JPS60149388A - ｌａｍＢ遺伝子の少なくとも１部を含有する改良ベクタ−およびこのベクタ−で形質転換した微生物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ｔａｍ　Ｓ遺伝子の少なくとも１部あるいは
ｔａｍ　Ｓ遺伝子全体で改変した改良ベクターに関し、
このベクター自体は所定のアミノ酸配列をコードする所
定のヌクレオチド断片で構成されるインサートで改変す
ることが出来る。

本発明はまた、かかるベクターで形質転換され、上記の
所定のアミノ酸配列を含むノ・イブリッドタンパク質を
合成し得かつ自身の細胞膜外表面にノ・イブリッドタン
・ぐり質を軸沿ることが出来るようにされている微生物
菌株、特にＥ、ｃｏμに関する。

この技術分野に属するベクターについてはすでに先行刊
行物及び特許に記述されている。特に、１９８２年４月
２６日伺出願のフランス特許出願１８２０７２０１号に
はラクトースオペロンのプロモーターと上記オペロンの
２遺伝子の少なくとも１断片を持つベクターが開示され
ている。このベクターの特徴は、少なくとも１つの配列
、特にｊａｍ　Ｓ遺伝子の近位部分を、含む配列がこの
ベクター、特に前記２遺伝予断片中あるいは前記断片の
すぐ下流に挿入・されていることである。このｊａｍ　
Ｓ遺伝子の配列は充分長いので、このベクターで形質転
換した微生物、特にＬｃｏＡｉは、ラクトースオペロン
のプロモーターの制御下でこれら細胞の外膜中に輸送さ
れるハイブリッドタンパク質を産生ずることが出来、こ
のハイブリッドタンパク質は、λファツジの受容体及び
β−ガラクトシダーゼが含みかつそれぞれｔａｍＢ及び
Ｓ遺伝子によシコードされているアミノ酸配列を有する
。ある場合には、ハイブリッド・タン・ぐり質は前記形
質転換した微生物の培地中に分泌され得る。

しかしながら、外膜ノ・イブリッドタンノぐり質を生産
するのは困難であり、また、ヌクレオチドの相当する配
列の転写及び翻訳を確実になし得る条件で形質転換した
微生物を培養したとき、一定レベルの不安定さを伴なっ
た杉、あるいは合成したハイブリッドタンノやり質のあ
る種の毒性すなわちそのためにか外シの比率で培養細胞
の溶菌を引き起したシ、あるいは同時にその双方を伴う
ことがありえた。

本発明の目的は、上記困難の少なくとも一部を取シ除く
ことであシ、特に所定のアミノ酸配列をコードするヌク
レオチド配列からなるインサートをも含む前述したタイ
プのベクターを提供することである。この所定のアミノ
酸配列は、適当な微生物、偶にＥ、　ｃａｌｌでの合成
の誘発が望まれるものであり、その際の条件は、相当す
る発現したタン本発明の基礎になった発見は、＋４ｊ′
９Ｈ魅せにそを予め形質転換することにょυ得られると
いうことである。この改良ベクターに於いては、９を定
のアミノ酸配列をコード化するヌクレオチド断片自よっ
て定義される配列と所定のヌクレオチド断片との全体の
転写及び翻訳が可能となるに充分強力本発明の改良ベク
ターｉ：、Ｆ５［定のアミノ酸配列をコードする所定の
ヌクレオチド・インサートを含むヌクレオチド配列で改
変されており１前記ヌクレオチド配列は、前記改良ベク
ターで予め形質転換した。ｌｑ、ｃｏ７１　菌株の中で
前記ヌクレオチド配列の全体を実質的に転写及び翻訳し
得る程に充分強力なプロモーターの制御下に配置されて
いる。本発明の改良ベクターの特徴は、前記のプロモー
ターに対し近位にあシかっ前記所定のヌクレオチド・イ
ンサートの上流にある前記ヌクレオチド配列の近位部分
（ｐａｒｔｉｅ　ｐｒｏｘｉｍａｌｅ）が、相当するタ
ン・臂り質のＮ−末端部の最初のアミノ酸を少なくとレ
オチド配列の遠位部分（ｐａｒｔｉｅ　ｄｉｓｔａｌｅ
）が、肩粍己刊淀功Ａ≠シ用く井陶■酬酬給廿で■叩相
尚するタンパフグ１のＣ−末ｒ１“）：部の最後のアミ
ノ酸を少なくとも２０　（４，１コードするｔａｍ　Ｂ
遺伝子イ麦部（ｐａｒｔｉｅ　ｐｏａｔぷｒｒｅｕｒｏ
　）を有することでアリ）ｌｎ＋ｎ　ｎ　遺伝子のｆｊ
！Ｊ記前部及び後部並びに６！１ｉｊｊヌクレオナト薗
片は、前記プロモーターの孔１掬１ｊ下でのドされたタ
ンパク質のうちの最初のアミノ酸少なくとも１８０個及
びｔｌｉ後のアミノｊ変少なくとも２０個を奪＃牟扛イ
イし、’（Ｗ方では前記り「定のアミノ酸配列を有する
ように、プロモーターとそれぞれ同位相となっている。

