JPS62282589A - 別個のポリペプチド構造を有するタンパク内にエピト−プを露出させる方法及びその結果得られる生成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、タンパクに通常は外来性であるようなエピト
ープを、該エピトープの固有の性質、例えば免疫原性が
発現されるような条件下で、該タンパクに挿入する遺伝
子Ｔ学的方法に関するものである。本発明の目的であり
本明細書中で詳説している方法の一つは、形成されるハ
イブリッドタンパクに対して、通常エピトープがその一
部を形成しているところの天然に産生される抗原中に於
いてその該エピトープが発現する免疫原性に類似したも
のを付与するような条件下で該エピトープを担体タンパ
クに導入することである。この方法が直接目的としてい
るものは公知のものである。

即ち、選択的なワクチン、例えば、ワクチンの免疫原性
が調節され得、該ワクチンの主要な効果に関連のない有
害な副作用がないようなワクチンの製造に関係する。

あるタンパクの公知の又は認識されている免疫原性をに
なうエピトープの担体と考えられるペプチド配列の多く
が文献に記載されており、従ってこれらのエピトープを
単離し、更にはこれらのエピトープを含有するペプチド
を合成する試みがすでになされてきている。ワクチンを
製造するためにこのようなペプチドを使用する際に遭遇
する困難の一つは、例えば、特に該ペプチドが低分子量
である場合にはその本来の免疫原性が欠失していたり、
エピトープが天然に産生されるタンパクの一部を形成し
ているときと同じ構造を常にとるとは限らないことであ
る。従って、このような合成ペプチド（又は天然に産生
されるタンパクの断片）を高分子量の担体に結合させる
ことが検討されてきた。

もう一つの解決法は、非病原性細菌、例えば大腸菌のあ
る株を、該細菌の表面に通常露出しているタンパクをコ
ードするヌクレオチド配列であるが所望のエピトープを
含有するペプチドをコードする断片の挿入によって修飾
されている前記配列を含有する適当なベクターを使って
形質転換することである。この方法の目的とするところ
は“生ワクチン（１ｉｖｅ　ｖａｃｃｉｎｅｓ　）　”
を生産することであり幾つかの利点を併有するものであ
る。即ら、大量に生産し得ること、投与対象である生物
の免疫システムによって容易に認識され得るような条件
下でエピトープを露出する支持体を再構成すること、そ
して最後に該生ワクチンには病原性がないことである。

このような型の細菌及びそれを産生ずるに適切なベクタ
ーについては色囲特許第８２１６３１６号（１９８２年
９月２８日出願）及び色囲特許第８３１４２３６号（１
９８３年９月６日出願）明細書に記載されている。これ
らの明細書は、微生物の株、より特定的には、限定アミ
ノ酸配列をコードするヌクレオチド配列によって構成さ
れている配列を導入することによって修飾されている　
ｌａｍＢ遺伝子の少なくとも一部によって修飾を受けて
いるベクターによって形質転換された大腸菌株を記載し
ている。もちろん前記ヌクレオチド配列はある特定のエ
ピトープをコードする配列によって構成することもでき
る。ト記特訂明細書記載の発明の実際の目的は問題とな
るエピトープを含むハイブリッドタンパクを形質転換大
腸菌の表面に該エピトープの免疫原性が発現されるよう
な位置で露出させることである。

前記の第二番目の特許明細書中には従来の困難な点を低
減することが可能な改良方法が記載されているが、それ
でも尚難しい点が存在している。

挿入したヌクレオチド配列全体を転写し翻訳することは
難しいということである。また合成されたハイブリッド
タンパクは宿主細菌にとって非常に毒性であるので、培
養中の細菌のかなり多くのものが溶解し易くなる。

幾つかの別個のエピトープを１つの同じタンパク内に組
み込むことによって生産された混合ワチクンには更に別
の分野に於いて難しい事態が生じている。この困難な点
というのは、担体タンパク内に挿入された通常は外来性
であるところのエピトープが適切に露出されるかどうか
ということである。加えて、エピトープを導入すること
によって担体タンパクの構造がしばしば変化し、それに
よって後者の本来の免疫原性が影響を受けるということ
である。受容タンパクのペプチド配列内にエピトープを
挿入する為の最も適切な位置を決めることによって上記
問題点が克服されることもある。しかしながら、このよ
うなやり方での位置の決定法では１つの場所からもう１
つの他の場所へ置き換えることができず、従って、新し
い担体タンパクに関してこの問題が提起された際には常
に前記の難しい事態に直面せざるを得ないことになる。

これまで記載の問題点に加え、しばしば更にもう一つの
新たな問題が起る。それはハイブリッドタンパクを産生
ずるのに用いるベクターを調製オスｆｉｌ）ａ７−の、
−、Ｌ−′７−ムる（小がこともべ々今一を調製するた
めに遺伝子工学の力を借りた場合）。

この新たな問題点というのはエピトープをコードする配
列を受容タンパク配列のそれに対応する部分と同一の読
み取り枠に導入しなければならないということに関係す
る。

本発明の目的は、上記問題に対して別の一般的な解決法
を提供することであり、これは担体タンパク内より一般
的にはエピトープにとって外来のものである構造内で、
該エピトープの免疫原性が発現される一方同時にその環
境構造の性質が制御上維持されるようにエピトープが適
切に露出されることで達成される。例えば、このような
制御下での維持は担体タンパクの重要な最初の性質の少
なくとも幾つかを保存することを意味する。

選択したエピトープを大腸菌の表面に露出することに起
因する特別な問題を再検討することによって本発明の解
決手段はより良く理解され得るであろう。尚、以下の実
施例は本発明の範囲を限定するものと解してはならない
。

第１に、大腸菌株の表面にペプチド抗原を運ぶ担体の例
として本発明で使用する　Ｉａｍ３タンパクは通常大腸
菌の外股に位置するものである。このタンパクはマルト
ース及びマルトデキストリンの輸送に関与する膜透過型
タンパクであり（ｌｌｅｎｌＪＯｅ。

Ｒ１及びＢｏｏｓ、　Ｗ、（１９８３）、Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、　Ｂ１１１）ｈｙｓ、　Ａｃｔａ。

７３７．４４３−４７８参照）、バクテリオファージλ
を含む様々なバクテリオファージ吸収のための受容体と
して機能する（　Ｃｈａｒｂｉｔ、八、及びｌｌｏｆｎ
ｕｎｇ。

Ｈ，（１９８５）　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ、　５３．６６７−６７１参照）。ｌａｍＢの配
列、つまりこのタンパクの構造遺伝子は決定されている
（Ｃｌｉｍｅｎｔ、　Ｊ、Ｈ，及びＨｏｆｎｕｎｇ、　
Ｈ，（１９８１）、　Ｃｅ１ｌ、　２７，５０７−５１
４参照）。

この配列はＮ末端に２５個のアミノ酸から成るシグナル
ペプチドを含む４４６個のアミノ酸を有する前駆体をコ
ードしている。このペプチドは細菌の表面から輸送され
ると切断される。

