示した。またコントロールのＪＭ８３株
（レーン３）には有意義なバンドを検出しなかった。
これは、ｐＡＡＱ １及びｐＡＡＱ ２に由来する約４
８にのバンドが７ポエクオリン及びプロティンＡを含有
していることを示し、さらにプロティンＡの持つ抗体結
合能を有していることを示す、この４８にというサイズ
は、予想される融合タンパク質のサイズの５２によりや
や小さいが、近似の値を示した。
８にのバンドが７ポエクオリン及びプロティンＡを含有
していることを示し、さらにプロティンＡの持つ抗体結
合能を有していることを示す、この４８にというサイズ
は、予想される融合タンパク質のサイズの５２によりや
や小さいが、近似の値を示した。
以上の結果を総合すると、ｐＡＡＱ １又はｐＡＡＱ
２より発現される約４８にのプロティンＡとアポエクオ
リンの融合タンパク質は、両者の活性（すなわち、抗体
結合能と発光能）を保持しており、本融合タンパク質を
用いることにより抗体を発光で検出することが出来ると
推定される。
２より発現される約４８にのプロティンＡとアポエクオ
リンの融合タンパク質は、両者の活性（すなわち、抗体
結合能と発光能）を保持しており、本融合タンパク質を
用いることにより抗体を発光で検出することが出来ると
推定される。
第１．２．３図は本発明の説明図である。
第１図は、プロティンＡ融合エクオリン発現ベクターｐ
ＡＡＱ ｌ及びｐＡＡＱ ２の構築工程を示すフローシ
ートである。 第２図は、プロティンＡ遺伝子とエクオリン遺伝子の融
合近傍の塩基配列とそれに対応するアミノ酸配列を表わ
したものである。 第３図はウェスタン・プロッティングの結果を示したも
ので、Ａがエクオリンに対する抗体を用いた場合で、Ｂ
がＨＲＰ標識ＩｇＧを用いた場合である。ｐＡＡＱｌ及
びｐＡＡＱ ２におけるプロティンＡ融合エクオリンの
検出、及び同定を表わしたものである。 以上
ＡＡＱ ｌ及びｐＡＡＱ ２の構築工程を示すフローシ
ートである。 第２図は、プロティンＡ遺伝子とエクオリン遺伝子の融
合近傍の塩基配列とそれに対応するアミノ酸配列を表わ
したものである。 第３図はウェスタン・プロッティングの結果を示したも
ので、Ａがエクオリンに対する抗体を用いた場合で、Ｂ
がＨＲＰ標識ＩｇＧを用いた場合である。ｐＡＡＱｌ及
びｐＡＡＱ ２におけるプロティンＡ融合エクオリンの
検出、及び同定を表わしたものである。 以上
Claims (4)
- （１）組換えＤＮＡの手法を用いることを特徴とする特
異的結合能を有するタンパク質の遺伝子とエクオリン遺
伝子の融合遺伝子の製造法。 - （２）特許請求の範囲第１項に記載の製造法により生産
されてなる特異的結合能を有するタンパク質の遺伝子と
エクオリン遺伝子の融合遺伝子。 - （３）組換えＤＮＡの手法を用いることを特徴とする特
異的結合能を有するタンパク質とエクオリンの融合タン
パク質の製造法。 - （４）特許請求の範囲第３項に記載の製造法により生産
されてなる特異的結合能を有するタンパク質とエクオリ
ンの融合タンパク質。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30842488A JPH02154688A (ja) | 1988-12-06 | 1988-12-06 | 特異的結合能を有するタンパク質と融合したエクオリン及びその製造法 |
| EP19890121881 EP0372352B1 (en) | 1988-12-06 | 1989-11-27 | Aequorin fused with a protein having a specific-binding activity, its preparation, its purification and detection method by its use |
| DE1989622971 DE68922971T2 (de) | 1988-12-06 | 1989-11-27 | Mit einem Protein mit spezifischer Bindungsaktivität fusioniertes Aequorin, seine Herstellung, Reinigung und Nachweismethode. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP30842488A JPH02154688A (ja) | 1988-12-06 | 1988-12-06 | 特異的結合能を有するタンパク質と融合したエクオリン及びその製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02154688A true JPH02154688A (ja) | 1990-06-14 |
Family
ID=17980890
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP30842488A Pending JPH02154688A (ja) | 1988-12-06 | 1988-12-06 | 特異的結合能を有するタンパク質と融合したエクオリン及びその製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02154688A (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH044872A (ja) * | 1989-06-26 | 1992-01-09 | Commiss Energ Atom | 細胞質外酵素と少なくとも１つの他のタンパク質とのハイブリッドタンパク質およびその製造方法 |
| JP2008048607A (ja) * | 2006-08-22 | 2008-03-06 | Chisso Corp | Ｆｃ結合ドメインとカルシウム結合発光蛋白質との融合蛋白質、それをコードする遺伝子およびそれらの用途 |
| JP2008099669A (ja) * | 2006-09-19 | 2008-05-01 | Chisso Corp | 組換え蛋白質の可溶性蛋白質としての製造方法 |
| JP2008283944A (ja) * | 2007-05-21 | 2008-11-27 | Chisso Corp | Ｆｃ結合ドメインとカルシウム結合発光蛋白質との融合蛋白質、それをコードする遺伝子およびそれらの用途 |
| JP2015091873A (ja) * | 2015-01-30 | 2015-05-14 | Jnc株式会社 | Ｆｃ結合ドメインとカルシウム結合発光蛋白質との融合蛋白質、それをコードする遺伝子およびそれらの用途 |
| US9738692B2 (en) | 2006-09-19 | 2017-08-22 | Jnc Corporation | Process for production of recombinant proteins as a soluble form |
-
1988
- 1988-12-06 JP JP30842488A patent/JPH02154688A/ja active Pending
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH044872A (ja) * | 1989-06-26 | 1992-01-09 | Commiss Energ Atom | 細胞質外酵素と少なくとも１つの他のタンパク質とのハイブリッドタンパク質およびその製造方法 |
| JP2008048607A (ja) * | 2006-08-22 | 2008-03-06 | Chisso Corp | Ｆｃ結合ドメインとカルシウム結合発光蛋白質との融合蛋白質、それをコードする遺伝子およびそれらの用途 |
| JP2008099669A (ja) * | 2006-09-19 | 2008-05-01 | Chisso Corp | 組換え蛋白質の可溶性蛋白質としての製造方法 |
| US9738692B2 (en) | 2006-09-19 | 2017-08-22 | Jnc Corporation | Process for production of recombinant proteins as a soluble form |
| JP2008283944A (ja) * | 2007-05-21 | 2008-11-27 | Chisso Corp | Ｆｃ結合ドメインとカルシウム結合発光蛋白質との融合蛋白質、それをコードする遺伝子およびそれらの用途 |
| JP2015091873A (ja) * | 2015-01-30 | 2015-05-14 | Jnc株式会社 | Ｆｃ結合ドメインとカルシウム結合発光蛋白質との融合蛋白質、それをコードする遺伝子およびそれらの用途 |
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