JPH0657153B2 - 抗腫瘍または抗癌蛋白質の遺伝子 - Google Patents
抗腫瘍または抗癌蛋白質の遺伝子Info
- Publication number
- JPH0657153B2 JPH0657153B2 JP60298014A JP29801485A JPH0657153B2 JP H0657153 B2 JPH0657153 B2 JP H0657153B2 JP 60298014 A JP60298014 A JP 60298014A JP 29801485 A JP29801485 A JP 29801485A JP H0657153 B2 JPH0657153 B2 JP H0657153B2
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- JP
- Japan
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- dna
- sagp
- gene
- amino acid
- plasmid
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/315—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Streptococcus (G), e.g. Enterococci
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は溶血性連鎖球菌(streptococcus pyogenes)によ
り産生される抗腫瘍または抗癌蛋白質の遺伝子ＤＡＮお
よび該遺伝子ＤＮＡ配列を含有する組換えベクター、お
よび該組換えベクターにより形質転換された微生物及び
細胞に関する。
り産生される抗腫瘍または抗癌蛋白質の遺伝子ＤＡＮお
よび該遺伝子ＤＮＡ配列を含有する組換えベクター、お
よび該組換えベクターにより形質転換された微生物及び
細胞に関する。
従来技術及び問題点 S.pyogenesはグラム陽性の連鎖球菌であり、丹毒、敗血
症、産褥熱等の病原菌として知られている。一方、S.py
ogenesの一部菌株が抗癌活性を有していることが古くか
ら知られており、今日、臨床的にも抗癌剤として用いら
れている。
症、産褥熱等の病原菌として知られている。一方、S.py
ogenesの一部菌株が抗癌活性を有していることが古くか
ら知られており、今日、臨床的にも抗癌剤として用いら
れている。
吉村によりS.pyogenes Su株の菌体よりin vitro細胞増
殖抑制作用を指標として抽出精製された物質がin vivo
においても抗癌活性を有することが動物実験により示さ
れている（特開昭58-222026）。
殖抑制作用を指標として抽出精製された物質がin vivo
においても抗癌活性を有することが動物実験により示さ
れている（特開昭58-222026）。
吉村によれば、この抗癌性蛋白質は分子量約50000（Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による測定）の
糖蛋白質であると報告されているが、遺伝子の該酸塩基
配列はもとよりアミノ酸配列も明らかにされていない。
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による測定）の
糖蛋白質であると報告されているが、遺伝子の該酸塩基
配列はもとよりアミノ酸配列も明らかにされていない。
問題解決の手段 本発明者は、溶血性連鎖球菌(streptococcus pyogenes)
により産生される抗癌性蛋白質（以下、ＳＡＧＰと略
す）の遺伝子をクローン化し、ＳＡＧＰをコードしてい
るＤＮＡ塩酸配列およびそれから推定されるＳＡＧＰの
アミノ酸配列を決定し、本発明を完成した。
により産生される抗癌性蛋白質（以下、ＳＡＧＰと略
す）の遺伝子をクローン化し、ＳＡＧＰをコードしてい
るＤＮＡ塩酸配列およびそれから推定されるＳＡＧＰの
アミノ酸配列を決定し、本発明を完成した。
本発明は、ＳＡＧＰ遺伝子、該遺伝子を含みＤＮＡ，Ｓ
ＡＧＰ遺伝子を含み宿主細胞内で複製可能な組換えプラ
スミド及び該プラスミドを保持する微生物又は細胞を提
供する。
ＡＧＰ遺伝子を含み宿主細胞内で複製可能な組換えプラ
スミド及び該プラスミドを保持する微生物又は細胞を提
供する。
本発明のＳＡＧＰ遺伝子は概略以下の工程を経て取得、
確認することができる。
確認することができる。
(1)プローブと呼ばれるＳＡＧＰ遺伝子の一部分に相補
的な短鎖ＤＮＡの合成 (2)S.pyogenes菌体からの染色体ＤＮＡの抽出および制
限酵素による該ＤＮＡの分解 (3)S.pyogenes染色体ＤＮＡ断片のプラスミドベクター
