JP3023008B2 - プロテア−ゼインヒビタ−遺伝子 - Google Patents
プロテア−ゼインヒビタ−遺伝子Info
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はプロテアーゼインヒビタ
ーの遺伝子情報を担うＤＮＡに関するものである。
ーの遺伝子情報を担うＤＮＡに関するものである。
【０００２】
【従来の技術】細胞内の蛋白質分解は、細胞内で起こる
非常に多くの生理的反応、例えば自己蛋白質の代謝回
転、外来性蛋白質・ペプチドの分解、異常蛋白質の除
去、細胞内小器官と分泌蛋白質のプロセッシング、情報
伝達、細胞増殖・分化などの酸素反応あるいは調節に関
与している。細胞内は多数のコンパートメントからなる
複雑な構造をしており、直接、蛋白質分解に関与するプ
ロテアーゼは厳密なコントロールが必要となる。プロテ
アーゼインヒビターはプロテアーゼの作用をただちに抑
制する物質としてきわめて有効であり、重要なプロテア
ーゼの制御系の一要素である。
非常に多くの生理的反応、例えば自己蛋白質の代謝回
転、外来性蛋白質・ペプチドの分解、異常蛋白質の除
去、細胞内小器官と分泌蛋白質のプロセッシング、情報
伝達、細胞増殖・分化などの酸素反応あるいは調節に関
与している。細胞内は多数のコンパートメントからなる
複雑な構造をしており、直接、蛋白質分解に関与するプ
ロテアーゼは厳密なコントロールが必要となる。プロテ
アーゼインヒビターはプロテアーゼの作用をただちに抑
制する物質としてきわめて有効であり、重要なプロテア
ーゼの制御系の一要素である。
【０００３】また、生体内においてプロテアーゼ及びプ
ロテアーゼインヒビターのバランスが乱れることによ
り、組織蛋白の分解が異常に進み、肺気腫、関節炎、筋
ジストロフィー等が引き起こされることも報告されてお
り、これらの疾病への治療薬となる可能性も大きい
（「バイオテクノロジー事典」（株）シーエムシー
（１９８６−１０−９） ｐ．９５６−９５８）。
ロテアーゼインヒビターのバランスが乱れることによ
り、組織蛋白の分解が異常に進み、肺気腫、関節炎、筋
ジストロフィー等が引き起こされることも報告されてお
り、これらの疾病への治療薬となる可能性も大きい
（「バイオテクノロジー事典」（株）シーエムシー
（１９８６−１０−９） ｐ．９５６−９５８）。
【０００４】また微生物工業や発酵工業において、微生
物が目的とする蛋白質をたとえ分泌生産しても、同時に
プロテアーゼを生産する場合には、このプロテアーゼに
よって目的蛋白質が分解されてしまう。しかしながらこ
のような系においてプロテアーゼインヒビターが存在す
れば、プロテアーゼの作用が抑制され、その結果として
目的蛋白質が効率的に得られることになる。
物が目的とする蛋白質をたとえ分泌生産しても、同時に
プロテアーゼを生産する場合には、このプロテアーゼに
よって目的蛋白質が分解されてしまう。しかしながらこ
のような系においてプロテアーゼインヒビターが存在す
れば、プロテアーゼの作用が抑制され、その結果として
目的蛋白質が効率的に得られることになる。
【０００５】さらに、プロテアーゼインヒビターを遺伝
子的に分析することは、その生理的役割を研究する上で
非常に有利になり、生体内の未知の制御系の解明にも寄
与することになる。
子的に分析することは、その生理的役割を研究する上で
非常に有利になり、生体内の未知の制御系の解明にも寄
与することになる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】プロテアーゼインヒビ
ターは動物・植物・微生物界に広く存在し、特にトリプ
シン、キモトリプシン、パパインに対応するインヒビタ
ーの存在が良く知られている。その有用性が確認されつ
つあるが、まだ産業上必要な量を供給する迄に至ってい
ないし、また、その複雑な代謝制御機構も完全には解明
されていないのが現状である。
ターは動物・植物・微生物界に広く存在し、特にトリプ
シン、キモトリプシン、パパインに対応するインヒビタ
ーの存在が良く知られている。その有用性が確認されつ
つあるが、まだ産業上必要な量を供給する迄に至ってい
ないし、また、その複雑な代謝制御機構も完全には解明
されていないのが現状である。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らはプロテアー
ゼインヒビターの代謝制御機構を解明し、かつ有利な製
造方法を開発するために遺伝子工学に着目し、鋭意研究
を進めた結果、バチルス・ズブチリス菌体内プロテアー
ゼインヒビターをコードする遺伝子をクローン化しその
ＤＮＡ塩基配列を決定するのに成功し、本発明を完成す
るに至った。
ゼインヒビターの代謝制御機構を解明し、かつ有利な製
造方法を開発するために遺伝子工学に着目し、鋭意研究
を進めた結果、バチルス・ズブチリス菌体内プロテアー
