JPH06261746A - 高収量の組換え産物の産生宿主体 - Google Patents
高収量の組換え産物の産生宿主体Info
- Publication number
- JPH06261746A JPH06261746A JP5269020A JP26902093A JPH06261746A JP H06261746 A JPH06261746 A JP H06261746A JP 5269020 A JP5269020 A JP 5269020A JP 26902093 A JP26902093 A JP 26902093A JP H06261746 A JPH06261746 A JP H06261746A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- lon
- gene
- proteins
- cells
- host
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 132
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 97
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 46
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 46
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 45
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 32
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 28
- 101150043276 Lon gene Proteins 0.000 claims description 72
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 63
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 61
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 21
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 13
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 13
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 7
- 101150090155 R gene Proteins 0.000 claims description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 4
- 108700026215 vpr Genes Proteins 0.000 claims description 4
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 34
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 24
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 14
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract description 3
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 abstract description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 92
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 88
- 101100235786 Rattus norvegicus Lonp1 gene Proteins 0.000 description 54
- 239000000047 product Substances 0.000 description 53
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 27
- 101150106872 rpoH gene Proteins 0.000 description 21
- 108010023294 Protease La Proteins 0.000 description 20
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 20
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 20
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 19
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 19
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 19
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 18
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 18
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 18
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 18
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 17
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 15
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 15
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 15
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 14
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 12
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 12
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 11
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 11
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 10
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 10
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 10
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 10
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 10
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 9
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 9
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 9
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 8
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 8
- 101150098156 tsx gene Proteins 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- 101100343677 Escherichia coli (strain K12) lon gene Proteins 0.000 description 4
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 4
- FSBIGDSBMBYOPN-VKHMYHEASA-N L-canavanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCONC(N)=N FSBIGDSBMBYOPN-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- FSBIGDSBMBYOPN-UHFFFAOYSA-N O-guanidino-DL-homoserine Natural products OC(=O)C(N)CCON=C(N)N FSBIGDSBMBYOPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 4
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 4
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 4
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 4
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 3
- 108010071550 ATP-Dependent Proteases Proteins 0.000 description 3
- 102000007566 ATP-Dependent Proteases Human genes 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 3
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 3
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 3
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 3
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 3
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 150000002972 pentoses Chemical class 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 101150010939 tpa gene Proteins 0.000 description 3
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 2
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000010039 intracellular degradation Effects 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000009790 rate-determining step (RDS) Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 2
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- FEGMUTASCDZUMG-JTQLQIEISA-N (2S)-2-amino-N-methoxy-N-naphthalen-1-ylpropanamide Chemical compound CON(C(=O)[C@H](C)N)c1cccc2ccccc12 FEGMUTASCDZUMG-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- WXSTZZVBULFWJM-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-(cyclohexa-1,3-dien-1-ylamino)propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC1=CC=CCC1 WXSTZZVBULFWJM-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700027842 Bacteriophage lambda DNA replication complex Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000012623 DNA damaging agent Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000701536 Enterobacteria phage T6 Species 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 101150017040 I gene Proteins 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710115465 Lon protease Proteins 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 1
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 229940123573 Protein synthesis inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000012722 SDS sample buffer Substances 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000002730 additional effect Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000011681 asexual reproduction Effects 0.000 description 1
- 238000013465 asexual reproduction Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 210000005056 cell body Anatomy 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000003413 degradative effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000010359 gene isolation Methods 0.000 description 1
- -1 glutaryl-alanyl-phenyl Chemical group 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 210000004517 glycocalyx Anatomy 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 150000002338 glycosides Chemical class 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000009655 industrial fermentation Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 239000003317 industrial substance Substances 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000004457 myocytus nodalis Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Substances N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011017 operating method Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 229940080469 phosphocellulose Drugs 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000007 protein synthesis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 102220032376 rs104895238 Human genes 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008684 selective degradation Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 101150023453 smc gene Proteins 0.000 description 1
- RTWIRLHWLMNVCC-WQYNNSOESA-M sodium (2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-[hydroxy(methyl)phosphoryl]butanoyl]amino]propanoyl]amino]propanoate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCP(C)(O)=O RTWIRLHWLMNVCC-WQYNNSOESA-M 0.000 description 1
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/832—Bacillus
- Y10S435/839—Bacillus subtilis
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/848—Escherichia
- Y10S435/849—Escherichia coli
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Hematology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 組換え産物を高収量で産生するための改良宿
主生物を得る。 【構成】 ｈｔｐＲ遺伝子とｌｏｎ遺伝子の両方の中に
変異を有し、この結果タンパク、ポリペプチド、または
生成物の存在に応答しタンパク分解能を減少したものと
し、前記生成物はｈｔｐＲタンパク、ポリペプチドまた
は生成物でない生成物からなる大腸菌宿主体である。
主生物を得る。 【構成】 ｈｔｐＲ遺伝子とｌｏｎ遺伝子の両方の中に