への組込みおよび該組換えベクターによる宿主大腸菌の
形質転換 (4)(1)で合成したプローブを用いたコロニーハイブリダ
イゼーション法によるＳＡＧＰ遺伝子を保持する形質転
換体の選別、取得 (5)培養増殖させた形質転換体からのプラスミドＤＮＡ
の抽出精製 (6)該プラスミドＤＮＡの制限酵素地図の作成 (7)該プラスミドＤＮＡのうちＳＡＧＰ遺伝子を含む部
分のＤＮＡ塩基配列の決定 次に以上の各工程をさらに詳しく述べる。
的な短鎖ＤＮＡの合成 (2)S.pyogenes菌体からの染色体ＤＮＡの抽出および制
限酵素による該ＤＮＡの分解 (3)S.pyogenes染色体ＤＮＡ断片のプラスミドベクター
への組込みおよび該組換えベクターによる宿主大腸菌の
形質転換 (4)(1)で合成したプローブを用いたコロニーハイブリダ
イゼーション法によるＳＡＧＰ遺伝子を保持する形質転
換体の選別、取得 (5)培養増殖させた形質転換体からのプラスミドＤＮＡ
の抽出精製 (6)該プラスミドＤＮＡの制限酵素地図の作成 (7)該プラスミドＤＮＡのうちＳＡＧＰ遺伝子を含む部
分のＤＮＡ塩基配列の決定 次に以上の各工程をさらに詳しく述べる。
(1)ブローブの合成 図２に記載のＳＡＰＧ遺伝子の塩基配列と相補的な塩基
配列を有する短鎖ＤＮＡを合成する。
配列を有する短鎖ＤＮＡを合成する。
また、公知の方法によりS.pyogenes菌体から抽出精製し
たＳＡＧＰのアミノ酸配列を決定し、このアミノ酸配列
からＤＮＡ塩基配列を予想し、プローブを作製すること
も可能である。
たＳＡＧＰのアミノ酸配列を決定し、このアミノ酸配列
からＤＮＡ塩基配列を予想し、プローブを作製すること
も可能である。
(2)S.pyogenes染色体ＤＮＡの抽出、および制限酵素分
解 S.pyogenesを培養増殖した後、菌体を集め、酵素及び界
面活性剤等で処理して溶菌せしめ、該溶菌液より公知の
方法〔J.Marmur J.Mol.Biol.,3,208(1961)〕に従って染
色体ＤＮＡを抽出精製する。
解 S.pyogenesを培養増殖した後、菌体を集め、酵素及び界
面活性剤等で処理して溶菌せしめ、該溶菌液より公知の
方法〔J.Marmur J.Mol.Biol.,3,208(1961)〕に従って染
色体ＤＮＡを抽出精製する。
抽出された染色体ＤＮＡを制限酵素により分解する。
染色体ＤＮＡの制限酵素分解物をアガロースゲル電気泳
動することでＤＮＡ断片の大きさによる分画を行う。分
画されたＤＮＡ断片をサザーンの方法〔E.M.Southern,
J.Mol.Biol.,98,503(1975)〕によってニトロセルトース
フィルター上に移して固定し、放射性同位元素により標
識したプローブを用いてハイブリダイゼーションを行い
ＳＡＧＰ遺伝子を含むＤＮＡ断片の大きさを同定する。
動することでＤＮＡ断片の大きさによる分画を行う。分
画されたＤＮＡ断片をサザーンの方法〔E.M.Southern,
J.Mol.Biol.,98,503(1975)〕によってニトロセルトース
フィルター上に移して固定し、放射性同位元素により標
識したプローブを用いてハイブリダイゼーションを行い
ＳＡＧＰ遺伝子を含むＤＮＡ断片の大きさを同定する。
(3)形質転換ベクターへの組込みと組換えベクターによ
る細胞の形質転換 アガロースゲル電気泳動により分画した染色体ＤＮＡの
制限酵素分解物のうち、ＳＡＧＰ遺伝子を含むＤＮＡ断
片の大きさのＤＮＡ断片を抽出し、同一の制限酵素を切
断したベクターＤＮＡとＤＮＡリガーザにより結合す
る。このリガーゼ反応混合物を形質転換により大腸菌に
導入する。
る細胞の形質転換 アガロースゲル電気泳動により分画した染色体ＤＮＡの
制限酵素分解物のうち、ＳＡＧＰ遺伝子を含むＤＮＡ断
片の大きさのＤＮＡ断片を抽出し、同一の制限酵素を切
断したベクターＤＮＡとＤＮＡリガーザにより結合す
る。このリガーゼ反応混合物を形質転換により大腸菌に
導入する。
(4)ＳＡＧＰ遺伝子を保持する形質転換体の選別、取得 (3)で得られた多数の形質転換体をニトロセルロースフ
ィルター上で生育せしめた後溶菌し、ＤＮＡを該フィル
ター上に固定する。放射性同位元素により標識したプロ
ーブとフィルター上に固定したＤＮＡとのハイブリダイ
ゼーションを行いＳＡＧＰ遺伝子を含む形質転換体を同
定する。
ィルター上で生育せしめた後溶菌し、ＤＮＡを該フィル
ター上に固定する。放射性同位元素により標識したプロ
ーブとフィルター上に固定したＤＮＡとのハイブリダイ
ゼーションを行いＳＡＧＰ遺伝子を含む形質転換体を同
定する。
(5)プラスミドＤＮＡの取得 (4)でＳＡＧＰ遺伝子を保持することが認められた形質
転換体を培養、増殖せしめ、文献既知の方法(T.Maniati
s,E.F.Fritsch,J.Sambrook,Molecular Cloning,p.86,Co