事実として判明したことは、倚んとするアミノ酸配列を
コードする所定のヌクレオチド断片の下流に、相当する
タンパク質のＣ−末端部の最後のアミノ酸少なくとも２
０個をコードする―Ｂ遺伝子後部（以下、簡略のためｔ
ａ＋ｎ　Ｂ遺伝子のＣ−末端部とする）が存在すること
が、形質転換の好条件を得る必須条件であるということ
であった。

ｌｎｍ　Ｂ遺伝子のＣ−末端は、それが変容していても
、事実、かようにして改変したベクターがコードするタ
ンパク質の微生物に対する毒性の著しるしい増加となっ
て現われる。

７ａｍ　Ｂ遺伝子のとのＣ−末端部を含むベクターを上
述した条件で製造することは、７ａｍＢ遺伝子断片から
栴成された配列と転写及び翻訳をさせようとするアミノ
酸配列をコードするインサートとの融合物を利用するベ
クターを製造するという文献中に詳述された数多くの試
みに逆らうことでおる。すなわち、これらベクター内の
融合物に於いては、一般にＡａｍ　Ｂ遺伝子断片は、常
にインサートの上流にのみ配置され、しかも多くの場合
、４四Ｂシグナル配列及び細胞外膜を通してハイブリッ
ド・タンパク質を輸送するのに心安な情報を含むと推測
される４凹Ｂ遺伝子のＮ−末端部であ（ｐａｒｔｉｅ　
１ｎｆｅｒｉｅｕｒｅ）の最少１晶さに関する条件も同
じく重要なことでおる。事実上述した条件、すなわち、
相当するタンノ臂り質のＮ−末端部の最初のアミノ酸少
なくとも１８０個をコードする前記前部（または、前記
と同様に１．４晶ｍＢ遺伝子のＮ−末端部と略称する）
が合成したタンパク質を安定化する観点からも同様に重
要であることが確認されている。Ａａｍ　Ｂ遺伝子のＮ
−末端部がインサートの上流でよシ短かいベクターによ
ってその合成が誘導されるハイブリッドタンパク質は、
放射性マーカーの存在下で行なわれるタンパク質の特性
テストによって検出されるように、非常に不安定になる
。

前記の４四Ｂ遺伝子の前部及び後部が全体で充分な総数
のヌクレオチドを有すると好ましく、こ−ターを含有す
るプラスミド内の前記囚プロモーターの制御下で同位相
に配置されれば、予め前記シラスミドで形質転換したＥ
、ｃｏｔｉ菌株中で安定でしかもＥ、ｃｏｔｉにとって
非致死性のタンＡり質をこの微生物の外膜上で取得出来
るよう轟る。

Ｕ見プロモーターを使用するベクターの場合（例えばＰ
ｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、Ｖ
ｏｌ　ｓｏ１頁２１−２５．１９８３年１月年中月刊中
載のＩ（、Ａ。

ＤＥ　ＢＯＩＩＣＲ等の論文に記述されている）、形質
転換した微生物で合成したハイブリッドタンパク質の毒
性すなわち致死性は下記の条件で評価できる。

有利には、使用ｔｉ＝微生物は、最初λファージに耐性
のＥ、ｃｏｔｉ変異株及び／又はマルトデキストリン（
ｍｏｌｔｏｄｅｘｔｒｉｎｅ　）含有培地中で自己増殖
することが出来ないＥ　、　ｃ　ｏｔｉ変異株である。