ゼインヒビターをコードする遺伝子をクローン化しその
ＤＮＡ塩基配列を決定するのに成功し、本発明を完成す
るに至った。
【０００８】本発明に係るプロテアーゼインヒビターを
コードする遺伝子のクローニングは、常法に従い、例え
ば次のようにして行う。先ず、プロテアーゼインヒビタ
ー生産能を有する微生物、動物及び植物より染色体ＤＮ
Ａを調製し、この染色体ＤＮＡを、適当な制限酵素で切
断して得たＤＮＡ断片と、同様にしてベクターを切断し
て得られたベクター断片とを、例えば、Ｔ４ ＤＮＡリ
ガーゼなどにより結合させ、プロテアーゼインヒビター
遺伝子を含む組換えＤＮＡを形成する。
コードする遺伝子のクローニングは、常法に従い、例え
ば次のようにして行う。先ず、プロテアーゼインヒビタ
ー生産能を有する微生物、動物及び植物より染色体ＤＮ
Ａを調製し、この染色体ＤＮＡを、適当な制限酵素で切
断して得たＤＮＡ断片と、同様にしてベクターを切断し
て得られたベクター断片とを、例えば、Ｔ４ ＤＮＡリ
ガーゼなどにより結合させ、プロテアーゼインヒビター
遺伝子を含む組換えＤＮＡを形成する。
【０００９】クローニングによって得られたプロテアー
ゼインヒビター遺伝子をコードするＤＮＡを制限酵素で
切断した後、クローニングベクターと結合し、これを宿
主微生物に導入し、目的とする形質転換体をスクリーニ
ングすること等により、常法にしたがってプロテアーゼ
インヒビター遺伝子をクローン化することができる。
ゼインヒビター遺伝子をコードするＤＮＡを制限酵素で
切断した後、クローニングベクターと結合し、これを宿
主微生物に導入し、目的とする形質転換体をスクリーニ
ングすること等により、常法にしたがってプロテアーゼ
インヒビター遺伝子をクローン化することができる。
【００１０】クローニング方法としては、具体的には、
バチルス・ズブチリスＮＩＧ１１２１（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＩＧ １１２１）を炭素源、
窒素源、無機物、その他の栄養素を程よく含有する培地
で培養し遠心分離して菌体を集める。培養培地の好適な
例としては、ポリペプトン１．０％、肉エキス０．５
％、酵母エキス０．２％、グルコース１．０％、ｐＨ
７．０が挙げられる。培養温度は２０〜４０℃、好まし
くは３０〜３７℃の範囲、培養開始ｐＨは６〜８、好ま
しくは７付近で１〜３日間通気攪拌培養する。目的とす
るＤＮＡは、得られた菌体を溶菌させることによって調
製することができる。
バチルス・ズブチリスＮＩＧ１１２１（Ｂａｃｉｌｌｕ
ｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＮＩＧ １１２１）を炭素源、
窒素源、無機物、その他の栄養素を程よく含有する培地
で培養し遠心分離して菌体を集める。培養培地の好適な
例としては、ポリペプトン１．０％、肉エキス０．５
％、酵母エキス０．２％、グルコース１．０％、ｐＨ
７．０が挙げられる。培養温度は２０〜４０℃、好まし
くは３０〜３７℃の範囲、培養開始ｐＨは６〜８、好ま
しくは７付近で１〜３日間通気攪拌培養する。目的とす
るＤＮＡは、得られた菌体を溶菌させることによって調
製することができる。
【００１１】溶菌方法は、例えばリゾチームやβ−グル
カナーゼなどの細胞壁溶解酵素による処理や超音波処理
などが用いられる。また、必要によりプロテアーゼ、リ
ボヌクレアーゼなどの他の酵素剤やラウリル硫酸ナトリ
ウムなどの界面活性剤が併用される。また凍結融解処理
を施すこともある。
カナーゼなどの細胞壁溶解酵素による処理や超音波処理
などが用いられる。また、必要によりプロテアーゼ、リ
ボヌクレアーゼなどの他の酵素剤やラウリル硫酸ナトリ
ウムなどの界面活性剤が併用される。また凍結融解処理
を施すこともある。
【００１２】このようにして得られる溶菌物からＤＮＡ
を分離、精製するには、常法にしたがって、例えばフェ
ノール抽出、除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌク
レアーゼ処理、アルコール沈殿、遠心分離などの方法を
適宜組み合わせることによって行うことができる。
を分離、精製するには、常法にしたがって、例えばフェ
ノール抽出、除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌク
レアーゼ処理、アルコール沈殿、遠心分離などの方法を
適宜組み合わせることによって行うことができる。
【００１３】ＤＮＡを切断する方法は、例えば、超音波
処理、制限酵素処理などにより行うことができる。切断
後、必要に応じてホスファターゼやＤＮＡポリメラーゼ
等の修飾酵素が用いられる。また種々のリンカーやアダ
プターを用いることによりＤＮＡ断片末端の塩基配列を
変えることができる。
処理、制限酵素処理などにより行うことができる。切断