ld Spling Harbor Laboratory(1982))によりプラスミド
ＤＮＡを取得する。
転換体を培養、増殖せしめ、文献既知の方法(T.Maniati
s,E.F.Fritsch,J.Sambrook,Molecular Cloning,p.86,Co
ld Spling Harbor Laboratory(1982))によりプラスミド
ＤＮＡを取得する。
(6)プラスミドＤＮＡの制限酵素地図の作成 (5)で取得したプラスミドＤＮＡを種々の制限酵素で切
断して各断片の大きさを電気泳動で調べることにより、
該プラスミドＤＮＡの制限酵素地図を作成する。
断して各断片の大きさを電気泳動で調べることにより、
該プラスミドＤＮＡの制限酵素地図を作成する。
(7)ＳＡＧＰ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定 (6)で作成した制限酵素地図に基づいてＳＡＧＰ遺伝子
ＤＮＡを制限酵素によりさらに小さく断片化し、それぞ
れの断片をクローニングしてサンガー法(G.F.Hong,Bios
ci.Report, 2,907(1982))により塩基配列の決定を行
う。
ＤＮＡを制限酵素によりさらに小さく断片化し、それぞ
れの断片をクローニングしてサンガー法(G.F.Hong,Bios
ci.Report, 2,907(1982))により塩基配列の決定を行
う。
また部分的には断片化したＤＮＡについてマキサム−ギ
ルバート法(A.Maxam and W.Gilbert,Mothod in Enzymol
ogy,65,499(1980))により塩基配列の決定を行う。
ルバート法(A.Maxam and W.Gilbert,Mothod in Enzymol
ogy,65,499(1980))により塩基配列の決定を行う。
最終的に各断片の塩基配列をつなぎあわせて、ＳＡＧＰ
の全塩基配列を決定し、該塩基配列に基づいてＳＡＧＰ
のアミノ酸配列を推定する。
の全塩基配列を決定し、該塩基配列に基づいてＳＡＧＰ
のアミノ酸配列を推定する。
上述のようにS.pyogenesから抽出したＳＡＧＰ遺伝子
は、言わば天然のＤＮＡ塩基配列である。最近のＤＮＡ
合成技術によればアミノ酸配列の明らかな蛋白質の遺伝
子ＤＮＡは化学的に合成することが可能である。よく知
られているように多くのアミノ酸についてはそれをコー
ドする遺伝子ＤＮＡ塩基配列は複数存在する。従って遺
伝子ＤＮＡを合成する際には、その塩基配列は一義的に
は決まらず多数の可能性が在りうる。
は、言わば天然のＤＮＡ塩基配列である。最近のＤＮＡ
合成技術によればアミノ酸配列の明らかな蛋白質の遺伝
子ＤＮＡは化学的に合成することが可能である。よく知
られているように多くのアミノ酸についてはそれをコー
ドする遺伝子ＤＮＡ塩基配列は複数存在する。従って遺
伝子ＤＮＡを合成する際には、その塩基配列は一義的に
は決まらず多数の可能性が在りうる。
本発明により明らかにされたＳＡＧＰのアミノ酸配列を
コードするＳＡＧＰ遺伝子を化学合成する場合も、その
ＤＮＡ塩基配列は、天然のＳＡＧＰ遺伝子のＤＮＡ塩基
配列に制限されるものではなく、多数の可能性がある
が、本発明のＳＡＧＰ遺伝子ＤＮＡは、天然のＤＮＡ塩
基配列のみに限定されるものではなく、本発明により明
らかにされたＳＡＧＰのアミノ酸配列をコードする他の
ＤＮＡ塩基配列も含むものである。
コードするＳＡＧＰ遺伝子を化学合成する場合も、その
ＤＮＡ塩基配列は、天然のＳＡＧＰ遺伝子のＤＮＡ塩基
配列に制限されるものではなく、多数の可能性がある
が、本発明のＳＡＧＰ遺伝子ＤＮＡは、天然のＤＮＡ塩
基配列のみに限定されるものではなく、本発明により明
らかにされたＳＡＧＰのアミノ酸配列をコードする他の
ＤＮＡ塩基配列も含むものである。
また遺伝子組換え技術によれば基本となるＤＮＡの特定
の部位に、該ＤＮＡがコードするものの基本的な特性を
変化させることなく、あるいはその特性を改善するよう
に、人為的に変異を起すことができる。本発明により提
供される、天然の塩基配列を有するＳＡＧＰ遺伝子ＤＮ
Ａあるいは天然のものとは異なる塩基配列を有するＳＡ
ＧＰ遺伝子ＤＮＡに関しても、同様に人為的に挿入、欠
失、置換を行うことにより天然のＳＡＧＰ遺伝子と同等
おるいは改善された特性とすることが可能であり、本発
明は、そのような変異ＳＡＧＰ遺伝子をも含むものであ
る。
の部位に、該ＤＮＡがコードするものの基本的な特性を
変化させることなく、あるいはその特性を改善するよう
に、人為的に変異を起すことができる。本発明により提
供される、天然の塩基配列を有するＳＡＧＰ遺伝子ＤＮ
Ａあるいは天然のものとは異なる塩基配列を有するＳＡ
ＧＰ遺伝子ＤＮＡに関しても、同様に人為的に挿入、欠
