JP2801263B2 - カルバメート‐ヒドロラーゼを単離し引続き精製する方法、カルバメート‐ヒドロラーゼのＢｒＣＮ‐分解ペプチド、合成オリゴヌクレオチドの製法、カルバメート‐ヒドロラーゼ‐遺伝子の単離法及びアルトロバクター・オキシダンスの新規菌株 - Google Patents
カルバメート‐ヒドロラーゼを単離し引続き精製する方法、カルバメート‐ヒドロラーゼのＢｒＣＮ‐分解ペプチド、合成オリゴヌクレオチドの製法、カルバメート‐ヒドロラーゼ‐遺伝子の単離法及びアルトロバクター・オキシダンスの新規菌株Info
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- JP2801263B2 JP2801263B2 JP1124595A JP12459589A JP2801263B2 JP 2801263 B2 JP2801263 B2 JP 2801263B2 JP 1124595 A JP1124595 A JP 1124595A JP 12459589 A JP12459589 A JP 12459589A JP 2801263 B2 JP2801263 B2 JP 2801263B2
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- C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、除草剤フエンメジフアム（Phenmediqham）
の失活化のための遺伝子及びそれによりコードされた酵
素を単離し、かつ特性化する方法に関する。この酵素
は、アルトロバクター・オキシダンスからのカルバメー
ト−ヒドロラーゼであり、これは、フエンメジフアム
（IUPAC−命名では３−ｍ−トリルカルバモイルオキシ
フエニルカンパメート）の２つのフエニル核の間の−OO
C−Ｎ−結合の分解に寄与する。
の失活化のための遺伝子及びそれによりコードされた酵
素を単離し、かつ特性化する方法に関する。この酵素
は、アルトロバクター・オキシダンスからのカルバメー
ト−ヒドロラーゼであり、これは、フエンメジフアム
（IUPAC−命名では３−ｍ−トリルカルバモイルオキシ
フエニルカンパメート）の２つのフエニル核の間の−OO
C−Ｎ−結合の分解に寄与する。
実際に、種々の雑草の撲滅のためには、屡々多くの除
草剤もしくは除草剤混合物を使用しなければならない。
この問題は、遺伝子操作により変えられ、非選択性除草
剤に対する抵抗を有する植物によりさけることができ
る。
草剤もしくは除草剤混合物を使用しなければならない。
この問題は、遺伝子操作により変えられ、非選択性除草
剤に対する抵抗を有する植物によりさけることができ
る。
従つて、除草剤相容性植物に関する要求は、今日、植
物保護の前面に出ている。
物保護の前面に出ている。
除草剤相容性植物を得るためには、第１に、除草剤を
代謝により失活させることのできる酵素の単離及び引続
く精製のための方法及び第２に、活性酵素のコード化の
ために寄与するDNS−配列を有する遺伝子及びそれによ
りコードされた酵素の特性化の方法が必要である。
代謝により失活させることのできる酵素の単離及び引続
く精製のための方法及び第２に、活性酵素のコード化の
ために寄与するDNS−配列を有する遺伝子及びそれによ
りコードされた酵素の特性化の方法が必要である。
フエンメジフアムを失活させることのできる遺伝子及
びそれによりコードされた酵素の単離及び引続く特性化
のこのような方法は従来未知である。
びそれによりコードされた酵素の単離及び引続く特性化
のこのような方法は従来未知である。
本発明の課題は、フエンメジフアムを失活化すること
のできる遺伝子及びそれによりコードされた酵素を単離
し、引続き、特性化する方法を開発することである。
のできる遺伝子及びそれによりコードされた酵素を単離
し、引続き、特性化する方法を開発することである。
このために、まず、除草剤フエンメジフアムを代謝に
より失活化させる能力を有する微生物に同定するために
微生物のスクリーニングを行なう。
より失活化させる能力を有する微生物に同定するために
微生物のスクリーニングを行なう。
ところで、土壌微生物例えばアルトロバクター・オキ
シダンスから、フエンメジフアムの２つのフエニル核の
間の−OOC−Ｎ−結合の加水分解に関与するカルバメー
ト−ヒドロラーゼを単離できることを発見した。フエン
メジフアムの２つのフエニル核の間の−OOC−Ｎ−結合
の加水分解は、次の反応により、除草剤失活化合物例え
ばメチル−３−ヒドロキシフエニル−カルバメート及び
ｍ−トルイジンと生ぜしめる： 前記の反応によりフエンメジフアムを加水分解するこ
とのできる遺伝子及びそれによりコードされた酵素の単
離及び引続く精製のために、アルトロバクター・オキシ
ダンスの微生物を栄養培地中で培養する。フエンメジフ
アムの分解に関与するカルバメート−ヒドロラーゼを、
超音波細胞崩解及び遠心分離により単離し、アニオン交
換体クロマトグラフイ、勾配溶離、硫酸アンモニウム沈
殿及びFPLC−分離により、電気泳動的な均一性に達する
まで精製する。この精製されたカルバメート−ヒドロラ
ーゼから出発して、BrCN−分解により、その配列をエド
マン−分解（Edman−Abbau）により決定することのでき
る２個のペプチドを単離することができる。このペプチ
ドの配列情報に準拠して、ハイブリダイゼーシヨンプロ
ーブ（Hybridisierungssonden）としてカルバメート−
ヒドロラーゼ−遺伝子の検出のために使用されるオリゴ
ヌクレオチドを合成する。
シダンスから、フエンメジフアムの２つのフエニル核の
間の−OOC−Ｎ−結合の加水分解に関与するカルバメー
ト−ヒドロラーゼを単離できることを発見した。フエン
メジフアムの２つのフエニル核の間の−OOC−Ｎ−結合
の加水分解は、次の反応により、除草剤失活化合物例え
ばメチル−３−ヒドロキシフエニル−カルバメート及び
ｍ−トルイジンと生ぜしめる： 前記の反応によりフエンメジフアムを加水分解するこ
とのできる遺伝子及びそれによりコードされた酵素の単
離及び引続く精製のために、アルトロバクター・オキシ
ダンスの微生物を栄養培地中で培養する。フエンメジフ
アムの分解に関与するカルバメート−ヒドロラーゼを、
超音波細胞崩解及び遠心分離により単離し、アニオン交
換体クロマトグラフイ、勾配溶離、硫酸アンモニウム沈
殿及びFPLC−分離により、電気泳動的な均一性に達する
まで精製する。この精製されたカルバメート−ヒドロラ
ーゼから出発して、BrCN−分解により、その配列をエド
マン−分解（Edman−Abbau）により決定することのでき
る２個のペプチドを単離することができる。このペプチ
ドの配列情報に準拠して、ハイブリダイゼーシヨンプロ
ーブ（Hybridisierungssonden）としてカルバメート−
ヒドロラーゼ−遺伝子の検出のために使用されるオリゴ
ヌクレオチドを合成する。
土壌細菌アルトロバクター・オキシダンスのすべての
実施されている単離物中で、細胞の分解及び核酸の抽出
の後に、プラスミドを検出することができる。
実施されている単離物中で、細胞の分解及び核酸の抽出
の後に、プラスミドを検出することができる。
菌株アルトロバクター・オキシダンスp52に関して、
カルバメート−ヒドロラーゼはプラスミドでコードされ
ることが明らかにすることができる。
カルバメート−ヒドロラーゼはプラスミドでコードされ
ることが明らかにすることができる。
プラスミドpHP52の欠損の場合に、この菌株はフエン
メジフアムを加水分解する特性を失なう。カルバメート
−ヒドロラーゼは、菌株p52のプラスミド不含の誘導体
中では生化学的に検出することはできない。
メジフアムを加水分解する特性を失なう。カルバメート
−ヒドロラーゼは、菌株p52のプラスミド不含の誘導体
中では生化学的に検出することはできない。
このプラスミドpH52を調製的に単離し、制限エンドヌ
クレアーゼを書き入れる。電気泳動により生じる制限フ
ラグメントをメンブランフイルター上に移し、オリゴヌ
クレオチドと交雑させる。ブロツト−ハイブリダイゼー
ション（Blot−Hybridisierung）のデータから、このカ
ルバメート−加水分解−遺伝子は3.3kbの大きさのPst I
−制限フラグメント上に局在することが明らかである。
クレアーゼを書き入れる。電気泳動により生じる制限フ
ラグメントをメンブランフイルター上に移し、オリゴヌ
クレオチドと交雑させる。ブロツト−ハイブリダイゼー
ション（Blot−Hybridisierung）のデータから、このカ