後、必要に応じてホスファターゼやＤＮＡポリメラーゼ
等の修飾酵素が用いられる。また種々のリンカーやアダ
プターを用いることによりＤＮＡ断片末端の塩基配列を
変えることができる。
【００１４】切断されたＤＮＡ断片から目的蛋白をコー
ドする塩基配列を持つＤＮＡ断片を得るには、例えば目
的蛋白のアミノ酸配列をもとに合成した合成プローブを
用いて、電気泳動したゲルでサザンハイブリダイゼーシ
ョン（Ｓａｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．，９８，５０３，（１９７５））を行い反応する
ＤＮＡ断片を抽出することによって最適な長さの断片の
みが得られる。
ドする塩基配列を持つＤＮＡ断片を得るには、例えば目
的蛋白のアミノ酸配列をもとに合成した合成プローブを
用いて、電気泳動したゲルでサザンハイブリダイゼーシ
ョン（Ｓａｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉ
ｏｌ．，９８，５０３，（１９７５））を行い反応する
ＤＮＡ断片を抽出することによって最適な長さの断片の
みが得られる。
【００１５】ベクターとしては、宿主微生物で自律的に
増殖し得るファージまたはプラスミドが適している。フ
ァージとしては、既知のものが適宜使用でき、例えば、
エシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）を宿主微生物とする場合には、λファージやＭ１３
ファージなどが使用出来る。
増殖し得るファージまたはプラスミドが適している。フ
ァージとしては、既知のものが適宜使用でき、例えば、
エシェリヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌ
ｉ）を宿主微生物とする場合には、λファージやＭ１３
ファージなどが使用出来る。
【００１６】また、プラスミドとしては、例えば、エシ
ェリヒア コリを宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ３
２２，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１１８やそれらの派生体、例
えばｐＢＲ−ＡＮ３などが使用できる。更に、例えば、
エシェリヒア コリ、バチルス ズブチリスなどの二種
以上の宿主微生物で自律的増殖の可能な、例えば、ｐＨ
Ｙ３００ＰＬＫ，ＹＩｐ５，ＹＥｐ１３などのベクター
のほか、各種の既知のシャトルベクターを利用すること
も可能である。このようなベクターを、先に述べたＤＮ
Ａと同様に制限酵素などで切断し、ベクター断片を得
る。
ェリヒア コリを宿主微生物とする場合には、ｐＢＲ３
２２，ｐＵＣ１８，ｐＵＣ１１８やそれらの派生体、例
えばｐＢＲ−ＡＮ３などが使用できる。更に、例えば、
エシェリヒア コリ、バチルス ズブチリスなどの二種
以上の宿主微生物で自律的増殖の可能な、例えば、ｐＨ
Ｙ３００ＰＬＫ，ＹＩｐ５，ＹＥｐ１３などのベクター
のほか、各種の既知のシャトルベクターを利用すること
も可能である。このようなベクターを、先に述べたＤＮ
Ａと同様に制限酵素などで切断し、ベクター断片を得
る。
【００１７】ＤＮＡ断片とベクター断片とを結合させる
方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよ
く、例えば、ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリン
グの後、生体外で適当なＤＮＡリガーゼの作用により組
換えＤＮＡを作成する。必要ならば、アニーリングの
後、宿主微生物に導入して、生体内のＤＮＡリガーゼを
利用して組換えＤＮＡにすることもできる。
方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であればよ
く、例えば、ＤＮＡ断片とベクター断片とをアニーリン
グの後、生体外で適当なＤＮＡリガーゼの作用により組
換えＤＮＡを作成する。必要ならば、アニーリングの
後、宿主微生物に導入して、生体内のＤＮＡリガーゼを
利用して組換えＤＮＡにすることもできる。
【００１８】宿主微生物としては、組換えＤＮＡが安定
かつ自律的増殖が可能でその形質発現のできるものであ
ればどのようなものでもよい。
かつ自律的増殖が可能でその形質発現のできるものであ
ればどのようなものでもよい。
【００１９】宿主微生物に組換えＤＮＡを導入する方法
は、公知の方法、例えば、宿主微生物がエシェリヒア
コリの場合にはカルシウム法（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ，