失、置換を行うことにより天然のＳＡＧＰ遺伝子と同等
おるいは改善された特性とすることが可能であり、本発
明は、そのような変異ＳＡＧＰ遺伝子をも含むものであ
る。
遺伝子工学技術においては通常遺伝子ＤＮＡはベクター
と呼ばれる形質転換微生物または形質転換細胞内で複製
可能なＤＮＡに組込んだ形で取り扱われる。ベクターと
しては、一般にプラスミドと呼ばれる環状ＤＮＡや、フ
ァージＤＮＡが用いられる。遺伝子配列を含むＤＮＡ断
片を細胞外でベクターＤＮＡに結合して組換えベクター
を作製する。得られた組換えベクターを微生物または細
胞中へ導入して得た形質転換体を増殖させることにより
大量の組換えベクターを得ることができる。
と呼ばれる形質転換微生物または形質転換細胞内で複製
可能なＤＮＡに組込んだ形で取り扱われる。ベクターと
しては、一般にプラスミドと呼ばれる環状ＤＮＡや、フ
ァージＤＮＡが用いられる。遺伝子配列を含むＤＮＡ断
片を細胞外でベクターＤＮＡに結合して組換えベクター
を作製する。得られた組換えベクターを微生物または細
胞中へ導入して得た形質転換体を増殖させることにより
大量の組換えベクターを得ることができる。
本発明により得られるＳＡＧＰ遺伝子も適当な組換えベ
クターに組込むことにより、宿主細胞内において複製可
能でありＳＡＧＰを生産させる組換えベクターを構築す
ることができ、得られた組換えベクターを、例えば、細
菌、酵母等の微生物又は動植物細胞等の宿主細胞に導入
することにより、ＳＡＧＰを生産する微生物、形質転換
細胞を得ることができる。
クターに組込むことにより、宿主細胞内において複製可
能でありＳＡＧＰを生産させる組換えベクターを構築す
ることができ、得られた組換えベクターを、例えば、細
菌、酵母等の微生物又は動植物細胞等の宿主細胞に導入
することにより、ＳＡＧＰを生産する微生物、形質転換
細胞を得ることができる。
このようにして得られた形質転換微生物又は細胞を培養
することによりＳＡＧＰを生産することができる。
することによりＳＡＧＰを生産することができる。
現在の遺伝子工学技術の分野においては宿主細胞として
大腸菌(E.coli)が遺伝的解析が最も進んでおりまた安全
性が高いこともあって最もよく採用されている。ＳＡＧ
Ｐ遺伝子に関しても大量にかつ速やかに複製させるため
には宿主としては大腸菌を採用することが望ましい。ま
た宿主大腸菌を形質転換するためのベクターとしては多
くのプラスミド、ファージが知られており、また市販さ
れていて、その多くはＳＡＧＰ遺伝子を組込むことが可
能であるが、ＳＡＧＰ遺伝子のＤＮＡ塩基配列決定の目
的のためにはプラスミドｐＵＣ１９が最も適している。
大腸菌(E.coli)が遺伝的解析が最も進んでおりまた安全
性が高いこともあって最もよく採用されている。ＳＡＧ
Ｐ遺伝子に関しても大量にかつ速やかに複製させるため
には宿主としては大腸菌を採用することが望ましい。ま
た宿主大腸菌を形質転換するためのベクターとしては多
くのプラスミド、ファージが知られており、また市販さ
れていて、その多くはＳＡＧＰ遺伝子を組込むことが可
能であるが、ＳＡＧＰ遺伝子のＤＮＡ塩基配列決定の目
的のためにはプラスミドｐＵＣ１９が最も適している。
実施例 以下の実施例は本発明の代表例として示すものでありＳ
ＡＧＰ遺伝子配列を含むＤＮＡ、および該ＤＮＡを保持
する形質転換体を限定するものではない。
ＡＧＰ遺伝子配列を含むＤＮＡ、および該ＤＮＡを保持
する形質転換体を限定するものではない。
1)ＳＡＧＰの部分アミノ酸配列 S.pyogenes Su株（ＡＴＣＣ２１０６０）の培養菌体よ
りＳＡＧＰを公知の方法（吉村、特開昭58-222026）に
従って精製し、得られた精製ＳＡＧＰ100μｇを使って
気相プロテインシークエンサー（アプライドバイオシス
テムズ社製モデル４７０Ａ）によりＮ末端部分のアミノ
酸配列を分析した。
りＳＡＧＰを公知の方法（吉村、特開昭58-222026）に
従って精製し、得られた精製ＳＡＧＰ100μｇを使って
気相プロテインシークエンサー（アプライドバイオシス
テムズ社製モデル４７０Ａ）によりＮ末端部分のアミノ
酸配列を分析した。
その結果ＳＡＧＰのアミノ酸配列を次のように決定し
た。
た。
Pro（またはThr)-Ala-Glu-Thr-Pro-Ile-Unk-Val-Tyr-Un
k-Unk-Ile-Gly-Lys-Leu-Lys-Lys-Val-Leu-Leu-His-Unk-
Pro-Gly-Lys 上記配列中Ｕｎｋはアミノ酸種が不明であることを示
す。
k-Unk-Ile-Gly-Lys-Leu-Lys-Lys-Val-Leu-Leu-His-Unk-
Pro-Gly-Lys 上記配列中Ｕｎｋはアミノ酸種が不明であることを示
す。