ルバメート−加水分解−遺伝子は3.3kbの大きさのPst I
−制限フラグメント上に局在することが明らかである。
このフラグメントをプルスミドpH52から調製的に単離
し、ベクターpUC19CのPst I−部位に導入する（Yanish
−Perron、C.Vieira.J.＆Messing（1985）、Gene33、10
3ff参照）。連結バッチを用いるE.コリーDH5αの形質転
換の後に、２つの型の組換えE.コリークローンが得られ
（それぞれpp52Pst及びpp52Pst）、これらは、ベクター
のLac−プロモータに対する種々の配向でカルバメート
−ヒドロラーゼ−遺伝子を含有する（第５図参照）。
し、ベクターpUC19CのPst I−部位に導入する（Yanish
−Perron、C.Vieira.J.＆Messing（1985）、Gene33、10
3ff参照）。連結バッチを用いるE.コリーDH5αの形質転
換の後に、２つの型の組換えE.コリークローンが得られ
（それぞれpp52Pst及びpp52Pst）、これらは、ベクター
のLac−プロモータに対する種々の配向でカルバメート
−ヒドロラーゼ−遺伝子を含有する（第５図参照）。
カルバメート−ヒドロラーゼを、インダクター（Indu
ctors）イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドの存
在で、E.コリーDH5α（pp52Pst）型のクローンの培養に
より機能的に表現されうる。E.コリーDH5α（pp52inv）
型のクローンの蛋白質抽出物（これはLac−プロモータ
ーに対する逆の配向でカルバメート−ヒドロラーゼ−遺
伝子を含有する）中には、カルバメート−ヒドロラーゼ
−遺伝子の表現は検出できない。このことから、アルト
ロバクタープロモーターはE.コリーRNA−ポリメラーゼ
により確認されないことが推考できる。
ctors）イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシドの存
在で、E.コリーDH5α（pp52Pst）型のクローンの培養に
より機能的に表現されうる。E.コリーDH5α（pp52inv）
型のクローンの蛋白質抽出物（これはLac−プロモータ
ーに対する逆の配向でカルバメート−ヒドロラーゼ−遺
伝子を含有する）中には、カルバメート−ヒドロラーゼ
−遺伝子の表現は検出できない。このことから、アルト
ロバクタープロモーターはE.コリーRNA−ポリメラーゼ
により確認されないことが推考できる。
カルバメート−ヒドロラーゼ−遺伝子のヌクレオチド
配列はサンガー（Sanger）等による方法（Sanger.F.Nic
klen.S.＆Coulson.A（1977）、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
74、5463〜5468）により確認される。
配列はサンガー（Sanger）等による方法（Sanger.F.Nic
klen.S.＆Coulson.A（1977）、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
74、5463〜5468）により確認される。
このために、クローン化された3.3kbの長さのPst I−
制限フラグメントから出発して、15サブクローンは、一
重鎖DNS−バクテリオフアージM13mp18及びmp19に分けら
れる（Messing.J.（1983）、Methodsin Enzymol.101、
20〜78）。第６図に、配列決定法を明らかにするコード
化帯域の正確な制限地図を示す。
制限フラグメントから出発して、15サブクローンは、一
重鎖DNS−バクテリオフアージM13mp18及びmp19に分けら
れる（Messing.J.（1983）、Methodsin Enzymol.101、
20〜78）。第６図に、配列決定法を明らかにするコード
化帯域の正確な制限地図を示す。
これから推論しうる蛋白質配列を有する確認ヌクレオ
チド配列を第７図に示す。双方の確認BrCN−分解ペプチ
ドのアミノ酸配列（例４参照）は、同じ読み枠（Lasera
ster）内でDNA−面上で固定することができる。この読
み枠は、TGA−翻訳トポコドンで終結し（第７図、ヌク
レオチド位置1789〜1791）、およらくGTG−出発コドン
で開始する（第７図、Nukleotid−位置340〜342）。合
計で、1479塩基対の読み枠が生じる。推定上のGTG−ス
タートコドンの上流に、E.コリーリボソーム結合位置に
関するコンセンサス−配列に対して有意のホモロジーを
有する領域（Shine−Dalgarnoボツクス）を確認するこ
とができる（第７図参照、ヌクレオチド−位置298〜30
2）。
チド配列を第７図に示す。双方の確認BrCN−分解ペプチ
ドのアミノ酸配列（例４参照）は、同じ読み枠（Lasera
ster）内でDNA−面上で固定することができる。この読
み枠は、TGA−翻訳トポコドンで終結し（第７図、ヌク
レオチド位置1789〜1791）、およらくGTG−出発コドン
で開始する（第７図、Nukleotid−位置340〜342）。合
計で、1479塩基対の読み枠が生じる。推定上のGTG−ス
タートコドンの上流に、E.コリーリボソーム結合位置に
関するコンセンサス−配列に対して有意のホモロジーを
有する領域（Shine−Dalgarnoボツクス）を確認するこ
とができる（第７図参照、ヌクレオチド−位置298〜30
2）。
1987年８月25日に、西ドイツ微生物寄託局（DSM）
（Ｇttingen、西ドイツ在に、次の微生物を寄託した
（寄託番号）： アルトロバクター・オキシダンスp16/4/B（DSM4038）、 アルトロバクター・オキシダンスp67（DSM4039）、 アルトロバクター・オキシダンスp75（DSM4040）、 アルトロバクター・オキシダンスp11/1/−ｂ（DSM404
1）、 アルトロバクター・オキシダンスp15/4/A（DSM4045）、 アルトロバクター・オキシダンスp21/2（DSM4046）、 プラスミドpHP52を含有するアルトロバクター・オキシ
ダンスp52（DSM4044）。
（Ｇttingen、西ドイツ在に、次の微生物を寄託した
（寄託番号）： アルトロバクター・オキシダンスp16/4/B（DSM4038）、 アルトロバクター・オキシダンスp67（DSM4039）、 アルトロバクター・オキシダンスp75（DSM4040）、 アルトロバクター・オキシダンスp11/1/−ｂ（DSM404
1）、 アルトロバクター・オキシダンスp15/4/A（DSM4045）、 アルトロバクター・オキシダンスp21/2（DSM4046）、 プラスミドpHP52を含有するアルトロバクター・オキシ
ダンスp52（DSM4044）。
図面の説明 略字 ｇ−遠心力 DEAE−ジエチルアミノエチル EPLC−（Fast Protein/Peptid/Polynukleotid Liquid C
hromatography:蛋白質、ペプチド及びポリヌクレオチド
に関する高速液体クロマトグラフイ） pH−水素イオン濃度の負の常用対数 kb−キロ塩基 SDS−ラウリル硫酸ナトリウム DTT−ジチオスレイトール １×SSC−NaCl0.15M、クエン酸三ナトリウム0.015M（pH
7.0） １×Denhardt−牛血清アルブミン0.02％（w/v） （シグマ、フラクシヨンＶ） フイコル（Ficoll）400 0.02％（w/v）ポリビニルピロ
リドン0.02％ MCS−マルチプルクローニング部位 （Multiple Cloning site） 制限エンドヌクレアーゼに関する略字 Bm＝BamH I、Bs＝BstE II、Cl＝Cla I、 E V＝EcoR V、H II＝Hind II、Kp＝Kp I、 Nc＝Nco I、Nd＝Nde I、Nh＝Nhe I、 Ps＝Pst I、pv I＝Pv II、Pv II＝Pvu II、 Sc＝Sac I、Sp＝Sph I、St＝Stu I、 xb＝Xba I。
hromatography:蛋白質、ペプチド及びポリヌクレオチド
に関する高速液体クロマトグラフイ） pH−水素イオン濃度の負の常用対数 kb−キロ塩基 SDS−ラウリル硫酸ナトリウム DTT−ジチオスレイトール １×SSC−NaCl0.15M、クエン酸三ナトリウム0.015M（pH
7.0） １×Denhardt−牛血清アルブミン0.02％（w/v） （シグマ、フラクシヨンＶ） フイコル（Ficoll）400 0.02％（w/v）ポリビニルピロ