変異を有し、この結果タンパク、ポリペプチド、または
生成物の存在に応答しタンパク分解能を減少したものと
し、前記生成物はｈｔｐＲタンパク、ポリペプチドまた
は生成物でない生成物からなる大腸菌宿主体である。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、組換え産物を高収量で
産生するための改良宿主生物と方法に関する。より詳細
には、本発明は、細胞質プロテアーゼの発現が減少した
ために細胞の外来性タンパクの分解能が減少するという
特異的な変異をＤＮＡ配列内にもつ宿主菌株、並びに遺
伝子操作技術によって外来性タンパク、ポリペプチド及
び他の産物を高収量で産生するためにこれら菌株を宿主
細胞として使用することに関する。本発明に開示された
方法は、外来性組換えタンパク、ポリペプチド及び他の
産物を、通常そのような産物を産生しない宿主で高収量
で産生させるという利点がある。
産生するための改良宿主生物と方法に関する。より詳細
には、本発明は、細胞質プロテアーゼの発現が減少した
ために細胞の外来性タンパクの分解能が減少するという
特異的な変異をＤＮＡ配列内にもつ宿主菌株、並びに遺
伝子操作技術によって外来性タンパク、ポリペプチド及
び他の産物を高収量で産生するためにこれら菌株を宿主
細胞として使用することに関する。本発明に開示された
方法は、外来性組換えタンパク、ポリペプチド及び他の
産物を、通常そのような産物を産生しない宿主で高収量
で産生させるという利点がある。
【０００２】
【従来の技術】組換えＤＮＡ技術の発達により、外来性
産物をコードする外来性ＤＮＡ配列で形質転換した宿主
においてそれらの産物の産生が可能になった。一般的
に、所望のアミノ酸、ポリペプチドもしくはタンパク産
物をコードするＤＮＡは、発現ビークル内に組換えＤＮ
Ａ分子を形成するように適当な部位に導入される。次い
で、その組換え分子は、適合宿主を形質転換するために
用いられ、宿主は挿入ＤＮＡ配列を発現しかつそのＤＮ
Ａ配列によってコードされる産物を産生するために培養
される。そのような組換え技術は、細菌宿主中で真核及
びウイルスタンパクを生産するために用いられている。
これらには、たとえば白血球インターフェロン［Ｓ．ナ
ガタ等、「ヒト白血球インターフェロン活性を有するポ
リペプチドの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内における合
成」、ネイチャー、第２８４巻、第３１６〜３２０頁
（１９８０）］、ヒトＢ型肝炎ウイルスの抗原［Ｃ．
Ｊ．バレル等、「プラスミドｐＢＲ３２２にクローン化
されたＢ型肝炎ウイルスＤＮＡ配列の大腸菌（Escheric
hia Coli）内における発現」、ネイチャー、第２７９
巻、第４３〜４７頁（１９７９）；Ｍ．パセック等、
「Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子と大腸菌内におけるそれらの
発現」、ネイチャー、第２８２巻、第５７５〜５７９頁
（１９７９）］、ＳＶ４０ｔ抗原［Ｔ．Ｍ．ロバーツ
等、「大腸菌内におけるシミアンウイルス４０ｔ抗原の
合成」、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス ＵＳＡ、第７６巻、第５５９
６〜５６００頁（１９７９）］、及びＦＭＤウイルス抗
原［Ｈ．クッパー等、「口啼疫ウイルスの主要抗原のｃ
ＤＮＡのクローニングと、大腸菌内の発現」、ネイチャ
ー、第２８９巻、第５５５〜５５９頁（１９８１）］な
どが含まれる。
産物をコードする外来性ＤＮＡ配列で形質転換した宿主
においてそれらの産物の産生が可能になった。一般的
に、所望のアミノ酸、ポリペプチドもしくはタンパク産
物をコードするＤＮＡは、発現ビークル内に組換えＤＮ
Ａ分子を形成するように適当な部位に導入される。次い
で、その組換え分子は、適合宿主を形質転換するために
用いられ、宿主は挿入ＤＮＡ配列を発現しかつそのＤＮ
Ａ配列によってコードされる産物を産生するために培養
される。そのような組換え技術は、細菌宿主中で真核及
びウイルスタンパクを生産するために用いられている。
これらには、たとえば白血球インターフェロン［Ｓ．ナ
ガタ等、「ヒト白血球インターフェロン活性を有するポ
リペプチドの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内における合
成」、ネイチャー、第２８４巻、第３１６〜３２０頁
（１９８０）］、ヒトＢ型肝炎ウイルスの抗原［Ｃ．
Ｊ．バレル等、「プラスミドｐＢＲ３２２にクローン化
されたＢ型肝炎ウイルスＤＮＡ配列の大腸菌（Escheric
hia Coli）内における発現」、ネイチャー、第２７９
巻、第４３〜４７頁（１９７９）；Ｍ．パセック等、
「Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子と大腸菌内におけるそれらの
発現」、ネイチャー、第２８２巻、第５７５〜５７９頁
（１９７９）］、ＳＶ４０ｔ抗原［Ｔ．Ｍ．ロバーツ
等、「大腸菌内におけるシミアンウイルス４０ｔ抗原の
合成」、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデ
ミー・オブ・サイエンス ＵＳＡ、第７６巻、第５５９
６〜５６００頁（１９７９）］、及びＦＭＤウイルス抗
原［Ｈ．クッパー等、「口啼疫ウイルスの主要抗原のｃ
ＤＮＡのクローニングと、大腸菌内の発現」、ネイチャ
ー、第２８９巻、第５５５〜５５９頁（１９８１）］な
どが含まれる。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】組換えＤＮＡ技術によ
る外来性タンパク、ポリペプチド及び他の産物の大規模
な工業的生産は、産生宿主による組換え産物の細胞内分
解のために制約されていた。所定の宿主細胞中では、外
来性もしくは他の異常タンパクは、急速にペプチドやア
ミノ酸に分解される。さらに、高温（たとえば４０℃以
上）では、これらの異常タンパクと同様に正常タンパク
の分解がより速くなることが見い出されている［Ｓ．リ
ン及びＩ．ザビン、ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー、第２４７巻、第２２０５〜２２１１頁
（１９７２）；Ａ．セント．ジョン等、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２５３巻、第３
９４５〜３９５１頁（１９７８）］。これは、そのよう
な高温では正常と外来性との両タンパクは構造的な安定
性が減少する傾向にありかつ変性してしまう（すなわち
異常になる）結果、細胞内プロテアーゼの攻撃をうけや
すくなるためである。
る外来性タンパク、ポリペプチド及び他の産物の大規模
な工業的生産は、産生宿主による組換え産物の細胞内分
解のために制約されていた。所定の宿主細胞中では、外
来性もしくは他の異常タンパクは、急速にペプチドやア
ミノ酸に分解される。さらに、高温（たとえば４０℃以
上）では、これらの異常タンパクと同様に正常タンパク
の分解がより速くなることが見い出されている［Ｓ．リ
ン及びＩ．ザビン、ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー、第２４７巻、第２２０５〜２２１１頁
（１９７２）；Ａ．セント．ジョン等、ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２５３巻、第３
９４５〜３９５１頁（１９７８）］。これは、そのよう
な高温では正常と外来性との両タンパクは構造的な安定
性が減少する傾向にありかつ変性してしまう（すなわち
異常になる）結果、細胞内プロテアーゼの攻撃をうけや
すくなるためである。
【０００４】この異常タンパクの分解は代謝エネルギを
必要とする［Ｊ．Ｄ．コウイット及びＡ．Ｌ．ゴールド
バーグ、「大腸菌における特異的異常タンパクの分解の
中間段階」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー、第２５２巻、第８３５０〜８３５７頁（１９
７７）；Ｋ．オルデン及びＡ．Ｌ．ゴールドバーグ、
「大腸菌における細胞内タンパク分解のためのエネルギ
要求の研究」、バイオケミー・エト・バイオフィジィー
ク・アクタ、第５４２巻、第３８５〜３９８頁（１９７
８）］。ＡＴＰ依存性プロテアーゼであるプロテアーゼ
Ｌａは、細胞内タンパク分解の初期律速段階を触媒する
［Ｃ．Ｈ．チャン及びＡ．Ｌ．ゴールドバーグ、「ＡＴ
Ｐ依存性プロテアーゼであるプロテアーゼＬａにおける
大腸菌のｌｏｎ（ｃａｐＲ）遺伝子の産生物」、プロシ
ーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス ＵＳＡ、第７８巻、第４９３１〜４９３５
頁（１９８１）；Ｆ．Ｓ．ラリモア等、「大腸菌のＡＴ
Ｐ依存性タンパク分解酵素であるプロテアーゼＬａの研
究」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー、第２５７巻、第４１８７〜４１９５頁（１９８
２）；Ｌ．ワックスマン及びＡ．Ｌ．ゴールドバーグ、
「大腸菌からのプロテアーゼＬａはＡＴＰとタンパクと
をある結合形式で加水分解する」、プロシーディングス
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
ＵＳＡ、第７９巻、第４８８３〜４８８７頁（１９８
２）］。プロテアーゼＬａはｌｏｎ遺伝子によってコー
ドされ、またｃａｐＲやｄｅｇ遺伝子とも呼ばれている
［チャン及びゴールドバーグ、前出］。ｌｏｎ遺伝子の
変異は欠陥があるが、部分的に活性のあるプロテアーゼ
を産生し［チャン及びゴールドバーグ、前出；Ｃ．Ｈ．
チャン等、「大腸菌におけるｌｏｎ変異ｃａｐＲ９によ
ってコードされるタンパクの研究：野生型プロテアーゼ
を阻害するＡＴＰ依存性プロテアーゼＬａの不安定
型」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー、第２５８巻、第２１５〜２２１頁（１９８３）］、
かつ異常タンパクの分解能の減少を示す［Ｓ．ゴッテス
マン及びＤ．ジプサー、「大腸菌ｌｏｎ変異のｄｅｇ表
現型」、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、第１３
３巻、第８４４〜８５１頁（１９７８）；コウイット及
びゴールドバーグ、前出］。ｌｏｎ変異は異常タンパク
の分解能の減少を示すが、まだ幾分かの分解活性を保っ
ている（約正常活性の１／３〜１／２）。加えて、組換
えＤＮＡ技術の宿主としてそれらを用いることは、ｌｏ
ｎ変異株のいくつかの好ましくない表現形質のため、生
存能力の点で限界がある。これらの菌は紫外線照射に対
し大きな感受性を示し、さらに細胞被膜ムコ多糖類の過
剰生産のためムコイド状になる。ｌｏｎ遺伝子の機能を
完全に持たない変異株は、従来得られていない。
必要とする［Ｊ．Ｄ．コウイット及びＡ．Ｌ．ゴールド
バーグ、「大腸菌における特異的異常タンパクの分解の
中間段階」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー、第２５２巻、第８３５０〜８３５７頁（１９
７７）；Ｋ．オルデン及びＡ．Ｌ．ゴールドバーグ、
「大腸菌における細胞内タンパク分解のためのエネルギ
要求の研究」、バイオケミー・エト・バイオフィジィー
ク・アクタ、第５４２巻、第３８５〜３９８頁（１９７
８）］。ＡＴＰ依存性プロテアーゼであるプロテアーゼ
Ｌａは、細胞内タンパク分解の初期律速段階を触媒する
［Ｃ．Ｈ．チャン及びＡ．Ｌ．ゴールドバーグ、「ＡＴ
Ｐ依存性プロテアーゼであるプロテアーゼＬａにおける
大腸菌のｌｏｎ（ｃａｐＲ）遺伝子の産生物」、プロシ
ーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス ＵＳＡ、第７８巻、第４９３１〜４９３５
頁（１９８１）；Ｆ．Ｓ．ラリモア等、「大腸菌のＡＴ
Ｐ依存性タンパク分解酵素であるプロテアーゼＬａの研
究」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー、第２５７巻、第４１８７〜４１９５頁（１９８
２）；Ｌ．ワックスマン及びＡ．Ｌ．ゴールドバーグ、
「大腸菌からのプロテアーゼＬａはＡＴＰとタンパクと
をある結合形式で加水分解する」、プロシーディングス
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
ＵＳＡ、第７９巻、第４８８３〜４８８７頁（１９８
２）］。プロテアーゼＬａはｌｏｎ遺伝子によってコー
ドされ、またｃａｐＲやｄｅｇ遺伝子とも呼ばれている
［チャン及びゴールドバーグ、前出］。ｌｏｎ遺伝子の
変異は欠陥があるが、部分的に活性のあるプロテアーゼ
を産生し［チャン及びゴールドバーグ、前出；Ｃ．Ｈ．
チャン等、「大腸菌におけるｌｏｎ変異ｃａｐＲ９によ
ってコードされるタンパクの研究：野生型プロテアーゼ
を阻害するＡＴＰ依存性プロテアーゼＬａの不安定
型」、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー、第２５８巻、第２１５〜２２１頁（１９８３）］、
かつ異常タンパクの分解能の減少を示す［Ｓ．ゴッテス
マン及びＤ．ジプサー、「大腸菌ｌｏｎ変異のｄｅｇ表
現型」、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー、第１３
３巻、第８４４〜８５１頁（１９７８）；コウイット及
びゴールドバーグ、前出］。ｌｏｎ変異は異常タンパク
の分解能の減少を示すが、まだ幾分かの分解活性を保っ
ている（約正常活性の１／３〜１／２）。加えて、組換
えＤＮＡ技術の宿主としてそれらを用いることは、ｌｏ
ｎ変異株のいくつかの好ましくない表現形質のため、生
存能力の点で限界がある。これらの菌は紫外線照射に対
し大きな感受性を示し、さらに細胞被膜ムコ多糖類の過
剰生産のためムコイド状になる。ｌｏｎ遺伝子の機能を
完全に持たない変異株は、従来得られていない。
【０００５】外来性組換え産物の有用量の工業的に可能
な生産における組換えＤＮＡ技術の可能性は、現在まで
外来性タンパクの分解能が減少した特性を有する生存能
力のある宿主がなかったので制約されている。
な生産における組換えＤＮＡ技術の可能性は、現在まで
外来性タンパクの分解能が減少した特性を有する生存能
力のある宿主がなかったので制約されている。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、外来性タンパ
ク、ポリペプチド及び他の産物をそれらをコードするＤ
ＮＡ配列で形質転換された宿主生物内にて生産するため
の改良宿主生物と方法を提供することによって、前述の
問題を解決する。より詳細には、本発明は、細胞内プロ
テアーゼの発現が減少したために細胞の外来性産物の分
解能が減少するような特異的変異をＤＮＡ配列内にもつ
宿主細胞菌株、並びにこれらの菌株を用いて遺伝子操作
技術により作成された外来性タンパク、ポリペプチド及
び他の産物の収量を増大させることに関する。
ク、ポリペプチド及び他の産物をそれらをコードするＤ
ＮＡ配列で形質転換された宿主生物内にて生産するため
の改良宿主生物と方法を提供することによって、前述の
問題を解決する。より詳細には、本発明は、細胞内プロ
テアーゼの発現が減少したために細胞の外来性産物の分
解能が減少するような特異的変異をＤＮＡ配列内にもつ
宿主細胞菌株、並びにこれらの菌株を用いて遺伝子操作
技術により作成された外来性タンパク、ポリペプチド及
び他の産物の収量を増大させることに関する。
【０００７】本発明によって、外来性産物の分解能が減
少した特性をもつ宿主細胞内で所望の外来性タンパク、
ポリペプチド及び他の産物を高収量にて生産することが
可能である。
少した特性をもつ宿主細胞内で所望の外来性タンパク、
ポリペプチド及び他の産物を高収量にて生産することが
可能である。
【０００８】以下の開示からも認められるように、本発
明の宿主菌株及び方法は、外来性組換え産物の大規模生
産を高収量でおこなうことを可能にする。
明の宿主菌株及び方法は、外来性組換え産物の大規模生
産を高収量でおこなうことを可能にする。
【０００９】
【実施例】ここに開示する発明を十分に理解するため、
以下詳細に説明する。
以下詳細に説明する。
【００１０】この説明において以下の用語を用いる：ヌクレオチド ：糖部（ペントース）、リン酸及び窒素複
素環塩基よりなるＤＮＡあるいはＲＮＡの単量体単位。
塩基はグリコシド炭素（ペントースの１′炭素）を介し
糖と結合し、糖と塩基との結合体はヌクレオチドとよば
れる。塩基はヌクレオチドを特性化する。４つのＤＮＡ
塩基はアデニン（「Ａ」），グアニン（「Ｇ」），シト
シン（「Ｃ」）及びチミン（「Ｔ」）である。４つのＲ
ＮＡ塩基は、Ａ、Ｇ、Ｃ及びウラシル（「Ｕ」）であ
る。
素環塩基よりなるＤＮＡあるいはＲＮＡの単量体単位。
塩基はグリコシド炭素（ペントースの１′炭素）を介し
糖と結合し、糖と塩基との結合体はヌクレオチドとよば
れる。塩基はヌクレオチドを特性化する。４つのＤＮＡ
塩基はアデニン（「Ａ」），グアニン（「Ｇ」），シト
シン（「Ｃ」）及びチミン（「Ｔ」）である。４つのＲ
ＮＡ塩基は、Ａ、Ｇ、Ｃ及びウラシル（「Ｕ」）であ
る。
【００１１】ＤＮＡ配列：隣りあったペントースの３′
と５′の炭素がホスホジエステル結合で互いに連結した
直鎖状デオキシヌクレオチド。
と５′の炭素がホスホジエステル結合で互いに連結した
直鎖状デオキシヌクレオチド。
【００１２】コドン：鋳型もしくはｍＲＮＡを介してア
ミノ酸、翻訳開始シグナルもしくは翻訳停止シグナルを
コードする３つのヌクレオチド（トリプレット）のＤＮ
Ａ配列。たとえば、ヌクレオチド・トリプレットＴＴ
Ａ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ及びＣＴＧはアミ
ノ酸ロイシン（「Ｌｅｕ」）をコードし、ＴＡＧ、ＴＡ
Ａ及びＴＧＡは翻訳停止シグナルであり、かつＡＴＧは
翻訳開始シグナルである。
ミノ酸、翻訳開始シグナルもしくは翻訳停止シグナルを
コードする３つのヌクレオチド（トリプレット）のＤＮ
Ａ配列。たとえば、ヌクレオチド・トリプレットＴＴ
Ａ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、ＣＴＡ及びＣＴＧはアミ
ノ酸ロイシン（「Ｌｅｕ」）をコードし、ＴＡＧ、ＴＡ
Ａ及びＴＧＡは翻訳停止シグナルであり、かつＡＴＧは
翻訳開始シグナルである。
【００１３】ポリペプチド：隣接アミノ酸のαアミノ基
とカルボキシ基との間がペプチド結合で互いに連結され
たアミノ酸の線状列。
とカルボキシ基との間がペプチド結合で互いに連結され
たアミノ酸の線状列。
【００１４】遺伝子：メッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮ
Ａ」）を介してｍＲＮＡからの特異的ポリペプチドに特
性的なアミノ酸列をコードするＤＮＡ配列。
Ａ」）を介してｍＲＮＡからの特異的ポリペプチドに特
性的なアミノ酸列をコードするＤＮＡ配列。
【００１５】転写：遺伝子もしくはＤＮＡ配列からｍＲ
ＮＡを産生する過程。
ＮＡを産生する過程。
【００１６】翻訳：ｍＲＮＡからポリペプチドを産生す
る過程。
る過程。
【００１７】発現：ＤＮＡ配列もしくは遺伝子がポリペ
プチドを産生する過程。転写と翻訳とを含む。
プチドを産生する過程。転写と翻訳とを含む。
【００１８】プラスミド：プラスミドが宿主細胞内で複
製するような完全「レプリコン」を含んだ非染色体２本
鎖ＤＮＡ配列。プラスミドを単細胞生物内に存在させる
と、その生物の特性はプラスミドＤＮＡによって変化す
るか、または形質転換される。たとえば、テトラサイク
リン耐性（ＴｅｔR ）の遺伝子をもつプラスミドは従前
にテトラサイクリン感受性であった細胞を形質転換させ
て耐性にする。プラスミドで形質転換された細胞は形質
転換株と呼ばれる。
製するような完全「レプリコン」を含んだ非染色体２本