事実、小孔がマルトデキストリンに対して作用するよう
に働く。本発明によるベクター（または７晶ｍ　Ｂ遺伝
子すべてを有するベクター（野生）でかかる微生物を形
質転換すると、これらの変異株のλファージに対する感
受性及び／又はマルトデキストリン上、特にイソプロピ
ルチオガラクトシド（Ｉ　Ｐ’ｌＵ　）で相成される誘
導物質の存在下での増殖能が復元される。

本発明の範囲内で行なわれたテストに於いて使用した旦
、凹の変異株はＢＢ１菌株＝　ｔｈｒ　Ａｅｕ胚す肋」
４■Ｙ１μぴＡ幻竪５世Ａ里Ｅ。

ラスミドｐ　ＢＢＯで形質転換された前記菌株は、便希
１９８３年９月６日、受託番号第１−２３９でパリ（Ｔ
）　Ａ　スツール研究所（Ｌ／工Ｎ５ＴＩＴＵＴ　ＰＡ
ＳＴＥＵＲ）のＣ、Ｎ、Ｃ、Ｍ、に寄託されている。望
ましいベクターはＢＥ　ＢＯＥＲ等の９１１２プロモー
ターをインサートすることによシ得られたプラスミドｐ
ＢＢｏよシ誘導され、前記ｊａｃ　１２プロモーターは
（Ｊ　、Ｍ、ＣＬＥＭＥＮＴ　、Ｄ、ＰＥＲＲＩＮ及び
Ｊ　、　ＨＥＤＧＰＥＴＨ。

１９８２年、　Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇ、１８５，３０２”
３１０）記載の７’　７　スミトｐＨ８Ｆ１の二部Ｒ１
及び彫り車１部位間で、Ａａｍ　’　Ｂ遺伝子ノ５ＨＩ
ＮＥ−ＤＡＬＧＡＲＮＯ配列の直前にインサートされて
いる。

ｐＢＢｏによる前記変異株の形質転換及びＬｕｒｉａ固
体培地上ＩＰＴＧＩＯΔ１の存在下での形質転換微生物
の培養によって、７晶ｍＢがコードしているタンパク質
が過剰に産生（５ｕｒｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）される。

形質転換した細菌は細胞溶菌が全く認められず、コンフ
ルエント（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）になるまでヤ規則的
に増殖する半透明コロニーを形成する。

ある種のベクター、例えばｔａｍ　ＢのＣ−末端部の最
後のトリプシン）１０個ｆｒｖ、１．　更されたベクタ
ーの致死性は、ＩＰＴＧに対する過度の感受性として現
われ、−世代後ですべての細胞の溶菌を引き起こすこと
もあシうる。

逆に、本発明に依らないベクターによって合成されたタ
ンパク質の安定性の欠如は、溶菌すなわち細胞壁の破壊
後に回収されかつ放射性アミノ酸、例えば６５Ｓ−メチ
オニンで標識された形質転換細胞の全細胞抽出物を免疫
沈降したあとで、ＩＴＯ等の方法（Ｋ、ＩＴＯ，Ｐ、、
Ｔ、ＢＡＳＳＦＯＲＤ及びＪ、Ｒ，ＢＥＣｉ（ＷＩＴＨ
。

１９８１年、　Ｃｅ１１，２４．７０７−７１７　）に
よって評価し得る。特に翻訳が早期に中断されたときの
形成したタンパク質の安定性は、形成したタンパク質が
１０％０％ドブフルナトリウム（ＳＤＳ）で改変したア
クリルアミドグル上での分画テストにおいて、オートラ
ジオグラフィーによってすみやかに検出されなくなるよ
うなタンノや夕質の減成分解として現われる。この不安
定性は特に、本発明によるベクター中のり＝ｍ　Ｂ遺伝
子の近位部が短かすぎるとき、または会見Ｂの適当な部
位中に導入されたインサートがＡａｍ　Ｂ遺伝子の後部
のＣ−末端部の読み取フ相のずれを引き起こすときに観
察される。