2)プローブ合成 上記アミノ酸配列決定の結果に基づきその一部分のアミ
ノ酸配列をコードする２種の短鎖ＤＮＡ、Ｐ−37および
Ｐ−38を合成した。Ｐ37はアミノ酸配列Pro-Ala-Glu-Th
r-Pro-Ileに対応し、配列はCC(T,A)GC(T,A)CAAAC(A,T)C
C(T,A)AT(A,T)Tで表され、Ｐ−38はアミノ酸配列Ile-Gl
y-Lys-Leu-Lys-Lys-Valに対応し、配列はAT(T,A)GG(T,
C)AAATT(A,G)AAAAAAGTで表される。括弧内は複数のうち
どちらかの塩基であることを示す。多くのアミノ酸につ
いてはそれをコードするＤＮＡ配列は複数個存在するた
め、上記のようにＰ−37は32種の、Ｐ−38は８種のＤＮ
Ａ配列の混合物である。
ノ酸配列をコードする２種の短鎖ＤＮＡ、Ｐ−37および
Ｐ−38を合成した。Ｐ37はアミノ酸配列Pro-Ala-Glu-Th
r-Pro-Ileに対応し、配列はCC(T,A)GC(T,A)CAAAC(A,T)C
C(T,A)AT(A,T)Tで表され、Ｐ−38はアミノ酸配列Ile-Gl
y-Lys-Leu-Lys-Lys-Valに対応し、配列はAT(T,A)GG(T,
C)AAATT(A,G)AAAAAAGTで表される。括弧内は複数のうち
どちらかの塩基であることを示す。多くのアミノ酸につ
いてはそれをコードするＤＮＡ配列は複数個存在するた
め、上記のようにＰ−37は32種の、Ｐ−38は８種のＤＮ
Ａ配列の混合物である。
合成は全自動ＤＮＡ合成機（アプライドバイオシステム
ズ社製モデル380A）を使用して行った。その結果Ｐ−37
を約146μｇ、Ｐ−38を約244μｇ取得した。
ズ社製モデル380A）を使用して行った。その結果Ｐ−37
を約146μｇ、Ｐ−38を約244μｇ取得した。
これらのプローブＤＮＡは後述するハイブリダイゼーシ
ョンに使用する直前に放射性同位元素32Ｐで次のように
標識した。
ョンに使用する直前に放射性同位元素32Ｐで次のように
標識した。
合成プローブ５ｐＭをＴ４−ポリヌクレオチドキナーゼ
および〔γ32Ｐ〕−ＡＴＰ30μCiと共に37℃30分間イン
キュベートした。反応生成物を少量のＤＥ−52に吸着せ
しめ0.1M-NaCl溶液で洗浄して未反応の〔γ32Ｐ〕−Ａ
ＴＰを除いた後ＤＥ−52より1M-NaCl溶液にて32P−標識
プローブを溶出した。
および〔γ32Ｐ〕−ＡＴＰ30μCiと共に37℃30分間イン
キュベートした。反応生成物を少量のＤＥ−52に吸着せ
しめ0.1M-NaCl溶液で洗浄して未反応の〔γ32Ｐ〕−Ａ
ＴＰを除いた後ＤＥ−52より1M-NaCl溶液にて32P−標識
プローブを溶出した。
3)S.pyogenes Su株染色体ＤＮＡの抽出および制限酵素
分解 S.pyogenes Su株（ＡＴＣＣ２１０６０）をＬ培地300ml
にて37℃15時間培養し、遠心分離により菌体を集めた。
この菌体を0.15M NaCl-0.1M EDTA溶液に懸濁し、リゾチ
ーム、プロナーゼおよびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）で処理して溶菌せしめた。該溶菌液より文献記載の
方法(J.Marmur,J.Mol.Biol.,3,208(1961))により染色体
ＤＮＡを抽出、精製した。
分解 S.pyogenes Su株（ＡＴＣＣ２１０６０）をＬ培地300ml
にて37℃15時間培養し、遠心分離により菌体を集めた。
この菌体を0.15M NaCl-0.1M EDTA溶液に懸濁し、リゾチ
ーム、プロナーゼおよびドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）で処理して溶菌せしめた。該溶菌液より文献記載の
方法(J.Marmur,J.Mol.Biol.,3,208(1961))により染色体
ＤＮＡを抽出、精製した。
染色体ＤＮＡ５μｇを制限酵素EcoRIと37℃１時間イン
キュベートして分解し、分解反応生成物を１％アガロー
ス平板ゲルを用いた電気泳動により分画した。このアガ
ロースゲルを0.2M NaOH-0.5MNaCl溶液に浸漬してＤＮＡ
を変性せしめ、次いでトリス−アセテート−ＥＤＴＡ緩
衝液で各10分間３回洗浄した。次にアガロースゲル上の
ＤＮＡを電気泳動によりZeta-Probeフィルター上に移し
た。電気泳動は30Ｖで１晩行った。該フィルターを室温
30分間風乾後80℃３時間加熱処理してＤＮＡを固定し
た。
キュベートして分解し、分解反応生成物を１％アガロー
ス平板ゲルを用いた電気泳動により分画した。このアガ
ロースゲルを0.2M NaOH-0.5MNaCl溶液に浸漬してＤＮＡ
を変性せしめ、次いでトリス−アセテート−ＥＤＴＡ緩
衝液で各10分間３回洗浄した。次にアガロースゲル上の