鎖ＤＮＡ配列。プラスミドを単細胞生物内に存在させる
と、その生物の特性はプラスミドＤＮＡによって変化す
るか、または形質転換される。たとえば、テトラサイク
リン耐性（ＴｅｔR ）の遺伝子をもつプラスミドは従前
にテトラサイクリン感受性であった細胞を形質転換させ
て耐性にする。プラスミドで形質転換された細胞は形質
転換株と呼ばれる。
【００１９】ファージもしくはバクテリオファージ：バ
クテリアのウイルスであり、その大部分はタンパク膜あ
るいは外殻（カプシド）でカプシド化されたＤＮＡ配列
よりなる。
クテリアのウイルスであり、その大部分はタンパク膜あ
るいは外殻（カプシド）でカプシド化されたＤＮＡ配列
よりなる。
【００２０】クローニング・ビークルもしくはベクタ
ー：宿主細胞内で複製可能であるプラスミド、ファージ
ＤＮＡもしくは他のＤＮＡ配列であり、１つあるいは少
数のエンドヌクレアーゼ認識部位によって特徴化され、
その部位でＤＮＡ配列は不可欠な生物的機能、たとえば
複製、コートタンパクの生産、プロモーターや結合部位
などの損失を伴なわずに決定しうる方式で切断できる。
また、それらは形質転換細胞の同定に適当なマーカー、
たとえばテトラサイクリン耐性やアンピシリン耐性を含
んでいる。
ー：宿主細胞内で複製可能であるプラスミド、ファージ
ＤＮＡもしくは他のＤＮＡ配列であり、１つあるいは少
数のエンドヌクレアーゼ認識部位によって特徴化され、
その部位でＤＮＡ配列は不可欠な生物的機能、たとえば
複製、コートタンパクの生産、プロモーターや結合部位
などの損失を伴なわずに決定しうる方式で切断できる。
また、それらは形質転換細胞の同定に適当なマーカー、
たとえばテトラサイクリン耐性やアンピシリン耐性を含
んでいる。
【００２１】クローニング：無性的再生によって生物も
しくはＤＮＡ配列に由来するような生物もしくはＤＮＡ
配列を大量に得るための過程。
しくはＤＮＡ配列に由来するような生物もしくはＤＮＡ
配列を大量に得るための過程。
【００２２】組換えＤＮＡ分子もしくはハイブリドＤＮ
Ａ：異なったゲノム（細胞もしくはウイルスの全ＤＮ
Ａ）からのＤＮＡの部分を含み、生細胞体外で末端と末
端を結合しかつ生細胞中で維持できるようにした分子。
Ａ：異なったゲノム（細胞もしくはウイルスの全ＤＮ
Ａ）からのＤＮＡの部分を含み、生細胞体外で末端と末
端を結合しかつ生細胞中で維持できるようにした分子。
【００２３】発現制御配列：遺伝子もしくはＤＮＡ配列
に作用結合したときにその遺伝子もしくはＤＮＡ配列の
発現を制御・調節するヌクレオチド配列。「作用結合」
という用語は、所望産物をコードする遺伝子もしくはＤ
ＮＡ配列の前に適当な開始シグナルをもつこと、並びに
発現制御配列の制御下に挿入ＤＮＡ配列を発現させてそ
の遺伝子もしくはＤＮＡによってコードされる所望産物
を産生させうる正しい解読フレームを維持することを含
んでいる。
に作用結合したときにその遺伝子もしくはＤＮＡ配列の
発現を制御・調節するヌクレオチド配列。「作用結合」
という用語は、所望産物をコードする遺伝子もしくはＤ
ＮＡ配列の前に適当な開始シグナルをもつこと、並びに
発現制御配列の制御下に挿入ＤＮＡ配列を発現させてそ
の遺伝子もしくはＤＮＡによってコードされる所望産物
を産生させうる正しい解読フレームを維持することを含
んでいる。
【００２４】本出願人は、細胞が高温度下もしくは多量
の外来性ポリペプチドの存在下でタンパク分解酵素の含
有量を増やすことを見出した。本発明は、高温度下もし
くは多量の外来性ポリペプチドの存在下で特に外来性産
物の分解能が減少するという特異的な変異をＤＮＡ配列
内にもつ宿主細胞菌株に関する。この重要な特性は、細
胞質プロテアーゼの発現が減少したためと思われる。従
って、これらの宿主細胞の利用により、遺伝子操作技術
により作成された外来性タンパク、ポリペプチド及び他
の産物の収量を増大しうる。
の外来性ポリペプチドの存在下でタンパク分解酵素の含
有量を増やすことを見出した。本発明は、高温度下もし
くは多量の外来性ポリペプチドの存在下で特に外来性産
物の分解能が減少するという特異的な変異をＤＮＡ配列
内にもつ宿主細胞菌株に関する。この重要な特性は、細
胞質プロテアーゼの発現が減少したためと思われる。従
って、これらの宿主細胞の利用により、遺伝子操作技術
により作成された外来性タンパク、ポリペプチド及び他
の産物の収量を増大しうる。
【００２５】本発明の好ましい一具体例においては、プ
ロテアーゼ遺伝子の発現の特異的変異もしくは欠損が、
その遺伝子産物の産生もしくは機能に影響するｈｔｐＲ
遺伝子に位置する。大腸菌のｈｔｐＲ遺伝子は、細胞の
ヒート・ショック応答に含まれる調節遺伝子である。高
温もしくは他の不利な条件等によって「ヒート・ショッ
ク」がかかり、高温でのある細胞タンパクの変性によっ
て異常タンパクが出現したとき、細胞は「ヒート・ショ
ック・タンパク」と呼ばれる多数のポリペプチドの合成
を増加させることによって応答する［Ｆ．Ｃ．ネイドハ
ート等、「大腸菌の高温レギュロンを調節する遺伝子の
モレキュラー・クローニングと発現」、ジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー、第１５３巻、第５９７〜６０３
頁（１９８３）；Ｔ．ヤマモリ、「ヒート・ショック・
オペロンの翻訳と高温における細胞生育との大腸菌遺伝
子（ｈｉｎ）調節」；Ｆ．Ｃ．ネイドハート、「大腸菌
の高温レギュロン」、「ヒート・ショック・フロム・バ
クテリア・ツー・マン」、Ｍ．Ｊ．アッシュバーナー等
編、コールド スプリング ハーバー研究所、第１３１
〜１３８頁及び第１３９〜１４５頁（１９８２）］。ヒ
ート・ショック応答のシグナルは、細胞におけるこれら
の変性タンパクの出現であることを突き止めた。また、
異質タンパクもしくはポリペプチドのクローニングおよ
び発現化の結果として生じた細胞内の外来性ポリペプチ
ドもしくは他の産物の蓄積は、そのヒート・ショック応
答を引きおこすことも突き止めた。最終的に、ヒート・
ショック・タンパクの少なくとも１種が異常もしくは外
来性タンパクのタンパク分解において決定的な役割を果
たすことを確認した［Ｓ．ゴフ等、プロシーディングス
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
ＵＳＡ、第８１巻、第６６４７〜６６５１頁（１９８
４）；Ｔ．Ａ．ベイカー等、プロシーディングス・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス ＵＳ
Ａ、第８１巻、第６６７９〜６６８３頁（１９８
４）］。
ロテアーゼ遺伝子の発現の特異的変異もしくは欠損が、
その遺伝子産物の産生もしくは機能に影響するｈｔｐＲ
遺伝子に位置する。大腸菌のｈｔｐＲ遺伝子は、細胞の
ヒート・ショック応答に含まれる調節遺伝子である。高
温もしくは他の不利な条件等によって「ヒート・ショッ
ク」がかかり、高温でのある細胞タンパクの変性によっ
て異常タンパクが出現したとき、細胞は「ヒート・ショ
ック・タンパク」と呼ばれる多数のポリペプチドの合成
を増加させることによって応答する［Ｆ．Ｃ．ネイドハ
ート等、「大腸菌の高温レギュロンを調節する遺伝子の
モレキュラー・クローニングと発現」、ジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー、第１５３巻、第５９７〜６０３
頁（１９８３）；Ｔ．ヤマモリ、「ヒート・ショック・
オペロンの翻訳と高温における細胞生育との大腸菌遺伝
子（ｈｉｎ）調節」；Ｆ．Ｃ．ネイドハート、「大腸菌
の高温レギュロン」、「ヒート・ショック・フロム・バ
クテリア・ツー・マン」、Ｍ．Ｊ．アッシュバーナー等
編、コールド スプリング ハーバー研究所、第１３１
〜１３８頁及び第１３９〜１４５頁（１９８２）］。ヒ
ート・ショック応答のシグナルは、細胞におけるこれら
の変性タンパクの出現であることを突き止めた。また、
異質タンパクもしくはポリペプチドのクローニングおよ
び発現化の結果として生じた細胞内の外来性ポリペプチ
ドもしくは他の産物の蓄積は、そのヒート・ショック応
答を引きおこすことも突き止めた。最終的に、ヒート・
ショック・タンパクの少なくとも１種が異常もしくは外
来性タンパクのタンパク分解において決定的な役割を果
たすことを確認した［Ｓ．ゴフ等、プロシーディングス
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
ＵＳＡ、第８１巻、第６６４７〜６６５１頁（１９８
４）；Ｔ．Ａ．ベイカー等、プロシーディングス・オブ
・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス ＵＳ
Ａ、第８１巻、第６６７９〜６６８３頁（１９８
４）］。
【００２６】本出願人は、これらのヒート・ショック・
タンパクの１種が、細胞内で異常タンパクの選択的分解
の律速段階を遂行するＡＴＰ依存性プロテアーゼとして
のプロテアーゼＬａであることを突き止めた［Ｓ．ゴフ
等、前出；Ｔ．Ａ．フィリップス等、ジャーナル・オブ
・バクテリオロジー、第１５９巻、第２８３〜２８７頁
（１９８４）］。また、プロテアーゼＬａは、他のヒー
ト・ショック・タンパクと同様、低温でも細胞内で外来
性タンパクの蓄積に応答して誘導されることも見い出し
た。外来性ＤＮＡ配列で形質転換した宿主細胞内にクロ
ーン化された外来性ＤＮＡ配列の発現の際に生ずる外来
性タンパクの大量の産生は、ヒート・ショックによって
も誘導されるいくつかのタンパクの低温（たとえば３０
℃）での産生を誘導することも実験的に実証された。た
とえば、組織プラスミノーゲン活性因子（ＴＰＡ）をコ
ードするＤＮＡ配列で形質転換した宿主内におけるその
発現は、３０℃のような低温でさえプロテアーゼＬａを
コードするｌｏｎ遺伝子の発現を増加させる。このよう
に、ヒート・ショック・タンパクの誘導は、高温及び低
温の両方での外来性もしくは他の異常タンパクの蓄積か
ら細胞を防御するという一般化された機構を示す。
タンパクの１種が、細胞内で異常タンパクの選択的分解
の律速段階を遂行するＡＴＰ依存性プロテアーゼとして
のプロテアーゼＬａであることを突き止めた［Ｓ．ゴフ
等、前出；Ｔ．Ａ．フィリップス等、ジャーナル・オブ
・バクテリオロジー、第１５９巻、第２８３〜２８７頁
（１９８４）］。また、プロテアーゼＬａは、他のヒー
ト・ショック・タンパクと同様、低温でも細胞内で外来
性タンパクの蓄積に応答して誘導されることも見い出し
た。外来性ＤＮＡ配列で形質転換した宿主細胞内にクロ
ーン化された外来性ＤＮＡ配列の発現の際に生ずる外来
性タンパクの大量の産生は、ヒート・ショックによって
も誘導されるいくつかのタンパクの低温（たとえば３０
℃）での産生を誘導することも実験的に実証された。た
とえば、組織プラスミノーゲン活性因子（ＴＰＡ）をコ
ードするＤＮＡ配列で形質転換した宿主内におけるその
発現は、３０℃のような低温でさえプロテアーゼＬａを
コードするｌｏｎ遺伝子の発現を増加させる。このよう
に、ヒート・ショック・タンパクの誘導は、高温及び低
温の両方での外来性もしくは他の異常タンパクの蓄積か
ら細胞を防御するという一般化された機構を示す。
【００２７】蓄積した異常タンパクに応じておこるこの
タンパク分解酵素の誘導は、高収量で遺伝子操作技術に
よって作成された外来性タンパクの生産に対する特殊な
問題である。宿主細胞内での所望の外来性タンパクの生
産に際し、プロテアーゼＬａ及び他のプロテアーゼは、
高割合で細胞によって合成されかつ細胞の所望タンパク
の分解能を増加させることを見出した。その結果、遺伝
子操作技術を用いて作成されたタンパクの高収量生産に
対する障害を克服するための手段を検索した。ヒート・
ショック・タンパクの誘導は、ｈｉｎ変異株とも呼ばれ
るｈｔｐＲ変異株中ではおこらないことを突き止めた。
そのような変異株は当業者により突然変異誘発技術を用
いて得られる。
タンパク分解酵素の誘導は、高収量で遺伝子操作技術に
よって作成された外来性タンパクの生産に対する特殊な
問題である。宿主細胞内での所望の外来性タンパクの生
産に際し、プロテアーゼＬａ及び他のプロテアーゼは、
高割合で細胞によって合成されかつ細胞の所望タンパク
の分解能を増加させることを見出した。その結果、遺伝
子操作技術を用いて作成されたタンパクの高収量生産に
対する障害を克服するための手段を検索した。ヒート・
ショック・タンパクの誘導は、ｈｉｎ変異株とも呼ばれ
るｈｔｐＲ変異株中ではおこらないことを突き止めた。
そのような変異株は当業者により突然変異誘発技術を用
いて得られる。
【００２８】細胞質タンパク分解に対するｈｔｐＲ変異
の影響の研究により、ｈｔｐＲ遺伝子はプロテアーゼＬ
ａをコードするｌｏｎ遺伝子の転写を調節することが示
された。ｈｔｐＲ変異株では、ｌｏｎ遺伝子の転写が減
少する結果、プロテアーゼＬａの産生が減少し、次いで
異常もしくは外来性タンパクを分解するという変異株の
能力の減少をもたららす。この異常タンパクの分解能の
減少は、高温及び低温の両条件下（たとえば各々４２℃
と３０℃）で明らかである。このように、変異株から単
離されたプロテアーゼＬａのレベルは３０℃で野生株よ
りも低く、４２℃に移しても増加しない（図１）。図１
の表は、ｈｔｐＲ変異株から単離したプロテアーゼＬａ
のレベルを３０℃と４２℃について示している。この表
に示されたデータは、３０℃で生育させかつ４２℃に１
時間移した大腸菌培養物を用いて得た。プロテアーゼＬ
ａ活性は、Ｌ．ワックスマン及びＡ．Ｌ．ゴールドバー
グによってジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー（１９８５）［印刷中］に記述されたように、ホ
スホセルロース・クロマトグラフィーによる酵素の部分
精製の後、特異的蛍光測定物質であるグルタリル−アラ
ニル−フェニルアラニル−メトキシナフチルアミンを用
いて測定した。さらに、宿主細胞内で遺伝子操作技術を
用いて作成されたＴＰＡの誘導後、ｌｏｎ遺伝子の発現
の増加を観察する研究により、この発現の増加はｈｔｐ
Ｒ変異株では存在しないことも示した。従って、このｈ
ｔｐＲ変異は、プロテアーゼＬａの基礎レベルに影響を
与えかつ温度シフトに際し産生の増加を妨げると思われ
る。
の影響の研究により、ｈｔｐＲ遺伝子はプロテアーゼＬ
ａをコードするｌｏｎ遺伝子の転写を調節することが示
された。ｈｔｐＲ変異株では、ｌｏｎ遺伝子の転写が減
少する結果、プロテアーゼＬａの産生が減少し、次いで
異常もしくは外来性タンパクを分解するという変異株の
能力の減少をもたららす。この異常タンパクの分解能の
減少は、高温及び低温の両条件下（たとえば各々４２℃
と３０℃）で明らかである。このように、変異株から単
離されたプロテアーゼＬａのレベルは３０℃で野生株よ
りも低く、４２℃に移しても増加しない（図１）。図１
の表は、ｈｔｐＲ変異株から単離したプロテアーゼＬａ
のレベルを３０℃と４２℃について示している。この表
に示されたデータは、３０℃で生育させかつ４２℃に１
時間移した大腸菌培養物を用いて得た。プロテアーゼＬ
ａ活性は、Ｌ．ワックスマン及びＡ．Ｌ．ゴールドバー
グによってジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー（１９８５）［印刷中］に記述されたように、ホ
スホセルロース・クロマトグラフィーによる酵素の部分
精製の後、特異的蛍光測定物質であるグルタリル−アラ
ニル−フェニルアラニル−メトキシナフチルアミンを用
いて測定した。さらに、宿主細胞内で遺伝子操作技術を
用いて作成されたＴＰＡの誘導後、ｌｏｎ遺伝子の発現
の増加を観察する研究により、この発現の増加はｈｔｐ
Ｒ変異株では存在しないことも示した。従って、このｈ
ｔｐＲ変異は、プロテアーゼＬａの基礎レベルに影響を
与えかつ温度シフトに際し産生の増加を妨げると思われ
る。
【００２９】ｈｔｐＲ変異株によって示される分解能の
減少は、欠損したプロテアーゼＬａをコードするｌｏｎ
変異株に見られるものより大きいかもしくは同等であ
る。しかしながら、ｈｔｐＲ変異株は、たとえば皮膜多
糖類の過剰生産や蓄積（ムコイド状とも云われる）、細
胞分裂時の欠陥や繊維形成及び紫外線照射もしくは他の
ＤＮＡ損傷剤への感受性の増加のようなｌｏｎ変異株が
示す望ましくない表現型を示さない。従って、ｈｔｐＲ
変異株は、大規模な産業的醗酵で見られる種々の条件下
（たとえばリッチな培地など）で、ｌｏｎ変異株よりも
生存力が強い。これらの条件下ではｌｏｎ変異株はあま
り生育しないが、ｈｔｐＲ変異株の生育はよく、従って
発現した外来性タンパク、ポリペプチド及び他の産物の
収量を増加させるため組換えＤＮＡ技術における宿主生
物として明らかな利点を与える。
減少は、欠損したプロテアーゼＬａをコードするｌｏｎ
変異株に見られるものより大きいかもしくは同等であ
る。しかしながら、ｈｔｐＲ変異株は、たとえば皮膜多
糖類の過剰生産や蓄積（ムコイド状とも云われる）、細
胞分裂時の欠陥や繊維形成及び紫外線照射もしくは他の
ＤＮＡ損傷剤への感受性の増加のようなｌｏｎ変異株が
示す望ましくない表現型を示さない。従って、ｈｔｐＲ
変異株は、大規模な産業的醗酵で見られる種々の条件下
（たとえばリッチな培地など）で、ｌｏｎ変異株よりも
生存力が強い。これらの条件下ではｌｏｎ変異株はあま
り生育しないが、ｈｔｐＲ変異株の生育はよく、従って
発現した外来性タンパク、ポリペプチド及び他の産物の
収量を増加させるため組換えＤＮＡ技術における宿主生
物として明らかな利点を与える。
【００３０】Ｐ１形質導入を利用して、ｈｔｐＲ変異と
ｌｏｎ遺伝子内の変異（たとえばｌｏｎΔ１００もしく
はｃａｐＲ９等）との両者を含むｈｔｐＲ ｌｏｎ変異
株を作成した。これらの二重変異株は、不安定なプロテ
アーゼの生産が減少し、どちらか一方の変異のみをもつ
菌株に比べて異常タンパクの分解能が劣っている。これ
らの二重変異株によるタンパク分解の欠点は、既知のい
ずれの菌株よりも顕著である。これらの二重変異株は、
培養で高細胞密度を達成する生存力のある宿主である。
ｈｔｐＲ変異株と同様、それらはｌｏｎ変異株が示すよ
うなムコイド状或いは他の不健全な特性を示さない。
ｌｏｎ遺伝子内の変異（たとえばｌｏｎΔ１００もしく
はｃａｐＲ９等）との両者を含むｈｔｐＲ ｌｏｎ変異
株を作成した。これらの二重変異株は、不安定なプロテ
アーゼの生産が減少し、どちらか一方の変異のみをもつ
菌株に比べて異常タンパクの分解能が劣っている。これ
らの二重変異株によるタンパク分解の欠点は、既知のい
ずれの菌株よりも顕著である。これらの二重変異株は、
培養で高細胞密度を達成する生存力のある宿主である。
ｈｔｐＲ変異株と同様、それらはｌｏｎ変異株が示すよ
うなムコイド状或いは他の不健全な特性を示さない。
【００３１】このように本発明のｈｔｐＲ ｌｏｎ変異
株は、通常では急速な細胞内分解を受けるような遺伝子
操作技術によって作成されたタンパクの大規模生産に特
に有益である。本発明によれば、外来性タンパク、ポリ
ペプチドもしくは他の産物は、ｈｔｐＲ変異株、より好
ましくはｈｔｐＲ ｌｏｎ変異株を用いて外来性タンパ
ク、ポリペプチドもしくは他の産物をコードするＤＮＡ
配列を特徴とする組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿
主を培養し、この宿主はプロテアーゼ遺伝子の発現に欠
陥があることを特徴とし、培養物から産生物を収集する
ことによって生産される。さらに、外来性タンパク、ポ
リペプチド及び他の産物は、ｈｔｐＲ遺伝子産物の産生
もしくは機能に欠陥があるような宿主を用い、外来性タ
ンパク、ポリペプチドもしくは他の産物をコードするＤ
ＮＡ配列を特徴とする組換えＤＮＡ分子で形質転換され
た上記宿主を培養することによっても生産しうる。
株は、通常では急速な細胞内分解を受けるような遺伝子
操作技術によって作成されたタンパクの大規模生産に特
に有益である。本発明によれば、外来性タンパク、ポリ
ペプチドもしくは他の産物は、ｈｔｐＲ変異株、より好
ましくはｈｔｐＲ ｌｏｎ変異株を用いて外来性タンパ
