JPH0650985B2 - 新規な大腸菌宿主 - Google Patents
新規な大腸菌宿主Info
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- JPH0650985B2 JPH0650985B2 JP60295140A JP29514085A JPH0650985B2 JP H0650985 B2 JPH0650985 B2 JP H0650985B2 JP 60295140 A JP60295140 A JP 60295140A JP 29514085 A JP29514085 A JP 29514085A JP H0650985 B2 JPH0650985 B2 JP H0650985B2
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- Japan
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- tosyl
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、外来性のタンパク又はポリペプチド（以下、
単にタンパクと略す）を高発現しうるベクターの宿主と
して新規な大腸菌及び該大腸菌を宿主とした形質転換体
からタンパクを高収率で得る方法を提供する。具体的に
は、ヒト免疫インターフェロン分解活性を欠失した新規
な大腸菌を提供し、この大腸菌を宿主とした形質転換体
からヒト免疫インターフェロン活性をもつタンパクを効
率良く得る方法を提供する。
単にタンパクと略す）を高発現しうるベクターの宿主と
して新規な大腸菌及び該大腸菌を宿主とした形質転換体
からタンパクを高収率で得る方法を提供する。具体的に
は、ヒト免疫インターフェロン分解活性を欠失した新規
な大腸菌を提供し、この大腸菌を宿主とした形質転換体
からヒト免疫インターフェロン活性をもつタンパクを効
率良く得る方法を提供する。
［従来の技術］ 近年、遺伝子工学、とりわけ組換えDNA技術の急速な進
歩に伴ない、それまで、生物体からの分離・精製に頼っ
ていた多くの生理活性タンパクを微生物を用いて大量に
生産させることが可能となった。これにより、従来は、
その存在が知られるのみであった生理活性タンパクを医
薬品あるいは農薬などの薬剤に使用することも可能とな
ってきた。
歩に伴ない、それまで、生物体からの分離・精製に頼っ
ていた多くの生理活性タンパクを微生物を用いて大量に
生産させることが可能となった。これにより、従来は、
その存在が知られるのみであった生理活性タンパクを医
薬品あるいは農薬などの薬剤に使用することも可能とな
ってきた。
又、組換え技術に関しては、これまで、いかに効率良く
目的物質を生産させるかという点に多くの工夫がなさ
れ、改良技術が提案されてきた。例えば、ベクターの改
良、新しいホスト−ベクター系の開発、培地・培養条件
の改良、更に最近では、プロテインエンジニアリングを
用いたより安定なアミノ酸配列をもつタンパクの開発な
どが行なわれている。
目的物質を生産させるかという点に多くの工夫がなさ
れ、改良技術が提案されてきた。例えば、ベクターの改
良、新しいホスト−ベクター系の開発、培地・培養条件
の改良、更に最近では、プロテインエンジニアリングを
用いたより安定なアミノ酸配列をもつタンパクの開発な
どが行なわれている。
然しながら、高発現される生理活性タンパクも、その形
質転換体からの抽出・精製段階には、多くの工程を要し
ているのが現状である。有用物質を生産する形質転換体
から該物質を容易に、かつ効率良く抽出・精製する技術
を確立することが、産業上有用であることは言をまたな
い。
質転換体からの抽出・精製段階には、多くの工程を要し
ているのが現状である。有用物質を生産する形質転換体
から該物質を容易に、かつ効率良く抽出・精製する技術
を確立することが、産業上有用であることは言をまたな
い。
組換え微生物（形質転換体）が生産する目的タンパクを
抽出・精製するにおいては、通常まず培養微生物を殺菌
剤を用いて死菌とした後（抽出工程を完全に密閉して行
なうことができる場合、この工程は除かれることもあ
る）、菌体を破砕し、その破砕懸濁液を遠心分離して、
その上清又は沈渣のいずれかを精製過程に付すという形
式で行なわれている。しかし、一般に、該上清または沈
渣からの抽出液はプロテアーゼ活性が強いため、目的タ
ンパクが分解されることが多い。
