JPH044872A - 細胞質外酵素と少なくとも１つの他のタンパク質とのハイブリッドタンパク質およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は細胞質外タンパク質ＰＩの断片、タンパク質
Ｐ２および細胞外酵素とのハイブリッドタンパク質類て
あって、そのタンパク質Ｐ２が特に抗原かまたは抗体の
単一連鎖の可変断片（Ｆｖ）であるハイブリッドタンパ
ク質類、その製造法、ならびにその用途の特に診断剤と
しての用途および核酸ライブラリーのスクリーニングも
しくは組換え体クローンの選択の際の用途に関する。

またこの発明は、前記ハイブリッドタンパク質をコード
するＤＮＡ配列、前記配列を含有する発現ベクター、前
記ベクターで形成転換された細菌もしくは酵母の株、お
よびそれらの株の前記ハイブリッドタンパク質を産生じ
分泌させる用途に関する。

文献には、いくつものハイブリッドタンパク質とその製
造法が記載されている。

特に、米国特許第４，４１１，９９４号と同４．３３８
，３９７号が挙げられるが、これらには、プラスミドｐ
ＢＲ３２２中のベニシリナーゼ遺伝子を融合タンパク質
の産生に用いることが記載されているが、この融合タン
パク質は、プラスミドｐＢＲ３２２のＰｓｔ１部位に挿
入された、プレプロインスリンをコードするｃＤＮＡ配
列を用いて、ペニンリナーゼリーダー”配列によって、
細胞周辺校に輸送される。

また、ヨーロッパ特許願第１９６，８６４号には、アル
カリホスファターゼの“リーダー”配列の用途が記載さ
れ、その下流と読み枠に所望のタンパク質をコードする
配列が続いている。

上記配列を発現するシステムは、前記／”ｔイブリッド
をコードする配列に動作可能に連結された適切なプロモ
ーター（例えばｐｈｏＡ遺伝子プロモーター）と、前記
ハイブリッドをコードする配列から下流に適切なターミ
ネータ−１特にｐｈｏＡターミネータ−をもっている。

このヨーロッパ特許願第１９６，８６４号には、いわゆ
る感受性タンパク質だけがアルカリホスファターゼのＮ
末端部に融合して、放出されると記載されている。さら
に、タンパク質は、アルカリホスファターゼのリーダー
の配列と相互に作用して前記配列の分泌を起こすアミノ
酸配列をもってｌ、＋るときに感受性であるとみなされ
ると述べられている。

また、このタンパク質の感受性は、そのアミノ酸配列の
、２つの配列を相互に作用させる性質によるものである
ことは疑いのないところであるが、現在まだ解明されて
いないとも述べられている。

しかし、いくつかの非相同のタンパク質がいくつかの細
菌の“リーダー”由来のシグナル配列と相互に作用しう
るが、他のタンパク質はこの相互作用ができないことは
明らかである。

このヨーロッパ出願には、特に、ｈＧＨとＴＮＦが感受
性タンパク質として記載されているが、一方ＩＬ−２は
非感受性タンパク質であり、つまり放出されないと記載
されている。この出願に述べられているハイブリッドタ
ンパク質は、特に遺伝子組換え法によってｈＧＨもしく
はＴＮＦを工業的量で生産するように設計され、そのア
ルカリホスファターゼシグナル配列は、異質タンパク質
の輸送する働きだけを行っている。

ヨーロッパ特許願第２４２，２４３号には、エピトープ
を含有する酵素からなるハイブリッドタンパク質が記載
されているが、そのエピトープはこれが暴露される酵素
のペプチド連鎖に次のように挿入されている。すなわち
、ハイブリッドタンパク質がエピトープに対する抗体と
免疫接触をしている時に、このハイブリッドタンパク質
と前記抗体とで複合体が形成され、前記酵素の酵素活性
が、非複合状態か複合状態であるかにかかわらず、保持
されるように挿入されている。このヨーロッパ出願に記
載されているハイブリッドタンパク質は、選択されたエ
ピトープが細菌の表面で暴露されるようなしかたで細菌
の外膜に充填されている。また表面で暴露される上記ハ
イブリッドタンパク質を含有する改変されたえファージ
受容体を、外表面にもっているイー・コリ菌株が、この
出願には記載されている。この出願に記載されているノ
ーイブリッドタンパク質は、適切な場合、アルカリホス
ファターゼ、ペルオキシダーゼまたはβ−ガラクトシダ
ーゼを含有してもよい。

所望の分泌もしくは放出される産物を得ることができる
融合タンパク質について記載している文献はこの外にも
ある。中でも、Ｔ、　Ｐ、　Ｈｏｐｐら、Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌ　、、６巻、１２０４−１２１０頁、１９８８
年の報告が挙げられる。この報告には組換え体タンパク
質の同定と精製用の標識として使用される短いＮ末端融
合配列が記載され、この標識を除くと、融合タンパク質
をつよく処理する必要がないという利点があると述べら
れている。この報告でＴ、　Ｐ、　Ｈ。

ｐｐらは、融合タンパク質の産生法には現在いくつもの
欠点があると述べていることに留意すべきである。実際
に、天然タンパク質の四次構造に相当する四次構造を有
し、安定でかつ天然タンパク質の生物学的活性を保持す
る融合タンパク質を得ることは自明なことではない。ま
た、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉ
ｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１９８７年、　１４９．
２．６０７〜６１４には、連続的した、プロインスリン
もしくはその断片およびアルカリホスファターゼからな
り、プロインスリン遺伝子とアルカリホスファターゼ遺
伝子を連続して含有しているＤＮＡ（成熟ｐｈｏＡをコ
ードする遺伝子の５°末端を通じて結合している）から
得られるハイブリッドタンパク質が記載されている。

しかし、文献に記載されている融合および／または放出
されたタンパク質の説明は、特別の場合にのみ適用され
ているだけで、−膜化することができない。

したがって、本願の出願人は、細胞周辺腔に直接放出さ
れるかまたはそのハイブリッド形の細胞から分泌され、
かつタンパク質Ｐ１の断片、タンパク質Ｐ２および酵素
からなる一群のハイブリッドタンパク質を提供すること
を目的としており、このハイブリッドタンパク質は、タ
ンパク質Ｐ２と上記酵素の特性を保持し、ＲＡ（受容体
検定法）もしくはＥＩＡ（酵素免疫検定法）式の検定法
、特にＥＬ　ｒ　ＳＡ式の検定法における診断および／
または検出用の試薬、および組換え体クローンの選択も
しくはＤＮＡライブラリーのスクリーニング用の試薬と
して用いることができる。またこれらのハイブリッドタ
ンパク質は、特に前記の放出もしくは分泌されるハイブ
リッドタンパク質が精製工程なしで診断試薬として直接
使用することができかつ安定であるという点で、従来技
術のハイブリッドタンパク質よりも実用上の要求によく
合致している。

さらにこのハイブリッドタンパク質によって、特に小分
子の検定が可能になる。小分子は通常、たとえ酵素に化
学的に結合できても、試薬として利用できないので、従
来特にＲＩＡ法によって検定されている。

この発明の目的は、前記ハイブリッドタンパク質を産生
ずる装置を提供することにある。

この発明の主題は、細菌と酵母からなる群から特に選択
される微生物によって、放出もしくは分泌される適切な
タンパク質Ｐ１に対する構造遺伝子のリーダー配列、前
記成熟タンパク質ＰＩのＮＨ２末端断片をコードする核
酸配列、タンパク質Ｐ２をコードする核酸配列、および
適切な細胞質外酵素の成熟配列の少なくとも１つの機能
性断片をコードする断片を連続して有するハイブリッド
配列からなる核酸配列であり、これらの断片のアセンブ
リー（集合体）は単一の読み枠内にあり、酵素の性質と
、前記のタンパク質Ｐ２のいくつかの性質の特に抗体、
抗原もしくは受容体と特異的に相互作用を行う性質を同
時に有するハイブリッドタンパク質をコードしている。

この発明において、核酸とは一重鎖もしくは二重鎖の核
酸配列を意味し、その核酸はＤＮＡもしくはＲＮＡであ
ることは理解されるであろう。

この発明の配列の他の有利な態様によれば、酵素は、特
にアルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、酸性
グルコースホスファターゼ、サイクリックホスホジェス
テラーゼおよびβ−ラクタマーゼからなる群から選択さ
れる。

この発明の配列の他の有利な態様によれば、タンパク質
Ｐ２をコードする配列の断片は、特にペプチドホルモン
をコードする配列、毒素をコードする配列、および免疫
グロブリン（組換え体免疫グロブリン）の可変ドメイン
に類似した単一連鎖断片をコードする配列からなる群か
ら選択される。

している。

上記態様の有利な構成によれば、前記ハイブリッド配列
は、アルカリホスファターゼに対する構造遺伝子のリー
ダー配列、成熟アルカリホスファターゼの最大２８個ま
でのＮ末端アミノ酸をコードする断片、タンパク質Ｐ２
もしくはその断片をコードするＤＮＡ配列、およびアル
カリホスファターゼの少なくとも４２２個のＣ末端アミ
ノ酸残基をコードする断片を、連続して含有し、これら
断片のアセンブリーは、単一の読み枠内にあり、アルカ
リホスファターゼの性質、特にその酵素活性と、タンパ
ク質Ｐ２の性質のいくつが、特に抗原、抗体もしくは受
容体と特異的に相互作用を行う性質を同時にもつている
ハイブリッドタンパク質をコードするハイブリッドＤＮ
Ａ配列を形成している。