実際には、所望のエピトープを特定するＤＮＡ断片をｌ
ａｍ３遺伝子に挿入しなければならない。

本発明の目的を達成する為にはこの融合に際して少なく
とも以下の３条件が満足されなければならない（これら
が満足されれば、ｌａｍｅタンパクの重要な性質が修飾
されることなくエピトープが適切に露出されるであろう
）。

１、　構成されるハイブリッドタンパクは安定であり細
菌にとって有毒であってはならない。

２、構造遺伝子に含まれているタンパクの通常の輸送に
関する情報を損うことなく融合されること。

３、　外膜に於けるハイブリッドタンパクの折りたたみ
（ｆｏｌｄｉｎｏ）が選択したエピトープが細菌の表面
に露出され明確に呈示されるものであること。

まず最初に、ｌａｍＢ遺伝子を強力で調節可能なプロモ
ーターＢａｃ）の調節下におくようなプラスミドを構築
する（Ａ＋ｎａｎｎ、　Ｅ、、　Ｂｒ０３ｉｕＳ、　Ｊ
、及びＰｔａｓｈｎｕ、　Ｈ，（１９８３）、　Ｇｅｎ
ｅ、　２５．１６７−１７８参照）。

このプラスミドはこのプロモーターを調節し得るリプレ
ッサー（ｔａｃｔ）の構造遺伝子も含む（Ｂａ１Ｊｄａ
Ｓａｒｉａｎ、　Ｈ，Ｈ，、Ａｍａｎｎ、　Ｅ、、　Ｌ
ｕｒｔｚ、、　Ｉｌ、、　Ｒｕｃｋｅｒｔ。

Ｂ及びＢａｏｄａｄｓａｒｉａｎ、　Ｈ，（１９８３）
、　Ｇｅｎｅ、　２６．２７３−２８２参照）。これと
同タイプのベクターは色囲特許第８３１４２３６号明細
書に記載されている。後で一般的方法で定義するように
、本発明方法を実施することによって、タンパクの輸送
及び折りたたみを乱すことなくエピトープを含むペプチ
ド配列を挿入し得るタンパク上の部位を定筏限定するこ
とが可能になった。この目的の為に、公知方法でブちフ
々ピしい７　Ｉｆ　１．　ｌ−トη關１＋＋１１−１−
４丁惺りなプラスミド分子をそのヌクレオチド鎖に沿っ
てランダムに分布した部位で切断することが可能になる
（Ｈｅｒｒｒｏｎ、　Ｆ、Ｓｏ、　Ｈ，及びＨｃ　ｃａ
ｒｔｈｙ、　Ｂ、Ｊ。

（１９７８）、Ｐ、Ｎ、八、　Ｓ、　（ＩＪＳＡ）、　
７５．６０１２−６０１６参照）。

引き続いて、制限ＦＪ素１３ａｍＨＩに対する特異部位
を与える１０塩基対のアダプターを過剰に存在させて前
記切断によって開環したｂのを閉じる（　Ｌａｔｈｅ、
　Ｒ，、に１ｅｒｒｙ、　Ｈ，Ｐ、、　５ｋｏｒｙ、　
Ｓ、及びしｅｃ。

ｃｑ、　Ｊ、Ｐ、　（１９８４）、　ＤＮＡ、　３Ｎｏ
２　、１７３−１８２参照）。

このアダプターを使用することの重要性はそれによって
該アダプターが挿入された部位でＤＮＡを容易に開裂し
更に別の挿入が行えるようになるということである。以
下に述べる実施例中に於いて、アダプターがランダムに
挿入された約４００個のクローンが分析された。ｌａｍ
３遺伝子の翻訳読み取り枠が保存されるアダプターの挿
入が実施された４つの々ローンを准根ｂＬ↑縞例中、１
ａ１をコードする配列解析をアダプターによる上記の修
飾後に行ない、前記の選択した４つのクローンに於いて
夫々成熟ｌａｍ３タンパクのＮ末端１４６．１５３゜１
８９及び３７４番目のアミノ酸の部位で挿入が起ってい
ることが判明した。これらのうち３つの部位（１４６，
１５３及び３７４）に於いては、アダプターの存在が４
つのアミノ酸の挿入に対応していることが判った。もう
一つの部位（１８９）では８つのアミノ酸が欠失して５
つのアミノ酸が挿入されていた。

全ての場合について、ハイブリッドタンパクは安定であ
り、５ＤＳ−ボリアミリルアミド上での電気泳動、ニト
ロセルロースフィルターへの吸着及び抗−１ａｍ３抗血
清による免疫学的検出によって検出することができた。

３種類のハイブリッドタンパク（１４６，１５３及び３
７４番目の部位のもの）は細菌に対して依然としてλ受
容体をを利用する少なくとも一つのファージに対する感
受性及びデキストリンでの増殖能を付与するものであっ
た。このことは、外膜に於ける該ハイブリッドタンパク
の折りたたみが野生型のそれに近いということを強く示
唆するものである。更に、これら３つのハイブリッドタ
ンパクは細菌に対する毒性はなかった。

対数増殖期に於いて１０’ｍｏｌ／４のイソプロピル−
β−チオガラクトシド（Ｉ　ＰＴＧ）を存在させても影
響がなかった。４番目の場合（１８９番目の部位での挿
入）、ハイブリッドタンパクは細菌にとって幾らか毒性
があり（Ｉ　ＰＴＧの存在による増殖阻害により証明）
、もはや形質転換細菌上へのファージ感受性を付与する
ものではなかった。

調製された上記４つの挿入物のうち３つは　ｌａｍＢタ
ンパクの輸送及び折りたたみのいずれ゛にも実質的に影
響を与えなかった（１４６．１５３及び３７４番目の部
位のもの）。加えて、遺伝子工学によって得られた生成
物に於いて、挿入部位がＣｈａｒｂｉｔ他の提案したモ
デルによると（Ｃｈａｒｂｉｔ、　Ａ１．　Ｃｌｅｍｉ
ｎｔ、　Ｊ、Ｈ，及びＨｏｆｎｕｎｇ、Ｈ，（１９８４
）、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、。

１７５、３９５−４０１）細菌表面上で膜の外側に位置
するタンパクの領域に相当するものであったという事実
は大いに注目すべきものである。第４番目の部°位（１
８９）は上記のモデルによれば外膜の内側に位置してい
るものである。

最初に挙げた３つの部位を使用してそこに更にペプチド
を挿入して、該挿入ペプチドが細菌表面に露出されるよ
うな新しいハイブリッドタンパクを調製した。この遺伝
子工学産物及びその性質について以後記述する。

ポリオウィルスタイブエのＶＰ１タンパクのエピトープ
９３〜１０３に相当する１１個のアミノ酸から成るペプ
チド（Ｈｏｇｌｅ、　Ｊ、Ｈ，、Ｃｈｏｗ、Ｈ，及びＦ
ｉｌｍａｎ。

Ｄ、Ｊ、、　（１９８５）、　５ｃｉｅｎｃｅ、　２２
９．１３５８−１３６５参照）を選びこれを挿入した。

これは以下のことを考慮して決定されたものである。即
ら、このペプチドは小さく、親水性であり、そしてハイ
ブリッドタンパクの輸送にとって停止配列として機能す
ることはないと考えられたからである。この領域に相当
する合成ペプチドに対するポリクロ−プル抗体（抗−Ｖ
ＰＩ）及び該ウィルス中の同じ領域に対するモノクロー
ナル抗体（抗Ｃ３）は入手し得る。