抽出・精製するにおいては、通常まず培養微生物を殺菌
剤を用いて死菌とした後（抽出工程を完全に密閉して行
なうことができる場合、この工程は除かれることもあ
る）、菌体を破砕し、その破砕懸濁液を遠心分離して、
その上清又は沈渣のいずれかを精製過程に付すという形
式で行なわれている。しかし、一般に、該上清または沈
渣からの抽出液はプロテアーゼ活性が強いため、目的タ
ンパクが分解されることが多い。
例えば、ヒト免疫インターフェロン（以下、hIFN−γと
略す）を大腸菌を用いて生産する場合、菌体により生産
されたhIFN−γを抽出する際、菌体を破砕すると、本来
目的としている146アミノ酸より成るペプチドのＣ末端
側が切断された131アミノ酸より成るペプチドが多く得
られる。このＣ末端側の切断を抑え、146アミノ酸より
なるペプチドとして得るためにこれまで、プロテアーゼ
インヒビターを添加して分解を抑える（米国特許第4,47
6,069号）、蛋白変性剤を用いて、目的ペプチドを含め
た菌体タンパクを菌体破砕と同時に凝集・沈澱させた
後、精製する（特開昭59−161321号）等の技術が開示さ
れ、本出願人も先に銅又は亜鉛の塩とポリエチレンイミ
ンとを併用してhIFN−γを効率良く抽出・精製する方法
を開発している。
略す）を大腸菌を用いて生産する場合、菌体により生産
されたhIFN−γを抽出する際、菌体を破砕すると、本来
目的としている146アミノ酸より成るペプチドのＣ末端
側が切断された131アミノ酸より成るペプチドが多く得
られる。このＣ末端側の切断を抑え、146アミノ酸より
なるペプチドとして得るためにこれまで、プロテアーゼ
インヒビターを添加して分解を抑える（米国特許第4,47
6,069号）、蛋白変性剤を用いて、目的ペプチドを含め
た菌体タンパクを菌体破砕と同時に凝集・沈澱させた
後、精製する（特開昭59−161321号）等の技術が開示さ
れ、本出願人も先に銅又は亜鉛の塩とポリエチレンイミ
ンとを併用してhIFN−γを効率良く抽出・精製する方法
を開発している。
一方、近年、目的とするタンパクを細胞外（ベリプラズ
ム又は培地中）に分泌・生産させることにより、抽出液
中の不純物を少なくし、或いはプロテアーゼによる分解
をできるだけ少なくし、目的物質の精製を容易にしよと
する試みもなされているが、効率良く分泌させる技術
や、分泌過程でおこる前駆体の正しいプロセシング（通
常、分泌ペプチド又はタンパクはその前駆体が何らかの
分解過程を経て分泌される）などにおいて、未だ実用化
できる迄には至っていない。
ム又は培地中）に分泌・生産させることにより、抽出液
中の不純物を少なくし、或いはプロテアーゼによる分解
をできるだけ少なくし、目的物質の精製を容易にしよと
する試みもなされているが、効率良く分泌させる技術
や、分泌過程でおこる前駆体の正しいプロセシング（通
常、分泌ペプチド又はタンパクはその前駆体が何らかの
分解過程を経て分泌される）などにおいて、未だ実用化
できる迄には至っていない。
［発明が解決しようとする問題点］ 本発明者らは、大腸菌で発現されるhIFN−γが、特に培
養菌体からの抽出工程において分解され易いという問題
点に鑑み、鋭意研究の結果、ある特定のプロテアーゼ活
性を欠損した大腸菌を宿主として用いることにより上記
の問題を解決しうることを見出し、本発明を完成するに
至った。
養菌体からの抽出工程において分解され易いという問題
点に鑑み、鋭意研究の結果、ある特定のプロテアーゼ活
性を欠損した大腸菌を宿主として用いることにより上記
の問題を解決しうることを見出し、本発明を完成するに
至った。
［問題点を解決するための手段］ 本発明の宿主として使用できる目的変異株はジイソプロ
ピルフルオロフォスフェイト、フェニルメチルスルフォ
ニルフルオライド、Ｎ−α−トシル−Ｌ−リシルクロロ
メチルケトン、Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロ
ロメチルケトン、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ロイ
ペプチン、アンチパイン、α２−マクログロブリンおよ
びキモスタチンによって阻害されず、塩化亜鉛および塩
化銅で阻害されるプロテアーゼ活性が欠損した大腸菌で
あり、更に好ましくはヒト免疫インターフェロン活性を
有するポリペプチドを分解するプロテアーゼ活性が欠損
している大腸菌である。