この構成の有利な変形によれば、前記ハイブリッドＤＮ
Ａの配列は、アルカリホスファターゼのリーダーペプチ
ドをコードする核酸配列、アルカリホスファターゼの２
８個のＮ末端アミノ酸をコートする配列、成熟エラブト
キシンａ（ｅａ）をコードする配列、およびアルカリホ
スファターゼの４２２個のＣ末端アミノ酸をコードする
配列を、連続して含有している。

この変形によればエラブトキシンａをコードする配列は
、１９２の塩基対と、２つの追加のＳａｕ３ＡＩ制限部
位とを有する。

前記ハイブリッド配列は下記式で表される。

ｐｈｏ　Ａに対する構造遺伝子のリーダー配列−ＲＴＰ
ＥＭＰＶＬＥＮＲＡＡＱ ＣＧＧ　ＡＣＡ　ＣＣＡ　ＧＡＡ　ＡＴＧ　ＣＣ′ｒ　
Ｇ′ＩＴ　ＣｒＧ　ＧＡＡ　ＡＡＣＣＯＧαπα：Ｔ　
ＣＡＧＧＤＩＴＡＰＧＧＡＲＲＬＴＧ ＴＴＫＴＣ５ＰＧＥＳＳＣＹＮ ＣＧＣＰＴＶＫＰＧＩＫＬＳＣ ホスファターゼの少なくとも４２２個のＣ末端アミノ酸
残基をコードする断片。なおこの配列はｅａ／ｐｈｏＡ
　２８と呼ぶ。

第１の矢印は、エラブトキシンａを含有する挿入断片の
開始部分を示し、第２の矢印はこの挿入断片の末端を示
す。

アルカリホスファターゼに対する構造遺伝子（ｐｈｏＡ
遺伝子）の完全配列は、 Ｇｅｎｅ、　４４巻、１２１−１２５頁、１９８６年に
記載されている。

この態様の他の有利な構成によれば、この発明のハイブ
リッド核酸配列は、アルカリホスファターゼに対する構
造遺伝子のリーダー配列、成熟アルカリホスファターゼ
の６個のＮ末端アミノ酸をコードする断片、タンパク質
Ｐ２もしくはその断片をコードする核酸配列、およびア
ルカリホスファターゼの４４４個のＣ末端アミノ酸残基
をコードする断片を連続して含有し、さらにこのハイブ
リッド核酸配列は、特にこれら断片のアセンブリーを単
一の読み枠内におくために、タンパク質Ｐ２ををコード
する断片から下流および／または上流に適切な核酸断片
を有し、またハイブリッド核酸配列は単一の読み枠内に
あり、アルカリホスファターゼの性質と該酵素と異なる
タンパク質のいくつかの性質、特に抗原、抗体もしくは
受容体と特異的に相互作用を行う性質を同時にもってい
るハイブリッドタンパク質をコードしている。

この発明のハイブリッド核酸配列には、タンパク質Ｐ２
をコードする配列が、成熟アルカリホスファターゼの６
番目のアミノ酸をコードするトリブレットの後に挿入さ
れているが、この発明のハイブリッド核酸配列は、特に
、アルカリホスファターゼをコードする配列中に少なく
とも１つのユニーク制限部位を挿入し、ｐｈｏＡ遺伝子
の読み枠をフェーズからシフトし、アルカリホスファタ
ーゼの発現を防止することによって製造され、前記部位
へタンパク質Ｐ２を挿入したことによって、この発明の
条件下、アルカリホスファターゼ遺伝子をフェーズにシ
フトバックし、酵素を発現させることができる。

上記の構成の有利な変形によれば、前記ハイブリットＤ
ＮＡ配列は、連続した、アルカリホスファターゼに対す
る構造遺伝子のリーダー配列、アルカリホスファターゼ
の６個のＮ末端アミノ酸をコードする配列、アンギオテ
ンシン■をコードする核酸配列、配列ＡＧＧ　　Ｇを有
し、アルカリホスファターゼ遺伝子をフェーズにシフト
バックさせることができる断片、およびアルカリホスフ
ァターゼの少なくとも４４４個のＣ末端アミノ酸残基を
コードする断片で構成されている。

前記ハイブリッド配列は以下の式（ｎ）で表わされる配
列で構成されている。

、、、　　ｌｅｕ　ｌｙｓ　ｓｔｏｐ 式（ＩＩ）のこの配列はアンギオ／ＰｈｏＡ６と命名す
る。

この式（Ｉｆ）において、負の番号をつけであるのはア
ルカリホスファターゼのングナルベブチドに相当し、正
の番号をつけであるのは成熟アルカリホスファターゼの
アミノ酸に相当する。下線をつけである配列は、アンギ
オテンシンＩの配列である。アルギニンの次のバリン＋
７を、ｐｈｏＡ遺伝子のクローン化とフェーズへのソフ
トバックが必要なために導入した。ホスファターゼ遺伝
子に導入された、上記定義のユニーク制限部位に相当す
るヌクレオチドは小文字で示しているが、これらは、本
願の場合Ｓｍａ　Ｉ部位（ｃｃｃ・・・・・・ｇｇｇ）
に相当する。これによって、前記部位の存在によって生
じるｐｈｏＡ遺伝子のフェーズからのシフトと、アンギ
オテンノン配列を導入することによって生じたフェーズ
へのシフトバックとを実証することかできる。図示され
ていない（点線部分）ホスファターゼ配列の部分はＣｈ
ａｎｇらが発表した配列に相当する（Ｃｈａｎｇ、　Ｃ
，Ｎ、、　Ｌ−Ｊ、　Ｋｕａｎｇ、およびＥ、ＹＣｈｅ
ｎ、　Ｇｅｎｅ、　　４４巻、１２Ｌ−１２５頁、１９
８６年）。

この構成の他のを利な変形によれば、前記ハイブリッド
ＤＮＡ配列は、連続して、アルカリホスファターゼに対
する構造遺伝子のリーダー配列、アルカリホスファター
ゼの６個のＮ末端アミノ酸をコードする配列、配列ＣＡ
Ｔ　　ＣＣＣを有する断片、エラブトキシン＆をコード
する核酸配列、配列ＧＡＴ　　Ｃを有し、アルカリホス
ファターゼ遺伝子をフェーズにシフトバックすることが
できる断片、およびアルカリホスファターゼの少なくと
も４４４個のＣ末端アミノ酸残基をコードする断片をも
っている。

上記ハイブリッド配列は以下の式（［［［）で表わさ式
（ＯＩ）のこの配列：ｉｅａ／ｐＨｏ＾６と命名する。

この式（［［［）において、負の番号を付１すであるの
は、アルカリホスファーゼーゼのジクナルペプチドのア
ミノ酸に相当し、正の番号を付１すであるのは、成熟ア
ルカリホスファターゼのアミノ酸ζこ相当する。下線を
引いであるいは、エラブトキシンλの配列である。エラ
ブトキシンの配列の両端のアミノ故人５９−ＰｒｅとＡ
ｓｐ−＾ｒｇはｐｈｏＡ這伝子をクローン化し、フェー
ズにシフトＩくツクする必要ｈ（あるために導入したし
のである。ホスファーターゼ遺伝子に導入された３ｍａ
　Ｉ制限部位１こ相当するヌクレオチドは小文字（（Ｃ
Ｃ・・・・・・ｇｇｇ）で示しである。これによって、
前記部位の存在（こよって起こるｐｈｏＡｉｌ伝子のフ
ェーズｈ１らのソフトと、エラブトキノン配列の導入に
よって生じるフェーズへのシフトバックを例証すること
ができる。図示されていない（点線で示す）フォスファ
ターゼ配列の部分は、Ｃｈａｎｇらの発表した配列に相
当する（Ｃｈａｎｇ、　Ｃ，Ｎ、、　Ｗ、−Ｊ、　Ｋｕ
ａｎｇおよびＥ、Ｙ、Ｃｈｅｎ、　Ｇｅｎｅ。

４４巻、１２１−１２５頁、１９８６年）。

また、この発明の主題は、特に細菌および酵母からなる
群から選択される微生物によって放出もしくは分泌され
るタンパク質Ｐ１の断片、適切なタンパク質Ｐ２もしく
はその断片、および適切な酵素の少なくとも１つの機能
性断片を、連続してもっているハイブリッド配列からな
るタンパク質であって、前記酵素の性質とタンパク質Ｐ
２のいくつの性質、特に抗体、抗原もしくは受容体と特
異的に相互作用を行う性質を同時にもっているハイブリ
ッドタンパク質である。

前記ハイブリッドタンパク質の有利な態様によれば、タ
ンパク質ＰＩは上記酵素と異なる。

前記ハイブリッドタンパク質の他の有利な態様によれば
、タンパク質Ｐ１は上記酵素と同一である。

この態様の有利な構成によれば、前記ハイブリッドタン
パク質は、特に細菌と酵母からなる群から選択された微
生物によって放出もしくは分泌される酵素を含有し、適
切なタンパク質Ｐ２が挿入されている。

この態様の他の有利な構成によれば、前記のハイブリッ
ドタンパク質は、特に細菌と酵母からなる群から選択さ
れる微生物によって放出もしくは分泌される酵素の断片
、適切なタンパクＰ２、および前記酵素の完全成熟配列
を連続してもっている。

この発明によるハイブリッドタンパク質の他の有利な態
様によれば、このタンパク質は、ペプチドホルモン類、
および特にアルカリホスファターゼ、酸性ホスファター
ゼ、酸性グルコースホスファターゼ、サイクリックホス
ファターゼおよびβラクタマーゼからなる群から選択さ
れる酵素に挿入された免疫グロブリンと毒素の可変断片
に類似の単一連鎖の断片からなる群から選択されるタン
パク質Ｐ２を含有している。