更に、抗Ｃ３抗体は中和活性を有している（ｖａｎｄｅ
ｒ　Ｗｅｒｆｍ、　Ｓ、、　Ｗｙｃｈｏｗｓｋｉ、　Ｃ
，Ｂｒｕｎｅａｕ、　Ｐ、、　Ｂｉ。

ｎｄｅｌ、　Ｂ、、　Ｃｒａｉｎｉｃ、　Ｒ，、１ｌｏ
ｒｏｄｎｉｃｃａｎｕ、　ｒ　　及びＧｉｒａｒｄ、　
Ｈ，（１９８３）、　Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ、　（Ｕ、Ｓ、Ａ
、）、　５０８０−５０８４、並びにＷｙｃｈｏｗｓｋ
ｉ、　Ｃ，、Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅｒｆ、　Ｓ、。

５ｉｆｅｒｔ、　ｏ、　Ｃｒａｉｎｉｃ、　Ｒ，、Ｂｒ
ｕｎｅａｕ、　ｐ、及びＧｉｒａｒｄ、　Ｈ，（１９８
３）、　Ｅｍｂｏ　Ｊｏｕｒｎａｌ、　２Ｎ　１１．２
０１９−２０２４参照）。従ってこのように設計された
遺伝子工学産物は医薬品として重要なものとなろう。

このペプチドを特定しＢａｍＨＩ付着末端で終つている
オリゴヌクレオチドを合成した。１４６．１５３及び３
７４番目の部位のＢａｍＨＩ配列にこのオリゴヌクレオ
チドを挿入してもハイブリッドタンパクの翻訳読み取り
枠が保存されるように前記合成を行なった。前記３種類
の挿入は同一のオリゴヌクレオチドを使用して実施した
。何故ならば、最初に挿入されている３つのアダプター
は全て同一の相（ｐｈａｓｅ）であるからである。

オリゴヌクレオチド挿入後、３つの新しいハイブリット
タンパク、１４６ＶＰ１．１５３ＶＰ１及ヒ３７４ＶＰ
１が得られた。これらは本明細書中以降夫々１４６Ｃ３
゜１５３Ｃ３及び３７４Ｃ３と槓杵される。これらの３
つのタンパクは安定であり細菌にとって毒性でもない。

即ち該細胞の対数増殖は１０’ｍｏｌ／ｌ）　ｒ　Ｐ　
Ｔ　Ｇの存在によっては影響されない。電気泳動及びニ
トロセルロースフィルターへの吸着後、これらのタンパ
クは変性条件下でポリクローナル抗−ｌａｍＢ抗体と反
応し、非変性条件下で免疫沈降が得られた。

この性質はハイブリッドタンパクがちょうど野生型１ａ
ＩＩＩＢタンパクのような三次元構造をとっているとい
う事実を示しているものである。

ハイブリッドタンパク１５３Ｃ３及び３７４Ｃ３は細菌
にλ受容体を利用する少なくとも一つのファージに対す
る感受性を付与し得、炭素源としてデキストリンを使用
することができるという事実に注目することち像要であ
る。つまり、挿入にもかかわらず、上記のタンパクは野
生型ＩａｍＢタンパクの機能の殆んどを保持していたち
のである。

次に抗Ｖ　Ｐ’１抗血清（ポリクローナル）及び族Ｃ３
抗血清（モノクローナル）に対する上記ハイブリッドタ
ンパクの反応性を検討した。以下の３つの実験条件を用
いた。第１に、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上での
変性細菌抽出物の電気泳動及びニトロセルロースフィル
ターへの吸着そして免疫学的検出（以降、イムノプロッ
トを呼ぶ）、第２に、免疫沈降及び非変性条件下でのＳ
ＯＳ　−ポリアクリルアミドによる電気法１ＪＪ（以降
、免疫沈降と呼ぶ）、第３に、ニトロセルロースフィル
ターにコロニーを吸着させた後コロニー上のその場での
（ｉｎ　５ｉｔｕ　）免疫学的検出（以降、コロニー検
出と呼ぶ）である（　Ｇｕｅｓｄｏｎ、　Ｊ、　Ｌ、　
、　Ｒｏｕｇｅｓ−Ｂｏｃｑｕｅｔ、　Ｂ、、　Ｄｅｂ
ａｒｂｏｕｉｌｌｅ、　Ｍ、及びＨｏｆｎｕｎｇ。

Ｈ，（１９８５）　、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ、　Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ、印刷中、参照）。主な結果は以下の通り
である。

ハイブリッドタンパク１４６Ｃ３，１５３Ｃ３及び３７
４Ｃ３は全て抗■Ｐ１抗血清と反応してイムノプロット
を与えた（変性条件下）。

１５３Ｃ３及ヒ３７４Ｃ３１７）　両者は抗ＶＰ１及び
抗Ｃ３抗体と反応したく非変性条件下での免疫沈降によ
る）。同条件下で、ハイブリッドタンパク１４６Ｃ３体
とは検知し得るような反応は示さなかった。

ハイブリッドタンパク１５３Ｃ３はコロニー１に於いて
抗Ｃ３抗体と溶解なしで反応した（クロロホルムでの溶
解後でも同様であった）。ハイブリッドタンパク３７４
Ｃ３についても同じ結果が得られたが、この場合にはク
ロロホルムによる溶解後の方が検出感度が良かった。従
って両者の場合とも抗Ｃ３抗体によってエピトープは認
識され細胞表面上で該エピトープは該抗体によって接触
可能であった。この結果は光学顕微鏡下での免疫蛍光に
よっても確認され、また金粒子に結合したプロゲインＡ
による電子顕微鏡下でも確認された。抗■Ｐ１抗体は１
５３Ｃ３タンパク質を有する細菌とはコロニー検出法で
反応したが、３７４Ｃ３を有する細菌とは反応しなかっ
た。１４６Ｃ３ハイブリツドタンパクを産生する細菌は
コロニー検出法では上記のいずれの抗面清によってもＨ
ｙＨされなかった（溶解前後とも）。

様々なハイブリッドタンパク（ｌａａ＋Ｂ及びＣ３のハ
イブリッドタンパク及び対応するコード配列）の特徴を
第１表に示す。

Ｃｈａｒｂｉｔ他によって提案されたモデルを第１図に
示しである。これには細菌の細胞壁及びこの膜に交差し
て折りたたまれている　ｌａｍ３タンパクが図解的に描
かれている。該膜の外側上に突出しているタンパクの部
分を示しである。番号は天然のｌａｍ３タンパクのＮ末
端からのアミノ酸に対応し、四角はｌａｍ３内へのＶＰ
Ｉ由来配列の挿入部位を図式的に示している。３５２Ｃ
３，２６４Ｃ３，７３Ｃ３及び１７８Ｃ３は選択した４
つのコロニーに対応する（ＡＪＣ３５２，ＡＪＣ２６４
，＾ＪＣ７３，ＡＪＣ１７８）。