ピルフルオロフォスフェイト、フェニルメチルスルフォ
ニルフルオライド、Ｎ−α−トシル−Ｌ−リシルクロロ
メチルケトン、Ｎ−トシル−Ｌ−フェニルアラニンクロ
ロメチルケトン、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ロイ
ペプチン、アンチパイン、α２−マクログロブリンおよ
びキモスタチンによって阻害されず、塩化亜鉛および塩
化銅で阻害されるプロテアーゼ活性が欠損した大腸菌で
あり、更に好ましくはヒト免疫インターフェロン活性を
有するポリペプチドを分解するプロテアーゼ活性が欠損
している大腸菌である。
本発明の目的変異株は次のようにして得られる。
まず、組換え微生物の宿主となる大腸菌に変異誘導を処
理を施す。次に、例えばこの変異誘導処理を施した菌体
を培養し、菌体破砕液(lysate)に、対象となるタンパク
を添加後、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以
下SDS-PAGEと略す）でそのタンパクの分解の有無を解析
することにより、目的タンパク（例えばhIFN−γ）分解
活性の欠損した変異株を選択する。もし大腸菌が目的タ
ンパクを高生産する形質転換体である場合は、該形質転
換体の破砕液又は菌体の培養液そのものを直接SDS-PAGE
で解析することによっても目的とする変異株を得ること
ができる。この様にして得られた突然変異株を宿主とし
て目的タンパク（hIFN−γ）発現ベクターを導入し、形
質転換を行ない、得られた形質転換株を培養して目的タ
ンパク（hIFN−γ）を生産させ、この培養菌体を破砕
し、目的タンパク（hIFN−γ）を抽出・精製する。本発
明では、宿主が目的タンパク（hIFN−γ）分解活性を欠
損しているため、プロテアーゼインヒビターや蛋白変性
剤を抽出工程で全く用いなくても、目的タンパク（hIFN
−γ）は分解されることなく得られる。
理を施す。次に、例えばこの変異誘導処理を施した菌体
を培養し、菌体破砕液(lysate)に、対象となるタンパク
を添加後、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以
下SDS-PAGEと略す）でそのタンパクの分解の有無を解析
することにより、目的タンパク（例えばhIFN−γ）分解
活性の欠損した変異株を選択する。もし大腸菌が目的タ
ンパクを高生産する形質転換体である場合は、該形質転
換体の破砕液又は菌体の培養液そのものを直接SDS-PAGE
で解析することによっても目的とする変異株を得ること
ができる。この様にして得られた突然変異株を宿主とし
て目的タンパク（hIFN−γ）発現ベクターを導入し、形
質転換を行ない、得られた形質転換株を培養して目的タ
ンパク（hIFN−γ）を生産させ、この培養菌体を破砕
し、目的タンパク（hIFN−γ）を抽出・精製する。本発
明では、宿主が目的タンパク（hIFN−γ）分解活性を欠
損しているため、プロテアーゼインヒビターや蛋白変性
剤を抽出工程で全く用いなくても、目的タンパク（hIFN
−γ）は分解されることなく得られる。
以下、hIFN−γタンパクの分解活性を欠損した大腸菌お
よびそれを宿主としたhIFN−γ発現ベクターによる形質
転換体について詳述するが、本発明の範囲は、前の述べ
た性質をもつ分解酵素を欠損した大腸菌であれば、この
限りでないことは言うまでもない。
よびそれを宿主としたhIFN−γ発現ベクターによる形質
転換体について詳述するが、本発明の範囲は、前の述べ
た性質をもつ分解酵素を欠損した大腸菌であれば、この
限りでないことは言うまでもない。
尚、本発明により得られた新規大腸菌は、Escherichia
coli SBM 282と命名され、工業技術院微生物工業技術研
究所に微工研条寄第1097号(FERM BP-1097)として寄託さ
れている。
coli SBM 282と命名され、工業技術院微生物工業技術研
究所に微工研条寄第1097号(FERM BP-1097)として寄託さ
れている。
実施例 １．プロテアーゼ活性欠損株の分離 hIFN−γ生産菌であるW3110(M25)／pIN5T4（特開昭60−
24187に開示されたプラスミドpIN5GIF54上のアンピシリ
ン耐性遺伝子(Apr)をテトラサイクリン耐性遺伝子(Tcr)
に置き換えたプラスミドpIN5T4で形質転換された大腸
菌）をLB培地（0.5％酵母エキス、１％バクト−トリプ