ク、ポリペプチドもしくは他の産物をコードするＤＮＡ
配列を特徴とする組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿
主を培養し、この宿主はプロテアーゼ遺伝子の発現に欠
陥があることを特徴とし、培養物から産生物を収集する
ことによって生産される。さらに、外来性タンパク、ポ
リペプチド及び他の産物は、ｈｔｐＲ遺伝子産物の産生
もしくは機能に欠陥があるような宿主を用い、外来性タ
ンパク、ポリペプチドもしくは他の産物をコードするＤ
ＮＡ配列を特徴とする組換えＤＮＡ分子で形質転換され
た上記宿主を培養することによっても生産しうる。
【００３２】本発明の変異株は、組換えＤＮＡ配列が任
意公知の技術により導入されかつタンパク、ポリペプチ
ド及び他の産物として発現される宿主細胞として有利に
利用しうる。この変異株の外来性もしくは他の異常ポリ
ペプチドの分解能の減少により、組換えタンパク及び他
の産物が高収量で生産できる。例えば、本出願人の実験
データによれば、ｈｔｐＲ ｌｏｎ変異株内で生産され
た遺伝子操作技術を用いて作成された組織プラスミノー
ゲン活性因子は、野生型宿主細胞の場合と比較して３〜
５倍に収量が増加する。
意公知の技術により導入されかつタンパク、ポリペプチ
ド及び他の産物として発現される宿主細胞として有利に
利用しうる。この変異株の外来性もしくは他の異常ポリ
ペプチドの分解能の減少により、組換えタンパク及び他
の産物が高収量で生産できる。例えば、本出願人の実験
データによれば、ｈｔｐＲ ｌｏｎ変異株内で生産され
た遺伝子操作技術を用いて作成された組織プラスミノー
ゲン活性因子は、野生型宿主細胞の場合と比較して３〜
５倍に収量が増加する。
【００３３】本発明の方法は大腸菌、細菌、酵母、カ
ビ、動物もしくは植物または他の宿主生物を含む原核及
び真核宿主中での外来性タンパク、ポリペプチドもしく
は他の産物の生産に適用できる。ヒート・ショック応答
は、高温という不利な状況から細胞を防御するための普
遍的な機構であると思われる［アッシュバーナー等、前
出］。従来示唆されているように［Ｓ．ゴフ等、前
出］、ヒート・ショック応答は、異常タンパク分子の蓄
積から細胞を防御するための一般的な機構であると思わ
れる。プロテアーゼＬａに類似したＡＴＰ依存性プロテ
アーゼをサルモネラ・ティフィメウリウム（Salmonella
typhimeurium ）や枯草菌（Bacillus subtili s ）等の
他の細菌でも観察した。ｌｏｎ変異株は、サルモネラ・
ティフィメウリウムで検出されている。従って、大腸菌
で見られるのと同様な異常もしくは外来性タンパクの分
解機構はすべての原核生物で見い出だされうる。この機
構はさらに真核生物にも存在する。プロテアーゼＬａと
同様の酵素が、哺乳動物細胞のミトコンドリア中［Ｍ．
デザウテルズ及びＡ．Ｌ．ゴールドバーグ、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２５７巻、
第１１６−１７３頁（１９８２）］及びネズミ培養赤血
球−白血病細胞の細胞質中［Ｌ．ワックスマン等、ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（１９８
５）、投稿中］で見い出だされている。これら他の生物
でのそのような機構の存在により、大腸菌に存在するプ
ロテアーゼＬａ遺伝子に機能的に対応する遺伝子の欠損
を持ちかつここで述べた変異生物と同様に外来性産物の
分解能が減少した類似変異宿主生物を作製するため、本
発明の方法を使用することができる。
ビ、動物もしくは植物または他の宿主生物を含む原核及
び真核宿主中での外来性タンパク、ポリペプチドもしく
は他の産物の生産に適用できる。ヒート・ショック応答
は、高温という不利な状況から細胞を防御するための普
遍的な機構であると思われる［アッシュバーナー等、前
出］。従来示唆されているように［Ｓ．ゴフ等、前
出］、ヒート・ショック応答は、異常タンパク分子の蓄
積から細胞を防御するための一般的な機構であると思わ
れる。プロテアーゼＬａに類似したＡＴＰ依存性プロテ
アーゼをサルモネラ・ティフィメウリウム（Salmonella
typhimeurium ）や枯草菌（Bacillus subtili s ）等の
他の細菌でも観察した。ｌｏｎ変異株は、サルモネラ・
ティフィメウリウムで検出されている。従って、大腸菌
で見られるのと同様な異常もしくは外来性タンパクの分
解機構はすべての原核生物で見い出だされうる。この機
構はさらに真核生物にも存在する。プロテアーゼＬａと
同様の酵素が、哺乳動物細胞のミトコンドリア中［Ｍ．
デザウテルズ及びＡ．Ｌ．ゴールドバーグ、ジャーナル
・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、第２５７巻、
第１１６−１７３頁（１９８２）］及びネズミ培養赤血
球−白血病細胞の細胞質中［Ｌ．ワックスマン等、ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（１９８
５）、投稿中］で見い出だされている。これら他の生物
でのそのような機構の存在により、大腸菌に存在するプ
ロテアーゼＬａ遺伝子に機能的に対応する遺伝子の欠損
を持ちかつここで述べた変異生物と同様に外来性産物の
分解能が減少した類似変異宿主生物を作製するため、本
発明の方法を使用することができる。
【００３４】さらに、各種の発現ベクターを、本発明の
宿主を形質転換するのに用いうる。例えば、有用な発現
ベクターは染色体の断片、非染色体及び合成ＤＮＡ配列
などがあり、例として種々の既知のＳＶ４０の派生物、
ｃｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びそ
れらの派生物を含む大腸菌のプラスミド、より広い宿主
域をもつＲＰ４等のプラスミドなどの既知の細菌性プラ
スミド、ＮＭ９８９等の多数のλファージの派生物、Ｍ
１３及び繊維状（Filamentous ）一本鎖ＤＮＡファージ
等の他のＤＮＡファージなどのファージＤＮＡ、他の発
現制御配列、もしくは２μプラスミドやその派生物のよ
うな酵母プラスミドを用いて修飾したプラスミドのよう
なプラスミドとファージＤＮＡとの組合せに由来するベ
クター等とすることができる。特に好ましい発現ベクタ
ーは、多コピー数プラスミドもしくはバクテリオファー
ジ派生物である。なぜなら、そのようなベクターは発現
タンパク収量を増加させるからである。
宿主を形質転換するのに用いうる。例えば、有用な発現
ベクターは染色体の断片、非染色体及び合成ＤＮＡ配列
などがあり、例として種々の既知のＳＶ４０の派生物、
ｃｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９及びそ
れらの派生物を含む大腸菌のプラスミド、より広い宿主
域をもつＲＰ４等のプラスミドなどの既知の細菌性プラ
スミド、ＮＭ９８９等の多数のλファージの派生物、Ｍ
１３及び繊維状（Filamentous ）一本鎖ＤＮＡファージ
等の他のＤＮＡファージなどのファージＤＮＡ、他の発
現制御配列、もしくは２μプラスミドやその派生物のよ
うな酵母プラスミドを用いて修飾したプラスミドのよう
なプラスミドとファージＤＮＡとの組合せに由来するベ
クター等とすることができる。特に好ましい発現ベクタ
ーは、多コピー数プラスミドもしくはバクテリオファー
ジ派生物である。なぜなら、そのようなベクターは発現
タンパク収量を増加させるからである。
【００３５】同様に、種々の発現制御配列も、クローン
化ＤＮＡ配列の発現効率（転写と翻訳）を向上させるた
めに有用である。これらの発現制御配列には主に２つの
型があり、１つは構成的発現制御配列であり、もう一方
は制御可能な発現制御配列である。β−ｌａｃのような
構成的発現制御配列は、クローン化ＤＮＡ配列を発現さ
せてそのＤＮＡ配列により、コードされる産物を生産す
るよう宿主細胞の生育中、絶えず機能する。ｔｒｐ、λ
ＰL もしくはλＰR のような制御可能な発現制御配列
は、宿主細胞の生育の間に調節し（すなわち切換え）う
るので、クローン化されたＤＮＡ配列の発現を培養の生
育サイクル中の最適時に発現するようにすることができ
る。たとえば、制御可能な発現制御配列は、宿主が遺伝
子産物を過度に蓄積せずに繁殖するように発現を停止さ
せることができ、次いでこれらの発現制御配列の制御下
に多量の所望タンパク産物の発現を促進するように発現
を開始させうる。正常な無毒の遺伝子産物でさえ過剰生
産すると宿主細胞に害を与えかつ特殊な宿主−ベクター
系の安定性を低下させるので、制御可能な発現制御配列
はしばしば宿主細胞の生育の間発現を調節するのに好都
合である。
化ＤＮＡ配列の発現効率（転写と翻訳）を向上させるた
めに有用である。これらの発現制御配列には主に２つの
型があり、１つは構成的発現制御配列であり、もう一方
は制御可能な発現制御配列である。β−ｌａｃのような
構成的発現制御配列は、クローン化ＤＮＡ配列を発現さ
せてそのＤＮＡ配列により、コードされる産物を生産す
るよう宿主細胞の生育中、絶えず機能する。ｔｒｐ、λ
ＰL もしくはλＰR のような制御可能な発現制御配列
は、宿主細胞の生育の間に調節し（すなわち切換え）う
るので、クローン化されたＤＮＡ配列の発現を培養の生
育サイクル中の最適時に発現するようにすることができ
る。たとえば、制御可能な発現制御配列は、宿主が遺伝
子産物を過度に蓄積せずに繁殖するように発現を停止さ
せることができ、次いでこれらの発現制御配列の制御下
に多量の所望タンパク産物の発現を促進するように発現
を開始させうる。正常な無毒の遺伝子産物でさえ過剰生
産すると宿主細胞に害を与えかつ特殊な宿主−ベクター
系の安定性を低下させるので、制御可能な発現制御配列
はしばしば宿主細胞の生育の間発現を調節するのに好都
合である。
【００３６】いくつかの制御可能な発現制御配列を使用
して宿主生物でタンパクやポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列及び遺伝子を発現することができる。これらに
は、たとえば大腸菌のラクトース・オペロンのオペレー
ター、プロモーター及びリボゾーム結合・相互作用配列
［たとえば、Ｋ．イタクラ等、「ソマトスタチンホルモ
ンの化学合成した遺伝子の大腸菌における発現」、サイ
エンス、第１９８頁、第１０５６〜１０６３頁（１９７
７）；Ｄ．Ｖ．ゴーデル等、「ヒトインシュリンの化学
合成した遺伝子の大腸菌における発現」、プロシーディ
ングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンス ＵＳＡ、第７６巻、第１０６〜１１０頁（１９７
９）］、大腸菌のトリプトファン・オペロンの対応配列
［Ｊ．Ｓ．エムテージ等、「インフルエンザ抗原決定因
子は大腸菌にクローン化したヘマグルチニン遺伝子から
発現する」、ネイチャー、第２８３巻、第１７１〜１７
４頁（１９８０）；Ｊ．Ａ．マーシャル等、「ヒト成長
ホルモン：細菌での相補ＤＮＡのクローニングと発
現」、サイエンス、第２０５巻、第６０２〜６０６頁
（１９７９）］並びにλファージの主要オペレーター・
プロモーター領域［Ｈ．バーナード等、「バクテリオフ
ァージλＰL プロモーターから得た遺伝子発現を促進す
るプラスミド・クローニング・ビークルの作成」、ジー
ン、第５巻、第５９〜７６頁（１９７９）］等が含まれ
る。
して宿主生物でタンパクやポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列及び遺伝子を発現することができる。これらに
は、たとえば大腸菌のラクトース・オペロンのオペレー
ター、プロモーター及びリボゾーム結合・相互作用配列
［たとえば、Ｋ．イタクラ等、「ソマトスタチンホルモ
ンの化学合成した遺伝子の大腸菌における発現」、サイ
エンス、第１９８頁、第１０５６〜１０６３頁（１９７
７）；Ｄ．Ｖ．ゴーデル等、「ヒトインシュリンの化学
合成した遺伝子の大腸菌における発現」、プロシーディ
ングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンス ＵＳＡ、第７６巻、第１０６〜１１０頁（１９７
９）］、大腸菌のトリプトファン・オペロンの対応配列
［Ｊ．Ｓ．エムテージ等、「インフルエンザ抗原決定因
子は大腸菌にクローン化したヘマグルチニン遺伝子から
発現する」、ネイチャー、第２８３巻、第１７１〜１７
４頁（１９８０）；Ｊ．Ａ．マーシャル等、「ヒト成長
ホルモン：細菌での相補ＤＮＡのクローニングと発
現」、サイエンス、第２０５巻、第６０２〜６０６頁
（１９７９）］並びにλファージの主要オペレーター・
プロモーター領域［Ｈ．バーナード等、「バクテリオフ
ァージλＰL プロモーターから得た遺伝子発現を促進す
るプラスミド・クローニング・ビークルの作成」、ジー
ン、第５巻、第５９〜７６頁（１９７９）］等が含まれ
る。
【００３７】本発明のｈｔｐＲ変異株とｈｔｐＲ ｌｏ
ｎ変異株とが高温で外来性タンパクの分解能を減少する
という事実は、温度誘導性の制御可能な発現制御配列と
組合わせて使用するのに特に好都合である。バクテリオ
ファージλのＰL プロモーター等の熱誘導性発現配列
は、既知の標準的な技術によって所望のタンパクをコー
ドするＤＮＡ配列と融合させうる。得られた組換えＤＮ
Ａ配列を次いでｈｔｐＲ変異株もしくはｈｔｐＲ ｌｏ
ｎ変異株宿主を形質転換するのに使用できる。４２℃で
生育した場合、そのような宿主はその温度で発現を遂行
する温度誘発性発現制御配列によって、所望のタンパク
もしくは産物を高程度に発現する。さらに、所望のタン
パクもしくは産物の発現は、これらの宿主の外来性タン
パクもしくは産物の分解能が減少したためにさらに増加
する。これらｈｔｐＲ変異株もしくはｈｔｐＲ ｌｏｎ
変異株中では、野生株を宿主とした場合と異なり、高温
時もしくは細胞内での外来性タンパクの生産時における
タンパク分解酵素の増加が起こらない。
ｎ変異株とが高温で外来性タンパクの分解能を減少する
という事実は、温度誘導性の制御可能な発現制御配列と
組合わせて使用するのに特に好都合である。バクテリオ
ファージλのＰL プロモーター等の熱誘導性発現配列
は、既知の標準的な技術によって所望のタンパクをコー
ドするＤＮＡ配列と融合させうる。得られた組換えＤＮ
Ａ配列を次いでｈｔｐＲ変異株もしくはｈｔｐＲ ｌｏ
ｎ変異株宿主を形質転換するのに使用できる。４２℃で
生育した場合、そのような宿主はその温度で発現を遂行
する温度誘発性発現制御配列によって、所望のタンパク
もしくは産物を高程度に発現する。さらに、所望のタン
パクもしくは産物の発現は、これらの宿主の外来性タン
パクもしくは産物の分解能が減少したためにさらに増加
する。これらｈｔｐＲ変異株もしくはｈｔｐＲ ｌｏｎ
変異株中では、野生株を宿主とした場合と異なり、高温
時もしくは細胞内での外来性タンパクの生産時における
タンパク分解酵素の増加が起こらない。
【００３８】このように、熱誘発性発現制御配列と本発
明のｈｔｐＲ変異株もしくはｈｔｐＲ ｌｏｎ変異株と
を組合わせて使用することは、遺伝子操作技術によって
作成されたタンパク、ポリペプチド及び他の産物の発現
を増加させる。しかしながら、ｈｔｐＲ変異株とｈｔｐ
Ｒ ｌｏｎ変異株とは低い温度（たとえば３０℃）でも
外来性タンパクの分解が減少しているので、本発明は構
成的発現制御配列或いは非温度誘発性発現制御配列を使
用して外来性タンパクもしくは他の産物の発現を増加さ
せることもできることに注目すべきである。
明のｈｔｐＲ変異株もしくはｈｔｐＲ ｌｏｎ変異株と
を組合わせて使用することは、遺伝子操作技術によって
作成されたタンパク、ポリペプチド及び他の産物の発現
を増加させる。しかしながら、ｈｔｐＲ変異株とｈｔｐ
Ｒ ｌｏｎ変異株とは低い温度（たとえば３０℃）でも
外来性タンパクの分解が減少しているので、本発明は構
成的発現制御配列或いは非温度誘発性発現制御配列を使
用して外来性タンパクもしくは他の産物の発現を増加さ
せることもできることに注目すべきである。
【００３９】本発明の宿主生物及び方法は、多種のタン
パク及びポリペプチドの生産に応用しうる。加えて、本
発明の方法は、収量が酵素の高いレベルに依存する分解
をうけやすい他の産物の生産を増加させるために用いう
る。たとえば、ワクチンの活性成分や他の医薬上活性の
ある産物、農業上もしくは他の産業上有用な組成物、酵
素、ホルモン、アミノ酸、工業薬品、抗生物質、食品等
の産物を本発明の方法によって有効に生産しうる。本発
明の方法によって生産されうる他の産物には、白血球イ
ンターフェロン、繊維芽細胞インターフェロン及び他の
インターフェロン、免疫活性もしくは生物活性を示すポ
リペプチド、ＦＭＤＶウイルス抗原もしくはＢ型肝炎ウ
イルス抗原の抗原性を有するポリペプチド、ソマトメデ
ィンＣやプロインシュリンのようなヒトもしくは動物ホ
ルモンの生物活性を示すポリペプチド、並びにヒト、動
物もしくはウイルス産物の免疫活性もしくは生物活性を
示すポリペプチド及びタンパク等が含まれる。特定の産
物の選択は本発明の一部ではない。むしろ、本発明は、
そのような産物をコードするＤＮＡ配列の発現を増加さ
せること並びに本発明の変異宿主生物中でそのような産
物を生産することに一般に応用しうる。
パク及びポリペプチドの生産に応用しうる。加えて、本
発明の方法は、収量が酵素の高いレベルに依存する分解
をうけやすい他の産物の生産を増加させるために用いう
る。たとえば、ワクチンの活性成分や他の医薬上活性の
ある産物、農業上もしくは他の産業上有用な組成物、酵
素、ホルモン、アミノ酸、工業薬品、抗生物質、食品等
の産物を本発明の方法によって有効に生産しうる。本発
明の方法によって生産されうる他の産物には、白血球イ
ンターフェロン、繊維芽細胞インターフェロン及び他の
インターフェロン、免疫活性もしくは生物活性を示すポ
リペプチド、ＦＭＤＶウイルス抗原もしくはＢ型肝炎ウ
イルス抗原の抗原性を有するポリペプチド、ソマトメデ
ィンＣやプロインシュリンのようなヒトもしくは動物ホ
ルモンの生物活性を示すポリペプチド、並びにヒト、動
物もしくはウイルス産物の免疫活性もしくは生物活性を
示すポリペプチド及びタンパク等が含まれる。特定の産
物の選択は本発明の一部ではない。むしろ、本発明は、
そのような産物をコードするＤＮＡ配列の発現を増加さ
せること並びに本発明の変異宿主生物中でそのような産
物を生産することに一般に応用しうる。
【００４０】本発明を、ここには組換えＤＮＡ技術にｈ
ｔｐＲ変異株およびｈｔｐＲ ｌｏｎ変異株を宿主細胞
として利用することについて記載したが、ｈｔｐＲ変異
自体をそれに対応する遺伝子が除去されている宿主細胞
に挿入しうることも了解すべきである。これらの宿主細
胞を、次いで、組換えＤＮＡ分子すなわち所望タンパク
をコードするＤＮＡ配列で形質転換させて、これらのタ
ンパクを高収量で産生しうる。
ｔｐＲ変異株およびｈｔｐＲ ｌｏｎ変異株を宿主細胞
として利用することについて記載したが、ｈｔｐＲ変異
自体をそれに対応する遺伝子が除去されている宿主細胞
に挿入しうることも了解すべきである。これらの宿主細
胞を、次いで、組換えＤＮＡ分子すなわち所望タンパク
をコードするＤＮＡ配列で形質転換させて、これらのタ
ンパクを高収量で産生しうる。
【００４１】また、本発明は、ｈｔｐＲもしくはｌｏｎ
遺伝子またはその組合わせ内に多数のおこりうる変異の
いずれかを含む宿主生物を包含することを了解すべきで
ある。そのような変異株は、Ｔ．トベ等による「大腸菌
におけるタンパクのヒート・ショック誘導を欠損した温
度感受性変異株の単離及び物理的マッピング」、モレキ
ュラー・ジェネラル・ジェネティクス、第１９５巻、第
１０〜１６頁（１９８４）に見られるようなヒート・シ
ョック応答の新しい欠損株を作成するための標準的突然
変異誘発および選択技術を利用して得ることができる。
さらに、本発明の方法は、ヒート・ショック・タンパク
の誘導が欠損した変異株のような外来性タンパクの分解
能の減少を示すＤＮＡ配列内の他の変異を有する大腸菌
株中でタンパク、ポリペプチド及び他の産物を生産する