第２図は上方にエピトープ９３〜１０３．Ｃ３のアミノ
酸配列、下方にはＩａｍＢタンパクの１４６．１５３゜
１８９及び３７４部位に挿入された合成アダプターの成
分、そして中央にはエピトープ９３−１０３Ｃ３を含有
しＢａｍＨＩ特異性を有する付着末端によって両端が囲
まれている合成ヌクレオチド配列を夫々示している。

第３図は、エピトープを含む挿入配列を導入する前の上
記参照の３つのプラスミドの領域のヌクレオチドおよび
ペプチド配列を示す。

本明細書に記載の手法が、一方では他のどんな型のタン
パクにも、また一方では催のどんな型の挿入配列にも適
用し得るものであるということは当業者には明白であろ
う。特に、ポリオウィルスのＶＰエタンバク由来のエピ
トープ以外の如何なるエピトープも使用でき、また逆に
他の如何なる型のタンパク内にもその選択したエピトー
プを挿入し得るということは明らかであろう。適切な場
所に外来性エピトープが挿入されるにも拘らず、担体タ
ンパクとしてのタンパク活性は該タンパクり要求される
性質を奏効するような形態を取り戻し得るに充分な大き
ざを有するようなものでなければならないことは言うま
でもない。

明らかに、以上のことは当業者であれば当然に考慮し得
る範囲のものであり、エピトープの大きさに較べて担体
タンパクの大きさが小さいような場合にも上記に定義し
た本発明方法をより広範囲に実施し得るかどうかを決定
することもできる。

以上のことより、本発明はあらゆる核酸、特に、最初に
特定タンパクをコードするヌクレオチド配列を適当なプ
ロモーターの調節下で含有するベクターの精製に利用し
得る。ポリオウィルスのＶＰＩタンパクのエピトープを
　ｌａｍ３タンパクをコードする配列を含むプラスミド
に導入することに関して９本明細書中でまさに開示した
挿入技術は、エピトープに固有の性質と共に維持したい
と望むもう一つのタンパクの生物学的特性を少なくとも
発現しくｑるハイブリッドタンパクの産生を望むのであ
れば、エピトープをコードする配列を挿入することによ
ってもう一つの限定されたタンパクをコードするヌクレ
オチド配列をまず含有する他の如何なる核酸の修飾にも
適用し得る。

本発明方法は以下に定義するように一般的な方法であり
得る。本発明方法は、特定のタンパクをコードするヌク
レオチド配列を最初から含有する核酸にエピトープを担
持するペプチドをコード゛する挿入可能な別個のヌクレ
オチド断片を挿入することで該核酸を修飾する方法であ
り、その際、該Ｉ！飾核酸のうち少なくとも一つがコン
ピテント細胞に導入された時、少なくとも、一方で選択
された環境内で求められている前記タンパクの生物学的
性質ともう一方では該エピトープに特徴的な性質とを同
時に表現し得るハイブリッドタンパクが産生されるよう
な条件下で該修飾が行なわれるものであって、核酸をい
くつかの部位で開環又は開裂して多数の直鎖状核酸を生
成し： 多数の直鎖状核酸のイン・ヴイトロでの組み換え及びそ
れと同時又はその後の挿入可能断片の前記核酸のうちの
少なくともいくつかへの連結により再構成して、該核酸
中の異なる部位に挿入された前記断片を含有する核酸を
含む一連の再構成核酸を得： 前記一連の核酸でコンピテント細胞を形質転換しこの形
質転換細胞を培養し； 一方で前記の適当な選択環境内でタンパクに求められて
いる生物学的性質を他方で前記エピトープを担持するペ
プチドの求められている生物学的性質を同時に発現させ
られるようになったコロニーを検出し単離し； もし適当であれば、こうして単離したコロニーから上記
挿入可能ヌクレオチド断片を適当な部位に挿入すること
によって修飾された、該タンパクをコードするヌクレオ
チド配列を含有する対応修飾核酸を回収する； ことより成る一連の操作を特徴とする方法である。

本発明のもう一つの視点から観ると、本発明は、特定の
エピトープを含有するペプチドを、特定の生物学的性質
を発現するタンパクに挿入し、それが該タンパクをコー
ドするヌクレオチド配列を最初から含有している核酸に
よって形質転換されたコンピテント細胞内で該タンパク
及び該ペプチドの選択された環境内に於ける重要な生物
学的性質の損失を招くことなく産生きれ得るような方法
であって、 核酸を夫々異なる部位で開環又は開裂し、多数の直鎖状
核酸又は核酸の断片を生成し；多数の直鎖状核酸のイン
・ヴイトロでの組み換えによる再構成し、それと同時又
はその後に上記ペプチドを］−ドする挿入可能断片を前
記再構成核酸のうちの少なくともいくつかへ連結して、
該核酸中の異なる部位に挿入された前記挿入可能断片を
含有する核酸を含む一連の核酸を得；前記一連の再構成
核酸でコンピテント細胞を形質転換しこの形質転換細胞
を培養し； 一方で前記の選択環境内でタンパクに求められている生
物学的性質と前記ペプチドに求められている生物学的性
質を同時に発現させられるようになったコロニーを検出
し単離し： 元のタンパクの部位に挿入された、上記エピトープを含
むペプチドによって修飾された上記タンパクを含有する
か又は産生しているコロニーを回収し、該コロニーは元
来法タンパクの有していた重要な性質の保持（又は該選
択環境内での該重要な性質の顕示）と、該エピトープに
特徴的な性質の獲得とを同時に適合し得るものであり；
もし適当であれば、該修飾タンパクを回収する：ことよ
り成る一連のステップを特徴とする方法である。

非特異的エンドヌクレアーゼが好ましいが、これに代え
て制限酵素、更には制限酵素の“カクテル″を使用し得
る。部分濃化の場合にはヌクレオチド鎖に沿っての開裂
はもはや完全にランダムではなくなる。しかしながら、
もし必要ならば、核酸のヌクレオチド鎖に於いてト分な
数の部位を設けることができ、完全に確実ではないが、
ある場合には上記に定義したもう一つの別の方法によっ
て得られた結果に類似の最終結果を提供するハイブリッ
ド配列を選択し得る充分な数の部位に於いて挿入するこ
とができる。

上記核酸の夫々別個の部位での開環又は開裂は少なくと
も非特異的エンドヌクレアーゼ又は核酸にランダムに分
布した開環又は開裂を生成する他のいかなる適当な手段
（超音波、酵素、開裂力、等々）によっても実施し得る
。

本発明で使用する核酸は、好ましくは環状ＯＮ八へプラ
スミドベクター、環状ファージ又はコスミドである。従
って前記の核酸の再構成とはそれら核酸の再環化を意味
する。しかしながら、本発明はこのような核酸の使用に
限定されるものではない。環状ではないが同じ基準を満
たす核酸であれば同様に本発明で使用し得る。この場合
、エンドヌクレアーゼによってヌクレオチド配列内の様
々な別個な部位で断片に開裂し得、それによって前記の
再環化の代りに組み換えによって上述の一連の修飾核酸
の再構成をし、その中には該核酸の夫々の鎖の別個の部
位に於いて挿入された挿入可能な断片が含まれているも
のである。