この態様の構成によれば、前記のハイブリッドタンパク
質は、アルカリホスファターゼに挿入された神経毒で構
成されたものが好ましい。

この構成の有利な変形によれば、神経毒はエラブトキシ
ンａ（ｅａ）であり、そのハイブリッドタンパク質は、
上記式（１）もしくは（ＩＩＩ）によって表される配列
をもっている。

この態様の他の構成によれば、前記ハイブリッドタンパ
ク質は、アルカリホスファターゼに挿入されたアンギオ
テンシンＩで構成されたものが有利であり、上記式■に
よって示される配列をもっている。

この発明は、特に、機能性タンパク質Ｐ２が、酵素中に
挿入されるかまたはタンパク質ＰＩと前記酵素との間に
サイドイツチされているかにかかわらず予想外にも酵素
と機能性タンパク質Ｐ２の両方を発現し、しかも非常に
安定であるという利点をもっている。

また、この発明は小さな機能性タンパク質を発現すると
いう利点をもっている。従来、小さな機能性タンパクは
、たとえ酵素と化学的に結合させることができても試薬
としては利用できなかったので、ＥＩＡタイプもしくは
ＥＬ　Ｉ　ＳＡタイプの検定には利用できず、実施する
のが非常にやっかいなＲＩＡタイプの検定にしか使えな
かったものである。

この発明の主題は、この発明によるハイブリッドタンパ
ク質を発現および／またはクローン化するための一群の
ベクターである。この各ベクターは、以下のような構成
の発現システムをもっている。すなわち 適切なプロモーター； リボソーム結合部位； タンパク質Ｐ１の構造遺伝子のリーダー配列、前記成熟
タンパク質Ｐ１のＮＨ１末端断片をコードする配列、天
然の制限部位に挿入されたタンパク質Ｐ２をコードする
配列、および酵素もしくはその断片をコードする成熟配
列を含有し、この発明のハイブリッド配列に相当する核
酸配列：ならびに 転写ターミネータｍ：からなる発現システムであり、こ
の発現システムは、特に、プラスミド、ファージ、コス
ミドもしくは適切な染色体からなる群から選択された適
切な遺伝子構造に挿入される。

前記ベクターの有利な態様によれば、その遺伝子構造は
プラスミドであり、タンパク質ＰＩはその酵素と同一で
ある。

このベクターの有利な構成によれば、Ｐ２か有利にエラ
ブトキシン１である場合、下記の特性をもったプラスミ
ドが得られる。すなわち、そのプラスミドは６．１ｋｂ
で構成されこのプラスミドは、アルカリホスファターゼ
に対する構造遺伝子を有するプラスミドｐＪＣ２４３１
とアンピシリン耐性の遺伝子（ＡｐＲ）とを連結するこ
とによって得られる。上記のプラスミドｐＪＣ２４３１
はＢｅ１１部位が直線化され、アルカリホスファターゼ
に対する前記構造遺伝子のコドン２８の位置にエラブト
キシンａをコードする１９２塩基対のＳａｕ　ａＡＩ−
Ｓａｕ　３ＡＩ断片をもっている。

この発明の発明者らは、このプラスミドをｐＥＰ１７２
６と命名した。

プラスミドｐＪＣ２４３１は、Ｊ、　Ｃ，Ｌａｚｚａｒ
ｏｎｉら、Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　１６４巻、１３７６−１３８０
頁、１９８５年に記載されている。

この発明の主題は、この発明によるハイブリッドタンパ
ク質の発現および／またはクローン化を行う他の１群の
ベクターである。その各ベクターは以下のような構成の
発現システムをもっている。

すなわち、 適切なプロモーター； リボソーム結合部位 タンパク質ＰＩの構造遺伝子のリーダー配列、前記成熟
タンパク質ＰＬのＮＨ，末端断片をコードする配列、細
胞質外酵素またはその断片をコードする配列、およびタ
ンパク質ｐｔをコードする配列の断片と上記酵素をコー
ドする配列との連結部に位置し、タンパク質Ｐ２をコー
ドする配列を受けることができる１つ以上のユニーク制
限部位を含有する核酸配列：ならびに 転写ターミネータ−；からなる発現システムであり、こ
の発現システムは、特にプラスミド、ファージ、コスミ
ドもしくは適切な染色体からなる群から選択されｆコ適
切な遺伝子構造に挿入される。

前記ベクターの有利な態様によれば、導入されたユニー
ク制限部位の少なくとも１つが、酵素に対する遺伝子を
フェーズからシフトさせ、この遺伝子のフェーズへのシ
フトバックは、タンパク質Ｐ２に対する配列を導入する
ことで行われる。

この態様の有利な構成によれば、・下記の特性を有する
プラスミドが得られる。すなわち、そのプラスミドは約
５．９ｋｂで構成され：このプラスミドは、プラスミド
ｐＪＣ２４３１が持っているｐｈｏ　Ａ遺伝子の突然変
位を誘発して、成熟タンパク質の＋６の位置に対応する
ユニークＳａａ■制限部位を導入することによって得ら
れる。

この発明の発明者らは上記のプラスミドをｐＬＩＰｌと
命名し、このプラスミドは無負荷であるといわれでいる
。

タンパク質Ｐ２をコードする配列が、ｐｈｏ　Ａに対す
る構造遺伝子中に天然に存在する制限部位に挿入されて
いる場合が、またはタンパク質Ｐ２をコードする配列が
ｐｈｏ　Ａに対する構造遺伝子に予め導入されたユニー
ク制限部位に挿入されている場合に、かようなベクター
かこの発明のハイブリッド配列を含有し、かつ適切な微
生物中に存在している時ハイブリッドタンパク質を直接
発現する。

そしてかようなベクターは負荷されているといわれる。

一方ｐＬＩＰ１と呼ばれているベクターは、タンパク質
Ｐ２を受けることができるが、その部分については、負
荷されていないといわれている。

またこの発明の主題は、遺伝子の形質転換で得られる微
生物であり、この微生物は、イー・コリの適切な菌株を
、この発明のベクターで適切に修飾することによって得
られ、特に前記ベクターがプラスミドである場合の形質
転換によって得られる。

この発明の態様によれば、前記の微生物としては、プラ
スミドｐＥＰ１７２６で形質転換されたイー・コリ菌株
ＣＣ１１ｇが有利である。

前記プラスミドで形質転換された上記の菌株は、パスツ
ール研究所に所属するＣｏｌ　１ｅｃｔ　１ｏｎＮａｔ
ｉｏｎａｌｅ　ｄｅｓ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｅ　Ｍｉ
ｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓに寄託番号１−８６２で１
９８９年６月２日に寄託された。

この菌株を、発明者らはＳＥＰ　１７２６と呼称してい
る。

この発明の他の態様によれば、前記微生物としては、プ
ラスミドｐｔ、ｉｐｔで形質転換されたイー・コリ菌株
ＣＣ１１８が有利である。

前記プラスミドで形質転換された上記菌株は、パスツー
ル研究所に所属するＣｏ１１ｅｃｔｉｏｎＮａｔｉｏｎ
ａｌｅ　ｄｅｓ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｅ　Ｍｉｃｒｏ
ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓに寄託番号１−９５４で１９９０
年６月７日に寄託された。

かような無負荷のベクターは、タンパク質をコードする
いずれの配列もこのユニーク制限部位に挿入できるとい
う利点がある。

アルカリホスファターゼに対する構造遺伝子の上記の修
飾によって、さらに、下流に位置するヌクレオチド配列
にフレームシフトが導入され、この配列はｐｈｏ　Ａの
機能性部分の特徴である。

この無負荷ベクターは、上記定義のプラスミドＰＬＩＰ
Ｉに相当するものであり、アルカリホスファターゼ活性
を発現しない。

以下の式（ＩＶ）は、天然のｐｈｏＡ遺伝子（Ａ）、無
負荷ベクターｐＬＩＰｌがもっている修飾ｐｈｏ　Ａ遺
伝子（Ｂ）および負荷ベクターがもっているハイブリッ
ドｐｈｏ　Ａ遺伝子（Ｃ）に対応するヌクレオチドの配
列とタンパク質の配列を示す。

Ａ、天然のホスファターゼ Ｅ、Ｓｍａｌ部位の導入（無負荷ベクターｐＬＩＰ１）
Ｃ，ホスファターゼハイブリッドを得ることができるよ
うになる、挿入と、フェーズへのシフトバック（負荷さ
れたベクター） ｎ５ｅｒｔ 天然のｐｈｏ　Ａ遺伝子由来のヌクレオチドは大文字で
示しである。番号は、成熟アルカリホスファターゼのア
ミノ酸に対応する。点線は、図示していない配列部分に
対応する。ｐｈｏ＾遺伝子の導入されたＳｅａ　ｌ制限
部位に対応するヌクレオチドは小文字で示しである（ｃ
　ｃ　ｃ　ｇ　ｇ　ｇＸＢ）。その結果導入されたフレ
ームシフトが４９のア゛ミノ酸ノ異常タンパク質を合成
することになる（Ｂ）。終止コ５　？を含んでいない３
ｎ＋ｌ塩基対の配列（挿入断片）をＳｅａ　１部位に導
入することによって、ｐｈｏＡ遺伝子をフェーズにシフ
トバックし、ハイブリッドタンパク質を得ることができ
るようになる（Ｃ）。

さらに、その反対の配向の３ｎ十！配列が終止コドンを
もっている場合、この配列を所望の配向に導入すること
でしが、ホスファターゼ活性を有するタンパク質を得る
ことができない。