のに応用しうる［Ｋ．Ｈ．ピーク、「ｘｔｈＡ変異株に
おける高温でのヒート・ショック・タンパクの誘導の欠
損」、「アブストラクト・オブ・ペイパーズ・プレゼン
テッド・アット・ザ・バクテリオファージ・ミーティン
グ」、第１５１頁、コールドスプリングハーバー研究所
版、コールド スプリング ハーバー ニューヨーク
（１９８４）参照］。
遺伝子またはその組合わせ内に多数のおこりうる変異の
いずれかを含む宿主生物を包含することを了解すべきで
ある。そのような変異株は、Ｔ．トベ等による「大腸菌
におけるタンパクのヒート・ショック誘導を欠損した温
度感受性変異株の単離及び物理的マッピング」、モレキ
ュラー・ジェネラル・ジェネティクス、第１９５巻、第
１０〜１６頁（１９８４）に見られるようなヒート・シ
ョック応答の新しい欠損株を作成するための標準的突然
変異誘発および選択技術を利用して得ることができる。
さらに、本発明の方法は、ヒート・ショック・タンパク
の誘導が欠損した変異株のような外来性タンパクの分解
能の減少を示すＤＮＡ配列内の他の変異を有する大腸菌
株中でタンパク、ポリペプチド及び他の産物を生産する
のに応用しうる［Ｋ．Ｈ．ピーク、「ｘｔｈＡ変異株に
おける高温でのヒート・ショック・タンパクの誘導の欠
損」、「アブストラクト・オブ・ペイパーズ・プレゼン
テッド・アット・ザ・バクテリオファージ・ミーティン
グ」、第１５１頁、コールドスプリングハーバー研究所
版、コールド スプリング ハーバー ニューヨーク
（１９８４）参照］。
【００４２】本発明をより良く理解するため、以下に実
施例を示す。これらの実施例は例示のみを目的とし、あ
らゆる意味で本発明の範囲を限定するものではない。
施例を示す。これらの実施例は例示のみを目的とし、あ
らゆる意味で本発明の範囲を限定するものではない。
【００４３】実施例１ 以下の実施例は、本発明のｈｔｐＲ ｌｏｎ変異株の作
成方法を例示するものである。
成方法を例示するものである。
【００４４】ｈｔｐＲ ｌｏｎ変異株の作成 大腸菌の細胞（ＳＧ９００株、非サプレッサー、ｌｏｎ
+ ｔｓｘ+ ｈｔｐＲ+）に、非サプレッサー宿主中でＤ
ＮＡ合成をしないバクテリオファージであり、かつＣII
I 遺伝子内にＴｎ１０トランスポゾンを有するλＮＫ５
５を感染させた。Ｔｎ１０トランスポゾンは、９３００
塩基対のトランスポゾン可能なＤＮＡ断片であって末端
に逆反復配列を有し、大腸菌の染色体遺伝子上で約１０
分間にてｔｓｘ遺伝子に挿入される。得られた染色体の
領域をｔｓｘ：Ｔｎ１０と云う。
+ ｔｓｘ+ ｈｔｐＲ+）に、非サプレッサー宿主中でＤ
ＮＡ合成をしないバクテリオファージであり、かつＣII
I 遺伝子内にＴｎ１０トランスポゾンを有するλＮＫ５
５を感染させた。Ｔｎ１０トランスポゾンは、９３００
塩基対のトランスポゾン可能なＤＮＡ断片であって末端
に逆反復配列を有し、大腸菌の染色体遺伝子上で約１０
分間にてｔｓｘ遺伝子に挿入される。得られた染色体の
領域をｔｓｘ：Ｔｎ１０と云う。
【００４５】Ｔｎ１０はテトラサイクリン耐性遺伝子を
もっておりかつトランスポゾン自身がバクテリオファー
ジＴ６レセプタをコードするｔｓｘ遺伝子に挿入するの
で、Ｔｎ１０の挿入物を有する大腸菌細胞をテトラサイ
クリン耐性でありかつＴ６ファージ耐性である。従っ
て、λＮＤ５５感染細胞はテトラサイクリン耐性で選抜
し、これらのコロニーをさらにＴ６ファージに対する耐
性で選択した。大腸菌のｌｏｎ遺伝子はｔｓｘ遺伝子の
近くに位置しているので、その結果分離株はｔｓｘ：Ｔ
ｎ１０のテトラサイクリン耐性マーカーに連鎖したｌｏ
ｎ遺伝子を含んでいた。
もっておりかつトランスポゾン自身がバクテリオファー
ジＴ６レセプタをコードするｔｓｘ遺伝子に挿入するの
で、Ｔｎ１０の挿入物を有する大腸菌細胞をテトラサイ
クリン耐性でありかつＴ６ファージ耐性である。従っ
て、λＮＤ５５感染細胞はテトラサイクリン耐性で選抜
し、これらのコロニーをさらにＴ６ファージに対する耐
性で選択した。大腸菌のｌｏｎ遺伝子はｔｓｘ遺伝子の
近くに位置しているので、その結果分離株はｔｓｘ：Ｔ
ｎ１０のテトラサイクリン耐性マーカーに連鎖したｌｏ
ｎ遺伝子を含んでいた。
【００４６】ｌｏｎとｔｓｘ：Ｔｎ１０が連鎖した遺伝
子を次にＰ１形質導入によりｌｏｎΔ１００のようなｌ
ｏｎ- 大腸菌株に導入した。変異株のｌｏｎ遺伝子とＰ
１形質導入要素のｔｓｘ：Ｔｎ１０との間に交差をもつ
細胞を、テトラサイクリン耐性で選択し、ｌｏｎ変異株
に特有のムコイド表現型につきスクリーニングした。得
られた分離株は、Ｔｎ１０のテトラサイクリン耐性マー
カーに連鎖したｌｏｎ変異株であった（ｌｏｎ- 、ｔｅ
ｔr ）。
子を次にＰ１形質導入によりｌｏｎΔ１００のようなｌ
ｏｎ- 大腸菌株に導入した。変異株のｌｏｎ遺伝子とＰ
１形質導入要素のｔｓｘ：Ｔｎ１０との間に交差をもつ
細胞を、テトラサイクリン耐性で選択し、ｌｏｎ変異株
に特有のムコイド表現型につきスクリーニングした。得
られた分離株は、Ｔｎ１０のテトラサイクリン耐性マー
カーに連鎖したｌｏｎ変異株であった（ｌｏｎ- 、ｔｅ
ｔr ）。
【００４７】ｌｏｎ遺伝子とヒート・ショック応答を制
御するｈｔｐＲ遺伝子に変異をもつ二重変異株を作成す
るために、上記分離株のｌｏｎ- ：ｔｅｔr 配列を大腸
菌株Ｋ１６５もしくはＧＷ４７０１のようなｌｏｎ+ 、
ｈｔｐＲ- である大腸菌のｈｔｐＲ変異株にＰ１形質導
入によって導入した。二重変異株をテトラサイクリン耐
性でまず選抜し、次いで温度感受性でスクリーニングし
た。ここで述べた二重変異株はｈｔｐＲ- 株にｌｏｎ-
遺伝子を導入して作成したが、逆の順序の作成、すなわ
ち、ｌｏｎ- 株にｈｔｐＲ- 遺伝子を導入して作成して
もよいことは明らかである。
御するｈｔｐＲ遺伝子に変異をもつ二重変異株を作成す
るために、上記分離株のｌｏｎ- ：ｔｅｔr 配列を大腸
菌株Ｋ１６５もしくはＧＷ４７０１のようなｌｏｎ+ 、
ｈｔｐＲ- である大腸菌のｈｔｐＲ変異株にＰ１形質導
入によって導入した。二重変異株をテトラサイクリン耐
性でまず選抜し、次いで温度感受性でスクリーニングし
た。ここで述べた二重変異株はｈｔｐＲ- 株にｌｏｎ-
遺伝子を導入して作成したが、逆の順序の作成、すなわ
ち、ｌｏｎ- 株にｈｔｐＲ- 遺伝子を導入して作成して
もよいことは明らかである。
【００４８】作られた分離株は、ｌｏｎΔ１００、ｈｔ
ｐＲ- である大腸菌株ＳＧ９３５やＳＧ９２７のような
ｈｔｐＲ- ｌｏｎ- 二重変異株であり、本発明に従って
大腸菌で産生される遺伝子操作技術を用いて作成された
外来性タンパクの収量を増加させるために用いられる。
同様に、ｌｏｎＲ９ ｈｔｐＲ- である大腸菌株ＳＧ９
３６及びＳＧ９２８を作成して本発明に開示された方法
に従い使用することもできる。
ｐＲ- である大腸菌株ＳＧ９３５やＳＧ９２７のような
ｈｔｐＲ- ｌｏｎ- 二重変異株であり、本発明に従って
大腸菌で産生される遺伝子操作技術を用いて作成された
外来性タンパクの収量を増加させるために用いられる。
同様に、ｌｏｎＲ９ ｈｔｐＲ- である大腸菌株ＳＧ９
３６及びＳＧ９２８を作成して本発明に開示された方法
に従い使用することもできる。
【００４９】実施例２ ｈｔｐＲ変異株株中のタンパク分解の測定 以下の実施例は、本発明の変異株中でのタンパク分解を
測定する方法を例示したものである。
測定する方法を例示したものである。
【００５０】測定すべき変異株の培養を、好ましくはＭ
９最小培地中で一晩行なう［Ｊ．Ｈ．ミラー、「エクス
ペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティクス」、
コールド スプリング ハーバー研究所（１９８
１）］。午前中、１０ｍｌの培養物をクレット・フラス
コに入れ、好ましくは菌がよく増殖したことを確認する
ために少なくとも二世代生育させた。
９最小培地中で一晩行なう［Ｊ．Ｈ．ミラー、「エクス
ペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティクス」、
コールド スプリング ハーバー研究所（１９８
１）］。午前中、１０ｍｌの培養物をクレット・フラス
コに入れ、好ましくは菌がよく増殖したことを確認する
ために少なくとも二世代生育させた。
【００５１】菌が初期対数増殖期にあるとき、５ｍｇ／
ｍｌのＨ2 Ｏピューロマイシン（フィルター滅菌）０．
２ｍｌ〜０．５ｍｌを各々のフラスコに加えた。細胞培
養物の濃度は、次の２０分間が経過した後に中期対数増
殖期となるようにした。各々のフラスコのピューロマイ
シン最終濃度は１００〜２５０μｇ／ｍｌであった。ピ
ューロマイシンは、細胞の合成途中のポリペプチドに取
り込まれるタンパク合成阻害剤である。しばらくする
と、この取り込みは、未熟のまま終結した異常なタンパ
クを形成した。そのような短いタンパクは、プロインシ
ュリン等の産業上興味のある多くのクローン化タンパク
と同様に、細菌によって通常急速に分解される［Ａ．
Ｌ．ゴールドバーグ、プロシーディングス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンス、第６９巻、第
２６４０〜２６４４頁（１９７２）］。
ｍｌのＨ2 Ｏピューロマイシン（フィルター滅菌）０．
２ｍｌ〜０．５ｍｌを各々のフラスコに加えた。細胞培
養物の濃度は、次の２０分間が経過した後に中期対数増
殖期となるようにした。各々のフラスコのピューロマイ
シン最終濃度は１００〜２５０μｇ／ｍｌであった。ピ
ューロマイシンは、細胞の合成途中のポリペプチドに取
り込まれるタンパク合成阻害剤である。しばらくする
と、この取り込みは、未熟のまま終結した異常なタンパ
クを形成した。そのような短いタンパクは、プロインシ
ュリン等の産業上興味のある多くのクローン化タンパク
と同様に、細菌によって通常急速に分解される［Ａ．
Ｌ．ゴールドバーグ、プロシーディングス・オブ・ナシ
ョナル・アカデミー・オブ・サイエンス、第６９巻、第
２６４０〜２６４４頁（１９７２）］。
【００５２】ピューロマイシンの添加後、細胞を３７℃
で１５分間保温した。次いで、１μＣｉ 3Ｈ−アミノ酸
／ｍｌを、細胞によって合成されているタンパクを標識
するために培地に加えた（もし細胞をリッチなＬＢ培地
中で生育させる場合、32Ｓ−メチオニンが適当な標識で
あり、４μＣｉ35Ｓ−メチオニン／ｍｌを用いるべきで
ある）。培養物を放射活性標識と共に３７℃で５分間保
温した。細胞を直ちにソーバルＳＳ−３４型ロータを用
いて、４０ｍｌの滅菌遠心管中で５０００ｒｐｍにて１
分間遠心分離した。上澄を迅速にデカントし、沈殿物を
１ｍｇ／ｍｌの非放射性追跡アミノ酸を含む２倍容量の
培地に再懸濁しかつ回動させることによって洗浄した。
細胞を前記と同様に再遠心分離し、非放射性追跡アミノ
酸を含む培地に再懸濁し、クレット・フラスコに移し
た。これらのフラスコに移すとき、細胞濃度を、次の６
０〜９０分間の時間経過後に細胞が定常期とならないよ
う調節した。
で１５分間保温した。次いで、１μＣｉ 3Ｈ−アミノ酸
／ｍｌを、細胞によって合成されているタンパクを標識
するために培地に加えた（もし細胞をリッチなＬＢ培地
中で生育させる場合、32Ｓ−メチオニンが適当な標識で
あり、４μＣｉ35Ｓ−メチオニン／ｍｌを用いるべきで
ある）。培養物を放射活性標識と共に３７℃で５分間保
温した。細胞を直ちにソーバルＳＳ−３４型ロータを用
いて、４０ｍｌの滅菌遠心管中で５０００ｒｐｍにて１
分間遠心分離した。上澄を迅速にデカントし、沈殿物を
１ｍｇ／ｍｌの非放射性追跡アミノ酸を含む２倍容量の
培地に再懸濁しかつ回動させることによって洗浄した。
細胞を前記と同様に再遠心分離し、非放射性追跡アミノ
酸を含む培地に再懸濁し、クレット・フラスコに移し
た。これらのフラスコに移すとき、細胞濃度を、次の６
０〜９０分間の時間経過後に細胞が定常期とならないよ
う調節した。
【００５３】操作のこの段階で、ピューロマイシン処理
細胞は、ピューロマイシンを取り込んだ合成途中のポリ
ペプチドを含んでおり、標識アミノ酸がそれらの配列内
に取り込まれていた。ピューロマイシンによってこれら
のポリペプチドはそれらが合成されていたリボゾームか
ら解離し、その結果生じた異常ポリペプチドは細菌細胞
によって分解された。
細胞は、ピューロマイシンを取り込んだ合成途中のポリ
ペプチドを含んでおり、標識アミノ酸がそれらの配列内
に取り込まれていた。ピューロマイシンによってこれら
のポリペプチドはそれらが合成されていたリボゾームか
ら解離し、その結果生じた異常ポリペプチドは細菌細胞
によって分解された。
【００５４】ある特定の細胞菌株がこれらの不完全なま
ま終結したタンパクを分解する速度を測定するため、サ
ンプルを種々異なる培養時間の上澄から採取し、分解過
程から生じる遊離の放射性アミノ酸を測定した。
ま終結したタンパクを分解する速度を測定するため、サ
ンプルを種々異なる培養時間の上澄から採取し、分解過
程から生じる遊離の放射性アミノ酸を測定した。
【００５５】ｔ＝０の時点で、２つの０．５ｍｌサンプ
ルを各々の培養物から採取した。一方は「総カウント」
とし、ｔ＝０における全放射性タンパク量を示すものと
した。このサンプルを、１００μｌの７０％ＴＣＡ（ト
リクロル酢酸）を含む氷冷しておいた試験管に移した。
このサンプルに０．１ｍｌのＨ2 Ｏを加えた。ｔ＝０時
に採取したもう一方のサンプルは「ブランク」とし、酸
可溶性カウント、すなわち、ｔ＝０時にサンプル中に存
在する遊離の放射性アミノ酸を示していた。この０．５
ｍｌサンプルも１００μｌの７０％ＴＣＡを含む氷中の
試験管に移した。ＴＣＡの最終濃度は好ましくは１０％
であった。このサンプルに１００μｌの１０％ＢＳＡ
（ウシ血清アルブミン）を加えた。ｔ＝１５分、３０
分、６０及び９０分の時点で、同様の０．５ｍｌサンプ
ルを細胞培養液から採取し、１００μｌの１０％ＢＳＡ
を含む１０％ＴＣＡに加えた。
ルを各々の培養物から採取した。一方は「総カウント」
とし、ｔ＝０における全放射性タンパク量を示すものと
した。このサンプルを、１００μｌの７０％ＴＣＡ（ト
リクロル酢酸）を含む氷冷しておいた試験管に移した。
このサンプルに０．１ｍｌのＨ2 Ｏを加えた。ｔ＝０時
に採取したもう一方のサンプルは「ブランク」とし、酸
可溶性カウント、すなわち、ｔ＝０時にサンプル中に存
在する遊離の放射性アミノ酸を示していた。この０．５
ｍｌサンプルも１００μｌの７０％ＴＣＡを含む氷中の
試験管に移した。ＴＣＡの最終濃度は好ましくは１０％
であった。このサンプルに１００μｌの１０％ＢＳＡ
（ウシ血清アルブミン）を加えた。ｔ＝１５分、３０
分、６０及び９０分の時点で、同様の０．５ｍｌサンプ
ルを細胞培養液から採取し、１００μｌの１０％ＢＳＡ
を含む１０％ＴＣＡに加えた。
【００５６】各々のサンプルをＴＣＡ溶液中で３０分間
氷冷した。各々のサンプル中の遊離放射性アミノ酸はＴ
ＣＡ中で可溶化され、一方未分解のタンパクは不溶のま
ま残り、ＴＣＡから沈降した。このように、タンパクの
分解を、ＴＣＡ中に不溶である標識タンパクからＴＣＡ
中に可溶である遊離放射性アミノ酸への変化を測定する
ことにより決定した。従って、経時的にＴＣＡ可溶性カ
ウントの生産を、細胞内でのタンパク分解速度の指標と
して利用した。ピューロマイシンを取り込んだタンパク
の分解速度は極めて速いので、上記のＴＣＡ沈殿の操作
をできるだけ迅速におこなう必要があることに注意すべ
きである。
氷冷した。各々のサンプル中の遊離放射性アミノ酸はＴ
ＣＡ中で可溶化され、一方未分解のタンパクは不溶のま
ま残り、ＴＣＡから沈降した。このように、タンパクの
分解を、ＴＣＡ中に不溶である標識タンパクからＴＣＡ
中に可溶である遊離放射性アミノ酸への変化を測定する
ことにより決定した。従って、経時的にＴＣＡ可溶性カ
ウントの生産を、細胞内でのタンパク分解速度の指標と
して利用した。ピューロマイシンを取り込んだタンパク
の分解速度は極めて速いので、上記のＴＣＡ沈殿の操作
をできるだけ迅速におこなう必要があることに注意すべ
きである。
【００５７】ＴＣＡ溶液中での培養の後、すべてのサン
プル（「総カウント」を除く）をＮｏ．２６９ロータを
用いて、ＩＥＣ遠心分離で、３５００ｒｐｍにて１０分
間、４℃で遠心分離し、各々のサンプルの０．４ｍｌ上
澄を４ｍｌのリキシント・シンキレーション液中で５分
間カウント測定した。各々のサンプルのカウントを用い
て、以下の式に基づきタンパク分解の％を計算した。
プル（「総カウント」を除く）をＮｏ．２６９ロータを
用いて、ＩＥＣ遠心分離で、３５００ｒｐｍにて１０分
間、４℃で遠心分離し、各々のサンプルの０．４ｍｌ上
澄を４ｍｌのリキシント・シンキレーション液中で５分
間カウント測定した。各々のサンプルのカウントを用い
て、以下の式に基づきタンパク分解の％を計算した。
【００５８】
【数１】
【００５９】図２は、経時的なピューロマイシンを取り
込んだタンパクの分解％を示したものであり、それぞれ
大腸菌野生株細胞（ｌｏｎ+ ｈｔｐＲ+ ）対ｈｔｐＲ変
異株（ｌｏｎ+ ｈｔｐＲ- ）、［グラフ１参照、使用菌
株はグラハム・ウォーカー博士より寄贈のＳＣ１２２
（ｈｔｐＲ+ ）及びＫ１６５（ｈｔｐＲ- ）］及び種々
のｌｏｎ変異株とｈｔｐＲ ｌｏｎ二重変異株での分解
（グラフ２及び３参照）である。図から明らかなよう
に、野生型及びｌｏｎ変異株細胞の両者で、ｈｔｐＲ変
異は、タンパク分解パーセンテージをかなり減少させ
た。
込んだタンパクの分解％を示したものであり、それぞれ
大腸菌野生株細胞（ｌｏｎ+ ｈｔｐＲ+ ）対ｈｔｐＲ変
異株（ｌｏｎ+ ｈｔｐＲ- ）、［グラフ１参照、使用菌
株はグラハム・ウォーカー博士より寄贈のＳＣ１２２
（ｈｔｐＲ+ ）及びＫ１６５（ｈｔｐＲ- ）］及び種々
のｌｏｎ変異株とｈｔｐＲ ｌｏｎ二重変異株での分解
（グラフ２及び３参照）である。図から明らかなよう
に、野生型及びｌｏｎ変異株細胞の両者で、ｈｔｐＲ変
異は、タンパク分解パーセンテージをかなり減少させ
た。
【００６０】上記の例はピューロマイシンの取り込みに
よって生じた短いポリペプチドの分解について示してい
るが、ｈｔｐＲ変異の同様の効果も以下のようにカナバ
ニンのようなアミノ酸同族体を含む完全長さの異常タン
パクの急速な分解に従って示された。操作手順は、上記
と同様であった。中期対数増殖期に、Ｍ９培地で一晩生
育させた細胞を遠心分離し、アルギニンを含まない培地
に再懸濁した。カナバニン（すなわちアルギニンのアミ
ノ酸同族体）を最終濃度が０．６ｍＭになるように加え
た。１５分後、１０−２０μＣｉの 3Ｈ−フェニルアラ
ニンを加えた。５分後、培養物を遠心分離し、０．６ｍ
Ｍのアルギニンと非放射性フェニルアラニンを０．５−
１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で含む培地に再懸濁した。次い
で、その培養物を再遠心分離し、同じ培地に再懸濁し
た。
よって生じた短いポリペプチドの分解について示してい
るが、ｈｔｐＲ変異の同様の効果も以下のようにカナバ
ニンのようなアミノ酸同族体を含む完全長さの異常タン
パクの急速な分解に従って示された。操作手順は、上記
と同様であった。中期対数増殖期に、Ｍ９培地で一晩生
育させた細胞を遠心分離し、アルギニンを含まない培地
に再懸濁した。カナバニン（すなわちアルギニンのアミ
ノ酸同族体）を最終濃度が０．６ｍＭになるように加え
た。１５分後、１０−２０μＣｉの 3Ｈ−フェニルアラ
ニンを加えた。５分後、培養物を遠心分離し、０．６ｍ
Ｍのアルギニンと非放射性フェニルアラニンを０．５−
１．０ｍｇ／ｍｌの濃度で含む培地に再懸濁した。次い
で、その培養物を再遠心分離し、同じ培地に再懸濁し
た。
【００６１】ピューロマイシン決定について述べたのと
同じ方法で培養物からサンプルを採取し、カナバニン含
有タンパク％を同じ式により決定した。図３は、経時的
なタンパク分解％を示したものであり、大腸菌野生株
（ｌｏｎ+ ｈｔｐＲ+ ）対ｈｔｐＲ変異株（ｌｏｎ+ ｈ
ｔｐＲ- ）、［グラフ１参照、使用菌株はグラハム・ウ
ォーカー博士より寄贈のＧＷ１０００（ｈｔｐＲ+ ）及
びＧＷ４７０１（ｈｔｐＲ- ）］、及び種々の変異株と