Ｅ．Ｍ． ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．；Ｊ．Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ．，１１９，１０７２，（１９７４））な
どを採用することができる。
は、公知の方法、例えば、宿主微生物がエシェリヒア
コリの場合にはカルシウム法（Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ，
Ｅ．Ｍ． ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．Ｎ．；Ｊ．Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ．，１１９，１０７２，（１９７４））な
どを採用することができる。
【００２０】λファージＤＮＡであれば、イン ビトロ
パッケイジング法（Ｈｏｒｎ，Ｂ．；Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８，２９９，（１９
７９））によりλファージ粒子を形成し、このλファー
ジ粒子をエシェリヒア コリの培養懸濁液に添加して、
プロテアーゼインヒビター生産能を保有する特殊形質導
入ファージを得ることができる。
パッケイジング法（Ｈｏｒｎ，Ｂ．；Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８，２９９，（１９
７９））によりλファージ粒子を形成し、このλファー
ジ粒子をエシェリヒア コリの培養懸濁液に添加して、
プロテアーゼインヒビター生産能を保有する特殊形質導
入ファージを得ることができる。
【００２１】組換えＤＮＡが導入された形質転換微生物
の選択方法は、常法によって行い、例えば、コロニーハ
イブリダイゼーションによりポジティブクローンを得る
ことができる。得られた形質転換体を３７℃で液体培養
し、公知の方法、例えばアルカリ抽出法（Ｂｉｒｎｂｏ
ｉｍ，Ｈ．Ｃ ａｎｄ Ｄｏｌｙ，Ｊ．，Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，７，１５１３，（１９７
９））によってプラスミドを得る。このプラスミドを用
いダイデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ， Ｆ．，Ｎｉｃｋｅ
ｌｅｎ，Ｓ．＆ Ｃｏｌｕｓｉｏｎ， Ａ．Ｒ．，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．７４，５４９
３，（１９７７））によってシークエンスを決定するこ
とができる。また、得られた形質転換体を培養すること
により、目的とするプロテアーゼインヒビターを大量に
得ることができる。
の選択方法は、常法によって行い、例えば、コロニーハ
イブリダイゼーションによりポジティブクローンを得る
ことができる。得られた形質転換体を３７℃で液体培養
し、公知の方法、例えばアルカリ抽出法（Ｂｉｒｎｂｏ
ｉｍ，Ｈ．Ｃ ａｎｄ Ｄｏｌｙ，Ｊ．，Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，７，１５１３，（１９７
９））によってプラスミドを得る。このプラスミドを用
いダイデオキシ法（Ｓａｎｇｅｒ， Ｆ．，Ｎｉｃｋｅ
ｌｅｎ，Ｓ．＆ Ｃｏｌｕｓｉｏｎ， Ａ．Ｒ．，Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．７４，５４９
３，（１９７７））によってシークエンスを決定するこ
とができる。また、得られた形質転換体を培養すること
により、目的とするプロテアーゼインヒビターを大量に
得ることができる。
【００２２】次に、本発明を実施例により詳しく説明す
る。
る。
【００２３】
【実施例１ プロテアーゼインヒビター遺伝子のクロ
ーン化】バチルス・ズブチリスＮＩＧ １１２１をポリ
ペプトン１．０％、肉エキス０．５％、酵母エキス０．
２％、グルコース１．０％、ｐＨ７．０の液体培地にて
３０℃で６時間振とう培養し、遠心分離にて集菌、洗浄
し、得られた菌体から、Ｓａｉｔｏ，Ｍｉｕｒａの方法
（Ｓａｉｔｏ，Ｈ．ａｎｄ Ｍｉｕｒａ，Ｋ．，Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９
（１９６３））によって染色体ＤＮＡを分離、これをト
リス塩酸・ＥＤＴＡ緩衝液に溶解し、制限酵素ＰｓｔＩ
（宝酒造社製）を添加して、３７℃で完全分解した。分
解物をＡｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ電気泳動後、バチルス・
ズブチリスのプロテアーゼインヒビター（Ｔ．Ｎｉｓｈ
ｉｎｏ．，ｅｔ．ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．，５０，３０５９（１９８６））をもとに合成し