この発明によれば、プロモーターは、ｐｈｏ＾遺伝子プ
ロモーターおよびｐｈｏ遺伝子プロモーターより強力な
プロモーターからなる群から選択される。

ｐｈｏ　Ａ遺伝子プロモーターは、特に、細菌の培地中
のホスファターゼの濃度が非常に低くなった時に活性化
される誘発性プロモーターである。

このようなプロモーターは、特に、ハイブリッドタンパ
ク質を、リン酸含量の低い培地で産生させることができ
る。細菌の培養中、培地中にリン酸分がない場合、細菌
の集団が増大した後に、ハイブリッドタンパク質の合成
を誘発することができる。このような誘発システムの利
点は、抽出されるタンパク質は培養の末期に合成される
ので、産生中にタンパク質が分解する危険が低くなる。

その結果ハイブリッドの均一性が増大する。

また、この発明の主題は、この発明の微生物中に上記定
義の発現ベクターを用いる、この発明のハイブリッドタ
ンパク質を発現する方法である。

この発明のハイブリッドタンパク質の下記の２つの特性
は強調しなければならない。

（１）その生産が極めて簡単で、かつ長くてむずかしい
精製工程がない。

（２）酵素活性が基質の存在下２４時間以上も持続する
ので、細菌による生産、むづかしい条件下での貯蔵およ
び酵素の試験中、安定である。

またこの発明の主題は、この発明のハイブリッドタンパ
ク質からなる診断剤である。

このような試薬には、特に、受容体を検出する免疫酵素
検定法への用途または組織化学的標識としての用途があ
る。

またこの発明の主題は、タンパク質を含有する生物学的
流体をこの発明の診断剤と接触させろことによって、前
記生物学的流体中の前記タンパク質を検出することから
なり、複合体形もしくは遊離形での前記試薬の存在が適
切な比色反応で目視可能である、タンパク質の免疫酵素
学的検出法である。

前記方法の有利な態様によれば、前記タンパク質は抗原
である。

前記の方法の他の有利な態様によれば、前記タンパク質
は抗体である。

さらにこの発明の主題は、前記検定法を実施するのに有
利な緩衝剤と試薬の適切な量とは別に、この発明の試薬
の適切な量からなる、前記の免疫酵素学的検出法や実施
するためのすぐに使用できるのキットである。

この発明の試薬は、直接に使用できるという利点がある
が、一方、通常ＥＩＡ検定法もしくはＥＬＩＳＡ検定法
では、抗原もしくは抗体が酵素に対して共有結合し、そ
の結合は化学的に行われている。有効に結合させるには
、この結合を、２つの高度に精製された成分を用いて実
施しなければならない。

またこの発明の主題は、ｃＤＮＡもしくはゲノム核酸の
ライブラリーのスクリーニング法または組換え体クロー
ンの選択法であり、この方法によって、この発明のハイ
ブリッド核酸配列を含有する試験中のプラスミド、ファ
ージ、コスミドもしくは組換え染色体を、適切な時に組
込んだ細菌もしくは真核細胞のクローンから放出もしく
は分泌される酵素の存在の有無が、比色反応もしくは、
適切な培地で選択することによって目視可能である。

上記の方法の有利な態様によれば、酵素がアルカリホス
ファターゼの場合、放出もしくは分泌される酵素はその
酵素の適切な基質を用いて目視可能である。

上記の方法の他の有利な態様によれば、酵素がβ−ラク
タマーゼである場合、放出もしくは分泌される酵素の存
在はアンピシリンを含有する培地を用いて目視可能であ
る。

挿入されたタンパク質Ｐ２に対する配列から下流に、β
−ラクタマーゼを指定する遺伝子を有する発現系は、実
際には、開放した読み枠を有効かつ排他的にクローン化
することができる。これらの構築法によって、所望のペ
プチドを含有し、これに続いて機能性β−ラクタマーゼ
を含有するハイブリッドタンパク質が合成されるように
なる。

次いでかようなタンパク質を発現する細菌は、アンピシ
リンに対する耐性によって選択される。

上記の態様とは別に、またこの発明は、この発明の主題
の方法の実施例を参照する下記の説明から明らかになる
他の態様も含むものである。

さらに、これらの実施例は、この発明の主題を例証する
だけであって、この発明を限定するものではないことは
、明確に理解されるであろう。

実施例！＝ニブラスミド　Ｅ　Ｐ　１７２６の製法エラ
ブトキシンａをコードするＳａｕ３ＡＩ−Ｓａｕ３ＡＩ
断片の製造： エラブトキシンをコードする、シグナル配列のない′１
９２の塩基対のＳａｕ３ＡＩ−Ｓａｕ３Ａｒ制限断片を
、３コードンに関して変異を有するＥａ遺伝子を含有す
るファージＭ１３ｍｐ１９（−２０ＡＴ、−１０ｃｃ、
＋６３ＧＡＴ）ｅａの複製型から作った。これらの−時
変異によって、遺伝子に２つの新しいＳ　ａ　ｕ　Ｓ　
Ａ　Ｉ制限部位が生成する。：すなわち−２ＴＡＣ（Ｔ
ｙ　ｒ）はＧＡＴ（Ａｓｐ）になり、−１Ａｃｃ　（Ｔ
ｈ　ｒ）はＣＣＣ（Ｐｒｏ）に、＋６３ＴＡＧ（ＡＭＢ
）はＧＡＴ（Ａｓｐ）になる（式Ｉ参照）。この断片は
、Ｂｃｌ　ＩとＤＮＡリガーゼで部分開裂によって開か
れたベクターｐＪＣ２４３１に挿入される。５０ｍＭｈ
リスーＨＣｌｐＨ７，４、ｌＯｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　
ｔ、１０ｍＭ　ＤＴＴ、０．５ｍＭ　　ＡＴＰ及び１０
０μｇ／ｍｌＢ　Ｓ　Ａ緩衝液中で、ＩＵのファージＴ
４　　ＤＮＡリガーゼと１：１０のベクター／挿入断片
濃度比で、連結を行った。ベクターの脱リン酸化はＭａ
ｎｉａｔｉｓらの方法に従って行った。

第１図は、その自身のプロモーターのコントロール下で
アルカリホスファターゼの構造遺伝子を保持するプラス
ミドｐ　Ｊ　Ｃ２４３１を示す（Ｌａｚｚａｒｏｎ　ｉ
ら、１９８５）。このプラスミドは３つのＢｃｌ　Ｉ制
限部位、即ちｐｈｏＡプロモーターの上流に位置するＢ
ｃｌｌ’、およびｐｈｏＡ遺伝子のコードン＋２８と＋
３６３のそれぞれに位置するＢｃｌｌ’とＢｃｌＩ３を
有する。ｅａをＢｃｌＩ’部位へ挿入すると、この発明
によるハイブリッドタンパク質の産生に重要なプラスミ
ドｐ　Ｅ　Ｐ　１７２６を得ることができる。

酵素Ｂｅｔ　Ｉはダム・メチラーゼでメチル化された制
限部位でＤＮＡをカットできないので、非メチル化プラ
スミドを作るためダム種ＧＭ２１６３はｐ　Ｊ　Ｃ２４
３１で形質転換される。次いで、Ｂｃｌ　ｒと脱リン酸
化によってｐ　Ｊ　Ｃ２４３１の部分消化が行われる。

次にオープンプラスミドに対応するＤＮＡ（３つの可能
なカット法からＢｃｌ　ｒによる単一カット）が、Ｍａ
ｎｉａｔｉｓら（１９ｇ２）の原理に従って低融点アガ
ロースで単離される。

実施例２：ハイブリッドタンパク質ｅａ／ｐｈｏＡ２８
の発現 （アルカリホスファターゼのａａ２ｇへの挿入）株ＣＣ
１１ｇ（△ｐｈｏＡ２０）を実施例１記載の連結混合物
で形質転換した。得られたＡｐ’（アンピシリン耐性）
形質転換株をＸＰとアンピシリンを含むアルカリホスフ
ァターゼ誘導培地で精製した。

この誘導培地は、ＴＥＳ［２ｇ／ｌの（ＮＨ−）！ＳＯ
，，０，５ａ＋ｇ／ｌのＦｅＳＯ４・７Ｈ７０，７５ｍ
ｇ／ＩのＫ　Ｃｌ　、７．５ｇ／　ｌのトリエタノール
アミン、ｐＨ７，５に調整］である。色素産生基質（ｃ
ｈｒｏｍｏｇｅｎ　１ｃｓｕｂｓｔｒａｔｅ）の５−ブ
ロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸塩（Ｘ　Ｐ　
Ｏ，４ｇ／ｌ）をこの培地に加えると、ペトリ皿でアル
カリホスファターゼ活性を目視することができる。すな
わちＸＰは、これを加水分解するコロニーを青色に呈色
させる。

３つのタイプの形質転換体が、そのＸＰ加水分解能によ
り、無色クローン、青色クローンと最後に濃紺クローン
に区別されている。従って後者の２つは、それらを含有
するプラスミドによるアルカリホスファターゼ活性を有
する。

これらの異なる形質転換体のプラスミドＤＮＡの制限断
片を分析すると、各場合について、ｅａ遺伝子の挿入の
部位と配向を決めることができる。

濃紺クローンは、ＢｃｌＩ’部位すなわちｐｈｏＡ遺伝
子とそのプロモーターの上流に１つ又は２つのＳａｕ３
ＡＩ−９ａｕ３ＡＩ断片が挿入されていることに相当す
る。これらのクローンのアルカリホスファターゼ活性は
、株ＣＣ１１８（ｐ　Ｊ　Ｃ２４３１）と同じである。