ＤＮＡを電気泳動によりZeta-Probeフィルター上に移し
た。電気泳動は30Ｖで１晩行った。該フィルターを室温
30分間風乾後80℃３時間加熱処理してＤＮＡを固定し
た。
上記方法によりＤＮＡを固定したZeta-Probeフィルター
を２枚調整しそれぞれを４ｘＳＳＣ(Blin et al.,Nucle
ic Acid Research,3,2303(1976))，５０ｘデンハート(W
ahl etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.,76,3683(1979))、１％
ＳＤＳＡ10μｇ／ml超音波処理サケ精子ＤＮＡ溶液で60
℃３時間プレハイブリタイゼーションを行い、次いで上
記溶液に各々100000cpmの標識Ｐ−37プローブまたは標
識Ｐ−38ブローブを含む溶液で40℃18時間ハイブリダイ
ゼーションした。
を２枚調整しそれぞれを４ｘＳＳＣ(Blin et al.,Nucle
ic Acid Research,3,2303(1976))，５０ｘデンハート(W
ahl etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.,76,3683(1979))、１％
ＳＤＳＡ10μｇ／ml超音波処理サケ精子ＤＮＡ溶液で60
℃３時間プレハイブリタイゼーションを行い、次いで上
記溶液に各々100000cpmの標識Ｐ−37プローブまたは標
識Ｐ−38ブローブを含む溶液で40℃18時間ハイブリダイ
ゼーションした。
４ｘＳＳＣでフィルターを40℃15-30分間づつ４回洗浄
した後風乾し、Ｘ線フィルムに48時間露光した。
した後風乾し、Ｘ線フィルムに48時間露光した。
その結果、いずれのプローブを用いた場合も約２kbp（k
bp：千塩基対）ＤＮＡの大きさに相当する位置にハイブ
リダイズするバンドが認められた。
bp：千塩基対）ＤＮＡの大きさに相当する位置にハイブ
リダイズするバンドが認められた。
4)染色体ＤＮＡ断片のベクターへの組込みと大腸菌の形
質転換 染色体ＤＮＡ50μｇを制限酵素EcoRIと37℃１時間イン
キュベートして分解し、１％アガロースゲルを用いた電
気泳動により分画した。約1.8-2.2kbpの大きさに相当す
る部分のアガロースゲルを切り出し、このゲルからＤＮ
Ａ断片を抽出した。
質転換 染色体ＤＮＡ50μｇを制限酵素EcoRIと37℃１時間イン
キュベートして分解し、１％アガロースゲルを用いた電
気泳動により分画した。約1.8-2.2kbpの大きさに相当す
る部分のアガロースゲルを切り出し、このゲルからＤＮ
Ａ断片を抽出した。
EcoRIで切断したプラスミドベクターｐＵＣ１９（宝酒
造製）と上記染色体ＤＮＡを混合し、Ｔ４−ＤＮＡリガ
ーゼにより17℃一晩反応した。
造製）と上記染色体ＤＮＡを混合し、Ｔ４−ＤＮＡリガ
ーゼにより17℃一晩反応した。
リガーゼ反応生成物により大腸菌(E.coli)JM103株を形
質転換(M.Mandel and A.Higa,J.Mol.Biol.,53,159(197
0))し５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−
Ｄ−ガラクトシド(X-Gal)，イソプロピル−β−Ｄ−チ
オガラクトシド（ＩＰＴＧ）およびアンピシリンを含ん
だＬ−寒天培地にまいた。37℃で一晩培養して出現した
コロニーのうち白色のコロニーを64個拾った。
質転換(M.Mandel and A.Higa,J.Mol.Biol.,53,159(197
0))し５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−
Ｄ−ガラクトシド(X-Gal)，イソプロピル−β−Ｄ−チ
オガラクトシド（ＩＰＴＧ）およびアンピシリンを含ん
だＬ−寒天培地にまいた。37℃で一晩培養して出現した
コロニーのうち白色のコロニーを64個拾った。
5)ＳＡＧＰ遺伝子保持形質転換体の選別取得 前記のごとく取得したE.coli JM 103形質転換体64個を
アンピシリンを含むＬ−寒天培地上においたニトロスル
ロースフィルター上に植菌し37℃で６時間培養した。次
にこのフィルターをアンピシリン、クロラムフェニコー
ルを含むＬ−寒天培地に移し替え37℃一晩培養と継続し
た。
アンピシリンを含むＬ−寒天培地上においたニトロスル
ロースフィルター上に植菌し37℃で６時間培養した。次
にこのフィルターをアンピシリン、クロラムフェニコー
ルを含むＬ−寒天培地に移し替え37℃一晩培養と継続し
た。
培養後フィルターを10％ＳＤＳで５分間、0.5M NaOH-1.
5M NaClで３分間、次いで１Ｍトリス−塩酸緩衝液で５
分間処理してフィルター上の菌を溶菌し、次に80℃で３