トン、0.5％ＮａＣｌ、pH7.0）中、37℃で一晩培養し、
菌体を10,000rpm、５分間遠心分離して菌体を集菌した
後、M9培地（0.1％ＮＨ４Ｃｌ、0.6％Ｎａ２ＨＯＰ４、
0.3％ＫＨ２ＰＯ４、0.05％ＮａＣｌ、pH7.4に調整した
ものに、１Ｍ ＭｇＳＯ４を２ml／、20％グルコース
を10ml／、１Ｍ ＣａＣｌ２を0.1ml／加える）で
菌体を洗浄し、同培地に懸濁した。これに変異誘導剤と
してニトロソグアニジン（以下NTGと略す）を、50μｇ
／mlの濃度となる様に添加し、30分間放置した後、10,0
00rpm、５分間遠心分離して菌体を集菌した。この菌体
をLB培地を用いて洗浄した後、同培地に植菌した。これ
を37℃で一晩培養した後、プレートに出現したコロニー
を、LB培地５００mlを入れたチューブに１白金耳ずつ植
菌し、37℃で一晩培養した。10,000rpm５分間遠心分離
後、Lysozyme−EDTA溶液（500μｇ／ml Lysozyme、１mM
EDTA）200μを加え、凍結溶融法により菌体を破砕し
た。これに１mg／mlの濃度に調整したhIFN−γ溶液100
μを加え、37℃、１時間インキュベートし、SDSサン
プル溶液（10％グリセリン、５％ ２−メルトカプトエ
タノール、23％SDS、62.5mMトリス−塩酸バッファー、p
H6.8）150μを加え、100℃５分間処理した後、10,000
rpm 10分間遠心分離し、上清をSDS-PAGEにかけ、146ア
ミノ酸からなるhIFN−γ（分子量約18,000）の残存量を
検討した。この様にして、約2,000株のうちから、hIFN
−γ分解活性のない変異株を１株得た。
24187に開示されたプラスミドpIN5GIF54上のアンピシリ
ン耐性遺伝子(Apr)をテトラサイクリン耐性遺伝子(Tcr)
に置き換えたプラスミドpIN5T4で形質転換された大腸
菌）をLB培地（0.5％酵母エキス、１％バクト−トリプ
トン、0.5％ＮａＣｌ、pH7.0）中、37℃で一晩培養し、
菌体を10,000rpm、５分間遠心分離して菌体を集菌した
後、M9培地（0.1％ＮＨ４Ｃｌ、0.6％Ｎａ２ＨＯＰ４、
0.3％ＫＨ２ＰＯ４、0.05％ＮａＣｌ、pH7.4に調整した
ものに、１Ｍ ＭｇＳＯ４を２ml／、20％グルコース
を10ml／、１Ｍ ＣａＣｌ２を0.1ml／加える）で
菌体を洗浄し、同培地に懸濁した。これに変異誘導剤と
してニトロソグアニジン（以下NTGと略す）を、50μｇ
／mlの濃度となる様に添加し、30分間放置した後、10,0
00rpm、５分間遠心分離して菌体を集菌した。この菌体
をLB培地を用いて洗浄した後、同培地に植菌した。これ
を37℃で一晩培養した後、プレートに出現したコロニー
を、LB培地５００mlを入れたチューブに１白金耳ずつ植
菌し、37℃で一晩培養した。10,000rpm５分間遠心分離
後、Lysozyme−EDTA溶液（500μｇ／ml Lysozyme、１mM
EDTA）200μを加え、凍結溶融法により菌体を破砕し
た。これに１mg／mlの濃度に調整したhIFN−γ溶液100
μを加え、37℃、１時間インキュベートし、SDSサン
プル溶液（10％グリセリン、５％ ２−メルトカプトエ
タノール、23％SDS、62.5mMトリス−塩酸バッファー、p
H6.8）150μを加え、100℃５分間処理した後、10,000
rpm 10分間遠心分離し、上清をSDS-PAGEにかけ、146ア
ミノ酸からなるhIFN−γ（分子量約18,000）の残存量を
検討した。この様にして、約2,000株のうちから、hIFN
−γ分解活性のない変異株を１株得た。
この分解活性の欠損変異がプラスミド由来のものではな
く宿主由来の変異であることを確かめるため、次にプラ
スミドのキュアリング(curing)を行なった。即ち、プラ
スミド(pIN5T4)上にある遺伝子によってテトラサイクリ
ン耐性を示す上記変異株を、テトラサイクリンを含まな
い培地で培養し、テトラサイクリン感受性(Tcs)株とな
った株を選択し、プラスミドの脱落を確認した。この株
について、既述のように菌体破砕液にhIFN−γタンパク
を加えSDS-PAGEにより、hIFN−γタンパクの分解の有無
を調べた結果、全く分解活性はみられなかった。この結
果は、本変異株が宿主染色体の変異によるものであるこ
とを示している。次に、このプラスミドが脱落した株に
再び、hIFN−γを発現する様遺伝子の組込まれたプラス