あまり顕著でない青色クローンは、ＢｃｌＩ’部位への
ｅａ遺伝子のコピーのインフレーム挿入に対応する（　
ｐ　Ｅ　Ｐ　１？２６）。

無色クローンはＢｃｌＩ’部位へのｅａ遺伝子の挿入に
よるが、ｐｈｏＡ遺伝子のそれとは反対配向である。

浸透圧ショックによるペリプラズムタンパク質の抽出に
用いられる原理はＤｖｏｒａｋら（１９６７）の報告に
記載された方法である。

１、クローニング部位のｐｈｏＡ遺伝子への導入プラス
ミドｐ　Ｊ　Ｃ２４３１が保持するｐｈｏＡ遺伝子（Ｅ
、コリ　アルカリホスファターゼ）を、成熟タンパク質
の第６番目のアミノ酸に対応するコードンの後にユニー
クＳｍａ！制限部位を導入するために、直接の突然変異
誘発により修飾した。この遺伝子は、次の２つの理由で
選択した。

−その酵素活性を大きく損うことなく、ホスファターゼ
のＮ末端領域を修飾することができる。

−第１Ｎ末端アミノ酸の存在が、シグナルペプチドの開
裂を行うために必要である。

この部位は、ｐｈｏＡ遺伝子中のフレームシフトがもた
らされるように導入した。その結果、この修飾遺伝子は
機能性タンパク質を発現することはできない。

２、外因性ＤＮＡ配列のｐｈｏＡ遺伝子への導入ｐｈｏ
Ａ遺伝子のＳｍａｌ部位に導入するためのＤＮＡ断片は
、ヌクレオチド合成で得られるか又はクローン遺伝子配
列から生ずる。これらは次の要件に合うように作られる
。

（１）それらの５°末端と３°末端は平滑でなければな
らず、ＳｍａＩ部位は平滑端を発生する。

（２）所望の配向でそれらを導入することによって、挿
入部位から下流のｐｈｏＡ遺伝子配列をフェーズにシフ
トバックさせることができ、ホスファターゼ活性を有す
るハイブリッドタンパク質を合成することができるかつ （３）所望配向と反対の配向のそれら配列は、リーディ
ングフレームを持つフェースに終止コードンを所有しな
ければならない。このため、この配向を挿入した場合に
は、ハイブリッド遺伝子の機能がなくなる。

遺伝子構築は遺伝子工学の古典的技法で行われる。

正しい方向に外因性配列を挿入したベクターのみが、挿
入した配列でコードされたポリペプチドとアルカリホス
ファターゼとからなるハイブリッドタンパク質の発現を
許すオーブンリーディングフレーム（読み枠）を有する
。

３、ハイブリッド遺伝子の選択 ベクターｐＬＩＰＩに所望のＤＮＡ断片を連結した後、
組換え体プラスミドは、細菌株ＣＣ１１８（アルカリホ
スファターゼを発現しないイー・コリ変異体）を形質転
換するのに使用される。予想した遺伝子構成を含有する
細菌クローンのみが、ホスファターゼ活性を回復するこ
とができる。この活性は、ホスファターゼ用色素産生基
質を含む適当な選択培地で、細菌を培養することにより
目視できる。正のクローンは青色を呈する。

青色の呈色は、細菌がホスファターゼ活性を有するタン
パク質を発現していることを示し、次のことを意味する
。

一外因性ＤＮＡ断片が適当な配向で正しく挿入され、ホ
スファターゼをコードする配列をフェーズにシフトバッ
クさせることができる。

−ハイブリッドタンパク質、すなわち組換え体遺伝子の
産物が細菌のペリプラズムに正しく放出される。

−ハイブリッドタンパク質がホスファターゼの活性型に
相当するホモダイマーを形成するためにダイマーを産生
ずる。

−かつ従って外因性タンパク質の配列をホスファターゼ
に挿入してもその酵素活性を大きくそこなわない。

１、タンパク質Ｐ２のアルカリホスファターゼへの導入
　成熟ホスファターゼの６と７のアミノ酸の間に行った
。得られたハイブリッドタンパク質は次のもので構成さ
れている。

一ホスファターゼのシグナルペプチドの２１のアミノ酸
。このペプチドが細菌の細胞周辺腔にタンパク質を放出
させる。この局在化は、ホスファターゼ活性の獲得とハ
イブリッドタンパク質の簡便な抽出に必須である。

ホスファターゼの６Ｎ−末端アミノ酸。これの存在によ
り、細胞周辺腔へ継代中にシグナルペプチドが分裂され
る（ｃｌｓａｖｅ）。

−ホスファターゼに挿入された外因性タンパク質のアミ
ノ酸配列。クローニングの要求が、適当な場合に、この
配列の端部に１以上の付加アミノ酸が導入できる。およ
び −ホスファターゼのラストの４４４のアミノ酸。

２　ハイブリッドタンパク質の産生 細菌をリン酸が少ない液体培地で培養する。リン酸塩が
消費されると、ホスファターゼプロモーターが活性化さ
れハイブリッド遺伝子の転写をする。この誘導現象の利
点は、培養の終り（４〜５時間の培養）にハイブリッド
タンパク質の急速な合成をさせ、かつそのためタンパク
質分解の危険を制限をすることである。細菌の細胞周辺
腔のタンパク質を浸透ショック法で抽出する。このタン
パク質ハイブリッド（例えば試薬として）を使用する際
には更に精製を必要としない。

３、毒素／ホスファターゼハイブリッド（ｅａ／ｐｈｏ
Ａ　６　）−遺伝子構築： 実施例１で詳述したＳａｕ３ＡＬ部位の５°と３゛の末
端に隣接するエラブトキシンミコーディング配列からな
る１９６塩基対断片をクレノーポリメラーゼで修復し、
プラスミドｐＬＩＰｌのＳｍａＩ部位に導入した。反対
配向の断片中の、フェーズの終止コードンの存在により
実施例２に記載の原理によって探索した組換えクローン
の視覚選択ができる。そこで得られたプラスミドはｐ　
Ｌ　Ｉ　Ｐ　ｌ　／　ｅ　ａと呼称する。所期のポリペ
プチド鎖（ｅ　ａ／ｐｈｏＡ　６　）は、ホスファター
ゼシグナルペプチド、ホスファターゼの最初の６つのア
ミノ酸、クローニングが必要なため導入された２つの付
加アミノ、酸（Ａｓｐ、Ｐｒｏ）、エラブトキシンａの
６２のアミノ酸、クローニングが必要なため導入された
２つの付加付アミノ酸（Ａｓｐ。

Ａｒｇ）およびホスファターゼのラストの４４４のアミ
ノ酸を、連続して含有している。シグナルペプチドは、
細胞周辺腔へ継代（ｐａｓｓａｇｅ）中に分裂される。

ハイブリッドタンパク質ｅａ／ｐｈｏＡ６の特性 ハイブリッドタンパク質ｅａ／ｐｈｏＡ６は上記の方法
によって作られた。

このハイブリッドの３つの特性すなわち、（１）酵素活
性、（２）エラブトキシンに対して特異的な抗原決定因
子の存在および（３）遊離トキシンの検定をおこなうた
めのハイブリッドの使用可能性について研究した。

これらの特性は、ハイブリッドｅａ／ｐｈｏＡ２ｇ（実
施例２）、（ｐｈｏＡ遺伝子の前修飾をすることなく、
位置２８の後でホスファターゼにエラブトキシンを導入
して得られたプラスミドｐ　Ｅ　ｐ　１７２６の産生物
）の特性と、予め存在する制限部位を用いて比較した。

λ、ハイブリッドの酵素活性は、産生と同じ条件下で得
た天然アルカリホスファターゼの活性と比較して評価し
た。異なるタンパク質を含有し、浸透ショック法で得た
細菌の細胞周辺腔の抽出物の比活性が測定された。抽出
物のタンパク質濃度は、４６５ｎｍにおける吸光度とブ
ラッドフォード法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ、　１９７６年）
によるタンパク質検定法により作られた標準カーブとか
ら測定した。酵素活性は、２０μｇの抽出物で測定され
る。２５ｍＭｐニトロフェニルホスファート（ｐＮＰＰ
）の存在下３７℃で１５分培養後に、１　ｍ　ｌのＩＭ
ＮａＯＨを加えて反応を中止させる。４１０ｎｍにおけ
るサンプルの吸光度を（ｐ　Ｎ　Ｐ　ＯＨの生成による
黄色呈色）を読みとる。１分間にＩＪＩ９のタンパク質
当り加水分解されたｐＮｐｐのｎｍｏｌ中の比酸素活性
（ＳＡ）は次式で算出される。

ハイブリッドの活性は、天然ホスファターゼに対応する
比活性の％として表される。

天然ホスファターゼ＝１００％（Ｓ’Ａ　）ｅ　ａ／ｐ
ｈｏＡ　６　　　　　＝５０％ｅａ／ｐｈｏＡ２ｇ　　
　　＝３０％ ｂ、ハイブリッドタンパク質ｅａ／ｐｈｏＡ６とｅａ／
ｐｈｏＡ２Ｂがもっているエラブトキシンに対して特異
的な抗原決定因子の存在を、ＥＬ　Ｉ　ＳＡテスト法で
試験した。これらのタンパク質は、天然トキシンがもっ
ている抗原決定因子に特異的なモノクローナル抗体Ｍα
２−３に結合する能力を有する。その上、ｅａ／ｐｈｏ
Ａ又はｅａ／ｐｈｏＡ２ｇと天然トキシンの間の結合に
競合がある。ノ＼イブリッド中のトキシンの構築レベル
を評価するため、ＥＬ　Ｉ　ＳＡテスト法を用い、天然
トキシンに対する血清と、変性トキシンに対する血清に
よるその認識性を比較した。ハイブリッドｅａ／ｐｈｏ
Ａ６の６０％の程度でトキシンは正しく構築され、一方
この比率は、ハイブリッドｅａ／ｐｈｏＡ２８について
はわずかに３２％である。