前述のテストは、本発明によるベクターが最良の条件で
外膜のハイブリッドタンパク質を合成し得るために応答
しなければならない条件の決定要因となっている。上記
に記載した条件で所定のアミノ酸配列をコードする所定
のヌクレオチド断片をｈ四Ｂ遺両方中にインサートする
と、形質転換細胞を、溶菌しないコロニーを形成しつつ
ＩＰＴＧの存在下で増殖することが出来るようにするの
に適したベクターが得られる。また、免疫法政しうるタ
ンノｆり質は長時間存続する、すなわち安定している。

ｐＢＢｏで形質転換した変異株が、これをＩＰＴＧを含
有する適当な培地中で培養したときに細胞外膜中に見い
出されるハイブリッドタンパク質を合成する能力に関し
て上記した確認事実は、更に、ｐＢＢｏ山来ベ由来−中
に本発明に関して上記に定義した条件下で所定のインサ
ートを挿入することによって得られたｐＢＢｏ由来ベク
ターで改変された同様な細胞の培養に於いてもみられる
。この場合金むハイブリッド・タン／Ｇ’り質を朕の外
部に有するコロニーが得られる。上述した条件下でコロ
ニーが増殖するという早実はインサートのクローン化及
び発現が実現されたことを証明するものである。また、
上述した突然変異を有さない耳・」μを形質転換するこ
とも出来るが、勿論この場合、ハイブリッド・タンパク
質の検出には他の検出方法を使用する必要があシ、例え
ばインサートがコードするアミノ酸配列に対して、ある
いはこのアミノ酸配列を含有するタンパク質に対して予
め形成された抗体を利用する。

経験によると、７ａｍＢ遺伝子の前記前部及び後部が全
体でこの遺伝子のトリジレット４２０個のうちヌクレオ
チドトリプレット少ガくとも３５０個を有すると最良の
結果が得られる。前記遺伝子で件Ｂ遺伝子のヌクレオチ
ドのすべてを実質的に含んでも有利である。考えられ得
る減少した欠失および４−Ｂ遺伝子の二つの部分のある
配列の変更は、このベクターの全体の特性を実質的に変
えることのないようなものでなければならな（′ｏ上記
テストの記載から当業者は、いかなる情況に於いても、
本発明によるベクターの特性全体を変えることなくなし
得る欠失または変更の結果をテストするための必要事項
を得ることが出来る。また、ベクター中に所定のインサ
ートを挿入する部位の選択と宏びｊａｍ　Ｂ遺伝子の前
部及び後部の相対的な長さとの、後に形質転扱するａ菌
に対する影響のｆｉｍ誌に関しても上記と同じである。

一般的に云って、特に４四Ｂ遺伝子の前部及び後部が完
全な遺伝子のヌクレオチドのほとんど全体を含有してい
初のアミノ酸をコードするトリプレットから出発して行
なわれる）。

プロモーターに関しては、上述したように全配列り・些
すμθ中で転写及び翻訳し得る程度に充分強力な他のす
べてのプロモーターを使うことができる。ｔａｃ　７°
ｒ：１モーターが好ましくはあるが、ムＣ及びｔｒｐプ
ロモーターも同様に有効に使用することができる。

本発明の好ましい態様によれば、選択したプロ訳停止コ
ドンがλフアージ受容体の最後のアミノ酸（４２１番目
のｔｒｐ　）の直後に配置されていると好ましい。

本発明ベクターは４９μを形質転換ぜしめうる核酸いず
れによっても惜成することが出来る。

好甘しくけ、プラスミド例えばｐＢＲ３２２，場合によ
ってはファージを使用する。

４四Ｂ造献子全体またはおまＤ重要でない小部分（例え
ば配列３５０〜４００）が欠失した遺四子を有するベク
ターの配列中にインサートを挿入するには既に知られて
いるすべての技術を用いることができる。ベクターがプ
ラスミドから々る場合には、制限酵素を使用してプラス
ミドを直線化し、好ましくはＫｌｅｎｏｗポリメラーゼ
の存在下で適当なヌクレオチドを用いて制限末端部を二
本鎖に形成（すなわち平滑末端化、ｂｉｃａｔ４ｎａｒ
１ｓａｔｉｏｎ）した後、ヌクレオチドの短い配列（″
リンカー″。