ミドであるpIN5T4（既述）を常法に従って形質転換し
た。テトラサイクリン耐性をマーカーとして、形質転換
株を選択し、その形質転換株の菌体破砕・抽出液におけ
るhIFN−γの分解の有無をSDS-PAGEで調べた結果、hIFN
−γは全く分解されていなかった。
く宿主由来の変異であることを確かめるため、次にプラ
スミドのキュアリング(curing)を行なった。即ち、プラ
スミド(pIN5T4)上にある遺伝子によってテトラサイクリ
ン耐性を示す上記変異株を、テトラサイクリンを含まな
い培地で培養し、テトラサイクリン感受性(Tcs)株とな
った株を選択し、プラスミドの脱落を確認した。この株
について、既述のように菌体破砕液にhIFN−γタンパク
を加えSDS-PAGEにより、hIFN−γタンパクの分解の有無
を調べた結果、全く分解活性はみられなかった。この結
果は、本変異株が宿主染色体の変異によるものであるこ
とを示している。次に、このプラスミドが脱落した株に
再び、hIFN−γを発現する様遺伝子の組込まれたプラス
ミドであるpIN5T4（既述）を常法に従って形質転換し
た。テトラサイクリン耐性をマーカーとして、形質転換
株を選択し、その形質転換株の菌体破砕・抽出液におけ
るhIFN−γの分解の有無をSDS-PAGEで調べた結果、hIFN
−γは全く分解されていなかった。
尚、キュアリングした変異株であるW3110(M25)は、Esch
erichia coli SBM 282と命名され、工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託されている(FERM BP-1097)。又、変
異誘導処理による変異株の作製・選択は、ベクターの導
入されていない大腸菌に変異誘導処理を施し、目的の変
異株を選択し、これに目的タンパク発現ベクターを導入
しても得ることができる。
erichia coli SBM 282と命名され、工業技術院微生物工
業技術研究所に寄託されている(FERM BP-1097)。又、変
異誘導処理による変異株の作製・選択は、ベクターの導
入されていない大腸菌に変異誘導処理を施し、目的の変
異株を選択し、これに目的タンパク発現ベクターを導入
しても得ることができる。
２．変異誘導処理で得られた変異株の性質 次に、実施例の上記１に示した変異誘導処理により得ら
れたhIFN−γ分解活性欠損変異株が、どの様なプロテア
ーゼを欠損している株であるかを調べた。その結果、以
下に示す様に、一般的トリプシン様酵素阻害剤を用いて
も阻害されず、一方、銅の塩や亜鉛の塩によっては阻害
される様なプロテアーゼ活性が欠損している変異株であ
った。変異処理をしない親株(W3110)を宿主とした、hIF
N−γを生産する形質転換体であるW3110／pIN5T4を、LB
培地100mlの入った500ml容マイヤーフラスコで37℃１晩
培養した後、8,000rpm、10分間遠心分離して集菌した。
得られた湿菌体１ｇを50mMトリス−塩酸バッファー(pH
7.5)30mlに懸濁後、フレンチプレスホモジナイザーを用
いて20,000psiでホモジナイズし、8,000rpm、20分間遠
心分離した。
れたhIFN−γ分解活性欠損変異株が、どの様なプロテア
ーゼを欠損している株であるかを調べた。その結果、以
下に示す様に、一般的トリプシン様酵素阻害剤を用いて
も阻害されず、一方、銅の塩や亜鉛の塩によっては阻害
される様なプロテアーゼ活性が欠損している変異株であ
った。変異処理をしない親株(W3110)を宿主とした、hIF
N−γを生産する形質転換体であるW3110／pIN5T4を、LB
培地100mlの入った500ml容マイヤーフラスコで37℃１晩
培養した後、8,000rpm、10分間遠心分離して集菌した。
得られた湿菌体１ｇを50mMトリス−塩酸バッファー(pH
7.5)30mlに懸濁後、フレンチプレスホモジナイザーを用
いて20,000psiでホモジナイズし、8,000rpm、20分間遠
心分離した。
第１表に示す種々のプロテアーゼ阻害物質を、各最終濃
度になる様溶解した0.1Ｍトリス−塩酸バッファー(pH7.
5)700μに上記上清50μを加え、これにhIFN−γ溶
液（１mg／ml）250μを加えた後、37℃１時間インキ
ュベーションした。この溶液を、SDS-PAGEにかけ、hIFN
−γ分解の有無を検討した。その結果を第１表に示し
た。
度になる様溶解した0.1Ｍトリス−塩酸バッファー(pH7.