Ｃ０第２図は、ハイブリッドｅａ／ｐｈｏＡ６を用いて
のＥＬ　Ｉ　ＳＡテスト法によるエラブトキシンａの検
定結果を示す。

ＥＬ　Ｉ　ＳＡテスト法で、ｅａ／ｐｈｏＡ６と遊離ト
キシン間のモノクローナル抗体Ｍα２−３への結合の競
合を試験した。

ＥＬ　Ｉ　ＳＡプレート上に抗体を吸着させた後に、ｅ
　ａ　／ｐｈｏＡ　６　（浸透シｏ−７り法１０倍希釈
）を、異なる量のトキシンの存在下で加える。

は、遊離トキシンの量として表される。このテスト法の
感度（Ｂ　／　Ｂ　ｏ比＝０．５の際のトキシンの量で
評価）は、２．５ｐｍｏｌで１７ｎｇに相当する。この
感度はトリチウム化トキシンを使用するＲＩＡテストの
感度に等しい。

４、アンギオテンシンＩ／ホスファターゼハイブリッド
（アンギオ／ｐｈｏＡ　６　） −遺伝子構築 アンギオテンシンＩをコードしうる３１塩基対の断片を
、２つの相補合成オリゴヌクレオチドのハイブリッド化
で得た。この断片を、プラスミドｐＬＩＰ１のＳｍａＩ
部位に導入した。この断片の配列は、組込みか所望した
のと反対の配向で行われたとき、フェーズの終止コード
ンを、ホスファターゼのリーディングフレームをもつフ
ェーズにに導入できるように決めた。ホスファターゼ活
性を発現するように（青色クローン）選択された数種の
クローンの配列を決定した後、これらを全て所望の構築
に対応させた。そこで得られたプラスミドはｐＬＩＰ１
／アンギオと称呼。所期のポリペプチド鎖（アンギオ／
ｐｈｏＡ　６　）は、ホスファターゼシグナルペプチド
、ホスファターゼの最初の６つのアミノ酸、アンギオテ
ンシンｌの１０のアミノ酸、クローン化する必要がある
ため導入した１つの付加アミノ酸（Ａｒｇ）およびホス
ファターゼのラストの４４４のアミノ酸の連続したもの
で構成されている。シグナルペプチドは細胞周辺腔内に
継代中に分裂される。

−ハイブリッドタンパク質のアンギオ／ｐｈｏＡ６の特
性 ハイブリッドタンパク質アンギオ／ｐｈｏＡ６を上記の
方法で作り、その３つの特性、（１）酵素活性、（２）
アンギオテンシンＩに対する血清によるその認識と（３
）ホルモン検定を行うためのハイブリッドの使用可能性
について試験した。

ａ、ハイブリッドアンギオ／ｐｈｏＡ６の酵素活性はハ
イブリッドｅｉｌＬ／ｐｈｏＡ６について上記の方法に
従って評価した。この測定結果は、天然ホスファターゼ
に対応する比活性の％で示す。

天然ホスファターゼ＝１００％（ＳＡ）アンギオ／ｐｈ
ｏＡ６＝９３％ ｂ、ハイブリッドタンパク質アンギオ／ｐｈｏＡ６の、
アンギオテンンン■に対する血清による認識は、ＥＬ　
Ｉ　ＳＡテスト法で試験した。兎免疫グロブリンに対す
る豚血清をＥＬＩＳＡプレートに吸着させた。ウシ血清
アルブミンと結合させたアンギオテンシン■に対する兎
血清を上記豚血清と結合させた。最後に、浸透ショック
法で作ったハイブリッドタンパク質アンギオ／ｐｈｏＡ
６をその系に加えた。アンギオテンシンに対する抗体へ
のその結合が、酵素の色素量主用基質を加えることによ
って、ホスファターゼ活性を通じて目視することができ
た。この認識の特異性は、ハイブリッドと遊離ホルモン
間の結合の競合が存在することを示すものである。

Ｃ第３図は、ハイブリッドアンギオ／ｐｈｏＡ６を使用
してのＥＬ　Ｉ　ＳＡ法によるアンギオテンシンＩの検
定結果を示す。

アンギオ／ｐｈｏＡ６と遊離アンギオテンシン■の間の
このホルモンに対する兎血清への結合の競合をＥＬ　Ｉ
　ＳＡ法で試験した。兎血清は、ＥＬＩＳＡプレートに
吸着させた豚抗兎免疫グロブリンと予め結合させる。ハ
イブリッドアンギオ／ｐｈｏＡ６（浸透レジツク法２０
倍希釈）を、異なる量のアンギオテンシンＩの存在下で
加える。

は遊離ホルモンの量で表わされる。このテストの感度（
Ｂ／Ｂｏ比＝０．５のホルモン量で評価）は０．０９ｐ
ｍｏ＋で０．１２ｎ　ｇに相当する。この感度は通常の
診断実務で用いられるＲＩＡテスト法（ＣＯＭＰＡＧＮ
ＩＥ　０ＲＩＳ　ＩＮＤＵＳＴＲＩＥ、　ＦＲＡＮＣＥ
からの市販キット）の感度に等しい。

実施例５：ホスファターゼハイブリッ下タンパク質の安
定性 １、ホスファターゼハイブリッドの合成誘発産生じた発
現ベクター、ｐＬＩＰｌ中に、ｐｈｏＡ遺伝子プロモー
ターが、ハイブリッド遺伝子を発現できるように保持さ
れた。このプロモーターは、細菌の培地中のリン酸の濃
度が非常に低くなった際に活性化される誘導プロモータ
ーである。

選定した条件下で（実施例４．２参照）、ハイブリッド
タンパク質の合成（ホスファターゼ活性の出現で測定）
は、培養３時間半後に始まる。ハイブリッドが最大蓄積
量に到達した時、すなわち、４時間３０分〜５時間後に
抽出を行う。

２、ハイブリッドタンパク質の安定性 ハイブリッドタンパク質の安定性は、３つの状況すなわ
ち（１）産生中の安定性、（２）使用中の安定性、（３
）貯蔵操作中の安定性について評価した。

ａ）ハイブリッド及び天然ホスファターゼの安定性を、
［３５ＳＦメチオニンで標識をつけた後、免疫沈澱法と
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法とでその完全性を目
視可能にして試験した。細菌を通常の生産条件下で培養
する。３０分間の合成誘導時間に、ハイブリッドの［”
Ｓ］メチオニンによるラベル化を行う。アルカリホスフ
ァターゼに特異的なモノクロナール抗体で免疫沈澱させ
たタンパク質は、単一の分子種の型で現れる。観察され
た分子マスは予期の理論値に非常に近いものでホスファ
ターゼに対して約４６．Ｇｏｏ、ｅａ／ｐｈｏＡ６に対
して約５２，０００及びアンギオ／ｐｈｏＡ６に対し約
４７，０００である。標識をつけてから４時間まで細菌
培養を続けても（ｃｈａｓｅ）　、標識をつけたタンパ
ク質の分解は全く観察されない。この結果は、ホスファ
ターゼハイブリッドタンパク質は、その産生中タンパク
質分解作用を受けないことを示す。

このようなことは、スタフィロコッカスのプロティンＡ
もしくはＥ、コリβ−ガラクトシダーズの融合で得たハ
イブリッドタンパク質には決してみられないことである
。これらの系では、所期のハイブリッドタンパク質の大
部分がタンパク質分解作用を受ける。

ｂ、ＥＬＩＳＡテスト法の目視可能条件下で２４時間培
養した後、ハイブリッドの酵素活性の著しい低下はみら
れない。これは、その試薬が使用中安定であることを示
す。その結果、ＥＬＩＳＡテストの検視時間は、その感
度を増加さすために延長できる。

ｃ、　−１８０℃で凍結させ３７℃での解凍を１０回く
り返した後、すなわちきびしい条件下でもハイブリッド
のホスファターゼ活性の９５％が保持される。

予備試験では、凍結乾燥で同様の結果を得た。従って、
ホスファターゼハイブリッドは通常の包装条件下で完全
に安定のままで保持できることは明らかである。

市販のクローン化−発現を組合せたンステムをバクテリ
オファージ又はプラスミドにインチグレートする。これ
らの本質的に共通する特性は次の通りである。１つ又は
しばしばそれ以上、一連のユニーク制限部位を含むよう
に修飾されたＥ、コリの１ａｃＺ遺伝子の部分（β−ラ
クトシダーゼ）を有するということである。この部位の
ＤＮＡ断片の挿入は一般にβ−ガラクトシダーゼ活性の
損失をまねく。この性質は、組換えクローンの認識を可
能にし、無色のコロニー又は溶菌プラークを形成し、一
方挿入断片なしのクローンはＸ−ガルの存在下ブルーと
なる。その上、挿入されたＤＮＡ配列は、β−ガラクト
シダーゼとの断片との融合タンパク質の形で発現させる
ことができる。次いで、それらの検出は、所望のタンパ
ク質に特異的な抗体を使用することで可能である。目視
は、異なる方法、すなわちヨード１２５でのラベル化、
又は抗体−酵素の接合体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ
ｎｉｎｇ、１９８９年、１２〜１４）を使用することで
行われる。特にプラスミドｐＬＩＰｌで記載したように
、修飾１ａｃＺ遺伝子の系における修飾ｐｈｏＡ遺伝子
による置換によって、ＸＰの存在下、青色及び無色のク
ローンが出現する。この場合、この事情は、β−ガラク
トシダーゼを使用する系で生ずるのと反対であり、比色
基質すなよちこの場合のＸＰを変換しうるクローンは、
組換え体クローンである。その上、クローンが簡単に着
色するのは数種の性質を示す。すなわち ）ＤＮＡ断片がｐｈｏＡ遺伝子に挿入された、ｉｉ）こ
の断片はオーブンリーディングフレームをコードする、
ｉｉｉ　）挿入によって、ｐｈｏ　Ａ遺伝子をフェーズ
にシフトバックすることが可能になり、ハイブリッドタ
ンパク質の形で発現することが可能になる、ｉｖ）この
ハイブリッドタンパク質は細胞周辺腔へ放出される、お
よびＶ）組換えアルカリホスファターゼは二量化して、
その基質、特に比色基質を加水分解する活性酵素を形成
する。従って、比色テストで現れる情報は、β−ガラク
トシダーゼの場合より、より広範である。後者の酵素を
使用すると、挿入断片を育するクローンと挿入断片をも
っていないクローンとの区別を組換えタンパク質の存在
又は性質に頼ることなく行うことができ、一方、アルカ
リホスファターゼを使用すると、構築しかつ酵素的に活
性なｐｈｏＡドメインを有する放出しうる活性ハイブリ
ッドタンパク質を合成しうるクローンを直接に同定する
ことが可能になる。その上、ハイブリッドタンパク質の
細胞周辺腔への放出を可能とする能力は、ｐｈｏＡに挿
入されたポリペプチドの構築に対して必ず影響する。