たプローブを用いて、サザンハイブリダイゼーション
（Ｓａｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，９８，５０３，（１９７５））を行った。これに
より検出された１．８ｋｂの染色体ＤＮＡ断片をゲルよ
り切り出し溶解させた後、ガラスビーズに吸着させアガ
ロースを除去しＤＮＡ断片を精製した。この精製したＤ
ＮＡ断片をＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＢＲ−ＡＮ
３（アンピシリン耐性でかつＰｓｔＩで１ケ所切断可能
なプラスミドＤＮＡ）と混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
を添加して連結処理した。この処理液を用い、エシェリ
ヒア コリ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（フナコシ薬品販売）を
宿主として、Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ，Ｃｏｈｅｎ法（Ｌｅ
ｄｅｒｂｅｒｇ，Ｅ．Ｍ．ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．
Ｎ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１１９，１０７２，
（１９７４））により、当該プラスミドを導入した。
ーン化】バチルス・ズブチリスＮＩＧ １１２１をポリ
ペプトン１．０％、肉エキス０．５％、酵母エキス０．
２％、グルコース１．０％、ｐＨ７．０の液体培地にて
３０℃で６時間振とう培養し、遠心分離にて集菌、洗浄
し、得られた菌体から、Ｓａｉｔｏ，Ｍｉｕｒａの方法
（Ｓａｉｔｏ，Ｈ．ａｎｄ Ｍｉｕｒａ，Ｋ．，Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２，６１９
（１９６３））によって染色体ＤＮＡを分離、これをト
リス塩酸・ＥＤＴＡ緩衝液に溶解し、制限酵素ＰｓｔＩ
（宝酒造社製）を添加して、３７℃で完全分解した。分
解物をＡｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ電気泳動後、バチルス・
ズブチリスのプロテアーゼインヒビター（Ｔ．Ｎｉｓｈ
ｉｎｏ．，ｅｔ．ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．，５０，３０５９（１９８６））をもとに合成し
たプローブを用いて、サザンハイブリダイゼーション
（Ｓａｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．，９８，５０３，（１９７５））を行った。これに
より検出された１．８ｋｂの染色体ＤＮＡ断片をゲルよ
り切り出し溶解させた後、ガラスビーズに吸着させアガ
ロースを除去しＤＮＡ断片を精製した。この精製したＤ
ＮＡ断片をＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＢＲ−ＡＮ
３（アンピシリン耐性でかつＰｓｔＩで１ケ所切断可能
なプラスミドＤＮＡ）と混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ
を添加して連結処理した。この処理液を用い、エシェリ
ヒア コリ ＸＬ１−Ｂｌｕｅ（フナコシ薬品販売）を
宿主として、Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ，Ｃｏｈｅｎ法（Ｌｅ
ｄｅｒｂｅｒｇ，Ｅ．Ｍ．ａｎｄ Ｃｏｈｅｎ，Ｓ．
Ｎ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１１９，１０７２，
（１９７４））により、当該プラスミドを導入した。
【００２４】当該プラスミドを導入して得られた形質転
換処理菌体を前記合成プローブを用いてコロニーハイブ
リダイゼーションをおこなった。これにより合成プロー
ブとハイブリダイズするバチルス・ズブチリス プロテ
アーゼインヒビター形質転換体を得た。
換処理菌体を前記合成プローブを用いてコロニーハイブ
リダイゼーションをおこなった。これにより合成プロー
ブとハイブリダイズするバチルス・ズブチリス プロテ
アーゼインヒビター形質転換体を得た。
【００２５】該形質転換体を３７℃にて振とう培養し、
培養液を遠心分離して集菌し、洗浄後、分離菌体からア
ルカリ抽出法でプラスミドを抽出し、ここで得られた新
規プラスミドをｐＹＡＳ１１と命名した。
培養液を遠心分離して集菌し、洗浄後、分離菌体からア
ルカリ抽出法でプラスミドを抽出し、ここで得られた新
規プラスミドをｐＹＡＳ１１と命名した。
【００２６】
【実施例２ バチルス・ズブチリス プ