時間加熱することによりＤＮＡをフィルター上に固定し
た。
5M NaClで３分間、次いで１Ｍトリス−塩酸緩衝液で５
分間処理してフィルター上の菌を溶菌し、次に80℃で３
時間加熱することによりＤＮＡをフィルター上に固定し
た。
標識Ｐ−38プローブを用いて前記と同様にしてハイブリ
ダイゼーションを行いＸ線フィルムに露光したところ、
64個のうち２個のコロニーがプローブとハイブリダイズ
した。
ダイゼーションを行いＸ線フィルムに露光したところ、
64個のうち２個のコロニーがプローブとハイブリダイズ
した。
6)プラスミドＤＮＡの取得 前記の結果ＳＡＧＰ遺伝子を保持することが示唆された
２種の菌を培養し、文献に記載の方法(T.Maniatis,E.F.
Fritsch,J. Sambrook,Molecular Cloning.p.86,Cold Sp
rint Harbor Laboratory(1982))によりプラスミドＤＮ
Ａを調整した。
２種の菌を培養し、文献に記載の方法(T.Maniatis,E.F.
Fritsch,J. Sambrook,Molecular Cloning.p.86,Cold Sp
rint Harbor Laboratory(1982))によりプラスミドＤＮ
Ａを調整した。
２種の菌から得られたプアスミドＤＮＡは後述する制限
酵素による分析の結果、同一であることが判明し、この
プラスミドをｐＳＰ１と名付けた。
酵素による分析の結果、同一であることが判明し、この
プラスミドをｐＳＰ１と名付けた。
7)ｐＳＰ１の制限酵素地図の作成 前記のごとく取得したプラスミドｐＳＰ１を各種制限酵
素EcoRI,HindIII、PstI,ClaI,NcoI,AvaII、HpaI,HincII、A
haIII、BanI,HaeII、MluIでそれぞれ単独にまたはこれら
のうち複数の制限酵素を組併せて分解し、ＤＮＡ断片の
大きさをアガロースゲルまたはアルリルアミドゲルで分
画して調べることにより制限酵素地図を作成した。
素EcoRI,HindIII、PstI,ClaI,NcoI,AvaII、HpaI,HincII、A
haIII、BanI,HaeII、MluIでそれぞれ単独にまたはこれら
のうち複数の制限酵素を組併せて分解し、ＤＮＡ断片の
大きさをアガロースゲルまたはアルリルアミドゲルで分
画して調べることにより制限酵素地図を作成した。
その結果、ｐＳＰ１はｐＵＣ１９のＥｃｏＲＩ部位に約
2kbpの外来ＤＮＡ断片が挿入され、図−１に示すように
制限酵素認識部位を持つことが判明した。
2kbpの外来ＤＮＡ断片が挿入され、図−１に示すように
制限酵素認識部位を持つことが判明した。
8)ＳＡＧＰ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定 前述の制限酵素地図に基づきｐＳＰ１のうち外来ＤＮＡ
部分をさらに制限酵素により断片化したのち、ｐＵＣ１
９にクローニングし、それぞれを文献記載のジデオキシ
法(G.F.Hong,Biosci.Report,2,907(1982))による塩基配
列決定に用いた。塩基配列決定は宝酒造製のシークエン
シングキットを用いプライマーとしてＭ−４またはＲＶ
（いずれも宝酒造製）を使用して行った。各小断片の塩
基配列を繋ぎ合わせて最終的にＳＡＧＰ遺伝子を含む21
57bpの塩基配列を決定した。
部分をさらに制限酵素により断片化したのち、ｐＵＣ１
９にクローニングし、それぞれを文献記載のジデオキシ
法(G.F.Hong,Biosci.Report,2,907(1982))による塩基配
列決定に用いた。塩基配列決定は宝酒造製のシークエン
シングキットを用いプライマーとしてＭ−４またはＲＶ
（いずれも宝酒造製）を使用して行った。各小断片の塩
基配列を繋ぎ合わせて最終的にＳＡＧＰ遺伝子を含む21
57bpの塩基配列を決定した。
図１は、プラスミドｐＳＰ１の制限酵素地図を表す図で
ある。 図２は（その１〜その３）は、ｐＳＰ１の外来ＤＮＡ断
片の塩基配列およびＳＡＧＰ遺伝子の塩基配列から推定
されるＳＡＧＰのアミノ酸配列を表す図である。図中、
塩基番号４０番目から１２６９番目までの領域がＳＡＧ
Ｐをコードする領域である。ＳＡＧＰのＮ末端のアミノ
酸Thrをコードする配列の前に翻訳開始のMetをコードす
るＡＴＧがある。推定されるＳＡＧＰのアミノ酸数は４
１０個である。
ある。 図２は（その１〜その３）は、ｐＳＰ１の外来ＤＮＡ断
片の塩基配列およびＳＡＧＰ遺伝子の塩基配列から推定
されるＳＡＧＰのアミノ酸配列を表す図である。図中、
塩基番号４０番目から１２６９番目までの領域がＳＡＧ
Ｐをコードする領域である。ＳＡＧＰのＮ末端のアミノ
酸Thrをコードする配列の前に翻訳開始のMetをコードす
るＡＴＧがある。推定されるＳＡＧＰのアミノ酸数は４