5)700μに上記上清50μを加え、これにhIFN−γ溶
液（１mg／ml）250μを加えた後、37℃１時間インキ
ュベーションした。この溶液を、SDS-PAGEにかけ、hIFN
−γ分解の有無を検討した。その結果を第１表に示し
た。
第１表に掲げた物質中、hIFN−γ分解活性を阻害したの
はＣｕＣｌ２及びＺｎＣｌ２のみで、一般にトリプシン
様酵素の阻害剤と考えられている他の物質ではhIFN−γ
分解活性は阻害されなかった。
はＣｕＣｌ２及びＺｎＣｌ２のみで、一般にトリプシン
様酵素の阻害剤と考えられている他の物質ではhIFN−γ
分解活性は阻害されなかった。
３．菌体破砕後のhIFN−γ分解の経時変化 次に、野生株を宿主とした形質転換体W3110／pIN5T4と
上記変異株を宿主とした形質転換株W3110(M25)／pIN5T4
について、hIFN−γ生産性と、各形質転換株培養菌体の
破砕後のhIFN−γの分解の経時的変化の検討を行なっ
た。
上記変異株を宿主とした形質転換株W3110(M25)／pIN5T4
について、hIFN−γ生産性と、各形質転換株培養菌体の
破砕後のhIFN−γの分解の経時的変化の検討を行なっ
た。
即ち、W3110／pIN5T4及びW3110(M25)／pIN5T4を先述と
同様に培養・集菌し、バッファーに懸濁した。この懸濁
液（Ｗ）、懸濁液をフレンチプレスにより菌体破砕後遠
心分離した沈澱（Ｐ）、及び、遠心分離後０，15，30，
60分後の各上清について、既述のSDS-PAGEを用いて、分
解されないhIFN−γタンパク（分子量約18,000）量と分
解されたタンパク（分子量約16,000）量とを検討した。
結果を第１図に示した。
同様に培養・集菌し、バッファーに懸濁した。この懸濁
液（Ｗ）、懸濁液をフレンチプレスにより菌体破砕後遠
心分離した沈澱（Ｐ）、及び、遠心分離後０，15，30，
60分後の各上清について、既述のSDS-PAGEを用いて、分
解されないhIFN−γタンパク（分子量約18,000）量と分
解されたタンパク（分子量約16,000）量とを検討した。
結果を第１図に示した。
W3110／pIN5T4については、15分以内に上清で50％が、6
0分以内にはほぼ100％のhIFN−γが分離されているのに
対し、W3110(M25)／pIN5T4では、60分後でも分解はほと
んど見られず、分子量約18,000のhIFN−γは安定に保た
れていた。又、hIFN−γの生産性には差は認められなか
った。
0分以内にはほぼ100％のhIFN−γが分離されているのに
対し、W3110(M25)／pIN5T4では、60分後でも分解はほと
んど見られず、分子量約18,000のhIFN−γは安定に保た
れていた。又、hIFN−γの生産性には差は認められなか
った。
４．変異株を用いた形質転換体からのhIFN−γの抽出・
精製 W3110／pIN5T4及びW3110(M25)／pIN5T4を、30容ジャ
ーファーメンター中、20LB培地で30℃36時間培養し
た。得られた培養液を8,000rpm、10分間遠心分離して集
菌した。この湿菌体各１kgを20mMトリス−塩酸バッファ
ー(pH7.5)7,000mlに懸濁し、これをマントンゴーリン社
製ホモジナイザーＭ15を用いて8,000psiで菌体破砕し
た。尚、W3110／pIN5T4については、20mMトリス−塩酸
バッファーの代わりに、１mMＺｎＣｌ２を含む同バッフ
ァーを用いた。この破砕液を、7,000rpm、20分間遠心分
離して得られた上清に15％ポリエチレンイミン（pH8.
0、ＨＣｌで調整）を最終濃度0.75％となる様に加え、1
0分間撹伴後、４℃２時間放置し、生じた沈澱を7,000rp
m、20分間遠心分離して除去した。この上清により、以
下の様にしてhIFN−γを精製した。
精製 W3110／pIN5T4及びW3110(M25)／pIN5T4を、30容ジャ
ーファーメンター中、20LB培地で30℃36時間培養し
た。得られた培養液を8,000rpm、10分間遠心分離して集
菌した。この湿菌体各１kgを20mMトリス−塩酸バッファ
ー(pH7.5)7,000mlに懸濁し、これをマントンゴーリン社
製ホモジナイザーＭ15を用いて8,000psiで菌体破砕し
た。尚、W3110／pIN5T4については、20mMトリス−塩酸
バッファーの代わりに、１mMＺｎＣｌ２を含む同バッフ
ァーを用いた。この破砕液を、7,000rpm、20分間遠心分
離して得られた上清に15％ポリエチレンイミン（pH8.