この点について、前述の生物学的性質に関する限り、こ
れは免疫反応に於いて役割を果す性質に限定されるもの
ではない。他の性質も同様に考慮し得る°。例えば、関
連分子との反応性、特異基質に対する活性、タンパクに
よって修飾された細菌をある選択培地中で増殖させる能
力、等が考えられる。

特定ハイブリッドタンパクの産生に関係するヌクレオチ
ド構成部分の性質次第で使用方法に様々な変更を加え得
ることは当業者には自明のことであろう。選択されたエ
ピトープを含有するペプチドをコードする挿入配列の挿
入を容易にする為に、それ以前に行なう直鎖状プラスミ
ドの再環状化は上述の条件下（もし必要ならば、ポリメ
ラーゼによってプラスミドの末端を修飾し平滑末端を生
成した後）で行なうことが好ましい。この方法によって
対象配列をより良く調節することが確実にできるもので
ある。しかしながら、このようなアダプターは常に必要
であるという訳ではない。すでにランダムな様式ｒ直鎖
状にされその末端が修飾されているプラスミドの再環化
は同様に平滑末端を有する挿入ペプチドをコードする配
列及び適当なりガーゼの存在下で直接行なうこともでき
る。

もう一つの別の有利な方法では、挿入ペプチドをコード
する配列の両端に制限酵素部位をコードするリンカ−を
結合させることもできる。

このように本発明は、他の型の生ワクチン（ｌｉｖｉｎ
ｇ　ｖａｃｃｉｎｅ）の生産にも一般的に利用でき、上
記の条件下で細菌株の表面に輸送されることができるタ
ンパクをコードし、上記に定義したハイブリッド配列を
含有するベクターによって形質転換することのできる非
病理性細菌株であればどのφようなものでも使用し得る
。

本発明は、このような生ワクチンとワチクンのイン・ヴ
イボ投与、特に経口または非経口ルートの投与に適した
薬学的ベヒクルとの組合せから成るワクチン組成物に６
係わるものである。１本発明方法で使用し得る細菌は非
病理性大腸菌株に限られたものではない。

上記の点に関して、ヒト用には、ワクチンとして用い得
る非病原性及び非ｆｉｌｆｌｌｌ性のサルモネラチフス
（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉ）菌株、例えばＴ
Ｖ２１Ａ変異体、又動物用には、ネズミチフス菌（Ｓａ
　ｌ　ｍｏｎｅ　ＩＩａ　ｔ　　ｈｉ　ｍｕｒｉｕｍ　
）の非病原性及び非浸潤性株、例えばアロＢ−変異体を
例示することができる。

他の担体タンパクをコードする配列の例としては、Ｏｍ
ｐＦ、　Ｏｍｐ＾、　ＢｔｕＢ、　ＰｈｏＥ等のシンボ
ルで知られているタンパクを挙げることが出来よう。よ
り特定的には、本発明は、Ｉａｍ３タンパクをコードす
る配列を含み、それはプロモーターの調節下、形質転換
大腸菌株内で該配列の全てを可転、翻訳され得るような
ベクターに係わる。このベクターはＩａｍ３タンパクを
コードする配列の適当な部位に決定されているエピトー
プをコードするヌクレオチド配列を挿入されたものであ
ることを特徴とする。この適当な部位とは、成熟　１ａ
ｍＢタンパクの１４０〜１６０番目又は３７０〜３８０
番目のアミノ酸をコードする領域に位置する部位に該決
定エピトープを挿入するような部位のことである。ｌａ
ｍＢタンパクへの好ましい挿入部位は、それぞれ１５３
及び３７４番目のアミノ酸のある場所である。

挿入配列は通常４〜４４、刹えは１４〜３５、より特異
的には４〜２７個のアミノ酸から成るが、これらの数は
決して限定的なものと解してはならない。

本発明は更に、上記定義のベクターによって形質転換さ
れた大腸菌株にも係わる。この大腸菌はその外表面にフ
ァージに対する修飾受容体を有し置する挿入部位に挿入
された特徴的かつ独特なエピトープを含むペプチド配列
をその表面に露出した状態で含有するものである。

本発明はいくつかのエピトープを含有するハイブリッド
タンパクの合成にも適用し得るものである。

使用する細胞系及びベクターは最終的に得られる所望の
ハイブリッドタンパクが培養培地中へ分泌（ｅＸＣｒｅ
ｔｅ）されるように選ぶと有利である。適当なケースと
して、Ｂ型肝績炎ウィルスのｐｒｅ−３及びＳ領域を含
むゲノムの核酸中に選択したエピトープを含有するペプ
チドをコードするＤＮＡ配列を挿入し、感受性の真核宿
主細胞を形質転換し、この細胞が該ＨＢ’３ＡＱ抗原を
培養培地中に分泌し得るような場合がある。

細胞系自身は前記ｐｒｅ−８及びＳ領域の一部を含有し
それらを夫々発現することのできるベクターによって形
質転換された真核細胞から成る。この場合でも、本発明
は選択されたエピトープをコードする配列が挿入され得
るｐｒｅ−ｓ及びＳ領域を含む配列の一部を限定し得る
ものでなければならず、一方それによってＨａｓ抗原の
免疫原性を保持し、同時にＨＢｓ抗原粒子の表面上にエ
ピトープを適切に露出するように確保し、形成されるハ
イブリッド抗原がイン・ヴイボで投与されたときに該エ
ピトープの免疫原性も発現されるようにしなければなら
ない。

一般的な意味で、本発明は特定のエピトープを導入し得
るタンパク上の部位を分析する方法も提供するものであ
る。本発明方法は特定のタンパクのトポロジー及び構造
を該タンパクの様々なぶｔ位に適当な配列を挿入するこ
とによって研究し、そして該タンパクの挿入部位に於い
て番される束縛（ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔ）を評価する新
しい手段を提供する。

この領域を決定した後、挿入に用いたペプチドよりち大
きいペプチドを該タンパクにとって受画だと考えられる
性質及び、所望ならば、その大きいペプチドに固有の生
物学的性質を乱すことなく挿入し得るかどうか確認する
ことができる。

反対に、本発明方法によって特徴的なエピトープを含有
する特定のタンパクに於いてその領域を同定することも
できる。これは対象タンパクをコードするＤＮＡ配列を
断片化するか又はそのＤＮＡ配列断片を化学合成し、そ
してそこに挿入され断片を挿入し、そのハイブリッド配
列をコンピテント細菌に導入しその中で発現させた後、
その様々な断片の発現を研究することから成るステップ
を含む。この方法によって、該タンパク全体に対して産
生きれる抗体によってより強く認識されるところの対象
タンパクの領域を同定することができる。特に、この方
法によって対象タンパクの一つ又はいくつかかのエピト
ープを同定することができ（例えば、上記の　ｌａｍＢ
遺伝子の１５３番目の部位への挿入）、それらのエピト
ープを発現するクローンを調製することもできる。対象
タンパクに対する特異抗血清を用いて、エピトープを担
持するコロニーを捜し、更に単離することが可能である
り。例えば、患者の血清を使ってウィルスタンパクのエ
ピトープを調査することに本発明方法を応用し得る。