１０個である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (7)
- 【請求項１】溶血性連鎖球菌(streptococcus pyogenes)
により産生される下記のアミノ酸配列 で示される抗腫瘍または抗癌蛋白質をコードするＤＮＡ
または該ＤＮＡを含むＤＮＡ。 - 【請求項２】該抗腫瘍または抗癌蛋白質をコードするＤ
ＮＡが下記の塩基配列 で示される特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。 - 【請求項３】下記の塩基配列 を有する特許請求の範囲第１項または第２項記載のＤＮ
Ａ。 - 【請求項４】複製可能である特許請求の範囲第１〜３項
のいずれかに記載のＤＮＡ。 - 【請求項５】プラスミドｐＳＰ１である特許請求の範囲
第４項記載のＤＮＡ。 - 【請求項６】溶血性連鎖球菌(streptococcus pyogenes)
により産生される下記のアミノ酸配列 で示される抗腫瘍または抗癌蛋白質をコードするＤＮＡ
を含む複製可能なＤＮＡを保持する大腸菌。 - 【請求項７】大腸菌(Escherichia coli)ＪＭ１０３（ｐ
ＳＰ１）である特許請求の範囲第６項記載の大腸菌。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60298014A JPH0657153B2 (ja) | 1985-12-28 | 1985-12-28 | 抗腫瘍または抗癌蛋白質の遺伝子 |
| DE8686310075T DE3678702D1 (de) | 1985-12-28 | 1986-12-23 | Antitumorprotein-gen von streptococcus pyogenes su, plasmide, die das gen enthalten, transformantenzellen, die die plasmide beherbergen, und verfahren zur herstellung des antitumorproteins. |
| EP86310075A EP0230777B1 (en) | 1985-12-28 | 1986-12-23 | Antitumor protein gene of streptococcus pyogenes su, plasmids containing the gene, transformant cells harboring the plasmids, and process for producing the antitumor protein |
| US06/946,025 US4929547A (en) | 1985-12-28 | 1986-12-24 | Antitumor protein gene of streptococcus pyogenes Su, plasmids containing the gene, transformant cells harboring the plasmids, and process for producing the antitumor protein |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60298014A JPH0657153B2 (ja) | 1985-12-28 | 1985-12-28 | 抗腫瘍または抗癌蛋白質の遺伝子 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62158486A JPS62158486A (ja) | 1987-07-14 |
| JPH0657153B2 true JPH0657153B2 (ja) | 1994-08-03 |
Family
ID=17854002
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60298014A Expired - Lifetime JPH0657153B2 (ja) | 1985-12-28 | 1985-12-28 | 抗腫瘍または抗癌蛋白質の遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0657153B2 (ja) |
-
1985
- 1985-12-28 JP JP60298014A patent/JPH0657153B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS62158486A (ja) | 1987-07-14 |
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