0、ＨＣｌで調整）を最終濃度0.75％となる様に加え、1
0分間撹伴後、４℃２時間放置し、生じた沈澱を7,000rp
m、20分間遠心分離して除去した。この上清により、以
下の様にしてhIFN−γを精製した。
即ち、上記上清を、20mMＮ−２−ヒドロキシエチルピペ
ラジン−Ｎ′−３−プロパンスルフォン酸バッファー
（EPPSバッファー）pH8.6で平衡化したQAEセファデック
スA-25（ファルマシア社製）カラムにかけて得られた素
通り画分を、0.1％２−メルトカプトエタノール(2-ME)
を含む20mMトリス−塩酸バッファーpH7.4で平衡化したC
MセファロースCL6B（ファルマシア社製）カラムに、こ
の素通り画分をかけ吸着した画分を、０〜0.5ＭのＮａ
Ｃｌ直線濃度勾配で溶出し、インターフェロン活性の高
い区分を集めた。なお、インターフェロン活性は特開昭
58−201995号公報に記載した方法に準じて測定した。続
いてこの画分に50％飽和となる様に硫酸アンモニウムを
添加し、塩析を行い、7,000rpm、20分間遠心分離して沈
澱を得た。これを、0.3Ｍ ＮａＣｌ及び0.1％2-MEを含
む20mMリン酸ナトリウムバッファー(PSB)pH7.4に溶解
し、同バッファーで平衡化したセファクリルS-200（フ
ァルマシア社製）カラムにかけ、99％以上の純度を有す
る最終精製品を得た。W3110／pIN5T4とW3110(M25)／pIN
5T4によって生産されたhIFN−γの最終収率は各々、５
％、12％であった。
ラジン−Ｎ′−３−プロパンスルフォン酸バッファー
（EPPSバッファー）pH8.6で平衡化したQAEセファデック
スA-25（ファルマシア社製）カラムにかけて得られた素
通り画分を、0.1％２−メルトカプトエタノール(2-ME)
を含む20mMトリス−塩酸バッファーpH7.4で平衡化したC
MセファロースCL6B（ファルマシア社製）カラムに、こ
の素通り画分をかけ吸着した画分を、０〜0.5ＭのＮａ
Ｃｌ直線濃度勾配で溶出し、インターフェロン活性の高
い区分を集めた。なお、インターフェロン活性は特開昭
58−201995号公報に記載した方法に準じて測定した。続
いてこの画分に50％飽和となる様に硫酸アンモニウムを
添加し、塩析を行い、7,000rpm、20分間遠心分離して沈
澱を得た。これを、0.3Ｍ ＮａＣｌ及び0.1％2-MEを含
む20mMリン酸ナトリウムバッファー(PSB)pH7.4に溶解
し、同バッファーで平衡化したセファクリルS-200（フ
ァルマシア社製）カラムにかけ、99％以上の純度を有す
る最終精製品を得た。W3110／pIN5T4とW3110(M25)／pIN
5T4によって生産されたhIFN−γの最終収率は各々、５
％、12％であった。
［発明の効果］ 以上に示した様に、本発明による方法を用いれば、菌体
内で同じ発現量でありながら目的タンパク（hIFN−γ）
を２倍以上の収率で得ることができる。又、目的タンパ
ク（hIFN−γ）が菌体破砕後も分解されないため、プロ
テアーゼインヒビターや蛋白変性剤を用いる必要はな
く、抽出・精製段階の簡素化・効率化を計ることができ
る。
内で同じ発現量でありながら目的タンパク（hIFN−γ）
を２倍以上の収率で得ることができる。又、目的タンパ
ク（hIFN−γ）が菌体破砕後も分解されないため、プロ
テアーゼインヒビターや蛋白変性剤を用いる必要はな
く、抽出・精製段階の簡素化・効率化を計ることができ
る。
第１図は、hIFN−γタンパクの分解の経時的変化を調べ
るためのSDS-PAGEを示す。図中、Ｗは培養菌体の破砕前
懸濁液、Ｐは、該懸濁液を破砕・遠心処理して得られた
沈澱物、Ｏ′，15′，30′，60′はそれぞれ、菌体破砕
後の遠心上清を０，15，30，60分間37℃でインキュベー
ションした後の各種タンパクのパターンを示す。ａはhI
FN−γのタンパクに相当するバンド、ｂはhIFN−γ分解
物に相当するタンパクのバンドである。
るためのSDS-PAGEを示す。図中、Ｗは培養菌体の破砕前
懸濁液、Ｐは、該懸濁液を破砕・遠心処理して得られた
沈澱物、Ｏ′，15′，30′，60′はそれぞれ、菌体破砕
後の遠心上清を０，15，30，60分間37℃でインキュベー
ションした後の各種タンパクのパターンを示す。ａはhI
FN−γのタンパクに相当するバンド、ｂはhIFN−γ分解
物に相当するタンパクのバンドである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (7)
- 【請求項１】ジイソプロピルフルオロフォスフェイト、
フェニルメチルスルフォニルフルオライド、Ｎ−α−ト
シル−Ｌ−リシルクロロメチルケトン、Ｎ−トシル−Ｌ
−フェニルアラニンクロロメチルケトン、エチレンジア
ミン四酢酸(EDTA)、ロイペプチン、アンチパイン、α２
−マクログロブリンおよびキモスタチンによって阻害さ
れず、塩化亜鉛および塩化銅で阻害されるプロテアーゼ
活性が欠損した大腸菌。 - 【請求項２】前記プロテアーゼ活性がヒト免疫インター
フェロン活性を有するポリペプチドを分解する活性であ
ることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の大腸
菌。 - 【請求項３】W3110(M25)で表わされる特許請求の範囲第
２項記載の大腸菌。 - 【請求項４】ジイソプロピルフルオロフォスフェイト、
フェニルメチルスルフォニルフルオライド、Ｎ−α−ト
シル−Ｌ−リシルクロロメチルケトン、Ｎ−トシル−Ｌ
−フェニルアラニンクロロメチルケトン、エチレンジア
ミン四酢酸(EDTA)、ロイペプチン、アンチパイン、α２
−マクログロブリンおよびキモスタチンによって阻害さ
れず、塩化亜鉛および塩化銅で阻害されるプロテアーゼ
活性が欠損した大腸菌を宿主とした、外来性タンパク又
はポリペプチドを生産する形質転換体。 - 【請求項５】宿主がW3110(M25)で表わされる特許請求の
範囲第４項記載の形質転換体。 - 【請求項６】外来性タンパク又はポリペプチドが、ヒト
免疫インターフェロン活性を有することを特徴とする特
許請求の範囲第４項記載の形質転換体。 - 【請求項７】W3110(M25)／pIN5T4で表わされる特許請求
の範囲第６項記載の形質転換体。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60295140A JPH0650985B2 (ja) | 1985-12-27 | 1985-12-27 | 新規な大腸菌宿主 |
| DE8686118121T DE3680093D1 (de) | 1985-12-27 | 1986-12-29 | Neue e.coli-wirtszelle und ihre verwendung. |
| AT86118121T ATE64954T1 (de) | 1985-12-27 | 1986-12-29 | Neue e.coli-wirtszelle und ihre verwendung. |