ロテアーゼインヒビター遺伝子を含むＤＮＡ断片の全塩
基配列の決定】実施例１で得られたプラスミドｐＹＡＳ
１１を制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造社製）にて３７℃で分
解した。この分解物とプラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造
社製）を用いてバチルス・ズブチリス プロテアーゼイ
ンヒビター遺伝子の再クローン化を行った。プラスミド
ｐＵＣ１１９は３．２ｋｂでアンピシリン耐性を有し、
制限酵素ＰｓｔＩで１箇所切断可能なプラスミドであ
る。ＰｓｔＩで切断したｐＵＣ１１９をアルカリフォス
ファターゼ処理した後、前記のプラスミドｐＹＡＳ１１
から得られたＰｓｔＩ切断断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼを添加して連結処理した。この処理液を用い、エ
シェリヒア コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ（フナコシ薬品販
売）を宿主として、Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ，Ｃｏｈｅｎ法
により当該プラスミドを導入した。得られた形質転換処
理菌体を前記合成プローブを用いてコロニーハイブリダ
イゼーションを行い、合成プローブとハイブリダイズす
るバチルス・ズブチリス プロテアーゼインヒビター形
質転換体を得た。
ロテアーゼインヒビター遺伝子を含むＤＮＡ断片の全塩
基配列の決定】実施例１で得られたプラスミドｐＹＡＳ
１１を制限酵素ＰｓｔＩ（宝酒造社製）にて３７℃で分
解した。この分解物とプラスミドｐＵＣ１１９（宝酒造
社製）を用いてバチルス・ズブチリス プロテアーゼイ
ンヒビター遺伝子の再クローン化を行った。プラスミド
ｐＵＣ１１９は３．２ｋｂでアンピシリン耐性を有し、
制限酵素ＰｓｔＩで１箇所切断可能なプラスミドであ
る。ＰｓｔＩで切断したｐＵＣ１１９をアルカリフォス
ファターゼ処理した後、前記のプラスミドｐＹＡＳ１１
から得られたＰｓｔＩ切断断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼを添加して連結処理した。この処理液を用い、エ
シェリヒア コリＸＬ１−Ｂｌｕｅ（フナコシ薬品販
売）を宿主として、Ｌｅｄｅｒｂｅｒｇ，Ｃｏｈｅｎ法
により当該プラスミドを導入した。得られた形質転換処
理菌体を前記合成プローブを用いてコロニーハイブリダ
イゼーションを行い、合成プローブとハイブリダイズす
るバチルス・ズブチリス プロテアーゼインヒビター形
質転換体を得た。
【００２７】この形質転換体をアンピシリン５０μｇ／
ｍｌを含む培地にて３７℃で振とう培養した。培養液を
遠心分離して集菌し、洗浄後、分離菌体からアルカリ抽
出法によってプラスミドを分離し、新規なプラスミドを
得た。このプラスミドをｐＵＣ１１９−ＢｓｕＰＩと命
名した。
ｍｌを含む培地にて３７℃で振とう培養した。培養液を
遠心分離して集菌し、洗浄後、分離菌体からアルカリ抽
出法によってプラスミドを分離し、新規なプラスミドを
得た。このプラスミドをｐＵＣ１１９−ＢｓｕＰＩと命
名した。
【００２８】ＤＮＡ塩基配列の決定は、プラスミドｐＵ
Ｃ１１９−ＢｓｕＰＩとキロシークエンス用デレーショ
ンキット（宝酒造社製）を用い、Ｈｅｎｉｋｏｆｆの方
法（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．，Ｇｅｎｅ．２８，３５１
（１９８４））及びジデオキシヌクレチオド鎖終結法
（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．ａｎｄ Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．，
Ｇｅｎｅ，１９，２６９（１９８２））によって行っ
た。
Ｃ１１９−ＢｓｕＰＩとキロシークエンス用デレーショ
ンキット（宝酒造社製）を用い、Ｈｅｎｉｋｏｆｆの方
法（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ．，Ｇｅｎｅ．２８，３５１
（１９８４））及びジデオキシヌクレチオド鎖終結法
（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．ａｎｄ Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．，
Ｇｅｎｅ，１９，２６９（１９８２））によって行っ
た。
【００２９】その結果を図１、図２及び配列表の配列番
号１に示した。ＢｓｕＰＩ遺伝子は、８７３ｂｐのＭｅ
ｔから始まり１２２９ｂｐのＬｙｓでおわる１１９アミ