ｈｔｐＲ ｌｏｎ二重変異株でのタンパク分解（グラフ
２及び３参照）を示している。野生株及びｌｏｎ変異株
の両者で、ｈｔｐＲ変異は明らかにタンパク分解を減少
した。さらに、二重変異株、すなわちｈｔｐＲ及びｌｏ
ｎ変異株の両者を有する菌株は、ｈｔｐＲ変異のみを有
する菌株よりも分解がさらに減少しており、この二重変
異がタンパク分解に対し或る付加的影響を与えることを
示した。
同じ方法で培養物からサンプルを採取し、カナバニン含
有タンパク％を同じ式により決定した。図３は、経時的
なタンパク分解％を示したものであり、大腸菌野生株
（ｌｏｎ+ ｈｔｐＲ+ ）対ｈｔｐＲ変異株（ｌｏｎ+ ｈ
ｔｐＲ- ）、［グラフ１参照、使用菌株はグラハム・ウ
ォーカー博士より寄贈のＧＷ１０００（ｈｔｐＲ+ ）及
びＧＷ４７０１（ｈｔｐＲ- ）］、及び種々の変異株と
ｈｔｐＲ ｌｏｎ二重変異株でのタンパク分解（グラフ
２及び３参照）を示している。野生株及びｌｏｎ変異株
の両者で、ｈｔｐＲ変異は明らかにタンパク分解を減少
した。さらに、二重変異株、すなわちｈｔｐＲ及びｌｏ
ｎ変異株の両者を有する菌株は、ｈｔｐＲ変異のみを有
する菌株よりも分解がさらに減少しており、この二重変
異がタンパク分解に対し或る付加的影響を与えることを
示した。
【００６２】実施例３ 組織プラスミノーゲン活性因子産生のｈｔｐＲ+ 宿主細
胞におけるｌｏｎ遺伝子の発現増加及びｈｔｐＲ- 変異
株におけるそのような発現の欠如 以下の実施例は、遺伝子操作技術によって作成された外
来性タンパクである組織プラスミノーゲン活性因子を産
生させるよう誘導した宿主内でプロテアーゼＬａをコー
ドするｌｏｎ遺伝子の発現が増加したことを示すもので
ある。しかしながら、ｈｔｐＲ変異をもつ大腸菌宿主
は、このような発現の増加を示さなかった。
胞におけるｌｏｎ遺伝子の発現増加及びｈｔｐＲ- 変異
株におけるそのような発現の欠如 以下の実施例は、遺伝子操作技術によって作成された外
来性タンパクである組織プラスミノーゲン活性因子を産
生させるよう誘導した宿主内でプロテアーゼＬａをコー
ドするｌｏｎ遺伝子の発現が増加したことを示すもので
ある。しかしながら、ｈｔｐＲ変異をもつ大腸菌宿主
は、このような発現の増加を示さなかった。
【００６３】ｌｏｎ遺伝子の発現がなされているかどう
かを簡単に検出するために、ｌｏｎプロモーター配列を
β−ガラクトシダーゼの構造遺伝子であるｌａｃＺに作
用結合させてなるｌｏｎ−ｌａｃＺオペロン融合配列を
作成した。ｌｏｎプロモーターが作動している時、β−
ガラクトシダーゼが生産され、簡単に検定されうる。こ
のｌｏｎ−ｌａｃ融合配列をバクテリオファージλ中に
挿入し、宿主の染色体に組込ませた。次いで、ＴＰＡ遺
伝子をもつプラスミドを同じ宿主に挿入し、ＴＰＡを生
産するように誘導することにより、β−ガラクトシダー
ゼ活性の形で示されるｌｏｎ遺伝子の発現を測定した。
かを簡単に検出するために、ｌｏｎプロモーター配列を
β−ガラクトシダーゼの構造遺伝子であるｌａｃＺに作
用結合させてなるｌｏｎ−ｌａｃＺオペロン融合配列を
作成した。ｌｏｎプロモーターが作動している時、β−
ガラクトシダーゼが生産され、簡単に検定されうる。こ
のｌｏｎ−ｌａｃ融合配列をバクテリオファージλ中に
挿入し、宿主の染色体に組込ませた。次いで、ＴＰＡ遺
伝子をもつプラスミドを同じ宿主に挿入し、ＴＰＡを生
産するように誘導することにより、β−ガラクトシダー
ゼ活性の形で示されるｌｏｎ遺伝子の発現を測定した。
【００６４】Ａ．ｌｏｎ−ｌａｃオペロン融合配列の作
成 ｌａｃ Ｚ遺伝子に作用結合させたｌｏｎプロモーターを
含むＤＮＡ配列を、以下のように、大腸菌株ＳＣ１２２
［Ｆ- ｌａｃ（ａｍ）、ｔｒｐ（ａｍ）、ｐｈｏ（ａ
ｍ）、ｍａｌ（ａｍ）、ｒｐｓＬ、ｓｕｐＣ（ｔｓ）と
その派生体である菌株Ｋ１６５（ｈｔｐＲ（ａｍ）］に
導入した。
成 ｌａｃ Ｚ遺伝子に作用結合させたｌｏｎプロモーターを
含むＤＮＡ配列を、以下のように、大腸菌株ＳＣ１２２
［Ｆ- ｌａｃ（ａｍ）、ｔｒｐ（ａｍ）、ｐｈｏ（ａ
ｍ）、ｍａｌ（ａｍ）、ｒｐｓＬ、ｓｕｐＣ（ｔｓ）と
その派生体である菌株Ｋ１６５（ｈｔｐＲ（ａｍ）］に
導入した。
【００６５】ｌｏｎ遺伝子配列をもつプラスミドｐＪＭ
Ｃ４０［Ｂ．Ａ．ゼーンバウアー等、ジャーナル・オブ
・バクテリオロジー、第１４３巻、第８５２〜８６３頁
（１９８０）］とオペロン融合ベクターｐＭＬＢ１０２
２［Ｔ．Ｊ、シルハービー等、「エクスペリメント・ウ
イズ・ジーン・フュージョン」、コールド スプリング
ハーバー研究所、コールド スプリング ハーバー
ニューヨーク（１９８４）］をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ
制限エンドヌクレアーゼ（ニューイングランドバイオラ
ボ社）で切断し、これらＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼの
存在下で混合した。ｐＭＬＢ１０２２はアンピシリン耐
性遺伝子と、ガラクトースの発酵に関与する酵素である
β−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ構造遺伝子
の転写に必要なｌａｃプロモーターを欠損している。
Ｃ４０［Ｂ．Ａ．ゼーンバウアー等、ジャーナル・オブ
・バクテリオロジー、第１４３巻、第８５２〜８６３頁
（１９８０）］とオペロン融合ベクターｐＭＬＢ１０２
２［Ｔ．Ｊ、シルハービー等、「エクスペリメント・ウ
イズ・ジーン・フュージョン」、コールド スプリング
ハーバー研究所、コールド スプリング ハーバー
ニューヨーク（１９８４）］をＥｃｏＲＩとＢａｍＨＩ
制限エンドヌクレアーゼ（ニューイングランドバイオラ
ボ社）で切断し、これらＤＮＡをＴ４ＤＮＡリガーゼの
存在下で混合した。ｐＭＬＢ１０２２はアンピシリン耐
性遺伝子と、ガラクトースの発酵に関与する酵素である
β−ガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺ構造遺伝子
の転写に必要なｌａｃプロモーターを欠損している。
【００６６】ｌａｃ- である大腸菌細胞を結合混合物で
形質転換し、２５μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加した
マッコンキー・ガラクトース・プレートで平板培養し
た。ｐＭＬＢ１０２２のｌａｃＺ遺伝子の上流にｐＪＭ
Ｃ４０のｌｏｎプロモーターを含むプラスミドで形質転
換された細胞のみが、β−ガラクトシダーゼを産生する
ことができ、マッコンキー・ガラクトース・プレートで
赤いコロニーとして出現する。このように、プレート上
で赤いコロニーを形成するアンピシリン耐性コロニーを
分離した。これらのコロニーの１つからプラスミドＤＮ
Ａをとり、制限エンドヌクレアーゼマッピングとアガロ
ースゲル電気泳動とで分析し、ｌｏｎ−ｌａｃオペロン
融合配列を含むことが判明した。このプラスミドはｐＳ
Ｇ１２０１と名付けた。
形質転換し、２５μｇ／ｍｌのアンピシリンを添加した
マッコンキー・ガラクトース・プレートで平板培養し
た。ｐＭＬＢ１０２２のｌａｃＺ遺伝子の上流にｐＪＭ
Ｃ４０のｌｏｎプロモーターを含むプラスミドで形質転
換された細胞のみが、β−ガラクトシダーゼを産生する
ことができ、マッコンキー・ガラクトース・プレートで
赤いコロニーとして出現する。このように、プレート上
で赤いコロニーを形成するアンピシリン耐性コロニーを
分離した。これらのコロニーの１つからプラスミドＤＮ
Ａをとり、制限エンドヌクレアーゼマッピングとアガロ
ースゲル電気泳動とで分析し、ｌｏｎ−ｌａｃオペロン
融合配列を含むことが判明した。このプラスミドはｐＳ
Ｇ１２０１と名付けた。
【００６７】次いで、ＥｃｏＲＩで制限しておいたλＮ
Ｆ１９５５［Ｉ．フイ等、ジャーナル・オブ・バクテリ
オロジー、第１５２巻、第１０２２〜１０３２頁（１９
８２）］由来のλＤＮＡにまずこの融合配列を挿入する
ことによって、大腸菌宿主細胞の染色体にこの融合配列
を組み込んだ。結合反応を、１００μｇ／ｍｌのλＮＦ
１９５５ＤＮＡと３μｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡとを
用いて、プラスミドＤＮＡに対するλＤＮＡの高濃度に
て行なった。この末端−末端の高濃度により、結合混合
溶液中の組換えλＤＮＡのコンカタマーが形成される。
この結合混合溶液を、次いで、イン・ビトロ・パッケー
ジング法を用いてλ粒子内にパッケージングした［Ｂ．
ホーン等、プロシーディングス・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス ＵＳＡ、第７１巻、第２
３７２〜２３７６頁（１９７４）］。
Ｆ１９５５［Ｉ．フイ等、ジャーナル・オブ・バクテリ
オロジー、第１５２巻、第１０２２〜１０３２頁（１９
８２）］由来のλＤＮＡにまずこの融合配列を挿入する
ことによって、大腸菌宿主細胞の染色体にこの融合配列
を組み込んだ。結合反応を、１００μｇ／ｍｌのλＮＦ
１９５５ＤＮＡと３μｇ／ｍｌのプラスミドＤＮＡとを
用いて、プラスミドＤＮＡに対するλＤＮＡの高濃度に
て行なった。この末端−末端の高濃度により、結合混合
溶液中の組換えλＤＮＡのコンカタマーが形成される。
この結合混合溶液を、次いで、イン・ビトロ・パッケー
ジング法を用いてλ粒子内にパッケージングした［Ｂ．
ホーン等、プロシーディングス・オブ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス ＵＳＡ、第７１巻、第２
３７２〜２３７６頁（１９７４）］。
【００６８】ｌａｃの欠失をもつλ感受性大腸菌細胞に
これらの組換えファージ粒子を感染させ、β−ガラクト
シダーゼと反応して青いプラークを形成させる物質であ
るＸ−Ｇａｌ（５−ブロム−４−クロロ−３−インドリ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を５０μｇ／ｍｌの
濃度で添加したＴＢ（バクトトリプトン）培地に塗抹し
た。青いプラークを分離し、精製λＤＮＡの制限酵素分
析によってｌｏｎ−ｌａｃオペロン融合配列の存在を確
認した。
これらの組換えファージ粒子を感染させ、β−ガラクト
シダーゼと反応して青いプラークを形成させる物質であ
るＸ−Ｇａｌ（５−ブロム−４−クロロ−３−インドリ
ル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を５０μｇ／ｍｌの
濃度で添加したＴＢ（バクトトリプトン）培地に塗抹し
た。青いプラークを分離し、精製λＤＮＡの制限酵素分
析によってｌｏｎ−ｌａｃオペロン融合配列の存在を確
認した。
【００６９】λＮＦ１９５５は安定な溶原菌を形成しな
いし、サプレッサー菌内でのみ生育できるので、組換え
ファージ粒子を野生型λファージと交差させ、５０μｇ
／ｍｌのＸ−Ｇａｌを含むＴＢ培地にて３７℃で非サプ
レッサー細胞を平板培養し、濁った青いプラークをスク
リーニングした。融合配列を含むファージは安定な溶原
菌を形成できるので、この方法で分離し、λシグマガン
マ１０１と名付けた。
いし、サプレッサー菌内でのみ生育できるので、組換え
ファージ粒子を野生型λファージと交差させ、５０μｇ
／ｍｌのＸ−Ｇａｌを含むＴＢ培地にて３７℃で非サプ
レッサー細胞を平板培養し、濁った青いプラークをスク
リーニングした。融合配列を含むファージは安定な溶原
菌を形成できるので、この方法で分離し、λシグマガン
マ１０１と名付けた。
【００７０】大腸菌株ＳＣ１２２（ｈｔｐＲ+ ）とＫ１
６５（ｈｔｐＲ- ）とをλシグマガンマ１０１で溶原化
させるためにｍａｌ+ で形質導入し、次いでＸ−Ｇａｌ
を含む培地に塗抹した。λの追いうち感染に耐性のある
青いコロニーを分離した。
６５（ｈｔｐＲ- ）とをλシグマガンマ１０１で溶原化
させるためにｍａｌ+ で形質導入し、次いでＸ−Ｇａｌ
を含む培地に塗抹した。λの追いうち感染に耐性のある
青いコロニーを分離した。
【００７１】この方法で分離された２つの菌株を大腸菌
ＳＣ１２２由来のものにつき大腸菌ＳＧ９４３（ｈｔｐ
Ｒ+ ）と名付け、大腸菌Ｋ１６５由来のものを大腸菌Ｓ
Ｇ９４２（ｈｔｐＲ- ）と名付けた。
ＳＣ１２２由来のものにつき大腸菌ＳＧ９４３（ｈｔｐ
Ｒ+ ）と名付け、大腸菌Ｋ１６５由来のものを大腸菌Ｓ
Ｇ９４２（ｈｔｐＲ- ）と名付けた。
【００７２】Ｂ．組織プラスミノーゲン活性因子を産生
するよう誘導したｈｔｐＲ+ 細胞とｈｔｐＲ- 細胞にお
けるｌｏｎ遺伝子の発現 ｌｏｎ−ｌａｃ 融合体をもつ菌株ＳＧ９４３及びＳＧ９
４２を、次いで組織プラスミノーゲン活性因子をコード
するＤＮＡ配列をもつプラスミドｐＴＰＡ１０２（ｐＴ
ＰＡ１０２を含む大腸菌株は１９８４年８月２７日にメ
リーランド州ロッケビル在のアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションに寄託され、受託番号はＡＴＣＣ
３９８１０である）で形質転換した。ｐＴＰＡ１０２
は、プラスミドｐＭＣ９に由来し［Ｒ．Ａ．ヤング等、
「抗体プローブを用いた効果的な遺伝子の分離法」、プ
ロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス ＵＳＡ、第８０巻、第１１９４〜１１
９８頁（１９８３）］、周知の操作技術を用いてｔｒｃ
プロモーター（ｔｒｐからの−３５領域とｌａｃからの
−１０領域）の制御下にＴＰＡ遺伝子を含むようにした
ものである。ｐＴＰＡ１０２を大腸菌株ＳＧ９４３及び
ＳＧ９４２の各々を形質転換するために用い、各菌株を
培養して２つに分けた。各々の菌株から分けた一方に、
ｔｒｃプロモーターの誘導物質であるＩＰＴＧ［イソプ
ロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を１ｍＭの
濃度になるように加えた。もう一方は各々未誘導のまま
にしておいた。細胞を３０℃で１時間保温した後、ＩＰ
ＴＧを除去するためにろ過によって洗浄した。各々の分
取分で産生されたβ−ガラクトシダーゼのレベルを、オ
ルト−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（シ
グマ社）の分解をＯ．Ｄ．２４０で検出することによっ
て測定した［Ｊ．Ｈ．ミラー、「エクスペリメント・イ
ン・モレキュラー・ジェネティクス」、第４３１頁、コ
ールド スプリングハーバー プレス社（１９７
２）］。ＳＧ９４３株（ｈｔｐＲ+ ）は、３０℃で経時
的にβ−ガラクトシダーゼ活性の増加を示したのに対
し、ＳＧ９４２株（ｈｔｐＲ- ）はβ−ガラクトシダー
ゼ活性の増加を示さなかった。
するよう誘導したｈｔｐＲ+ 細胞とｈｔｐＲ- 細胞にお
けるｌｏｎ遺伝子の発現 ｌｏｎ−ｌａｃ 融合体をもつ菌株ＳＧ９４３及びＳＧ９
４２を、次いで組織プラスミノーゲン活性因子をコード
するＤＮＡ配列をもつプラスミドｐＴＰＡ１０２（ｐＴ
ＰＡ１０２を含む大腸菌株は１９８４年８月２７日にメ
リーランド州ロッケビル在のアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクションに寄託され、受託番号はＡＴＣＣ
３９８１０である）で形質転換した。ｐＴＰＡ１０２
は、プラスミドｐＭＣ９に由来し［Ｒ．Ａ．ヤング等、
「抗体プローブを用いた効果的な遺伝子の分離法」、プ
ロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンス ＵＳＡ、第８０巻、第１１９４〜１１
９８頁（１９８３）］、周知の操作技術を用いてｔｒｃ
プロモーター（ｔｒｐからの−３５領域とｌａｃからの
−１０領域）の制御下にＴＰＡ遺伝子を含むようにした
ものである。ｐＴＰＡ１０２を大腸菌株ＳＧ９４３及び
ＳＧ９４２の各々を形質転換するために用い、各菌株を
培養して２つに分けた。各々の菌株から分けた一方に、
ｔｒｃプロモーターの誘導物質であるＩＰＴＧ［イソプ
ロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を１ｍＭの
濃度になるように加えた。もう一方は各々未誘導のまま
にしておいた。細胞を３０℃で１時間保温した後、ＩＰ
ＴＧを除去するためにろ過によって洗浄した。各々の分
取分で産生されたβ−ガラクトシダーゼのレベルを、オ
ルト−ニトロフェニルβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（シ
グマ社）の分解をＯ．Ｄ．２４０で検出することによっ
て測定した［Ｊ．Ｈ．ミラー、「エクスペリメント・イ
ン・モレキュラー・ジェネティクス」、第４３１頁、コ
ールド スプリングハーバー プレス社（１９７
２）］。ＳＧ９４３株（ｈｔｐＲ+ ）は、３０℃で経時
的にβ−ガラクトシダーゼ活性の増加を示したのに対
し、ＳＧ９４２株（ｈｔｐＲ- ）はβ−ガラクトシダー
ゼ活性の増加を示さなかった。
【００７３】これらの結果により、プロテアーゼＬａの
発現を制御するｌｏｎプロモーターはＴＰＡタンパクを
コードするＤＮＡ配列で形質転換した宿主内でＴＰＡ生
産が誘導されることによって作動することが示される。
しかしながら、ｈｔｐＲ変異株は、このような発現の増
加を示さない。
発現を制御するｌｏｎプロモーターはＴＰＡタンパクを
コードするＤＮＡ配列で形質転換した宿主内でＴＰＡ生
産が誘導されることによって作動することが示される。
しかしながら、ｈｔｐＲ変異株は、このような発現の増
加を示さない。
【００７４】実施例４ ３０℃での組織プラスミノーゲン活性因子産生細胞中に
おけるいくつかのヒート・ショック・タンパクの誘導お
よびｈｔｐＲ変異株におけるこの誘導の欠損 ＴＰＡ遺伝子を含むｐＴＰＡ１０２を、前述のように大
腸菌株ＳＧ９４３及びＳＧ９４２に形質転換させ、各々
の細胞を等量で２分画した。各々の菌株から採取した一
方は、ＴＰＡを生産させるために、前述のように３０℃
で１時間ＩＰＴＧを添加することによって誘導した。も
う一方は、ＩＰＴＧの添加なしに、すなわち未誘導のま
ま３０℃で１時間保温した。次いで、細胞をろ過して洗
浄した後、35Ｓ−メチオニン（＞４００ｃｉ／ｍｍｏ
ｌ、ニューイングランド ヌクレア社）を２μｃｉ／ｍ
ｌの濃度で含むＭＯＰＳ培地に再懸濁し、５分間パルス
標識した。次いで、全細胞タンパクをＴＣＡ沈殿によっ
て細胞から抽出し、先ず、１０％ＴＣＡで洗浄した後、
５％ＴＣＡで洗浄した。次いでエタノール／エーテルの
１：１溶液で洗浄した。タンパクを真空乾燥し、１×Ｓ
ＤＳサンプル緩衝液に再懸濁し、７〜１５％リニア・グ
ラジエント・ポリアクリルアミドゲルにかけて分析し
た。典型的なヒート・ショック応答を示すため、大腸菌
ＳＧ９４３及びＳＧ９４２細胞（ｐＴＰＡ１０２で形質
転換されていないもの）を上記と同様に３０℃と４２℃
とにおいてパルス標識した。細胞を４２℃で生育させる
場合は、細胞を３０℃から４２℃に移して、５分間生育
させてからパルス標識した。
おけるいくつかのヒート・ショック・タンパクの誘導お
よびｈｔｐＲ変異株におけるこの誘導の欠損 ＴＰＡ遺伝子を含むｐＴＰＡ１０２を、前述のように大
腸菌株ＳＧ９４３及びＳＧ９４２に形質転換させ、各々
の細胞を等量で２分画した。各々の菌株から採取した一
方は、ＴＰＡを生産させるために、前述のように３０℃
で１時間ＩＰＴＧを添加することによって誘導した。も
う一方は、ＩＰＴＧの添加なしに、すなわち未誘導のま
ま３０℃で１時間保温した。次いで、細胞をろ過して洗
浄した後、35Ｓ−メチオニン（＞４００ｃｉ／ｍｍｏ
ｌ、ニューイングランド ヌクレア社）を２μｃｉ／ｍ
ｌの濃度で含むＭＯＰＳ培地に再懸濁し、５分間パルス
標識した。次いで、全細胞タンパクをＴＣＡ沈殿によっ
て細胞から抽出し、先ず、１０％ＴＣＡで洗浄した後、
５％ＴＣＡで洗浄した。次いでエタノール／エーテルの
１：１溶液で洗浄した。タンパクを真空乾燥し、１×Ｓ
ＤＳサンプル緩衝液に再懸濁し、７〜１５％リニア・グ
ラジエント・ポリアクリルアミドゲルにかけて分析し
た。典型的なヒート・ショック応答を示すため、大腸菌
ＳＧ９４３及びＳＧ９４２細胞（ｐＴＰＡ１０２で形質