エラブトキシンａの場合には、その放出には、ジスルフ
ィド架橋の形成をともなう。従って、それはトキシンの
構築型に対して特異的な抗体によって認識しうる構造を
とる。はとんどの抗体は、このタイプの構造依存性特異
性を有し、正しく構築されたタンパク質のみを認識する
。最後に、挿入されたタンパク質に特異的な抗体との相
互作用をごく簡単に証明するために、合成したハイブリ
ッドタンパク質の酵素活性を活用することが可能になる
。組換えタンパク質を合成するコロニーを、予め特異的
抗体溶液で飽和したニトロセルロースフィルターに簡単
にプロットし、ホスファターゼ用比色試薬で検視するこ
とにより、抗体と反応しうるハイブリッドタンパク質を
分泌するクローンを目視することができる。

この方法は、ある明白なタンパク質のエピトープを同定
するのに非常に効果的である。このタンパク質をコード
する断片は、合成、全遺伝子に対する制限酵素の作用、
又はＰ　ＣＲ（Ｐｏ１ｙａ＋ｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　
ｒｅａｃｔｉｏｎ）技法の使用、例えばｐｈｏＡ遺伝子
への組入れのような他の方法で得ることができる。

全タンパク質に対する血清又はモノクロナール抗体での
構築で得られる組換えＤＮＡの相互作用の研究により、
エピトープを有するタンパク質の領域を同定することが
可能になる。

実施例７：この発明による組換えクローンの選定法 β−ラクタマーゼ（それを発現する細菌でアンピシリン
耐性を与える酵素）をコードするｂｌａ遺伝子を使用す
ることによって、抗生物質の存在下で単独で生育しうる
組換えクローンの選定が可能となる。この種の選定によ
って、非常に稀なコーディング配列を試験することがで
きる。