これはｔａｍ’　Ｈの相当する部位に導入したいインサ
ートの粘着性末端に相当する制限部位を有している）を
連結し、こうして改変された直線状シラスミドとインサ
ートを有するヌクレオチド配列とを適当な制限酵素によ
って従来の条件で同時に処理し、特にＴ４　ＤＮＡ−！
Ｊガーゼの存在下で前記断片同士を連結して上記で選択
した位置にインサートを含有するプラスミドを再構成す
ることができる。

以下余白 本発明はまた。微生物の表面に漂出しかつ前記インサー
トによりコード化された所定のアミノ酸配列を有するハ
イブリッドタンパク質を含む形質転換微生物に関する。

本発明はかかる形質転換株の製造方法にも関し、この方
法は、λフアージ受容体を保持している微生物のカテゴ
リーに属する微生物、特に盈、ｃｏＡｉを上述したベク
ターで形質転換し、形質転換された菌株を選択し、適当
な培地で細胞の外膜上に前記ハイブリッドタンｉＱり質
を産生ずる形質転換株を培養することを特徴としている
。好ましくは、使用される菌株は、最初はλファージに
耐性であるか及び／又は最初はマルトデキストリン含有
培地で自己増殖し得ない変異株である。

形質転換した菌株は、その後前記菌株がλフアージに対
して非耐性になっているか及び／又はマルトデキストリ
ンを含有する培地中で増殖しうるようになっているかに
よって選択される。場合によってハイブリッドタンパク
質は、特に細胞壁の破壊あるいは情態したあとで、前記
微生物から、特にグル分画によって、また場合によって
はハイブリッドタンパク質を識別する免疫学的テストを
実施して回収することができる。例えば、アミノ酸配列
または前記アミノ酸配列を有するタンノ臂り質に対して
予め形成された抗体が使われる。

本発明の捕捉的な特徴については本発明によるベクター
製造に関する好ましい態様についての以下の記載から明
らか′となるであろう。

製造 ｐＢＢｏ中に含゛まれるｔａｍ　Ｂ　３１伝子中のＳｍ
ａ　ｌ制限酵素によって認識さ・れるヌクレオチド部位
（位［１８３）を選択して、ＨＢｓ抗原の一部をコード
する前記ＤＮＡ断片を挿入するために使用した。

ヌクレオチド４４個からなる前記断片は、Ｂ型肝炎ウィ
ルスのウィルスゲノムのＳ遺伝子を、前記ゲノム（ＤＮ
Ａ−ＨＢＶ）の４通Ｒ１部位（位置０）に対してヌクレ
オチド位置１１１及び１５５で、２顯すＮｌ　ｆｉｉｌ
Ｊ限酵素によって消化して得られた。前記断片の末端部
を次いでＫｌｅｎｏｗポリメラーゼによって処理し、前
記の得られｆｃ断片の一本鎖末端部を二本鎖にした。こ
うして得られた断片の末端に。

Ｔ４ファージのりガーゼ酵素の存在下で、化学合成によ
って１４ｆられた二つのオリゴゞ・ヌクレオチドを連結
した。この二つのオリゴ・ヌクレオチドの一次配列ばＢ
ａｍＨＩにより認識されるようにした。こうして改変さ
れた断片にＢａｍＨＩを作用させてＢａｍＨＩ粘着性末
昂１を（相生しブこ。最終的に得られた断片を再度Ｔ４
ファージのＤＮＡ−リガーゼで処」呈した０、５ａｍＢ
由来ヌクレオチド・トリブレット約１８３個を含む近位
部分と、これに続くアミノし”２３８個忙ヨードしてい
るトリルソトを実質的に含んでいるカニＢの配列で構成
された遠位部分との間に配置されたＤＮＡ−１（ＢＶの
Ｓ遺伝子由来インサートを有する再構成プラスミドを用
いて、上述した県外でＢＢＩ函株を形質転換した。次に
、ＩＰＴＧの存在下で誘導される形質転換てれたＥ。

−ｃｏｌＡの培・Ｎ物の外膜上に形成されたハイブリッ
ド・タンパク質の免疫学的特性のレベルについて検剖し
た。このために、特にＥＬＩＳＡテストに於いて抗ＨＢ
ｓ血溝と反応する能力捷だはＩＴＯ等によって記述され
ているようなテストに於ける。／、ａｍ　Ｂ遺伝子の断
片の識別について検討した。