転換されていないもの）を上記と同様に３０℃と４２℃
とにおいてパルス標識した。細胞を４２℃で生育させる
場合は、細胞を３０℃から４２℃に移して、５分間生育
させてからパルス標識した。
【００７５】未形質転換のｈｔｐＲ+ 細胞を３０℃と４
２℃とで生育させた場合のオートラジオグラフを比較す
ると、４２℃では多数のヒート・ショック・タンパクの
生産が見られた（しかしながら、３０℃では見られなか
った）。３０℃にてＩＰＴＧで誘導したＴＰＡを含むｈ
ｔｐＲ+ 細胞からのオートラジオグラフは、４２℃に移
して生育させた（すなわち典型的なヒート・ショック応
答）ｈｔｐＲ+ 細胞のオートラジオグラフで観察される
ヒート・ショック・タンパクのいくつかと対応する４〜
５種のタンパクを示した。これらの４〜５種のタンパク
は、ＩＰＴＧで誘導したＴＰＡを含むｈｔｐＲ+ 細胞の
オートラジオグラフにも現れなかったし、また４２℃に
移して生育させたｈｔｐＲ- 細胞のオートラジオグラフ
に現れたどのヒート・ショック・タンパクでもなかっ
た。このデータは、ｈｔｐＲ+ 細胞内でヒート・ショッ
クにより誘導されるタンパクの少なくとも数個が３０℃
におけるＴＰＡの産生によっても誘導されるが、これら
のタンパクの誘導はｈｔｐＲ変異株ではおこらないこと
を示している。
２℃とで生育させた場合のオートラジオグラフを比較す
ると、４２℃では多数のヒート・ショック・タンパクの
生産が見られた（しかしながら、３０℃では見られなか
った）。３０℃にてＩＰＴＧで誘導したＴＰＡを含むｈ
ｔｐＲ+ 細胞からのオートラジオグラフは、４２℃に移
して生育させた（すなわち典型的なヒート・ショック応
答）ｈｔｐＲ+ 細胞のオートラジオグラフで観察される
ヒート・ショック・タンパクのいくつかと対応する４〜
５種のタンパクを示した。これらの４〜５種のタンパク
は、ＩＰＴＧで誘導したＴＰＡを含むｈｔｐＲ+ 細胞の
オートラジオグラフにも現れなかったし、また４２℃に
移して生育させたｈｔｐＲ- 細胞のオートラジオグラフ
に現れたどのヒート・ショック・タンパクでもなかっ
た。このデータは、ｈｔｐＲ+ 細胞内でヒート・ショッ
クにより誘導されるタンパクの少なくとも数個が３０℃
におけるＴＰＡの産生によっても誘導されるが、これら
のタンパクの誘導はｈｔｐＲ変異株ではおこらないこと
を示している。
【００７６】実施例５ ｈｔｐＲ変異株にクローン化した組織プラスミノーゲン
活性因子の増収 当業界で周知された技術により大腸菌の野生株ＭＣ１０
６１、ｌｏｎ変異株であるＳＧ２０４１およびｈｔｐＲ
ｌｏｎ二重変異株であるＳＧ９３５にプラスミドｐＴ
ＰＡ１０２を形質転換させた。細胞をＬＢ培地中でＯ．
Ｄ．が０．５になるまで生育させ、ＩＰＴＧを１ｍＭの
濃度になるように添加し、０．５〜１時間培養した。細
胞を遠心分離し、ＳＤＳサンプル緩衝液に再懸濁し、１
０分間煮沸した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで
電気泳動した。ゲルをニトロセルロース紙にブロットし
て、ゲルから紙へバンドに分かれたタンパクを移した。
次いで、紙をＴＰＡに対するウサギ抗体（ヴォルフ−デ
ィーター・シュロイニンク博士の寄贈）で処理し、次い
で、さらにヤギのウサギ抗体で処理した（この２番目の
抗体は西洋ワサビのパーオキシダーゼで結合させてあ
る。バイオラッド社）。これらの抗体は、フィルター紙
のＴＰＡタンパクのバンドがある部分に結合した。ＴＰ
Ａバンドを検出するために、フィルター紙を、Ｈ2 Ｏ2
にさらし、紙上のＴＰＡバンドがある部分を変色させた
（ウェスタン・ブロット法参照）。この手法を用いて、
ｈｔｐＲ ｌｏｎ二重変異株では野生株に比べて組織プ
ラスミノーゲン活性因子の収量が３〜５倍に増加したこ
とを示した。
活性因子の増収 当業界で周知された技術により大腸菌の野生株ＭＣ１０
６１、ｌｏｎ変異株であるＳＧ２０４１およびｈｔｐＲ
ｌｏｎ二重変異株であるＳＧ９３５にプラスミドｐＴ
ＰＡ１０２を形質転換させた。細胞をＬＢ培地中でＯ．
Ｄ．が０．５になるまで生育させ、ＩＰＴＧを１ｍＭの
濃度になるように添加し、０．５〜１時間培養した。細
胞を遠心分離し、ＳＤＳサンプル緩衝液に再懸濁し、１
０分間煮沸した後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで
電気泳動した。ゲルをニトロセルロース紙にブロットし
て、ゲルから紙へバンドに分かれたタンパクを移した。
次いで、紙をＴＰＡに対するウサギ抗体（ヴォルフ−デ
ィーター・シュロイニンク博士の寄贈）で処理し、次い
で、さらにヤギのウサギ抗体で処理した（この２番目の
抗体は西洋ワサビのパーオキシダーゼで結合させてあ
る。バイオラッド社）。これらの抗体は、フィルター紙
のＴＰＡタンパクのバンドがある部分に結合した。ＴＰ
Ａバンドを検出するために、フィルター紙を、Ｈ2 Ｏ2
にさらし、紙上のＴＰＡバンドがある部分を変色させた
（ウェスタン・ブロット法参照）。この手法を用いて、
ｈｔｐＲ ｌｏｎ二重変異株では野生株に比べて組織プ
ラスミノーゲン活性因子の収量が３〜５倍に増加したこ
とを示した。
【００７７】実施例６ ｌｏｎ及びｈｔｐＲ変異株におけるソマトメジンＣの発
現 以下の実施例は、ヒトのホルモンであるソマトメジンＣ
（ＳＭＣ）を、以下のようにＳＭＣをコードする遺伝子
を有するプラスミドで形質転換したｌｏｎ変異株、ｈｔ
ｐＲ変異株及びｌｏｎ ｈｔｐＲ変異株の各宿主細胞に
おいて、４２℃での蓄積を示すものである。たとえば、
ｐＰＬｍｕＳＭＣori もしくはｐＰＬｍｕＳＭＣ２（そ
れらはＳＭＣ遺伝子を有する）とｐｃＩ857 とを大腸菌
株ＨＢ１０１、ＳＧ９３１（野生株）、ＳＧ９３３（ｌ
ｏｎ- ）、ＳＧ９３４（ｈｔｐＲ- ）及びＳＧ９３６
（ｌｏｎ- 、ｈｔｐＲ- ）のそれぞれに導入した。これ
らの菌株をヒート・ショック応答を誘導させるために４
２℃で２時間保温し、各々の菌株からの大腸菌抽出物を
ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにかけクマシーブルー染
色してＳＭＣの蓄積を検出した。ｐＰＬｍｕＳＭＣori
及びｐｃＩ857 を有する５種の菌株の放射性免疫分析に
より、上記の各々のＳＭＣの産生比率は１：１：３：１
５：３３であることが示された。従って、ｌｏｎ ｈｔ
ｐＲ変異株は最も大量のＳＭＣを蓄積し、２つの変異は
相乗効果があった。同様の効果が、ｐＰＬｍｕＳＭＣを
有する菌でも観察された。その場合、ＳＭＣの比率は５
種のそれぞれの菌株について１：１：２．６：２．３：
４．１であった。ここでも、ｌｏｎ ｈｔｐＲ変異株は
最も大量のＳＭＣを蓄積し、２つの変異は相乗効果があ
った。
現 以下の実施例は、ヒトのホルモンであるソマトメジンＣ
（ＳＭＣ）を、以下のようにＳＭＣをコードする遺伝子
を有するプラスミドで形質転換したｌｏｎ変異株、ｈｔ
ｐＲ変異株及びｌｏｎ ｈｔｐＲ変異株の各宿主細胞に
おいて、４２℃での蓄積を示すものである。たとえば、
ｐＰＬｍｕＳＭＣori もしくはｐＰＬｍｕＳＭＣ２（そ
れらはＳＭＣ遺伝子を有する）とｐｃＩ857 とを大腸菌
株ＨＢ１０１、ＳＧ９３１（野生株）、ＳＧ９３３（ｌ
ｏｎ- ）、ＳＧ９３４（ｈｔｐＲ- ）及びＳＧ９３６
（ｌｏｎ- 、ｈｔｐＲ- ）のそれぞれに導入した。これ
らの菌株をヒート・ショック応答を誘導させるために４
２℃で２時間保温し、各々の菌株からの大腸菌抽出物を
ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにかけクマシーブルー染
色してＳＭＣの蓄積を検出した。ｐＰＬｍｕＳＭＣori
及びｐｃＩ857 を有する５種の菌株の放射性免疫分析に
より、上記の各々のＳＭＣの産生比率は１：１：３：１
５：３３であることが示された。従って、ｌｏｎ ｈｔ
ｐＲ変異株は最も大量のＳＭＣを蓄積し、２つの変異は
相乗効果があった。同様の効果が、ｐＰＬｍｕＳＭＣを
有する菌でも観察された。その場合、ＳＭＣの比率は５
種のそれぞれの菌株について１：１：２．６：２．３：
４．１であった。ここでも、ｌｏｎ ｈｔｐＲ変異株は
最も大量のＳＭＣを蓄積し、２つの変異は相乗効果があ
った。
【００７８】また、ゲルのオートラジオグラフィーによ
って検出されるパルス追跡についても研究した。細胞を
システイン以外のすべてのアミノ酸を添加したＭ９最小
培地で２８℃にて一晩培養し、次いで同じ培地中で４２
℃にて誘導した。培養中の細胞を［35Ｓ］−システイン
で３０秒間標識し、次いで過剰の非標識システインを培
地に加えて追跡した。ｐＰＬｍｕＳＭＣ２をもつＨＢ１
０１株はｐＰＬｍｕＳＭＣori をもつＨＢ１０１株に比
べてＳＭＣに約４倍の［35Ｓ］−システインを取り込ん
だ。野生株であるＨＢ１０１を宿主とした場合、ＳＭＣ
の半減期は５分間もしくはそれ以下であり、ＳＭＣは６
０分後の追跡では殆ど検出されなかった。これに対し、
ｌｏｎ ｈｔｐＲ変異株を宿主とした場合、半減期は６
０分間であった。
って検出されるパルス追跡についても研究した。細胞を
システイン以外のすべてのアミノ酸を添加したＭ９最小
培地で２８℃にて一晩培養し、次いで同じ培地中で４２
℃にて誘導した。培養中の細胞を［35Ｓ］−システイン
で３０秒間標識し、次いで過剰の非標識システインを培
地に加えて追跡した。ｐＰＬｍｕＳＭＣ２をもつＨＢ１
０１株はｐＰＬｍｕＳＭＣori をもつＨＢ１０１株に比
べてＳＭＣに約４倍の［35Ｓ］−システインを取り込ん
だ。野生株であるＨＢ１０１を宿主とした場合、ＳＭＣ
の半減期は５分間もしくはそれ以下であり、ＳＭＣは６
０分後の追跡では殆ど検出されなかった。これに対し、
ｌｏｎ ｈｔｐＲ変異株を宿主とした場合、半減期は６
０分間であった。
【００７９】本明細書中に記載した工程によって調製さ
れた微生物はメリーランド州ロックビル在のアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託された培養
物によって、例証される。
れた微生物はメリーランド州ロックビル在のアメリカン
・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託された培養
物によって、例証される。
【００８０】１９８４年５月５日に寄託された培養物
は、以下のように同定される。 培養物ＳＧ９３５： ＡＴＣＣ３９，６２３ 培養物ＳＧ９３６： ＡＴＣＣ３９，６２４ １９８４年５月６日に寄託された培養物は、以下のよう
に同定される。 培養物ＳＧ９２７： ＡＴＣＣ３９，６２７◎ 培養物ＳＧ９２８： ＡＴＣＣ３９，６２８ 本出願人はここまでに本発明のいくつかの実施例を示し
たが、本発明の基本的な構成は、本発明の方法及び組成
物を利用目的に応じて改変しうることが明らかである。
従って、本発明の範囲は、以上に実施例として示した特
定の実施例のみに限定されない。
は、以下のように同定される。 培養物ＳＧ９３５： ＡＴＣＣ３９，６２３ 培養物ＳＧ９３６： ＡＴＣＣ３９，６２４ １９８４年５月６日に寄託された培養物は、以下のよう
に同定される。 培養物ＳＧ９２７： ＡＴＣＣ３９，６２７◎ 培養物ＳＧ９２８： ＡＴＣＣ３９，６２８ 本出願人はここまでに本発明のいくつかの実施例を示し
たが、本発明の基本的な構成は、本発明の方法及び組成
物を利用目的に応じて改変しうることが明らかである。
従って、本発明の範囲は、以上に実施例として示した特
定の実施例のみに限定されない。
【図１】ｈｔｐＲ変異株から単離したプロテアーゼＬａ
の３０℃と４２℃とにおけるレベルを示す表である。
の３０℃と４２℃とにおけるレベルを示す表である。
【図２】ピューロマイシンを取り込んだ種々の不完全大
腸菌ポリペプチドについての時間に対する分解パーセン
テージの比較グラフである。
腸菌ポリペプチドについての時間に対する分解パーセン
テージの比較グラフである。
【図３】アルギニンの代わりにカナバニンを含む種々の
大腸菌以上タンパクについての時間に対する分解パーセ
ンテージの比較グラフである。
大腸菌以上タンパクについての時間に対する分解パーセ
ンテージの比較グラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/57 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ゴフ，スティーブン エイ アメリカ合衆国、マサチューセッツ 02114、ボストン、ナンバー２、ジョイ ストリート 65 (72)発明者 カッソン，ローレンス ピー アメリカ合衆国、マサチューセッツ 02143、ソマービル、ウィロー アベニュ ー 96
Claims (3)
- 【請求項１】 ｈｔｐＲ遺伝子とｌｏｎ遺伝子の両方の
中に変異を有し、この結果タンパク、ポリペプチド、ま
たは生成物の存在に応答しタンパク分解能を減少したも
のとし、前記生成物はｈｔｐＲタンパク、ポリペプチ
ド、または生成物でない生成物であることを特徴とする
大腸菌宿主体。 - 【請求項２】 宿主体において、前記宿主体が、大腸菌
株ＳＧ９２７（ＡＴＣＣ受託番号３９，６２７）、大腸
菌株ＳＧ９２８（ＡＴＣＣ受託番号３９，６２８）、大
腸菌株ＳＧ９３５（ＡＴＣＣ受託番号３９，６２３）お
よび大腸菌株ＳＧ９３６（ＡＴＣＣ受託番号３９，６２
４）よりなる群から選択される請求項１記載の宿主体。 - 【請求項３】 ｈｔｐＲ ＤＮＡを含まず、かつ組換え
ＤＮＡ分子中Ｋ発現制御配列に作用的に結合したタンパ
ク、ポリペプチド、または生成物をコードするＤＮＡ配
列を特徴とする前記組換えＤＮＡ分子により形質転換さ
れた請求項１または２記載の宿主体。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US586786 | 1984-03-06 | ||
| US06/586,786 US4758512A (en) | 1984-03-06 | 1984-03-06 | Hosts and methods for producing recombinant products in high yields |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60501145A Division JPH0775550B2 (ja) | 1984-03-06 | 1985-03-06 | 高収量の組換え産物の産生宿主及び産生方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06261746A true JPH06261746A (ja) | 1994-09-20 |
| JPH0771483B2 JPH0771483B2 (ja) | 1995-08-02 |
Family
ID=24347106
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60501145A Expired - Lifetime JPH0775550B2 (ja) | 1984-03-06 | 1985-03-06 | 高収量の組換え産物の産生宿主及び産生方法 |
| JP5269020A Expired - Lifetime JPH0771483B2 (ja) | 1984-03-06 | 1993-10-27 | 高収量の組換え産物の産生宿主体 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60501145A Expired - Lifetime JPH0775550B2 (ja) | 1984-03-06 | 1985-03-06 | 高収量の組換え産物の産生宿主及び産生方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4758512A (ja) |
| EP (1) | EP0174367B1 (ja) |
| JP (2) | JPH0775550B2 (ja) |
| AT (1) | ATE77104T1 (ja) |
| AU (1) | AU594015B2 (ja) |
| DE (1) | DE3586189T2 (ja) |
| WO (1) | WO1985003949A1 (ja) |
Families Citing this family (45)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4758512A (en) * | 1984-03-06 | 1988-07-19 | President And Fellows Of Harvard College | Hosts and methods for producing recombinant products in high yields |
| DK108685A (da) * | 1984-03-19 | 1985-09-20 | Fujisawa Pharmaceutical Co | Vaekstfaktor i |
| US5972682A (en) * | 1984-05-29 | 1999-10-26 | Genencor International, Inc. | Enzymatically active modified subtilisins |
| US5801038A (en) * | 1984-05-29 | 1998-09-01 | Genencor International Inc. | Modified subtilisins having amino acid alterations |
| GB8507833D0 (en) * | 1985-03-26 | 1985-05-01 | Biogen Nv | Production of human somatomedin c |
| US5242811A (en) * | 1985-03-26 | 1993-09-07 | Biogen, Inc. | Production of human somatomedin C |
| PT83425B (en) * | 1985-09-27 | 1988-10-13 | Smithkline Beckman Corp | Proteolytic deficient e.coli |
| JPH0669377B2 (ja) * | 1985-11-25 | 1994-09-07 | 工業技術院長 | Ｄｎａ塩基配列およびベクタ− |
| JPH0650985B2 (ja) * | 1985-12-27 | 1994-07-06 | サントリー株式会社 | 新規な大腸菌宿主 |
| JPS6356277A (ja) * | 1986-08-26 | 1988-03-10 | Higeta Shoyu Kk | 新規バチルス・ブレビス及びその利用 |
| JPS6387975A (ja) * | 1986-10-02 | 1988-04-19 | Agency Of Ind Science & Technol | 枯草菌菌株 |
| ZA879286B (en) | 1986-12-16 | 1988-10-26 | Smith Kline Rit | New plasminogen activators |
| WO1988005821A1 (en) * | 1987-01-30 | 1988-08-11 | President And Fellows Of Harvard College | Periplasmic protease mutants of escherichia coli |
| US5240837A (en) * | 1987-02-19 | 1993-08-31 | The Upjohn Company | CDNAS encoding somatotropin, expression vectors and hosts |
| WO1988006186A2 (en) * | 1987-02-19 | 1988-08-25 | The Upjohn Company | cDNAs ENCODING SOMATOTROPIN, EXPRESSION VECTORS AND HOSTS |