この発明は以上のごとき上記の説明によって限定される
べきでなく、この発明の範囲を離れることなく、当業者
によってなしうる変形もこの発明に包含される。

【図面の簡単な説明】

第１図はアルカリホスファターゼに対する構造遺伝子を
もっているプラスミドｐＪＣ２４３１と、このプラスミ
ドからｐＥＰ１７２６、ｐＬＩＰｌおよびｐＬＩＰ１／
Ｅａの各プラスミドを得る過程を示す図： 第２図はハイブリッドｅａ／ｐｈｏＡ６を用い、ＥＬＩ
ＳＡテスト法でエラブトキシンλを検定した結果を示す
グラフ図；および 第３図はハイブリッドアンギオ／ｐｈｏＡ６を用い、Ｅ
ＬＩＳＡテスト法でアンギオテンシンＩを検定した結果
を示すグラフ図である。 ＬＣｊの浄書 ７４、　ｌ　＋Ｆ２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、細菌と酵母からなる群から特に選択される微生物に
   よって放出もしくは分泌される適切なタンパク質Ｐ１に
   対する構造遺伝子のリーダー配列、前記の成熟タンパク
   質Ｐ１のＮＨ＿２末端断片をコードする核酸配列、タン
   パク質Ｐ２をコードする核酸配列、および適切な細胞質
   外酵素の成熟配列の少なくとも１つの機能性断片をコー
   ドする断片を、連続して含有し；これらの断片のアセン
   ブリーが、単一の読み枠内にあり、かつ前記酵素の性質
   と前記タンパク質Ｐ２のいくつかの性質、特に抗体、抗
   原もしくは受容体と特異的に相互作用を行う性質を同時
   に有するハイブリッド配列からなる核酸配列。 ２、酵素が、特にアルカリホスファターゼ、酸性ホスフ
   ァターゼ、酸性グルコースホスファターゼ、サイクリッ
   クホスホジエステラーゼおよびβ−ラクタマーゼからな
   る群から選択される請求項１記載のハイブリッド配列。 ３、タンパク質Ｐ２をコードする配列の断片が、特にペ
   プチドホルモンをコードする配列、毒素をコードする配
   列、および免疫グログブリンの可変ドメインに類似の単
   一連鎖断片（組換え体免疫グロブリン）をコードする配
   列からなる群から選択される請求項１または２に記載の
   ハイブリッド配列。 ４、毒素（トキシン）が神経毒である請求項３記載のハ
   イブリッド配列。 ５、タンパク質Ｐ１が酵素と同一である請求項１〜４の
   いずれか１つに記載のハイブリッド配列。 ６、タンパク質Ｐ１が酵素とは異なる請求項１〜４のい
   ずれか１つに記載のハイブリッド配列。 ７、細菌および酵母からなる群から特に選択される微生
   物によって放出もしくは分泌される酵素の構造遺伝子の
   リーダー断片、前記成熟酵素のＮＨ＿２末端断片をコー
   ドする核酸配列、タンパク質Ｐ２をコードする核酸配列
   、および前記酵素の成熟配列の少なくとも１つの機能性
   断片をコードする断片を、連続して有し；これらの断片
   のアセンブリーが、単一読み枠内にあり、かつ酵素の性
   質および前記タンパク質のいくつかの性質、特に抗体、
   抗原もしくは受容体と特異的に相互作用を行う性質を同
   時に有するハイブリッドタンパク質をコードする請求項
   １〜５のいずれか１つに記載のハイブリッド配列。 ８、アルカリホスファターゼに対する構造遺伝子のリー
   ダー配列、成熟アルカリホスファターゼの最高２８個ま
   でのＮ末端アミノ酸をコードする断片、タンパク質Ｐ２
   もしくはその断片をコードするＤＮＡ配列、およびアル
   カリホスファターゼの少なくとも４２２個のＣ末端アミ
   ノ酸残基をコードする断片を、連続して有し；これらの
   断片のアセンブリーが単一の読み枠内にあり、かつ、ア
   ルカリホスファターゼの性質特にその酵素活性およびタ
   ンパク質Ｐ２のいくつかの性質、特に抗原、抗体もしく
   は受容体と特異的に相互作用を行う性質を同時に持って
   いるハイブリッドタンパク質をコードするハイブリッド
   ＤＮＡ配列を形成する請求項１〜５および７のいずれか
   １つに記載のハイブリッド配列。 ９、アルカリホスファターゼのリーダーペプチドをコー
   ドする核酸配列、アルカリホスファターゼの２８個のＮ
   末端アミノ酸をコードする配列、成熟エラブトキシンａ
   （ｅａ）をコードする配列、およびアルカリホスファタ
   ーゼの４２２個のＣ末端アミノ酸をコードする配列を、
   連続してもっている請求項８記載のハイブリッド配列。 １０、エラブトキシンａをコードする配列が１９２個の
   塩基対と、２つの追加のＳａｕ３ＡＩ制限部位からなる
   請求項８または９記載のハイブリッド配列。 １１、下記式： ｐｈｏＡに対する構造遺伝子のリーダー配列【遺伝子配
   列があります】−アルカリ ホスファターゼの少なくとも４２２個のＣ末端アミノ酸
   残基をコードする断片 で表わされる請求項１０記載のハイブリッド配列。 １２、アルカリホスファターゼに対する構造遺伝子のリ
   ーダー配列、成熟アルカリホスファターゼの６個のＮ末
   端アミノ酸をコードする配列、タンパク質Ｐ２もしくは
   その断片をコードする核酸素配列、およびアルカリホス
   ファターゼの４４４個のＣ末端アミノ酸残基をコードす
   る断片を、連続して有し；さらに、特にこれらの断片の
   アセンブリーを単一の読み枠内に置くために、タンパク
   質Ｐ２をコードする断片から下流および／または上流に
   、適切な核酸断片を有し；また単一読み枠内に、アルカ
   リホスファターゼの性質および酵素とは異なるタンパク
   質のいくつかの性質、特に抗原、抗体もしくは受容体と
   特異的に相互作用を行う性質を同時にもっているハイブ
   リッドタンパク質をコードする請求項１〜５および７の
   いずれか１つに記載のハイブリッド配列。 １３、アルカリホスファターゼに対する構造遺伝子のリ
   ーダー配列、アルカリホスファターゼの６個のＮ末端ア
   ミノ酸をコードする配列、アンギオテンシン I をコー
   ドする核酸配列、ＡＧＧＧの配列を有しアルカリホスフ
   ァターゼ遺伝子をフェーズにシフトバックさせることが
   できる断片、アルカリホスファターゼの少なくとも４４
   ４個のＣ末端アミノ酸残基をコードする断片を、連続し
   てもっている請求項１２記載のハイブリッド配列。 １４、下記式（II）： ▲数式、化学式、表等があります▼・・・、 で表わされる請求項１３記載のハイブリッド配列。 １５、アルカリホスファターゼに対する構造遺伝子のリ
   ーダー配列、アルカリホスファターゼの６個のＮ末端ア
   ミノ酸をコードする配列、ＧＡＴＣＣＣの配列を有する
   断片。エラブトキシンａをコードする核酸配列、ＧＡＴ
   Ｃの配列を有し、アルカリホスファターゼ遺伝子をフェ
   ーズにシフトバックすることができる断片、およびアル
   カリホスファターゼの少なくとも４４４個のＣ末端アミ
   ノ酸残基をコードする断片を、連続してもっている請求
   項１２記載のハイブリッド配列。 １６、下記式（III）： 【遺伝子配列があります】 で表わされる請求項１５記載の配列。 １７、細菌および酵母からなる群から特に選択される微
   生物によって放出もしくは分泌されるタンパク質Ｐ１の
   断片、適切なタンパク質Ｐ２もしくはその断片、および
   適切な酵素の少なくとも１つの機能性断片を、連続して
   もっているハイブリッド配列からなり；酵素の性質およ
   びタンパク質Ｐ２のいくつかの性質、特に抗体、抗原も
   しくは受容体と特異的に相互作用を行う性質を同時にも
   っているタンパク質。 １８、タンパク質Ｐ１が酵素とは異なる請求項１７記載
   のハイブリッドタンパク質。 １９、タンパク質Ｐ１が酵素と同一である請求項１７記
   載のハイブリッドタンパク質。 ２０、細菌および酵母からなる群から特に選択される微
   生物によて放出もしくは分泌される酵素からなり、適切
   なタンパク質Ｐ２が挿入されている請求項１７または１
   ９に記載のハイブリッドタンパク質。 ２１、細菌および酵母からなる群から特に選択される微
   生物によって放出もしくは分泌される酵素の断片、適切
   なタンパク質Ｐ２、および前記酵素の安全成熟配列を、
   連続してもっている請求項１７または１９記載のハイブ
   リッドタンパク質。 ２２、特に、アルカリホスファターゼ、酵性ホスファタ
   ーゼ、サイクリックホスホジエステラーゼおよびβ−ラ
   クタマーゼからなる群から選択された酵素に挿入された
   ペプチドホルモン、免疫グロブリンの可変ドメインに類
   似の単一連鎖断片、および毒素からなる群から特に選択
   されたタンパク質Ｐ２を含有する請求項１７〜２１のい
   ずれか１つに記載のハイブリッドタンパク質。 ２３、アルカリホスファターゼに挿入された神経毒を有
   利に含有する請求項２２に記載のハイブリッドタンパク
   質。 ２４、神経毒がエラブトキシンａ（ｅａ）であり、請求
   項１２もしくは１６に記載の式（ I ）もしくは（II）
   に示す配列を有する請求項２２または２３に記載のハイ
   ブリッドタンパク質。 ２５、アルカリホスファターゼに挿入されたアンギオテ
   ンシン I を有利に含有し、請求項１４に記載の式（II
   ）で表される配列を有する請求項２２記載のハイブリッ
   ドタンパク質。 ２６、各ベクターが、 適切なプロモーター； リボソーム結合部位； タンパク質Ｐ１に対する構造遺伝子のリーダー配列、前
   記の成熟タンパク質Ｐ１のＮＨ＿２末端断片をコードす
   る核酸配列、天然の制限部位に挿入されたタンパク質Ｐ
   ２をコードする核酸素配列、および成熟細胞質外酵素も
   しくはその断片をコードする配列を含有し、この発明の
   ハイブリッド配列に相当する核酸配列；ならびに 転写ターミネーターを有する発現システムをもち； その発現システムが、プラスミド、ファージ、コスミド
   もしくは適切な染色体からなる群から特に選択される適
   切な遺伝子構造に挿入されている；請求項１７〜２５の
   いずれか１つに記載のハイブリッドタンパク質の発現お
   よび／またはクローン化のための一群のベクター。 ２７、遺伝子構造がプラスミドであり、タンパク質Ｐ１
   が酵素と同一である請求項２６記載のベクター。 ２８、Ｐ２が有利にエラブトキシンａであるとき、ｐＥ
   Ｐ１７２６と呼ばれるプラスミドが得られ、このプラス
   ミドが、下記の性質： ６、１ｋｂを含有し； アルカリホスファターゼに対する構造遺伝子を有するプ
   ラスミドｐＪＣ２４３１とアンピシリン耐性の遺伝子（
   Ａｐ＾Ｒ）を連結し、前記プラスミドがＢｃｌ I 部位
   で直線化され、アルカリホスファターゼに対する前記構
   造遺伝子のコドン２８の位置に、エラブトキシンａをコ
   ードする１９２塩基対のＳａｕ３ＡＩ−Ｓａｕ３ＡＩ断
   片を有する；をもっている請求項２６または２７に記載
   のベクター。 ２９、各ベクターが、 適切なプロモーター； リボソーム結合部位； タンパク質Ｐ１に対する構造遺伝子のリーダー配列、前
   記成熟タンパク質Ｐ１のＮ＿２末端断片をコードする核
   酸配列、成熟細胞質外酵素もしくはその断片をコードす
   る配列、およびタンパク質Ｐ１をコードする配列の断片
   と酵素をコードする配列との接続部分に位置し、タンパ
   ク質Ｐ２をコードする配列を受けることができる１つ以
   上のユニーク制限部位を有する核酸配列；ならびに転写
   ターミネーターを有する発現システムをもち； その発現システムが、プラスミド、ファージ、コスミド
   もしくは適切な染色体からなる群から特に選択される適
   切な遺伝子構造に挿入されている；請求項１７〜２５の
   いずれか１つに記載のハイブリッドタンパク質の発現お
   よび／またはクローン化のための一群のベクター。 ３０、導入されるユニーク制限部位の少なくとも１つが
   、酵素に対する遺伝子をフェーズからシフトさせ、この
   遺伝子のフェーズへのシフトバックが、タンパク質Ｐ２
   に対する配列の導入によって行われる請求項２９記載の
   ベクター。 ３１、ｐＬＩＰＩと呼ばれるプラスミドが得られ、この
   プラスミドが下記性質： 約５．９ｋｂを有し； このプラスミドが、プラスミドｐＪＣ２４３１がもって
   いるｐｈｏＡ遺伝子の突然変異を誘発させて、成熟タン
   パク質の＋６位置に対応するユニークＳｍａｌ制限部位
   を導入することによって得られる：をもっている請求項
   ２９または３０に記載のベクター。 ３２、イー・コリの適切な菌株を、請求項２６〜３１の
   いずれか１つに記載のベクターで適切に修飾することに
   よって得られる、遺伝子形質転換で得られる微生物。 ３３、ベクターｐＥＰ１７２６で形質転換されたイー・
   コリＣＣ１１８菌株である請求項３２記載の微生物。 ３４、パスツール研究所に所属するＣｏｌｌｅｃｔｉｏ
   ｎＮａｔｉｏｎａｌｅｄｅｓＣｕｌｔｕｒｅｓｄｅＭｉ
   ｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓに、寄託番号Ｉ−８６２で
   １９８９年６月２日に寄託されたＳＥＰ１７２６と呼ば
   れる請求項３３記載の微生物。 ３５、プラスミドｐＬＩＰＩで形質転換されたイー・コ
   リＣＣ１１８菌株である請求項３２記載の微生物。 ３６、パスツール研究所に所属するＣｏｌｌｅｃｔｉｏ
   ｎＮａｔｉｏｎａｌｅｄｅｓＣｕｌｔｕｒｅｓｄｅＭｉ
   ｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓに、寄託番号Ｉ−９５２で
   １９９０年６月７日に寄託された請求項３５記載の微生
   物。 ３７、請求項３２〜３６のいずれか１つに記載の微生物
   中の請求項２６〜３１のいずれか１つに記載の発現ベク
   ターを利用する、請求項１７〜２５のいずれか１つに記
   載のハイブリッドタンパク質の発現方法。 ３８、請求項１７〜２５のいずれか１つに記載のハイブ
   リッドタンパク質からなる診断試薬。 ３９、タンパク質を含有する生物学的流体を、請求項３
   ８に記載の診断試薬と接触させることによって該生物流
   体中に存在する前記タンパク質を検出するとからなり、
   複合体もしくは遊離形の前記試薬の存在が適切な比色反
   応で目視可能であるタンパク質の免疫酵素学的検定法。 ４０、前記タンパク質が抗原である請求項３９記載の検
   定法。 ４１、前記タンパク質の抗体である請求項３９記載の検
   定法。 ４２、前記検定を実施するのに有用な緩衝液と試薬の適
   切な量の外に、請求項３８に記載の試薬の適切な量から
   なる、請求項３９〜４１のいずれか１つに記載の免疫酵
   素学的検定法を実施するためのすぐに使用できるキット
   。 ４３、請求項１〜１６のいずれか１つに記載のハイブリ
   ッド核酸配列を含有する、試験中のプラスミド、ファー
   ジ、コスミドもしく組換え体染色体を適切な場合に組込
   んだ細菌もしくは真核細胞のクローンから放出もしくは
   分泌される酵素の存在の有無を、適切な比色反応、もし
   くは適切な培地での選択によって目視可能である、ｃＤ
   ＮＡもしくはゲノム核酸のライブラリーのスクリーニン
   グまたは組換え体クローンの選択を行う方法。 ４４、酵素がアルカリホスファターゼの場合、放出もし
   くは分泌される酵素の存在が、前記酵素に対する適切な
   基質を用いて目視可能である請求項４３記載の方法。 ４５、酵素がβ−ラクタマーゼの場合、放出もしくは分
   泌される酵素の存在がアンピシリンを含有する培地を用
   いて目視可能である請求項４３記載の方法。