勿論、Ｂ型肝炎ウィルスのＳ遺伝子から抽出したＤＮＡ
配列を、同じような条件下で発現させたい他のすべての
ヌクレオチド配列とＩＮきかえることが出来る。例えば
、他のすべてのウィルスケゝツムから抽出したインサー
ト、例えばポリオ壕ブζはアフタ熱のウィルスの免疫原
性ペプチド及び毒素の断片または特別な特性を有する他
のすべてのタン・ぐり質をコードするインサートを使う
ことが出来る。一般的に、本発明によるベクターは、原
核生物または真核生物の任意のペグチド配列の発現及び
こうして形質転換した微生物菌株の細胞膜を通しての輸
送に適している。

従って本発明は、微生物の外膜を通過して輸送されうる
ペゾチド配列に関する形質転換微生物の相互挙動の特に
興味ある研究手段を提供する。更に本発明においては、
所定構成のタンノ４り質を徴用抗原を担持する媒体とし
て直接使用し得るように、細菌宿主（細菌宿主が無害の
場合）上に固定したワクチン接種用ウィルスタンｉ＋り
質を利用するワクチン成分の研究が可能になる。

勿論、上述したことから明らかなように、本発明は上記
の実施態様に限定されることなく、すべての変形を包含
する。特に前述の実施態様では、ｔａｍ　Ｂ遺伝子また
はその１部分を特に考慮に入れた。当然のことながら、
同一のポリペプチド丑たは同じような７時性を有するポ
リペプチドをコードしうるＤＮＡ捷／こはＤＮＡ断片の
他のすべての形態は。

’）＞　％Ｆ　請求のｊｉｉｌｊ囲に記載した保両範囲
内に入る均等物と考えられたい。−例として、λファー
ジの受容体、場合によってその前駆体に相当するメツセ
ンジャーＲＮＡの酵素的複製によって得ることができる
ｃ　ＤＮＡ配列が挙げられる。かかるｃＤＮＡまたは相
当するＭｉＪ部及び後部は、ハユＢ遺伝子断片に関して
既に記載したように、専門家には良く知られている遺伝
子組換法を使用してプロモーターの制御下に配置できる
のは言うまでもない。

本発明は工、吐旦によって構成される微生物に限定され
るものではなく、同様な技両を異なる種類の微生物例え
ばｓｈｉｇｈｅｌ　ｌａｅに応用できることに注意され
たい。前記微生物は同様に上述した条件のもとで、外膜
のハイブリッド・タンパク質を合成することが出来る。

より一般的には１本発明ｔＩｉｔた選択されたベクター
・プラスミドによって最後に、ＭＡＮＩＡＴＩＳ、　Ｆ
Ｉ’ＬＩＴＳＣ）Ｉ及びＳＡＭＢＩ’ｔＯＯＫ当然のこ
とながら、他の従来技術のいずれも使用することができ
る。例えば、Ｈ，Ａ、　ＤＥ　ＢＯＥＲ等の上記刊行物
中に記載の技術を餅うことも可能であろう。