リドン0.02％ MCS−マルチプルクローニング部位 （Multiple Cloning site） 制限エンドヌクレアーゼに関する略字 Bm＝BamH I、Bs＝BstE II、Cl＝Cla I、 E V＝EcoR V、H II＝Hind II、Kp＝Kp I、 Nc＝Nco I、Nd＝Nde I、Nh＝Nhe I、 Ps＝Pst I、pv I＝Pv II、Pv II＝Pvu II、 Sc＝Sac I、Sp＝Sph I、St＝Stu I、 xb＝Xba I。
図面 第１図は、アルトロバクター・オキシダンスからのフ
エンメジフアム分解性カルバメート−ヒドロラーゼの単
離及び引続く精製法（例２）を示す系統図である。
エンメジフアム分解性カルバメート−ヒドロラーゼの単
離及び引続く精製法（例２）を示す系統図である。
第２図は、粗製エキス及び個々の精製工程の後に単離
され、プールされた蛋白質フラクシヨンのSDS−ポリア
クリルアミドゲル上での電気泳動分離状態を示す図であ
り、ここで分子量に関するマーカーとして標準蛋白質
（Ｓ）を共に泳動させている。
され、プールされた蛋白質フラクシヨンのSDS−ポリア
クリルアミドゲル上での電気泳動分離状態を示す図であ
り、ここで分子量に関するマーカーとして標準蛋白質
（Ｓ）を共に泳動させている。
A:アルトロバクター・オキシダンスの超音波細胞崩壊の
遠心分離上澄みからの粗製エキス、 B:DEAE−セフアセル−カラムでの勾配溶離の後にプール
された蛋白質フラクシヨン、 C:Bからのフラクシヨンの硫酸アンモニウム沈殿 D:硫酸アンモニウム沈殿のゲル濾過及び引続くセフアク
リルＳ−300カラム上での分離の後の蛋白質フラクシヨ
ン E:DからのプールされたフラクシヨンをFPLC（アニオン
交換体−クロマトグラフイ）の分離後の蛋白質フラクシ
ヨン F:プールされたフラクシヨンＥのサプロース６−カラム
での分離（例２）の後の蛋白質フラクシヨン。
遠心分離上澄みからの粗製エキス、 B:DEAE−セフアセル−カラムでの勾配溶離の後にプール
された蛋白質フラクシヨン、 C:Bからのフラクシヨンの硫酸アンモニウム沈殿 D:硫酸アンモニウム沈殿のゲル濾過及び引続くセフアク
リルＳ−300カラム上での分離の後の蛋白質フラクシヨ
ン E:DからのプールされたフラクシヨンをFPLC（アニオン
交換体−クロマトグラフイ）の分離後の蛋白質フラクシ
ヨン F:プールされたフラクシヨンＥのサプロース６−カラム
での分離（例２）の後の蛋白質フラクシヨン。
第３図は、カルバメート−ヒドロラーゼの至適（pH6.
8）を得るための曲線図である。この至適pHは、酵素活
性（％）をpH値に対してプロツトすることにより確定す
ることができる（例２）。第４図は、アルトロバクター
・オキシダンス（菌株p52）からのプラスミドpHP52の制
限地図である。第５図は、カルバメート−ヒドロラーゼ
−遺伝子のクローニング法を示す図である。概要を示す
ため、５′−及び３′−側面領域を包含するオリゴヌク
レオチドと交雑性の遺伝子範囲を環上のプラスミド地図
の下に拡大して示している。
8）を得るための曲線図である。この至適pHは、酵素活
性（％）をpH値に対してプロツトすることにより確定す
ることができる（例２）。第４図は、アルトロバクター
・オキシダンス（菌株p52）からのプラスミドpHP52の制
限地図である。第５図は、カルバメート−ヒドロラーゼ
−遺伝子のクローニング法を示す図である。概要を示す
ため、５′−及び３′−側面領域を包含するオリゴヌク
レオチドと交雑性の遺伝子範囲を環上のプラスミド地図
の下に拡大して示している。
組換えクローンpp52pst及びpp52pstinv.が線状で示さ
れている。このLac Z′−遺伝子の転写方向は矢印
（）で示されている。
れている。このLac Z′−遺伝子の転写方向は矢印
（）で示されている。
第６図は、カルバメート−ヒドロラーゼ−遺伝子の正
確な位置を示す（開始:GTG＝開始コドン、停止:TGA＝停
止コドン）、クローニングされた3.3kb pet I−制限フ
ラグメントの制限地図である。
確な位置を示す（開始:GTG＝開始コドン、停止:TGA＝停
止コドン）、クローニングされた3.3kb pet I−制限フ
ラグメントの制限地図である。
この配列決定された範囲は、制限地図の下の矢印で示
されている。矢印の長さから、それぞれの配列決定され
た範囲の長さを読み取ることができる。
されている。矢印の長さから、それぞれの配列決定され
た範囲の長さを読み取ることができる。
例４に記載のオリゴヌクレオチドに対してホモロジー
範囲を有する制限フラグメントは、この地図から明らか
である M13クローンは次のように記載することができる。
範囲を有する制限フラグメントは、この地図から明らか
である M13クローンは次のように記載することができる。
第７図は５′−及び３′−側面範囲を包含するカルバ
メート−ヒドロラーゼ−遺伝子のヌクレオチド配列を示
す図である。
メート−ヒドロラーゼ−遺伝子のヌクレオチド配列を示
す図である。
特に1.GTG−開始コドン、2.リボソマール結合位置（S
hine−/Dalgarno Box;S/D）、3.例４に記載のオリゴヌ
クレトチドに対するホモロジー領域（oligo I％＆I/oli
go II）を明示している。
hine−/Dalgarno Box;S/D）、3.例４に記載のオリゴヌ
クレトチドに対するホモロジー領域（oligo I％＆I/oli
go II）を明示している。
暗号化されたヌクレオチド配列を形式的にアミノ酸配
列に翻訳した。この読み枠は、明らかに蛋白質確定アミ
ノ酸部分配列により決定されている。
列に翻訳した。この読み枠は、明らかに蛋白質確定アミ
ノ酸部分配列により決定されている。
実施例 例１ 除草剤フエンメジフアムを失活させる能力を有する微生
物の単離 フエンメジフアムを代謝により失活させる能力を有す
る微生物の同定のために、微生物のスクリーニングを実
施する。この微生物源として種々の土地（フエンメジフ
アムで数回処理された実験地）の土壌試料及び澄明スラ
イムをも使用する。カルバメート分解を実施することの
できる微生物の同定のための選択尺度として、次の特定
を採用する： ａ）特有の炭素源もしくは窒素源としてのフエンメジフ
アムを有する栄養培地上での生長 ｂ）次の反応によるフエンメジフアムの水溶性化合物へ
の分解： 土壌試料中に存在する、フエンメジフアムを分解する
ことのできる多くの微生物から、特に明白な分解を示す
７種の代表を選択する。すべての代表がアルトロバクタ
ーに属し、この属内のオキシダンス種に属するこれら土
壌細菌を次の合成培地（M9−培地）を有する培養液中で
培養する： NH4Cl 1.0g/ MgSO4×7H2O 0.25g/ KH2PO4 3.0g/ Na2HO4×2H2O 7.0g/ グルコース 2.0g/ 及びNaCl 0.5g/ このM9−培地は、付加的にチアミン（ビタミンB1）1m
g/に並び微少量元素を含有しこれらは基幹溶液の形で
（1ml/M9−培地ｌ）添加される。この微少量元素−基幹
溶液は、次のものを含有する： ホウ酸 0.5g/ CuSO4×5H2O 0.04g/ FeCl3×6H2O 0.2g/ MuSO4×7H2O 0.4g/ ZnCl2 0.4g/ メート−ヒドラーゼ0.5〜1mgを再現可能に単離するこ
とができる。カルバメート−ヒドロラーゼの単離のため
に、細胞を遠心（7000xg）により取得し、溶解緩衝液
（10mM燐酸ナトリウムpH6.8/1mM DTT）約40ml中に再懸
濁させる。細胞懸濁液を超音波により崩壊させ、同時に
ホモゲナイズする。
物の単離 フエンメジフアムを代謝により失活させる能力を有す
る微生物の同定のために、微生物のスクリーニングを実
施する。この微生物源として種々の土地（フエンメジフ
アムで数回処理された実験地）の土壌試料及び澄明スラ
イムをも使用する。カルバメート分解を実施することの
できる微生物の同定のための選択尺度として、次の特定
を採用する： ａ）特有の炭素源もしくは窒素源としてのフエンメジフ
アムを有する栄養培地上での生長 ｂ）次の反応によるフエンメジフアムの水溶性化合物へ
の分解： 土壌試料中に存在する、フエンメジフアムを分解する
ことのできる多くの微生物から、特に明白な分解を示す
７種の代表を選択する。すべての代表がアルトロバクタ
ーに属し、この属内のオキシダンス種に属するこれら土
壌細菌を次の合成培地（M9−培地）を有する培養液中で
培養する： NH4Cl 1.0g/ MgSO4×7H2O 0.25g/ KH2PO4 3.0g/ Na2HO4×2H2O 7.0g/ グルコース 2.0g/ 及びNaCl 0.5g/ このM9−培地は、付加的にチアミン（ビタミンB1）1m