| ES198686118121T ES2028785T3 (es) | 1985-12-27 | 1986-12-29 | Un procedimiento para producir interferon humano inmune. |
| EP86118121A EP0230670B1 (en) | 1985-12-27 | 1986-12-29 | Novel host e. coli and use thereof |
| US06/947,398 US4874697A (en) | 1985-12-27 | 1986-12-29 | Novel Host e. coli and use thereof |
| GR91400213T GR3002245T3 (en) | 1985-12-27 | 1991-07-04 | Novel host e. coli and use thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60295140A JPH0650985B2 (ja) | 1985-12-27 | 1985-12-27 | 新規な大腸菌宿主 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP31225393A Division JPH0763388B2 (ja) | 1993-12-13 | 1993-12-13 | 新規な大腸菌宿主を利用したタンパク又はポリペプチドの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62155080A JPS62155080A (ja) | 1987-07-10 |
| JPH0650985B2 true JPH0650985B2 (ja) | 1994-07-06 |
Family
ID=17816794
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60295140A Expired - Lifetime JPH0650985B2 (ja) | 1985-12-27 | 1985-12-27 | 新規な大腸菌宿主 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4874697A (ja) |
| EP (1) | EP0230670B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0650985B2 (ja) |
| AT (1) | ATE64954T1 (ja) |
| DE (1) | DE3680093D1 (ja) |
| ES (1) | ES2028785T3 (ja) |
| GR (1) | GR3002245T3 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1333777C (en) | 1988-07-01 | 1995-01-03 | Randy M. Berka | Aspartic proteinase deficient filamentous fungi |
| IT1246296B (it) * | 1990-07-25 | 1994-11-17 | Sclavo Spa | Procedimento di estrzione e purificazione del gamma interferone umano ricombinante |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4590159A (en) * | 1981-08-21 | 1986-05-20 | University Patents, Inc. | Enhancement of expression of protein synthesis in E. coli |
| JPS59146597A (ja) * | 1983-02-08 | 1984-08-22 | Toray Ind Inc | インタ−フエロン様ポリペロチドの生産方法 |
| US4758512A (en) * | 1984-03-06 | 1988-07-19 | President And Fellows Of Harvard College | Hosts and methods for producing recombinant products in high yields |
-
1985
- 1985-12-27 JP JP60295140A patent/JPH0650985B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-12-29 AT AT86118121T patent/ATE64954T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-12-29 ES ES198686118121T patent/ES2028785T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-29 DE DE8686118121T patent/DE3680093D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-29 EP EP86118121A patent/EP0230670B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-29 US US06/947,398 patent/US4874697A/en not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-07-04 GR GR91400213T patent/GR3002245T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62155080A (ja) | 1987-07-10 |
| ES2028785T3 (es) | 1992-07-16 |
| EP0230670A2 (en) | 1987-08-05 |
| GR3002245T3 (en) | 1992-12-30 |
| EP0230670A3 (en) | 1988-11-23 |
| US4874697A (en) | 1989-10-17 |
| ATE64954T1 (de) | 1991-07-15 |
| DE3680093D1 (de) | 1991-08-08 |
| EP0230670B1 (en) | 1991-07-03 |
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