本発明は数多くの具体例を含み得る。エピトープとその
幾つかの性質を保持しなければならないタンパクとを会
合（結合）することができるので゛、これをハイブリッ
ドタンパク中で元のタンパクと挿入エピトープの両方の
効果を結びつけることができる。その結果得られるハイ
ブリッドタンパクは元のそれぞれ自身の性質と異なる特
異的な性質を有する新しい生成物である。

該ハイブリッドタンパクの２つの要素間の相互作用は例
えばイン・ヴイトロでの診断に用いられる。この診断法
は、ハイブリッドタンパクに含まれるエピトープと該エ
ピトープに対する抗体との間の抗原−抗体型の反応を含
むものである。

本発明は、非常に高感度の診断アッセイ用のハイブリッ
ドタンパクの産生に利用すると特に興味深い効果が得ら
れる。つまり、エピトープを担持するハイブリッドタン
パクと該エピトープに対する抗体との間の免疫学的複合
体の生成を伴なう免疫反応の終了により、そうして形成
された該複合体中での担体タンパクの性質が修飾され、
タンパクの性質の変化は容易に判明し得るような場合で
ある。

この目的に使用し得るハイブリッドタンパクとしてはペ
プチド鎖の以下のような場所に挿入されたエピトープを
含有する酵素がある。

即ち、 該ハイブリッドタンパクがエピトープに対する抗体と免
疫学的に接触したときに、該複合体がハイブリッドタン
パクと該抗体との間で形成されるようにエピトープが露
出していること；非複合体状態のハイブリッドタンパク
に於いて酵素活性が保持されること；及び 複合体が形成されたときに、該複合体には前記酵素活性
が欠けていることである。

診断用アッセイに使用し得るもう一つのハイブリッドタ
ンパクには次のような場所にエピトープを挿入含有する
酵素がある。

即ち、 非複合体状態のハイブリッドタンパクに於いて酵素活性
が阻害されること； ハノゴ■旬げ１１　”／　ｉぐｈべＴピに一ブＬ−社オ
ス片体と免疫学的に接触したときに、ハイブリッドタン
パクと抗体との間に複合体が形成されるようにエピトー
プが露出していること； 前記複合体が形成されたときに、該複合体が酵素活性を
有することである。例えば以上の効果は、担体タンパク
がアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ又はβ
−ゴラクトシダーゼのようなビトーブに対する抗体が存
在しないときに保持されるが、ハイブリッドタンパクと
該抗体との間で形成される複合体中では前記酵素特性が
阻害されるようなものであるときに得られる。

こうして特に簡単に使用できる試薬が得られる。

この試薬を用いる診断アッセイは、 ハイブリッドタンパクを、エピトープに対する抗体とエ
ピトープを旧情するハイブリーフｉ−″々リパりとの間
の免疫学的複合体の生成を伴う免疫反応を可能にする条
件下で生物学的試料と接触させ；前記免−疫反応の反応
生成物と該酵素により加水分解される基質とを接触させ
； 基質の加水分解があればそれを物理を的又は化学的手段
により、或いは裸眼によって検出する。

ステップから成る。

このような反応は、加水分解が比色計又は分光光度計装
置によって検出し得る反応を含むような場合娑は特に容
易に達成し得る。この試験は、特に生物学的試料が液体
である場合には均一相で実施し得る。

このようなハイブリッドタンパクは上記定義の本発明方
法で作成し得るが、検出方法及びコンピテントなコロニ
ーの単離には更に別の満たすべき条件が存在する。実際
のところ、本発明方法は、保持すべきことが求められて
いるタンパクの生物学的性質（ここでは、決められた基
質を加水分解する能力）及び酵素に挿入されたペプチド
又はエピトープの生物学的性質（特に抗体によってこの
エピトープが認識され得る能力）とを同時に発現するか
又は発現させられるような産生物を発現するコロニーを
検出、単離するステップから成っている。

上述した診断方法用として適したハイブリッド酵素を得
る目的では、酵素活性がエピトープを特異的に認識する
抗体が存在しないときは保持され、該抗体と反応したと
きには阻害されるような条件を満足するハイブリッド酵
素を産生ずるコロニーを更に検出する必要がある。

逆に、特異基質を加水分解する酵素の天然の性質を発現
するという所望の該酵素の性質がエピトープに対する抗
体の非存在によって阻害され、該抗体の存在によって回
復するというような、エピトープを含有するハイブリッ
ド酵素の産生にも本発明方法は適用し得る。

従って、゛適当な環境内で最初のタンパクに求められて
いる性質を発揮し得る”ハイブリッドタンパクの能力に
関する上記の条件には所望の性質が発現されるについて
必要とされる進化のパラメーターも考慮に入れなければ
ならなくなる可能性があるということにも想到されるで
あろう。今の場合、適当な環境にはエピトープの存在が
更に必要とされ、それによって最初のタンパクに求めら
れる性質、例えば、酵素活性が該ハイブリッドタンパク
によって発現されることになる。

こうして得られたハイブリッドタンパクは前記の型の診
断アッセイに適当であり、但し、検出現象が逆転するこ
とはある。つまり、ハイブリッド酵素は、対応基質の存
在下で非修飾酵素の天然活４＆ルｚｓ羽″ｒ＆キー　−
女技社妄沃縫けＴビに−がＬ一対する抗体と該ハイブリ
ッドタンパクとの接触後に該酵素活性が回復するような
特性をハイブリッド酵素が有することも可能である。

本発明方法で得られるところのハイブリッドタンパクで
、タンパクの重要な性質とエピトープの性質を組み合せ
て使用するということは、診断用途には特に有利である
。実際、この方法を用いることによって構成成分を分離
することなく均一（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）相で酵素
免疫反応を達成し得るのである。

第４図は本発明の実施に用いる２種類のプラスミドの構
造を図解したものである。特に、該プラスミドはｐＢＩ
１３２２の誘導体から成り、この中に　ｌａｍＢの配列
が挿入されており、これはプロモーターＴＡＣ１２の調
節下にある。Ｐ／Ｂは上述した２つの断片の前者のＰｘ
ｕＩＩ／ＢａｍＨ１部位（ｌａｍＢの近位部分）に於け
る　ＩａｍＢとＤＢＲ３２２との結合を示し、Ｓ／Ｐ４
；ｔ　ｌａｍＢの前者Ｓ　ｔｕＩ　／　Ｐ　ｒｕＩ［部
位に於ける　ｌａｍ［３とｐＢＲ３２２との結合を示す
。ｐＡＣ工にはラクトースオペロンのリプレッサーを含
む　＋ａＣＩｑ配列が存在するが、ｐＢＢｏには該配列
は存在しない。

例えば、 生物学的試料にエピトープを特異的に認識する所定量の
ラベル抗体を加え、こうして得られた混合物とハイブリ
ッドタンパクとを、ラベル抗体及び生物学的試料中の抗
体（もし存在すれば）の両者とハイブリッドタンパクと
の免疫学的複合体を作成し、これによって前記所定量の
ラベル抗体と前記所定量のハイブリッドタンパクが非ラ
ベル抗体（もし存在すれば）とラベル抗体との間で競合
が起るように夫々調整されているような条件下で接触さ
せ、そして該生物学的試料中の抗体ｌを平衡条件下で免
疫学的複合体中に保持されていると判明したラベル抗体
の相対割合の関数として測定することにより成る可能抗
体量の間接的診所法がある。