g/に並び微少量元素を含有しこれらは基幹溶液の形で
（1ml/M9−培地ｌ）添加される。この微少量元素−基幹
溶液は、次のものを含有する： ホウ酸 0.5g/ CuSO4×5H2O 0.04g/ FeCl3×6H2O 0.2g/ MuSO4×7H2O 0.4g/ ZnCl2 0.4g/ メート−ヒドラーゼ0.5〜1mgを再現可能に単離するこ
とができる。カルバメート−ヒドロラーゼの単離のため
に、細胞を遠心（7000xg）により取得し、溶解緩衝液
（10mM燐酸ナトリウムpH6.8/1mM DTT）約40ml中に再懸
濁させる。細胞懸濁液を超音波により崩壊させ、同時に
ホモゲナイズする。
こうして得られた均一物を引続き4000xg及び４℃の温
度で45分間遠心する。沈殿を捨て、上澄みをDEAE−セフ
アセルカラム（100mMトリス−HCl、pH7.2/100mM NaCl/1
mM DTTで平衡化）上に装入する（カラム直径2.6mm、ゲ
ル床の高さ20.5cm、カラム容積約100ml）。
度で45分間遠心する。沈殿を捨て、上澄みをDEAE−セフ
アセルカラム（100mMトリス−HCl、pH7.2/100mM NaCl/1
mM DTTで平衡化）上に装入する（カラム直径2.6mm、ゲ
ル床の高さ20.5cm、カラム容積約100ml）。
この装入の前に、細胞抽出物を出発緩衡液（100mMト
リス/100mM NaCl/1mM DTT）で約1:10に稀釈する。引続
き、結合していない物質を除去するために、カラムを出
発緩衡液で洗浄する。次いで、カルバメート−ヒドロラ
ーゼを、NaCl100mM→NaCl500 （NH4）6Mo7O24×4H2O 0.2g/ この液体培地中での振動培養のために、この合成培地
はカサミノアシド（Casaminoacids;Difco）0.1％を補
充する。
リス/100mM NaCl/1mM DTT）で約1:10に稀釈する。引続
き、結合していない物質を除去するために、カラムを出
発緩衡液で洗浄する。次いで、カルバメート−ヒドロラ
ーゼを、NaCl100mM→NaCl500 （NH4）6Mo7O24×4H2O 0.2g/ この液体培地中での振動培養のために、この合成培地
はカサミノアシド（Casaminoacids;Difco）0.1％を補
充する。
土壌細菌をこのM9−培地中、28℃で、良好な通気下に
対数生長期の終りまでインキユベートする。酵素精製の
ために、培地10に定常予備培養液1:100を接種する。
対数生長期の終りまでインキユベートする。酵素精製の
ために、培地10に定常予備培養液1:100を接種する。
培養液のHPLC−分析より、アルトロバクター・オキシ
ダンスの培養物中で、フエンメジフアムを分解して、除
草活性のない生成物にすることが明らかにできた。
ダンスの培養物中で、フエンメジフアムを分解して、除
草活性のない生成物にすることが明らかにできた。
例２ アルトロバクター・オキシダンスからのカルバメート−
ヒドロラーゼの単離及び精製 カルバメート−ヒドロラーゼを単離し、引続き電気泳
動的に均一になるまで精製することは６工程の精製法に
より実施する。アルトロバクター・オキシダンス（pHP5
2）（DSM No.4044）の最終対数培養物６から、カルバ
mMの線状勾配濃度（５×カラム容積）で溶離させる。酵
素活性フラクシヨンをプールし（集める）、固体硫酸ア
ンモニウム（NH4）SO4を加えて、飽和溶液の33％の最終
濃度にする。この際に生じる蛋白質沈殿を遠心により沈
殿させ（20000×g/30分）捨てる。上澄みに（NH4）2SO2
（固体）を加えて、飽和溶液の60％の最終濃度にし、０
℃で約12時間撹拌する。生じる蛋白質を遠心により集め
る（20000×g/30分）。この沈殿を出発緩衡液約1ml中に
溶かし、10w/v％サツカロースを加え、セフアクリルＳ
−300カラム上に装入する。ゲル濾過2.5cm/hの流速で実
施する（溶離緩衡液→出発緩衡液）。このカラムは、次
の寸法を有する：直径＝2.6cm、ｈ＝95cm、容積＝475m
l。酵素活性フラクシヨンを引続きFPLC−カラム（Mono
QHR5/5:アニオン交換体）を通し更に後処理する（勾配
容離:NaCl100mM→NaCl300mM;流速:0.5ml/mm;装入量:2m
l）。
ヒドロラーゼの単離及び精製 カルバメート−ヒドロラーゼを単離し、引続き電気泳
動的に均一になるまで精製することは６工程の精製法に
より実施する。アルトロバクター・オキシダンス（pHP5
2）（DSM No.4044）の最終対数培養物６から、カルバ
mMの線状勾配濃度（５×カラム容積）で溶離させる。酵
素活性フラクシヨンをプールし（集める）、固体硫酸ア
ンモニウム（NH4）SO4を加えて、飽和溶液の33％の最終
濃度にする。この際に生じる蛋白質沈殿を遠心により沈
殿させ（20000×g/30分）捨てる。上澄みに（NH4）2SO2
（固体）を加えて、飽和溶液の60％の最終濃度にし、０
℃で約12時間撹拌する。生じる蛋白質を遠心により集め
る（20000×g/30分）。この沈殿を出発緩衡液約1ml中に
溶かし、10w/v％サツカロースを加え、セフアクリルＳ
−300カラム上に装入する。ゲル濾過2.5cm/hの流速で実
施する（溶離緩衡液→出発緩衡液）。このカラムは、次
の寸法を有する：直径＝2.6cm、ｈ＝95cm、容積＝475m
l。酵素活性フラクシヨンを引続きFPLC−カラム（Mono
QHR5/5:アニオン交換体）を通し更に後処理する（勾配
容離:NaCl100mM→NaCl300mM;流速:0.5ml/mm;装入量:2m
l）。
結合しない蛋白質を、出発緩衡液19mlを用いるイソク
ラテイツク溶離（isokratische Elution）により除去す
る（勾配溶離：トリス100mM/HCl;pH7.2/DTT 1mM中20ml
以内でのNaCl100mM→NaCl300mM）。
ラテイツク溶離（isokratische Elution）により除去す
る（勾配溶離：トリス100mM/HCl;pH7.2/DTT 1mM中20ml
以内でのNaCl100mM→NaCl300mM）。
酵素活性フラクシヨンを電気泳動的な純度分析（Ｌ
mnliによるSDS−ポリアクリルアミド−ゲル電気泳動）
の後に、限外濾過により濃縮させ（Amicon(R)、Centric
on 10 Konzntrator）、FPLC−ゲル濾過カラム（Superos
e6、HR10/30、Pharmacia）上に装入する（流速:0.2ml/m
in.装入量:100ml、展開剤:100mMトリス/HCl、pH7.2/10m
M NaCl）。
mnliによるSDS−ポリアクリルアミド−ゲル電気泳動）
の後に、限外濾過により濃縮させ（Amicon(R)、Centric
on 10 Konzntrator）、FPLC−ゲル濾過カラム（Superos
e6、HR10/30、Pharmacia）上に装入する（流速:0.2ml/m
in.装入量:100ml、展開剤:100mMトリス/HCl、pH7.2/10m
M NaCl）。
この工程で生じる活性蛋白質フラクシヨンは電気泳動
的に単一である。
的に単一である。
この単離された酵素は、緩衡溶液（生化学で慣用の緩
衡液、例えば隣酸塩緩衡液、トリス緩衡液等、pH6.8）
中で活性である。コフアクター又は金属イオンは、この
反応のために不必要であり、SH−試薬に対する敏感性も
同様に存在しない。この酵素の至適pHはpH6.8である。
衡液、例えば隣酸塩緩衡液、トリス緩衡液等、pH6.8）
中で活性である。コフアクター又は金属イオンは、この
反応のために不必要であり、SH−試薬に対する敏感性も
同様に存在しない。この酵素の至適pHはpH6.8である。
変性／解離条件（SDS−ゲル電気泳動）下でも自然の
条件（ゲル濾過）下でも、このカルバメート−ヒドロラ
ーゼの分子量は50〜60kd有利に53〜57kdの範囲内にあ
る。このことから、このカルバメート−ヒドロラーゼ
は、モノマーの蛋白質であると結論すべきである。カル
バメート−ヒドロラーゼの等電点は、pI＝6.2である。
条件（ゲル濾過）下でも、このカルバメート−ヒドロラ
ーゼの分子量は50〜60kd有利に53〜57kdの範囲内にあ
る。このことから、このカルバメート−ヒドロラーゼ
は、モノマーの蛋白質であると結論すべきである。カル
バメート−ヒドロラーゼの等電点は、pI＝6.2である。
例３ カルバメート−ヒドロラーゼの検出法 蛋白質粗製抽出物の精製の間の酵素活性を迅速かつ疑
いのない検出のために、試験管内酵素テストを開発す
る。このテストは、水中に難溶性のフエンメジフアムを