ノ酸よりなる蛋白質である。ＤＮＡ塩基配列より予想さ
れるバチルス・ズブチリスプロテアーゼインヒビターの
Ｎ末端アミノ酸配列は既報のＮ末端アミノ酸配列と完全
に一致する。このアミノ酸配列は他報のプロテアーゼイ
ンヒビターとは有意のホモロジーは認められない。
号１に示した。ＢｓｕＰＩ遺伝子は、８７３ｂｐのＭｅ
ｔから始まり１２２９ｂｐのＬｙｓでおわる１１９アミ
ノ酸よりなる蛋白質である。ＤＮＡ塩基配列より予想さ
れるバチルス・ズブチリスプロテアーゼインヒビターの
Ｎ末端アミノ酸配列は既報のＮ末端アミノ酸配列と完全
に一致する。このアミノ酸配列は他報のプロテアーゼイ
ンヒビターとは有意のホモロジーは認められない。
【００３０】
【発明の効果】本発明により、バチルス・ズブチリスの
菌体内プロテアーゼインヒビターをコードする遺伝子の
塩基配列が明らかとなった。プロテアーゼインヒビター
を遺伝子的に分析できたことにより、その生理的役割を
研究する上で非常に有利になり、生体内の未知の制御系
の解明に寄与することができる。また、この遺伝子を蛋
白質高生産菌に組変え、分泌生産させれば、プロテアー
ゼインヒビターを大量に生産させることも可能になり、
医薬や微生物工業への利用も可能となる。
菌体内プロテアーゼインヒビターをコードする遺伝子の
塩基配列が明らかとなった。プロテアーゼインヒビター
を遺伝子的に分析できたことにより、その生理的役割を
研究する上で非常に有利になり、生体内の未知の制御系
の解明に寄与することができる。また、この遺伝子を蛋
白質高生産菌に組変え、分泌生産させれば、プロテアー
ゼインヒビターを大量に生産させることも可能になり、
医薬や微生物工業への利用も可能となる。
【図１】プロテアーゼインヒビター遺伝子のヌクレオチ
ド（及びアミノ酸配列）を含む塩基配列（第１図の１）
を示す。
ド（及びアミノ酸配列）を含む塩基配列（第１図の１）
を示す。
【図２】プロテアーゼインヒビター遺伝子のヌクレオチ
ド（及びアミノ酸配列）を含む塩基配列（第１図の２）
を示す。
ド（及びアミノ酸配列）を含む塩基配列（第１図の２）
を示す。
【図３】プロテアーゼインヒビターのアミノ酸配列を第
２図に示す。
２図に示す。
【表１】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 志 賀 靖 弘 愛知県名古屋市千種区唐山町１−78 浅 田荘８号 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (2)
- 【請求項１】 配列表の配列番号１の塩基配列で示され
る８７３の位置（ATG：Met）から始まり最終位置１２２
９（AAA：Lys）で終了するアミノ酸配列をコードするバ
チルス・ズブチリス由来のプロテアーゼインヒビターBs
uPI遺伝子のDNA。 - 【請求項２】 配列表の配列番号１の最初の塩基配列 C
TG から最終塩基配列 CAG に至るバチルス・ズブチリス
由来のプロテアーゼインヒビターBsuPI遺伝子のDNAを含
むDNA。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3089076A JP3023008B2 (ja) | 1991-03-29 | 1991-03-29 | プロテア−ゼインヒビタ−遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3089076A JP3023008B2 (ja) | 1991-03-29 | 1991-03-29 | プロテア−ゼインヒビタ−遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04304888A JPH04304888A (ja) | 1992-10-28 |
| JP3023008B2 true JP3023008B2 (ja) | 2000-03-21 |
Family
ID=13960772
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3089076A Expired - Fee Related JP3023008B2 (ja) | 1991-03-29 | 1991-03-29 | プロテア−ゼインヒビタ−遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3023008B2 (ja) |
-
1991
- 1991-03-29 JP JP3089076A patent/JP3023008B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04304888A (ja) | 1992-10-28 |
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