【図面の簡単な説明】

添伺の図は、ｋ旦Ｂ遺伝子の全ヌクレオチド配列および
コートしているアミノｆｉｌ　／４己列を示ず。 ｆ（埋入ブー゛１　川　１〜１　、諒　薯Ｘｏｔｎｚ　
ｏＩ−ＩＩ＋ｏａｔｈ　ｏｐリ　０ｌ−ｔＥ−１０１’
１ｊ（ＪＦ飄く　ヘニリ　のニド　リニリ　いのＱ　リ
＋−１［Ｊへｒ＠べ　僧べ　へＱＥ？　へνべ　へのＨ
へ句０Ｉ−ＩＯりＨの０　ρリ　シｄ→　のＨのり　・
、−１べ　飄＜　のｈ　、−ｔｏ　二ＨのＨに（Ｊ　、
−＋＜　目’Ｃ１１７’１．）　Ｑ、Ｅ−１づく　フ＜
　αＵ　鈎０　αＯカベ 、−１（Ｊ　Ｈベ　リく　Φ（ＪＦ−１ベ　スくづＯい
Ｏ田く　のＨ■リ　Ｈべ 刃り　づＥ−Ｉ　のＥ−＠１リ　−ＯコくＨＯＨリ　ニ
ド　のべ　ＧＪ（Ｊ　Ｓ＜ｏ′ＩＱ　弓Ｑ　Ωバ→　句
０　蛸Ｅ−＋ｔｙ口りロパ→　絢ト　トＵ　−日　コＯ
口０ １／ｌべ　、αＵ　、−＋Ｏニリ　ωＨカベ弓Ｏｐ＜　
Ｌ７Ｉリ　ν鵡　ｒ−＋Ｕ　句く、−ＩＥ−１ｃ＋ｕ　
リ０　弓日　〉憧Ｑ　αＨづＥ−１ｅ［−１凶＜　ＨＣ
Ｊ　、ｑａ　カベ＞ＯＱｌ［−１、−＋ｚ　司り　−０
化０コｏ　：ｊ＜　コａ　ｌ−１（Ｊ　（イ）く　の８
１υｈ　（ＩＪＥ−１０ト　シ〔く　ン□＜　ｇＦ−４
＋＋（Ｊ　＋ｈ　＋−１［Ｊ　ｕｈ　ｓ＜　四ＨいＨα
０＋リ　αリ　トド　田く 冑Ｏ絢Ｕ　田ｉ−ｔ、　＋＜　、−ｔｏ　、−＋（Ｊ（
づ（Ｊ　、＋Ｊｓ　＞ａ　■Ｕ　■Ｏ句Ｑ１−ＩＦ−１
＼リ　鈎ｈ　、−ＩＦ−１αＯ−１−＋：＞＜　−４０
ΦＯづ日　−く　句ト ＪＪ［−１む〔り　のく　〉リ　ウＱ　〉０αＵ　へＵ
　αＬｌｌ＋−鈎じ　諷り １ｎｓｓ、　ａｄ、　−１＜　ｉｋ　（１１（Ｊ　、−
＋０（ｄべ　弓じ　いＵ　＞ａ　のＨひワ （その４） ＴＧＧ　ＡＣＣＴＴＣＧＧＴ　ＧＣＣＣＡＧ　ＡＴＱ、
　４００ ｐｈｅ　ａｓｎ　ｇｌｙ ＴＴＣＡＡＣＧＧＣ １０ ｓｅｒ　ａｓｐ　ｇｌｕ ＡＧＣＧＡＣＧＡＧ ２０ ｇｌｕ　ｉｌｅ　ｔｒｐ　ｔｒｐ ＧＡＡ　ＡＴＣＴＧＧ　ＴＧＧ 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ、４　識別記号　庁内整理番号０発　明
　者　ベルナデット・ブージ　フランス国、ニーホッケ
　ン・２ ０発　明　者　ジャンーリュック・グ　フランス国、ト
ン ■出願人　アンステイテユ・ナシ　フランス国、オナル
・トウ・う・サ　トルヒアツク ンテ・工・ドウ・う・ ルシエルシュ・メテイ カル ■出願　人　サンドル・ナシオナ　フランス国、ル・ド
ウ・う・ルシエ　５ ルシュ修シアンナイフ イク ９２２９０・シャントネー、リュ・ドユ・アルボ７５０
１５・パリ、リュ・ドユ・アモー・１２７５６５４・パ
リ・セデクス・１人　リュ・ドウ・、１０１ ７５００７・パリ、ケ・アナトール・フランス、１二■
−串し１ｉ　ネｒ１３　Ｕ、Ｊ下　古昭和６０年１月Ｉ
Ｉ日 １．８（’ｌの表示　１１（１和５９年持訂願第１８６
２４４号２、発明の名称　ムザＢ遺伝子の少なくとし１
部を含有づる改良ヘクターｄ３よびこのヘクターで形質
転換した微生物 ３、ンｄｉ正をりる者 事イ′１どの関係　９、旨′１出願人 名　利−シ７ンスデイテユ・パス）・ウール（ｉＪ　ｈ
１２名） ４、代　理　人　東≦４都新宿区新宿１丁目１番１４号
　山田ビル（郵便？ｒ１ｉ　＋６０）　電話（０３）　
３５４−８（＋２３）１式　６へ　（内容に変更なし）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）所定のアミノ酸配列をコードしている所定のヌク
   レオチドインサートを含有するヌクレオチド配列で改変
   されている改良ベクターであり、前記ヌクレオチド配列
   は、前記改良ベクターで予じめ形質転換した大腸菌（Ｅ
   、ｃｏＡｉ）菌株中でこのヌクレオチド配列全体を実質
   的に転写および翻訳し得る程充分強力なプロモーターの