可溶性の加水分解生成物に変えるこの酵素の特性に基づ
く。このために、固体フエンメジフアムを水中に懸濁さ
せ、超音波でマイクロナイズさせる。引続き、このマイ
クロ懸濁液を引続き50℃で撹拌下にアガロース溶液中に
注ぎ、硬化の前にペトリシャーレ中に入れる。濁つたゲ
ルマトリツクスが生じる。引続き、この酸素溶液を、固
体マトリツクス中に導入されている押し抜き穴中に入れ
る。30℃で２〜４時間のテストプレートのインキユベー
トの後に、酵素活性は、フエンメジフアムによる乳濁マ
トリツクス中の澄明帯域の現われにより示される。
いのない検出のために、試験管内酵素テストを開発す
る。このテストは、水中に難溶性のフエンメジフアムを
可溶性の加水分解生成物に変えるこの酵素の特性に基づ
く。このために、固体フエンメジフアムを水中に懸濁さ
せ、超音波でマイクロナイズさせる。引続き、このマイ
クロ懸濁液を引続き50℃で撹拌下にアガロース溶液中に
注ぎ、硬化の前にペトリシャーレ中に入れる。濁つたゲ
ルマトリツクスが生じる。引続き、この酸素溶液を、固
体マトリツクス中に導入されている押し抜き穴中に入れ
る。30℃で２〜４時間のテストプレートのインキユベー
トの後に、酵素活性は、フエンメジフアムによる乳濁マ
トリツクス中の澄明帯域の現われにより示される。
例４ 交雑によるカルバメート−ヒドロラーゼ−遺伝子の特異
的検出のための２種のBrCN−分解ペプチドのアミノ酸配
列の同定及びオリゴヌクレオチドの合成 精製されたカルバメート−ヒドロラーゼから出発し
て、BrCN−分解により、その配列がエドマン−分解（Ed
man−Abbau）により部分的に確定することのできる２種
のペプチドを単離する。
的検出のための２種のBrCN−分解ペプチドのアミノ酸配
列の同定及びオリゴヌクレオチドの合成 精製されたカルバメート−ヒドロラーゼから出発し
て、BrCN−分解により、その配列がエドマン−分解（Ed
man−Abbau）により部分的に確定することのできる２種
のペプチドを単離する。
BrCNペプチドI: BrCNペプチドII: このペプチドの配列情報の割合に従つて、交雑ゾンデ
としてカルバメート−ヒドロラーゼ−遺伝子の検出のた
めに使用されるオリゴヌクレオチドを合成する： オリゴヌクレオチドＩ（17mer混合試料）は、一重鎖D
NS−フラグメントとしてBrCN−ペプチドＩアミノ酸 po
s.10〜15（相対的連鎖）からの配列情報を有する： オリゴヌクレオチドII（42mer）は一重鎖DNS−フラグ
メントとしてBrCNペプチドＩアミノ酸pos.8〜21からの
配列情報（相補的連鎖）を有する。コドン選択は、グア
ニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）−の多いDNS−配列（ト
リプレツトの第３の位置でアデニン（Ａ）−及びチミン
（Ｔ）−ヌクレオチドの前のグアニン（Ｇ）−及びシト
シン（Ｃ）−ヌクレオチドを考慮する）の想定のもとに
行なう。
としてカルバメート−ヒドロラーゼ−遺伝子の検出のた
めに使用されるオリゴヌクレオチドを合成する： オリゴヌクレオチドＩ（17mer混合試料）は、一重鎖D
NS−フラグメントとしてBrCN−ペプチドＩアミノ酸 po
s.10〜15（相対的連鎖）からの配列情報を有する： オリゴヌクレオチドII（42mer）は一重鎖DNS−フラグ
メントとしてBrCNペプチドＩアミノ酸pos.8〜21からの
配列情報（相補的連鎖）を有する。コドン選択は、グア
ニン（Ｇ）及びシトシン（Ｃ）−の多いDNS−配列（ト
リプレツトの第３の位置でアデニン（Ａ）−及びチミン
（Ｔ）−ヌクレオチドの前のグアニン（Ｇ）−及びシト
シン（Ｃ）−ヌクレオチドを考慮する）の想定のもとに
行なう。
オリゴヌクレオチドIIIは、一重鎖DNS−フラグメント
としてBrCN−ペプチドIIからの配列情報（相補的連鎖）
を有する： これらヌクレオチドの使用下に、ヘルビチダーゼ−遺
伝子を交雑によりプラスミドンpHP52内に局在化させる
ことができる。このためにこのプラスミド−DNSを制限
エンドヌクレアーゼを用いて切断させ、この際に生じる
フラグメントをアガロースゲル電気泳動により分離さ
せ、引続き、E.M.サザンの方法（J.Mol.Biol.98、503〜
517（1975））により、一重鎖形でメンブランフイルタ
ー上に移す（Gen Screen PlusTM Hybridisierungsmembr
anen,Du Pont de Nemours/NEN−Research Prodncts）。
としてBrCN−ペプチドIIからの配列情報（相補的連鎖）
を有する： これらヌクレオチドの使用下に、ヘルビチダーゼ−遺
伝子を交雑によりプラスミドンpHP52内に局在化させる
ことができる。このためにこのプラスミド−DNSを制限
エンドヌクレアーゼを用いて切断させ、この際に生じる
フラグメントをアガロースゲル電気泳動により分離さ
せ、引続き、E.M.サザンの方法（J.Mol.Biol.98、503〜
517（1975））により、一重鎖形でメンブランフイルタ
ー上に移す（Gen Screen PlusTM Hybridisierungsmembr
anen,Du Pont de Nemours/NEN−Research Prodncts）。
オリゴヌクレオチドをT4−ポリヌクレオチドキナーゼ
（Boehringer Mannheim）及び〔γ32−ｐ〕−アデノシ
ン−５′−トリホスフエート（＞5000ci/mモル、Du Pon
t de Nemours/NEN−Research−Products）の使用下に末
端標識し（R.B.Wallace and C.G.Mirada、Methods in E
nzymology 152、432〜442（1987））、更に精製せずに
交雑のために使用する。
（Boehringer Mannheim）及び〔γ32−ｐ〕−アデノシ
ン−５′−トリホスフエート（＞5000ci/mモル、Du Pon
t de Nemours/NEN−Research−Products）の使用下に末
端標識し（R.B.Wallace and C.G.Mirada、Methods in E
nzymology 152、432〜442（1987））、更に精製せずに
交雑のために使用する。
この交雑（Hybridisierung）は、標準法（P.J.Mason
＆ J.G.WilliamsのNucleicacid hybridisation、133〜1
60頁（1985）、B.D.Hames ＆ S.J.Higgins Hrsg.IRL Pr
ess Oxford.Washington D.C.）の使用下に行なう。６×
SSC;10×Denhardt;0.5％（w/v）SDS及びｔ−RNA100μg/
ml（Ｂckerhefe、Boehringer Mannheim）並びに標識
オリゴヌクレオチドI/II/III10ng/mlの条件下で41℃
（≧6h）で、特異的な交雑が達成できる。雑種細胞（Hy
bride）の検出は、オートラジオグラフイ（T.Maniatis
E.P.Fritsch ＆ J.Sambrook.Molecular Cloning、Cold
Spring Harbor Laboratory（1982））により行なう。
＆ J.G.WilliamsのNucleicacid hybridisation、133〜1
60頁（1985）、B.D.Hames ＆ S.J.Higgins Hrsg.IRL Pr
ess Oxford.Washington D.C.）の使用下に行なう。６×
SSC;10×Denhardt;0.5％（w/v）SDS及びｔ−RNA100μg/
ml（Ｂckerhefe、Boehringer Mannheim）並びに標識
オリゴヌクレオチドI/II/III10ng/mlの条件下で41℃
（≧6h）で、特異的な交雑が達成できる。雑種細胞（Hy
bride）の検出は、オートラジオグラフイ（T.Maniatis
E.P.Fritsch ＆ J.Sambrook.Molecular Cloning、Cold
Spring Harbor Laboratory（1982））により行なう。
例５ アルトロバクター・オキシダンスからのプラスミドpHP5
2の単離及び特性化 アルトロバクターからプラスミドpH52を単離するた
め、Bimboin及びDolyによるアルカリ抽出法（Birnboin
H.C.＆ Doly.J.（1979）Nucl.Acid.Res.7,1513〜1523）
で、Brandsch及びDeckerの変法（Bransch.R.Decker.K.