もう一つのイン・ヴイトロに於ける、ハイブリッドタン
パクのエピトープに対する可能抗体量の間接的方法は、 アッセイすべき生物学的試料と、固体支持体表面上に固
定した既知はのハイブリッドタンパクを、ハイブリッド
タンパクのエピトープと検出すべき抗体（もし存在すれ
ば）との間に免疫学的複合体を生成せしめるような条件
下で接触させ、免疫反応生成物の免疫グロブリンを特異
的に認識するラベル試薬と前記で得られた免疫反応生成
物を接触させ、ここで該試薬は、例えば細菌タンパクＡ
、特にブドウ球菌（５ｔａｐｈｙ！ｏｃｃｏｃｕｓ　Ａ
ｕｒｅｕｓ）に対する免疫グロブリンに対する抗体であ
り；三つの部分から成る不溶化ラベル免疫学的複合体を
検出し； 任意に、該複合体を測定する、 ことより成る。

本発明はさらに生物学的試料に含まれる、ハイブリッド
タンパクのエピトープに対する可能抗体量をイン・ヴイ
トロで診断する為のキットにも係わる。

本発明の好適キットの一つは、 生物学的試料中の抗体（もし存在すれば）及び／又はラ
ベル抗体と免疫学的複合体を生成し得る所定量の本発明
のハイブリッドタンパク；ハイブリッドタンパクのエピ
トープを特異的にれた複合休みの関数として生物学的試
料中の抗体墨左澗中すへ為の拝金の汁確鬼昭曲總：抗体
及びハイブリッドタンパクを含有する免疫学的複合体を
検出し得る試薬、例えば、ラベル抗体が所定の酵素を含
有する場合には該酵素の基質；種々の免疫複合体の生成
を可能ならしめる適当な溶ｔｓ： を含む 本発明の好適キットのもう一つの例は、固体に結合した
本発明の所定量のハイブリッドタンパク； 該ハイブリッドタンパクのエピトープに対する所定量の
抗体； ハイブリッドタンパクのエピトープに対する抗体と該ハ
イブリッドタンパクの間、並びに免疫グロブリンとラベ
ル試薬との間の免疫反応を可能にする溶媒； 支持体結合ハイブリッドタンパクと該ハイブリッドタン
パクのエピトープに対する抗体との間に形成された３つ
の部分から成る免疫学的複合体を検出する為のラベル試
薬であって、このラベル試薬は免疫反応生成物の免疫グ
ロブリンを特異的に認識し得るものである、 を含むものである。ラベル試薬の例としては前述のもの
がある。本発明で使用する抗体はモノクローナル抗体が
好ましい。

以下の文献を引用し本明細書内容の一部とする。

−Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗａｉｔ、Ｓ、、　Ｗｙｃｈｏｗｓ
ｋｉ、Ｃ，Ｂｒｕｎｅａｕ、Ｐ、。

Ｂｌｏｎｄｅｌ、Ｂ、、　Ｃｒａｎｉｎｉｃ、Ｒ，、Ｈ
ｏｒｏｄｎｉｃｅａｒｕ、Ｆ。

ｅｔ　Ｇｉｒａｒｄ、Ｈｌ（１９８３）、　Ｐ、Ｎ、Ａ
、Ｓ、　（ＵＳＡ）　５０８０−５０８４　、及び −Ｗｙｃｈｏｗｓｋｉ、Ｃ，，Ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｗｅｒ
ｆ、Ｓ、、　５ｉｆｆｅｒｔ。