   制御下に配置されておシ、前記プロモーターに対して近
   位にｓｂかつ前記所定のヌクレオチドインサートの上流
   にある前記ヌクレオチド配列の近位部分は、相当するタ
   ンｉ４り質のＮ−末端部の最初のアミノ酸の少なくとも
   １８０個をコードしているＡａｍ　Ｂ遺伝子前部を含ん
   でおシ、前記ヌクレオチド配列の前記所定のインサート
   の下流に位置する遠位部分は、相当するタンパク質のＣ
   −末端部の最後のアミノ酸の少なくとも２０個をコード
   しているｔａｍ　Ｂ遺伝子後部を含んでお’ｊ）　、ｔ
   ａｍＢ遺伝子の前記前部および後部ならびに前記ヌクレ
   オチド断片はそれぞれ７０口モーターと同位相におり、
   その結果前記プロモーターの制御下での前記配列の翻訳
   によって得られるハイブリッドタンパク質は、一方でそ
   れぞれｔａｍ　Ｂ遺伝子がコードしているタンパク質の
   最初のアミノ酸の少なくとも１８０個および最後のアミ
   ノ酸の少なくとも２０１１ｆｆｉを含有し、他方で前記
   所定のアミノ酸配列を含有していることを特徴とする改
   良ベクター。
2. （２）　ｚａｍ　Ｂ遺伝子の前記前部および後部が、全
   体として、ｔａｃ７’ロモーターを含有するシラスミド
   の内部にｔａｃプロモーターの制御下回位相でこれらの
   部分を配置した場合、このプラスミドで予じめ形質転換
   した大腸菌（Ｅ、　ｃｏｔｉ　）菌株中この微生物の外
   膜上で安定かつ大腸菌（Ｋ　−ｃ　ｏｔｔ　）に対して
   非致死性のタンノぐり質を取得し得るに充分な数のヌク
   レオチドを含んでいることを特徴とする特許請求の範囲
   第１項に記載のベクター。
3. （３）　ｔａｍＢ遺伝子の前記前部および後部が全体で
   ヌクレオチドトリジレットを少なくとも３５０個有する
   ことを特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のベクタ
   ー。
4. （４）　７部ｍＢ遺伝子の前記前部および後部が全体で
   ｔａｍ　Ｓ遺伝子のヌクレオチドをほぼ全部含むことを
   特徴とする特許請求の範囲第１項に記載のベクター。
5. （５）前記プロモーターの制御下で転写されかつ翻訳さ
   れるヌクレオチドの最初のトリプレット（複数）がｔａ
   ｍＢ遺伝子の前部に特有のものであることを特徴とする
   特許請求の範囲第１項乃至第４項のいずれかに記載のベ
   クター。
6. （６）前記プロモーターがｔａｃプロモーターであるこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第５項のいず
   れかに記載のベクター。
7. （７）　フ０ラスミド、特にｐＢＲ３２２由来のプラス
   ミドから構成されることを特徴とする特許請求の範囲第
   １項乃至第６項のいずれかに記載のベクタ（８）特許請
   求の範囲第１項乃至第７項のいずれ（９）前記所定のア
   ミノ酸配列を含むタンパク質を外膜上に有することを特
   徴とする特許請求の範囲第８項に記載の微生物。 α０）細胞外膜の外部に露出しかつ所定のアミノ酸配列
   を含有するハイブリッドクン・臂り質を有する大腸菌（
   Ｅ、ｅｏ７１）菌株の創成方法であって、大腸菌（Ｅ、
   　ｃｏｔｌ　）の変異株好せしくけ最初λファージに耐
   性の変異株および／または最初マルトデキス）　ＩＪン
   含有培地中で自己増殖不能な変異株を特許請求の範囲第
   １項乃至第７項のいずれかに記載のベクターで形質転換
   し、λファージに非耐性になった形質転換株および／ま
   たはマルトデキストリン含有培地中で増殖可能になった
   形質転換株を選択し、外膜上に前記ハイブリッドタンパ
   ク質を産生ずる形質転換株を適当な培地中で培養するこ
   とを特徴とする方法。