（1984）Arch.Microbiol.138,15〜17）を用いる。調製
のために、バクテリアを次の成分： バクト−トリプトン （Bacto−Trypton;Difco ） 10g/ バクト−ヘーフエ−エキス （Difco ） 5g/ NaCl 10g/ よりなるLB−培地６中で、細胞密度0D550＝1.4になる
まで培養し、引続き、遠心分離により収穫する。
2の単離及び特性化 アルトロバクターからプラスミドpH52を単離するた
め、Bimboin及びDolyによるアルカリ抽出法（Birnboin
H.C.＆ Doly.J.（1979）Nucl.Acid.Res.7,1513〜1523）
で、Brandsch及びDeckerの変法（Bransch.R.Decker.K.
（1984）Arch.Microbiol.138,15〜17）を用いる。調製
のために、バクテリアを次の成分： バクト−トリプトン （Bacto−Trypton;Difco ） 10g/ バクト−ヘーフエ−エキス （Difco ） 5g/ NaCl 10g/ よりなるLB−培地６中で、細胞密度0D550＝1.4になる
まで培養し、引続き、遠心分離により収穫する。
次いでこの細胞を、溶液Ｉ（50mMグルコース、10mM E
DTA、25mMトリス/HCl pH8.0、リソチーム1mg/ml）合計2
10ml中に再懸濁させ、室温で１時間インキユベートす
る。溶液II（0.2M NaOH、１％SDS）360mlの添加により
分解を行なう。注意深い混合及び引続く室温での５分間
のインキユベーシヨン及び引続く５分間の氷令の後に、
混合物を溶液III（2Mトリス/HCl pH7.0/0.5M KCl）180m
lの添加により中和する。氷上で１時間インキユベーシ
ヨンの後に、不溶の沈殿を遠心により除去する。プラス
ミド−DNSはイソプロパノール0.6容量％の添加により沈
殿させ澄明上澄みを得、室温で15分間のインキユベーシ
ヨンの後に遠心（15000×g/30分）によりペレツト化す
る。プラスミド含有沈殿を真空中で乾燥させ、引続き10
XTE緩衝液（100mMトリス/HCl pH8.0;10mM EDTA）24ml中
に溶かす。このプラスミド含有溶液を引続き等密度（is
opyknische）塩化セシウム−密度勾配遠心により、臭化
エチジウムの存在下に、精製する（Maniatis T.Fritsc
h、E.F.＆ Sambrook J.によるMolecular Cloning（198
2）Cold Spring Harbor、N.Y.）。
DTA、25mMトリス/HCl pH8.0、リソチーム1mg/ml）合計2
10ml中に再懸濁させ、室温で１時間インキユベートす
る。溶液II（0.2M NaOH、１％SDS）360mlの添加により
分解を行なう。注意深い混合及び引続く室温での５分間
のインキユベーシヨン及び引続く５分間の氷令の後に、
混合物を溶液III（2Mトリス/HCl pH7.0/0.5M KCl）180m
lの添加により中和する。氷上で１時間インキユベーシ
ヨンの後に、不溶の沈殿を遠心により除去する。プラス
ミド−DNSはイソプロパノール0.6容量％の添加により沈
殿させ澄明上澄みを得、室温で15分間のインキユベーシ
ヨンの後に遠心（15000×g/30分）によりペレツト化す
る。プラスミド含有沈殿を真空中で乾燥させ、引続き10
XTE緩衝液（100mMトリス/HCl pH8.0;10mM EDTA）24ml中
に溶かす。このプラスミド含有溶液を引続き等密度（is
opyknische）塩化セシウム−密度勾配遠心により、臭化
エチジウムの存在下に、精製する（Maniatis T.Fritsc
h、E.F.＆ Sambrook J.によるMolecular Cloning（198
2）Cold Spring Harbor、N.Y.）。
精製されたプラスミド−DNSを、引続き制限エンンド
ヌクレアーゼを用い、単一又は多重切断により、かつ引
続く0.8（w/v）％アガロースゲル中での制限フラグメン
トのゲル電気泳動分離により分析する。フラグメントの
大きさ測定のために、ヌクレアーゼHind III並びにHind
III/ECoR Iで処理したバクテリオフアージλのDNSを標
準として用いる。
ヌクレアーゼを用い、単一又は多重切断により、かつ引
続く0.8（w/v）％アガロースゲル中での制限フラグメン
トのゲル電気泳動分離により分析する。フラグメントの
大きさ測定のために、ヌクレアーゼHind III並びにHind
III/ECoR Iで処理したバクテリオフアージλのDNSを標
準として用いる。
この情報を用いて、プラスミドpHP52の環状制限地図
が得られる（第４図参照）。このプラスミドの大きさ
は、41kbの制限フラグメント長さの合計として確認でき
る。
が得られる（第４図参照）。このプラスミドの大きさ
は、41kbの制限フラグメント長さの合計として確認でき
る。
この例に記載のすべての方法は、標準法で実施される
（Maniatis T.Fritsch E.F.＆ Sambrook J.によるMolec
ular Coloning,Cold Spring Harbor,N.Y.（1982）参
照）。
（Maniatis T.Fritsch E.F.＆ Sambrook J.によるMolec
ular Coloning,Cold Spring Harbor,N.Y.（1982）参
照）。
例６ オリゴヌクレオチド−交雑によるカルバメート−ヒドロ
ラーゼ−遺伝子のコード化領域の同定 ゲル電気泳動により現われ、メンブランフイルター上
に移されたプラスミドpHP52の制限フラグメントと例４
に記載の32p−標識オリゴヌクレオチドとの交雑によ
り、プラスミドpHP52の制限地図上のガルバメート−ヒ
ドロラーゼ−遺伝子のコード化領域の位置は明白に確定
することができる。第５図には、交雑範囲が拡大して示
されている。すべての３個のオリゴヌクレオチドは、3.