０、Ｃｒａｉｎｉｃ、　Ｉｔ’＋　Ｂｒｕｎｅａｕ、　
ｐ、　ｅｔ　Ｇｉｒａｒｄ、　Ｈ。

（１９８３）　Ｅｍｂｏ　Ｊｏｕｒｎａｌ、２．　Ｎ”
　　１１．２０１９−２０２４゜

【図面の簡単な説明】

第１図は、Ｃｈａｒｂｉｔ他より提案されたモデルの図
解である。 第２図は、挿入されたエピトープＶＰ１９３〜１０３の
アミノ酸及びＤＮＡ配列、並びに挿入部位を示す。 第３図は、プラスミドの挿入部位のアミノ酸及びＤＮＡ
配列を示す。 第４図は、プラスミドの構造を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）特定のタンパクをコードするヌクレオチド配列を
   最初から含有する核酸にエピトープを担持するペプチド
   をコードする挿入可能な別個のヌクレオチド断片を挿入
   することで該核酸を修飾する方法であり、その際、該修
   飾核酸のうち少なくとも一つがコンピテント細胞に導入
   された時、少なくとも、一方で選択された環境内で求め
   られている前記タンパクの生物学的性質ともう一方では
   該エピトープに特徴的な性質とを同時に表現し得るハイ
   ブリッドタンパクが産生されるような条件下で該修飾が
   行なわれるものであって、核酸をいくつかの部位で開環
   又は開裂して多数の直鎖状核酸を生成し； 多数の直鎖状核酸のイン・ヴィトロでの組み換え及びそ
   れと同時又はその後の挿入可能断片の前記核酸のうちの
   少なくともいくつかへの連結により再構成して、該核酸
   中の異なる部位に挿入された前記断片を含有する核酸を
   含む一連の再構成核酸を得； 前記一連の核酸でコンピテント細胞を形質転換しこの形
   質転換細胞を培養し； 一方で前記の適当な選択環境内でタンパクに求められて
   いる生物学的性質を他方で前記エピトープを担持するペ
   プチドの求められている生物学的性質を同時に発現させ
   られるようになったコロニーを検出し単離し； もし適当であれば、こうして単離したコロニーから上記
   挿入可能ヌクレオチド断片を適当な部位に挿入すること
   によって修飾された、該タンパクをコードするヌクレオ
   チド配列を含有する対応修飾核酸を回収する； ことより成る一連の操作を特徴とする方法。 ２　特定のエピトープを含有するペプチドを、特定の生
   物学的性質を発現するタンパクに挿入し、それが該タン
   パクをコードするヌクレオチド配列を最初から含有して
   いる核酸によつて形質転換されたコンピテント細胞内で
   該タンパク及び該ペプチドの選択された環境内に於ける
   重要な生物学的性質の損失を招くことなく産生され得る
   ような方法であって、 核酸を夫々異なる部位で開環又は開裂し、多数の直鎖状
   核酸又は核酸の断片を生成し； 多数の直鎖状核酸のイン・ヴィトロでの組み換えにより
   再構成し、それと同時又はその後に上記ペプチドをコー
   ドする挿入可能断片を前記再構成核酸のうちの少なくと
   もいくつかへ連結して、該核酸中の異なる部位に挿入さ
   れた前記挿入可能断片を含有する核酸を含む一連の核酸
   を得； 前記一連の再構成核酸でコンピテント細胞を形質転換し
   この形質転換細胞を培養し； 一方で前記の選択環境内でタンパクに求められている生
   物学的性質と前記ペプチドに求められている生物学的性
   質を同時に発現させられるようになったコロニーを検出
   し単離し； 元のタンパクの部位に挿入された、上記エピトープを含
   むペプチドによって修飾された上記タンパクを含有する
   か又は産生しているコロニーを回収し、該コロニーは元
   来該タンパクの有していた重要な性質の保持（又は該選
   択環境内での該重要な性質の顕示）と、該エピトープに
   特徴的な性質の獲得とを同時に適合し得るものであり； もし適当であれば、該修飾タンパクを回収する；ことよ
   り成る一連のステップを特徴とする方法。 （３）前記核酸の異なる部位に於ける開裂が該核酸に沿
   ってランダムに分布した部位で行なわれることを特徴と
   する特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （４）前記核酸の異なる部位に於ける開裂が該核酸に沿
   ってランダムに分布した部位で行なわれることを特徴と
   する特許請求の範囲第２項に記載の方法。 （５）各核酸ごとに異なる部位に於ける開裂が少なくと
   も一つの非特異的エンドヌクレーゼによって行なわれる
   ことを特徴とする特許請求の範囲第３項に記載の方法。 （６）修飾される核酸が環状であり、この核酸の開裂に
   よって該核酸の直鎖化が行なわれ、それに続くイン・ヴ
   ィトロに於ける組み換えによって異なる部位に挿入され
   た断片を含有する核酸を含む一連の再環化核酸が生成さ
   れることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方
   法。 （７）環状核酸がベクターであり、特定の制限酵素部位
   を含有するアダプターの存在下に組み換えを行ない、エ
   ピトープを含有するペプチドをコードする断片が該制限
   酵素に特有の付着末端を有しており、該断片が次いで該
   アダプターによって修飾ベクター内に導入された該制限
   酵素部位内に挿入され組み換えられることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項に記載の方法。 （８）環状核酸がベクターであり、特定の制限酵素部位
   を含有するアダプターの存在下に組み換えを行ない、エ
   ピトープを含有するペプチドをコードする断片が該制限
   酵素に特有の付着末端を有しており、該断片が次いで該
   アダプターによって修飾ベクター内に導入された該制限
   酵素部位内に挿入され組み換えられることを特徴とする
   特許請求の範囲第６項に記載の方法。 （９）上記ヌクレオチド配列中にコードされたタンパク
   が、通常コンピテント産生細胞の外表面に輸送されるか
   又は該細胞によって培養培地内に分泌されるタンパクで
   あることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載の方
   法。 （１０）特定のタンパクをコードするヌクレオチド配列
   又は少なくともその一部がｌａｍＢ遺伝子によって構成
   されていて、使用されるコンピテント細胞が細菌株であ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第９項に記載の方法
   。 （１１）上記コロニーの検出単離が、一方でλ受容体を
   用いるファージに対する形質転換細菌の感受性又はデキ
   ストリンに依存して増殖する該細菌の能力に、他方エピ
   トープを特異的に認識するモノクローナル抗体による該
   エピトープの認識によることを特徴とする特許請求の範
   囲第１０項に記載の方法。 （１２）ｌａｍＢタンパクをコードする配列を、該配列
   の全てを本ベクターにより多め形質転換されている大腸
   菌株又は他のグラム陰性細菌内で転写・翻訳させ得るプ
   ロモーターの調節下に含有するベクターであって、成熟
   ｌａｍＢタンパクの１４０〜１６０又は３７０〜３８０
   番目のアミノ酸をコードする領域内に位置する部位で独
   特のエピトープを担持するペプチド配列をコードするヌ
   クレオチド配列が挿入されていることを特徴とする前記
   ベクター。 （１３）挿入配列が４〜２７個のアミノ酸を含有するこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１２項に記載のベクタ
   ー。 （１４）挿入配列がポリオウィルスタイプ I のエピト
   ープ、特にペプチド；Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｌａ
   　Ｓｅｒ　ＴｈｒＴｈｒ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌ
   ｙｓをコードするヌクレオチド配列を含むことを特徴と
   する特許請求の範囲第１２項に記載のベクター。 （１５）より特定的にはｌａｍＢタンパクのアミノ酸配
   列の１４０〜１６０又は３７０〜３８０番目に位置する
   ２つのアミノ酸の間に、より特異的には１５３又は３７
   ４番目に位置するアミノ酸に挿入された特徴的なエピト
   ープを含有するペプチド配列を外表面上に露出させるよ
   うに含む、ファージλに対する修飾受容体を該外表面に
   担体する大腸菌細菌株。 （１６）特定エピトープに対する抗体によつて中和可能
   な病原性抗原に対する免疫学的調製物であって、特許請
   求の範囲第１５項の細菌をワクチンの製造に必要な適当
   な薬学的ベヒクルと組み合せて成ることを特徴とする該
   調製物。 （１７）酵素ペプチド鎖に挿入されたエピトープを含有
   する該酵素を含むハイブリッドタンパクであって、該エ
   ピトープは該ハイブリッドタンパクがエピトープに対す
   る抗体と免疫学的に接触したときに、複合体が該ハイブ
   リッドタンパクと該抗体との間で形成されるようにエピ
   トープが露出し；非複合体状態のハイブリッドタンパク
   に於いて該酵素活性が保持され；及び 該複合体が形成されたときに、該複合体には前記酵素活
   性が欠けているような位置に挿入されている前記ハイブ
   リッドタンパク。 （１８）エピトープを挿入して含有する酵素を含むハイ
   ブリッドタンパクであって、該エピトープは、ハイブリ
   ッドタンパクがエピトープに対する抗体と免疫学的に接
   触したときに、該ハイブリッドタンパクと該抗体との間
   に複合体が形成されるようにエピトープが露出し； 非複合状態のハイブリッドタンパクに於いて該酵素活性
   が阻害され； 前記複合体が形成されたときに、該複合体が酵素活性を
   有するような位置に挿入されている前記ハイブリッドタ
   ンパク。 （１９）生物学的試料中の可能抗体量を診断する方法で
   あって、 特許請求の範囲第１７項のハイブリッドタンパクと該生
   物学的試料を、エピトープを担持する該ハイブリッドタ
   ンパクと該エピトープに対する抗体との間での免疫学的
   複合体の生成を伴う免疫反応を可能にする条件下で接触
   させ； 前記免疫反応の反応生成物を該酵素によって加水分解し
   得る基質と接触させ該基質の可能加水分解を可能にし； もし基質が加水分解されればそれを物理的又は化学的手
   段、或いは裸眼によつて検出する；ことから成る前記方
   法。 （２０）生物学的試料中の可能抗体量を診断する方法で
   あって、 特許請求の範囲第１８項のハイブリッドタンパクと該生
   物学的試料を、エピトープを担持する該ハイブリッドタ
   ンパクと該エピトープに対する抗体との間での免疫学的
   複合体の生成を伴う免疫反応を可能にする条件下で接触
   させ； 前記免疫反応の反応生成物を該酵素によって加水分解し
   得る基質と接触させ該基質の可能加水分解を可能にし； もし基質が加水分解されればそれを物理的又は化学的手
   段、或いは裸眼によって検出する；ことから成る前記方
   法。