| WO1988009821A1 (en) * | 1987-06-12 | 1988-12-15 | Massachusetts Institute Of Technology | Coryneform expression and secretion system |
| US4965197A (en) * | 1987-06-12 | 1990-10-23 | Massachusetts Institute Of Technology | Coryneform expression and secretion system |
| AU620568B2 (en) * | 1987-09-09 | 1992-02-20 | Celltech Limited | The expression of antibody fragments in protease deficient bacterial host cells |
| DE3853481T2 (de) * | 1987-09-09 | 1995-10-19 | Celltech Therapeutics Ltd | Fv Antikörperfragment-Herstellung. |
| DE3804890C2 (de) * | 1988-01-05 | 1996-09-05 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur Herstellung von Proteinen oder proteinhaltigen Genprodukten |
| EP0327797B1 (de) * | 1988-01-05 | 2003-09-03 | Roche Diagnostics GmbH | Verfahren zur Herstellung von Proteinen oder proteinhaltigen Genprodukten |
| US5143846A (en) * | 1988-03-17 | 1992-09-01 | The General Hospital Corporation | Protease deficient bacterial hosts |
| CA1333777C (en) * | 1988-07-01 | 1995-01-03 | Randy M. Berka | Aspartic proteinase deficient filamentous fungi |
| US5232833A (en) * | 1988-09-14 | 1993-08-03 | Stressgen Biotechnologies Corporation | Accumulation of heat shock proteins for evaluating biological damage due to chronic exposure of an organism to sublethal levels of pollutants |
| GB8824591D0 (en) | 1988-10-20 | 1988-11-23 | Royal Free Hosp School Med | Fractionation process |
| US5180820A (en) * | 1989-08-30 | 1993-01-19 | Barde Yves Alain | Brain-derived neurotrophic factor |
| GB8927008D0 (en) * | 1989-11-29 | 1990-01-17 | Ciba Geigy | Novel process for the production of unfused protein in e.coli |
| EP0495638A3 (en) * | 1991-01-16 | 1993-06-02 | Schering Corporation | Expression of mature pdgf-b in escherichia coli |
| US5389529A (en) * | 1991-06-12 | 1995-02-14 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Modified lamβ signal sequence and processes for producing recombinant neurotrophins |
| US5288931A (en) * | 1991-12-06 | 1994-02-22 | Genentech, Inc. | Method for refolding insoluble, misfolded insulin-like growth factor-I into an active conformation |
| US5443980A (en) * | 1992-08-14 | 1995-08-22 | Univeridad Nacional Autonoma De Mexico (Unam) | Process to obtain extra-cellular recombinant products using Xanthomonas campestris pv campestris as host |
| EP0695359B1 (en) * | 1993-03-29 | 1997-06-04 | E.I. Du Pont De Nemours & Company Incorporated | A method for enhancing the production of biologically active recombinant proteins |
| US6110703A (en) * | 1996-07-05 | 2000-08-29 | Novo Nordisk A/S | Method for the production of polypeptides |
| JP3344618B2 (ja) * | 1997-06-20 | 2002-11-11 | 株式会社エイチ・エス・ピー研究所 | シャペロン発現プラスミド |
| AU777432B2 (en) * | 1999-04-15 | 2004-10-14 | Children's Medical Center Corporation | Osteopontin-derived chemotactic and inhibitory agents and uses therefor |
| US20050048614A1 (en) * | 2000-06-13 | 2005-03-03 | Children's Medical Center Corporation | Biosynthetic oncolytic molecules and uses therefor |
| US20040157289A1 (en) * | 2002-09-06 | 2004-08-12 | Salerno John C. | Protein expression system |
| KR100530988B1 (ko) * | 2003-03-14 | 2005-11-28 | 한국과학기술원 | 봉입체 결합 단백질을 코딩하는 유전자를 결핍시키거나 증폭시켜 목적 단백질을 제조하는 방법 |
| US8299052B2 (en) * | 2006-05-05 | 2012-10-30 | Shionogi Inc. | Pharmaceutical compositions and methods for improved bacterial eradication |
| EP2070507B1 (en) * | 2007-12-14 | 2013-09-04 | Dentsply DeTrey GmbH | Hardening composition |
| CN105821078A (zh) | 2010-12-09 | 2016-08-03 | 巴斯德研究所 | 用于获得高产量重组蛋白表达的基于mgmt的方法 |
| CA2861697C (en) | 2012-01-05 | 2022-03-15 | Novartis Ag | Protease deficient filamentous fungal cells and methods of use thereof |
| WO2013174927A1 (en) | 2012-05-23 | 2013-11-28 | Novartis International Pharmaceutical Limited | Production of fucosylated glycoproteins |
| RU2016104064A (ru) | 2013-07-10 | 2017-08-15 | Новартис Аг | Клетки мицелиальных грибов с множественной недостаточностью протеаз и способы их использования |
| CN108064266A (zh) | 2014-07-21 | 2018-05-22 | 格利科斯芬兰公司 | 在丝状真菌中具有哺乳动物样n-聚糖的糖蛋白的制备 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ199391A (en) * | 1981-01-02 | 1985-12-13 | Genentech Inc | Chimeric polypeptides comprising a proinsulin sequence,and preparation by recombinant dna technique;production of human insulin |
| CA1207253A (en) * | 1981-08-17 | 1986-07-08 | Lee D. Simon | T4 dna fragment as a stabilizer for proteins expressed by cloned dna |
| JPS58501406A (ja) * | 1981-08-21 | 1983-08-25 | ユニヴア−シテイ− パテンツ，インコ−ポレ−テツド | エシエリヒア・コリ−における蛋白合成発現の高揚 |
| ZA831094B (en) * | 1982-02-22 | 1983-11-30 | Biogen Nv | Dna sequences,recombinant dna molecules and processes for producing human immune interferon-like polypeptides |
| AR241654A1 (es) * | 1982-05-05 | 1992-10-30 | Genentech Inc | Procedimiento para producir activador de plasminogeno de tejido humano. |
| EP0123228B1 (en) * | 1983-04-25 | 1993-09-29 | Chiron Corporation | Hybrid dna synthesis of mature insulin-like growth factors |
| IL71991A (en) * | 1983-06-06 | 1994-05-30 | Genentech Inc | Preparation of human FGI and FGE in their processed form through recombinant AND tranology in prokaryotes |
| ATE66251T1 (de) * | 1983-12-23 | 1991-08-15 | Pfizer | Expressionsplasmide fuer die herstellung eines heterologen proteins in bakterien. |
| US4758512A (en) * | 1984-03-06 | 1988-07-19 | President And Fellows Of Harvard College | Hosts and methods for producing recombinant products in high yields |
| US4753879A (en) * | 1984-08-27 | 1988-06-28 | Biogen N.V. | Modified tissue plasminogen activators |
-
1984
- 1984-03-06 US US06/586,786 patent/US4758512A/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-03-06 AU AU40679/85A patent/AU594015B2/en not_active Ceased
- 1985-03-06 WO PCT/US1985/000386 patent/WO1985003949A1/en active IP Right Grant
- 1985-03-06 AT AT85901721T patent/ATE77104T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-03-06 EP EP85901721A patent/EP0174367B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-06 DE DE8585901721T patent/DE3586189T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-03-06 JP JP60501145A patent/JPH0775550B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-10-27 JP JP5269020A patent/JPH0771483B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU594015B2 (en) | 1990-03-01 |
| DE3586189D1 (de) | 1992-07-16 |
| ATE77104T1 (de) | 1992-06-15 |
| US4758512A (en) | 1988-07-19 |
| AU4067985A (en) | 1985-09-24 |
| JPS61501307A (ja) | 1986-07-03 |
| EP0174367B1 (en) | 1992-06-10 |
| DE3586189T2 (de) | 1992-12-17 |
| JPH0775550B2 (ja) | 1995-08-16 |
| EP0174367A4 (en) | 1988-08-29 |
| WO1985003949A1 (en) | 1985-09-12 |
| EP0174367A1 (en) | 1986-03-19 |
| JPH0771483B2 (ja) | 1995-08-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH06261746A (ja) | 高収量の組換え産物の産生宿主体 | |
| KR860001557B1 (ko) | 폴리펩티드의 제조방법 | |
| US5922583A (en) | Methods for production of recombinant plasmids | |
| JP3592326B2 (ja) | ユビキチン特異的プロテアーゼ | |
| Inada et al. | Conditionally lethal amber mutations in the leader peptidase gene of Escherichia coli | |
| US4711845A (en) | Portable temperature-sensitive control cassette | |
| Lundrigan et al. | Gene envY of Escherichia coli K-12 affects thermoregulation of major porin expression | |
| US5391490A (en) | Ubiquitin-specific protease | |
| JP3878207B2 (ja) | ｏｓｍＢ プロモータで制御される発現プラスミド | |
| US4888280A (en) | Hybrid proteins produced by an ultrahigh prokaryotic expression | |
| Hecht et al. | Phage lambda repressor revertants: amino acid substitutions that restore activity to mutant proteins | |
| US4830962A (en) | Recombinant diphtheria toxin fragments | |
| US5401642A (en) | Vectors and methods for making such vectors and for expressing cloned genes | |
| Bruist et al. | Phase variation and the Hin protein: in vivo activity measurements, protein overproduction, and purification | |
| JP2544602B2 (ja) | 新規プラスミドベクタ− | |
| US4828988A (en) | Hybrid polypeptides comprising somatocrinine and alpha1 -antitrypsin, method for their production from bacterial clones and use thereof for the production of somatocrinine | |
| Zaghloul et al. | Translational coupling in Bacillus subtilis of a heterologous Bacillus subtilis-Escherichia coli gene fusion | |
| JP2549504B2 (ja) | Ｄｎａ塩基配列、ポリペプチド分泌発現ベクター及び形質転換微生物 | |
| US5212083A (en) | Sequence for stabilizing proteins in bacteria | |
| JPH0746994A (ja) | ポリペプチドの製造方法 | |
| Hoshino et al. | Genetic analysis of the Pseudomonas aeruginosa PAO high-affinity branched-chain amino acid transport system by use of plasmids carrying the bra genes | |
| JP2538200B2 (ja) | ポリペプチド分泌発現ベクタ―及び形質転換微生物 | |
| JP2574146B2 (ja) | ポリペプチド発現ベクタ−、該ベクタ−で形質転換した宿主及び該宿主によるポリペプチドの製造法 | |
| Takebe et al. | In vitro construction of the tufB-lacZ fusion: analysis of the regulatory mechanism of tufB promoter | |
| CA1242981A (en) | Portable temperature-sensitive control cassette |