3kbの大きさのPst I−制限フラグメントの中心部と交雑
する。第６図にはフラグメント内の交雑範囲の正確な位
置を明らかにするフラグメントの詳細な制限地図が示さ
れている。
ラーゼ−遺伝子のコード化領域の同定 ゲル電気泳動により現われ、メンブランフイルター上
に移されたプラスミドpHP52の制限フラグメントと例４
に記載の32p−標識オリゴヌクレオチドとの交雑によ
り、プラスミドpHP52の制限地図上のガルバメート−ヒ
ドロラーゼ−遺伝子のコード化領域の位置は明白に確定
することができる。第５図には、交雑範囲が拡大して示
されている。すべての３個のオリゴヌクレオチドは、3.
3kbの大きさのPst I−制限フラグメントの中心部と交雑
する。第６図にはフラグメント内の交雑範囲の正確な位
置を明らかにするフラグメントの詳細な制限地図が示さ
れている。
例７ E.コリー中のカルバメート−ヒドロラーゼ−遺伝子のク
ローニング及びLac−プロモーター制限下における遺伝
子発現の検出 E.コリー中のカルバメート−ヒドロラーゼ−遺伝子の
クローニングのために、ベクターpUC19（Yanish−perro
n、C.Vicira,J.＆ Messing,J.（1985）Gene33,1033ff）
を使用する。このpUC19DNSを制限ヌクレアーゼPst Iを
用いる切断により線状化しアルカリ性ホスフアターゼで
処理する。プラスミドpHP52の3.3kbの長さのPst I−制
限フラグメントのDNSを、Pst I−を用いる野生型プラス
ミド−DNSの切断の後に調製用アガロースゲル電気泳動
により単離する。この線状化され、脱ホスホリル化され
たベクターDNS及び3.3kbの長さのPst I−フラグメント
を、引続きT4DNAリガーゼで連結させる。この連結混合
物で、E.コリーDH5αは形質転換される。この場合、２
種の型のクローンが得られ、これらは、それぞれベクタ
ーpUC19のLac Z′−因子の転写方向に対するそれぞれ異
なる方向でフラグメントを含有する。これは、クローン
pp52及びpp52Pst inv.である。双方のクローンの制限地
図が第５図に示されている。E.コリーpp52Pst型のクロ
ーンは、インダクターイソプロピル−β−Ｄ−チオガラ
クトシドを培地に添加の後に、カルバメート−ヒドロラ
ーゼを発現する。クローンpp52Pstの対数培養物へのイ
ンダクター添加なしに（lac−プロモータの未表現状
態）、かつクローンpp52Pst inv.の未表現の（reprimie
rt）及び誘導された対数培養物においては、酵素エキス
中で例３に記載の検査法により酵素活性は立証できな
い。
ローニング及びLac−プロモーター制限下における遺伝
子発現の検出 E.コリー中のカルバメート−ヒドロラーゼ−遺伝子の
クローニングのために、ベクターpUC19（Yanish−perro
n、C.Vicira,J.＆ Messing,J.（1985）Gene33,1033ff）
を使用する。このpUC19DNSを制限ヌクレアーゼPst Iを
用いる切断により線状化しアルカリ性ホスフアターゼで
処理する。プラスミドpHP52の3.3kbの長さのPst I−制
限フラグメントのDNSを、Pst I−を用いる野生型プラス
ミド−DNSの切断の後に調製用アガロースゲル電気泳動
により単離する。この線状化され、脱ホスホリル化され
たベクターDNS及び3.3kbの長さのPst I−フラグメント
を、引続きT4DNAリガーゼで連結させる。この連結混合
物で、E.コリーDH5αは形質転換される。この場合、２
種の型のクローンが得られ、これらは、それぞれベクタ
ーpUC19のLac Z′−因子の転写方向に対するそれぞれ異
なる方向でフラグメントを含有する。これは、クローン
pp52及びpp52Pst inv.である。双方のクローンの制限地
図が第５図に示されている。E.コリーpp52Pst型のクロ
ーンは、インダクターイソプロピル−β−Ｄ−チオガラ
クトシドを培地に添加の後に、カルバメート−ヒドロラ
ーゼを発現する。クローンpp52Pstの対数培養物へのイ
ンダクター添加なしに（lac−プロモータの未表現状
態）、かつクローンpp52Pst inv.の未表現の（reprimie
rt）及び誘導された対数培養物においては、酵素エキス
中で例３に記載の検査法により酵素活性は立証できな
い。
このことは、pp52Pst型のクローン中のカルバメート
−ヒドロラーゼ−遺伝子がベクターのLac Z′因子にお
けると同じ転写方向（５′−３′−配向）で存在するこ
とを意味する。アルトロバクタープロモータは明らか
に、E.コリー中には認められない（かつ又は不充分にの
み認められる）。
−ヒドロラーゼ−遺伝子がベクターのLac Z′因子にお
けると同じ転写方向（５′−３′−配向）で存在するこ
とを意味する。アルトロバクタープロモータは明らか
に、E.コリー中には認められない（かつ又は不充分にの
み認められる）。
例８ アルトロバクター・オキシダンス（菌株p52）からのカ
ルバメート−ヒドロラーゼ−遺伝子のヌクレオチド配列
及びこれから誘導された酵素の蛋白質配列 カルバメート−ヒドロラーゼ−遺伝子のヌクレオチド
配列をサンガーの方法で確認する（Sanger.F.Nicklen.
S.＆ Coulson.A.（1977）proc.Natl.Acad.Sci.USA74,54
63〜5468）。
ルバメート−ヒドロラーゼ−遺伝子のヌクレオチド配列
及びこれから誘導された酵素の蛋白質配列 カルバメート−ヒドロラーゼ−遺伝子のヌクレオチド
配列をサンガーの方法で確認する（Sanger.F.Nicklen.
S.＆ Coulson.A.（1977）proc.Natl.Acad.Sci.USA74,54
63〜5468）。
このために、クローンE.コリーpp52PstのDNSから出発
し、一重鎖DNS−バクテリオフアージM13mp18及びM13mp1
9内で15クローンを構成する（Messing,J.（1983）Metho
ds in Enzymol.101,20〜78）。E.コリーDH5αＦ′への
トランスフエクシヨンの後に一重鎖組換えデソキシリボ
ヌクレイン酸の配列が確認される。
し、一重鎖DNS−バクテリオフアージM13mp18及びM13mp1
9内で15クローンを構成する（Messing,J.（1983）Metho
ds in Enzymol.101,20〜78）。E.コリーDH5αＦ′への
トランスフエクシヨンの後に一重鎖組換えデソキシリボ
ヌクレイン酸の配列が確認される。
第６図には、カルバメート−ヒドロラーゼ−遺伝子の
配列決定法が示されている。合計して1864塩基対の配列
が確認される（ストランド及び対向ストランド第６図参
照）。
配列決定法が示されている。合計して1864塩基対の配列
が確認される（ストランド及び対向ストランド第６図参
照）。
第７図には、これから誘導されるカルバメート−ヒド
ロラーゼの蛋白質配列を有する確認ヌクレオチド配列が
示されている。この読み枠は明らかに、例４に記載の２
個のBrCN−切断ペプチドのアミン酸部分配列により定義
される。この読み枠は、TGA−停止コドンで終結してい
る（第７図のヌクレオチド−位置1789〜1791）。翻訳開
始コドンとしては、GTC（ヌクレオチド位置340〜342）
がこれに該当する。これは、1479bpの最長の開放読み枠 を生じる。慣用のATG開始コドンで開始するすべての開
放読み枠は、蛋白質通過寸法（蛋白質の分子量測定と比
較）を生じない。
ロラーゼの蛋白質配列を有する確認ヌクレオチド配列が
示されている。この読み枠は明らかに、例４に記載の２
個のBrCN−切断ペプチドのアミン酸部分配列により定義
される。この読み枠は、TGA−停止コドンで終結してい
る（第７図のヌクレオチド−位置1789〜1791）。翻訳開
始コドンとしては、GTC（ヌクレオチド位置340〜342）
がこれに該当する。これは、1479bpの最長の開放読み枠 を生じる。慣用のATG開始コドンで開始するすべての開
放読み枠は、蛋白質通過寸法（蛋白質の分子量測定と比
較）を生じない。
GTG上の翻訳開始（位置340〜342）の固定は、更に、
推定GTG−開始コドンの7bp上流の間隔で、リボソマール
E.コリー結合位置に関するコンセンサス−配列に対して
明らかなホモロジー領域の存在により支持される。
推定GTG−開始コドンの7bp上流の間隔で、リボソマール
E.コリー結合位置に関するコンセンサス−配列に対して
明らかなホモロジー領域の存在により支持される。
すべてのクローン化工程は、標準法で実施した（Mani
atis,T.Fritsch.E.F.＆ sambrook J.（1982）によるMol
ecular Cloning,Cold Spring Harbor.N.Y.）。この配列
化反応は、「セクエナーゼ DNAセクエンシングキツト
（SequenassRDNA Sequencing Kits:United States Bioc
hemical Corporation）の使用下に、製造者の指示に従
つて実施される。マークされた反応生成物の分離は、ポ
リアクリルアミド６（w/v）％／尿素ゲル中で行なつた
（Maxam.A.M.＆ Gilbert,W.（1980）Method Enzymol.6
5,497〜557）。
atis,T.Fritsch.E.F.＆ sambrook J.（1982）によるMol
ecular Cloning,Cold Spring Harbor.N.Y.）。この配列
化反応は、「セクエナーゼ DNAセクエンシングキツト
（SequenassRDNA Sequencing Kits:United States Bioc
hemical Corporation）の使用下に、製造者の指示に従
つて実施される。マークされた反応生成物の分離は、ポ
リアクリルアミド６（w/v）％／尿素ゲル中で行なつた
（Maxam.A.M.＆ Gilbert,W.（1980）Method Enzymol.6
5,497〜557）。
第１図はアルトロバクター・オキシダンスからフエンメ
ジフアム分解性カルバメート−ヒドロラーゼを単離し、
引続き精製する方法を示す系統図であり、第２図は、粗
製エキス及び精製工程の後の単離され、プールされた蛋
白質フラクシヨンのSDS−ポリアクリルアミドゲル上で
の電気泳動分離状態を示す図であり、第３図はカルバメ
ート−ヒドロラーゼの活性とpH値の関係を示す図であ
り、第４図は、アルトロバクター・オキシダンス（菌株
p52）からのプラスミドpHP52の制限地図であり、第５図
は、カルバメート−ヒドロラーゼ−遺伝子のクローニン
グ法を示す図であり、第６図は、カルバメート−ヒドロ
ラーゼ−遺伝子の正確な位置（開始:GTG＝開始コドン、
停止:TAG＝停止コドン）を示すクローン化された3.3kb
Pst I−制限フラグメントの制限地図であり、第７図
は、カルバメート−ヒドロラーゼ−遺伝子のヌクレオチ
ド配列を示す図である。
ジフアム分解性カルバメート−ヒドロラーゼを単離し、
引続き精製する方法を示す系統図であり、第２図は、粗
製エキス及び精製工程の後の単離され、プールされた蛋
白質フラクシヨンのSDS−ポリアクリルアミドゲル上で
の電気泳動分離状態を示す図であり、第３図はカルバメ
ート−ヒドロラーゼの活性とpH値の関係を示す図であ
り、第４図は、アルトロバクター・オキシダンス（菌株
p52）からのプラスミドpHP52の制限地図であり、第５図
は、カルバメート−ヒドロラーゼ−遺伝子のクローニン
グ法を示す図であり、第６図は、カルバメート−ヒドロ
ラーゼ−遺伝子の正確な位置（開始:GTG＝開始コドン、
停止:TAG＝停止コドン）を示すクローン化された3.3kb
Pst I−制限フラグメントの制限地図であり、第７図
は、カルバメート−ヒドロラーゼ−遺伝子のヌクレオチ
ド配列を示す図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 9/78 Ｃ１２Ｎ 9/78 //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:06） (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 9/78 - 9/86 C12N 15/55 C07K 14/195 C07K 7/08 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＹＳ（ＤＩＡＬＯＧ) (54)【発明の名称】 カルバメート‐ヒドロラーゼを単離し引続き精製する方法、カルバメート‐ヒドロラーゼのＢｒ ＣＮ‐分解ペプチド、合成オリゴヌクレオチドの製法、カルバメート‐ヒドロラーゼ‐遺伝子の 単離法及びアルトロバクター・オキシダンスの新規菌株
Claims (12)
- 【請求項１】フェンメジファムの２つのフェニル核の間
の−OOC−Ｎ−結合の分解に寄与するアルトロバクター
・オキシダンスからのカルバメート−ヒドロラーゼを単
離し、引続き精製する方法において、アルトロバクター
・オキシダンスの微生物を栄養培地中で培養し、引続
き、カルバメート−ヒドロラーゼを超音波−細胞崩壊及
び遠心分離により単離し、アニオン交換体−クロマトグ
ラフィ、勾配溶離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲル濾過及
びFPLC−分離により電気泳動的な均一性に達するまで精
製し、この際、カルバメート−ヒドロラーゼは、至適pH
6.8、50〜60kdの範囲の分子量及び等電点pI＝6.2を有す
ることを特徴とする、アルトロバクター・オキシダンス
からのカルバメート−ヒドロラーゼを単離し、引続き精
製する方法。 - 【請求項２】アミノ酸配列 ペプチドI: ペプチドII: を有することを特徴とする、カルバメート−ヒドロラー
ゼのBrCN−分解ペプチド。 - 【請求項３】配列 オリゴヌクレオチドI: オリゴヌクレオチドII: オリゴヌクレオチドIII: の合成ヌクレオチドを製造するため、請求項２に記載の
ペプチドＩ及びIIを使用することを特徴とする、合成オ
リゴヌクレオチドの製法。 - 【請求項４】カルバメート−ヒドロラーゼ−遺伝子の単
離のために、請求項３に記載の合成オリゴヌクレオチド
を使用することを特徴とする、カルバメート−ヒドロラ
ーゼ−遺伝子の単離法。 - 【請求項５】41kbの長さのプラスミドpHP52を3.3kbの長
さのPst−制限フラグメントと共に含有し、その上にカ
ルバメート−ヒドロラーゼ−遺伝子が局在している、ア
ルトロバクター・オキシダンスp52（pHP52）（DSM404
4）。 - 【請求項６】カルバメート−ヒドロラーゼ−遺伝子は、
1479塩基対のヌクレオチド配列を有するレーゼラスター
よりなる、請求項５記載のアルトロバクター・オキシダ
ンス。 - 【請求項７】アルトロバクター・オキシダンスp16/4/B
（DSM4038）。 - 【請求項８】アルトロバクター・オキシダンスp67（DSM
4039）。 - 【請求項９】アルトロバクター・オキシダンスp75（DSM
4040）。 - 【請求項１０】アルトロバクター・オキシダンスp11/1/
−ｂ（DSM4041）。 - 【請求項１１】アルトロバクター・オキシダンスp15/4/
A（DSM4045）。 - 【請求項１２】アルトロバクター・オキシダンスp21/2
（DSM4046）。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3817384.0 | 1988-05-19 | ||
| DE3817384A DE3817384A1 (de) | 1988-05-19 | 1988-05-19 | Verfahren zur isolierung einer phenmedipham spaltenden carbamat-hydrolase aus arthrobacter oxidans und anschliessenden reinigung der carbamat-hydrolase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02128689A JPH02128689A (ja) | 1990-05-17 |
| JP2801263B2 true JP2801263B2 (ja) | 1998-09-21 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP2801263B2 (ja) |
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| CA (1) | CA1338440C (ja) |
| DE (2) | DE3817384A1 (ja) |
| DK (1) | DK175794B1 (ja) |
| ES (1) | ES2059815T3 (ja) |
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- 1988-05-19 DE DE3817384A patent/DE3817384A1/de not_active Withdrawn
-
1989
- 1989-05-11 DK DK198902312A patent/DK175794B1/da not_active IP Right Cessation
- 1989-05-17 DE DE58907998T patent/DE58907998D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-17 EP EP89730123A patent/EP0343100B1/de not_active Expired - Lifetime
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- 1989-05-18 CA CA000600153A patent/CA1338440C/en not_active Expired - Fee Related
- 1989-05-19 JP JP1124595A patent/JP2801263B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| DK231289D0 (da) | 1989-05-11 |
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