JPS58501406A - エシエリヒア・コリ−における蛋白合成発現の高揚 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 エシェリヒア・コリー（ＥＳＱｈｅｒｉｈｉａ　Ｃｏ１１）における■白合成発 現の高揚 背　景 本発明は、一般には遺伝子工学に関連するものであり、特に、組換えＤＮＡ手法 を、選択された゛単細胞生物における蛋白合成の発現を確実にするために用いる ことに関連している。

長年にわたり、微生物は、抗生物質、酵素および他の生物学的に活性な蛋白、ア ルコールおよび類似のもののような商業的に有意な産物の源を供給して埋で）株 による。そのような商業的産物の細胞内および細胞外の収率な高めることを目標 とする集中的な研究努力の対象であった。発酵ならびに産物の収積過程の変数の 操作は、しばしば選ばれた株による産物の収率を劇的に増大させることがあり得 るが、培養あるいは単離条件をどのように修飾しても、産物の収率の増大によっ て証明されるような特定産物の生物による“発現０を高揚させる結果とならない のが通例である。

最近の遺伝子操作の焦点は、組換えＤＮＡの方法論を、遺伝子物質の精製ならび に増幅に用いることであった。コーヘン（Ｃｏｈｅｎ）等に対する米国レタース 特許第４．２３７．２２４号は、例えば、原核単細胞宿主生物の、外米性ＤＮＡ 配列を含む“雑種０ビールスまたは環状プラスミドＤＮＡによる形質転換に関す るものである。コーヘン（Ｃｏｈｅｎ）等の特許の手法は、第１にビールスまた は環状プラスミドＤＮＡが、直鎖状ＤＮＡ鎖を形成するように酵素的に開裂する ことにより、形質転換用ベクターを調製することを含む。選ばれた異種Ｄ　’Ｎ 　Ａ鎖も同様の酵素の利用により直鎖状に調製される。直鎖のビールスあるいは プラスミドＤＮＡは、異種ＤＮＡと復元過程をたどらせ得る結合酵素の存在下で 荷置されると、ビールスまたは環状ＤＮＡプラスミド中に“組み継がれた“選ば れた異種ＤＮＡ断片を含む“雑種“が形成される。共存を許す宿主単細胞生物を 雑種ベクターで形質転換し、形質転換細胞を増殖させると、宿主細胞集団内に多 数コピーの異種ＤＮＡが形成されることになる。少数例では、望まれる結果は、 単に異種ＤＮＡの増幅であり、収穫される“産物“はＤＮＡである。より多くの 場合、形質転換の目標は、例えば、異種ＤＮＡにコードされる商業的に有意な蛋 白およびポリペプチド断片の単離可能量の大規模合成という形になるよう、宿主 細胞に異種ＤＮＡを発現させることである。

コーヘン（Ｃｏｈｅｎ）等により述べられたような手法の成功は大部分、非雑種 ＤＮＡベクターおよび例えば、興味のもたれる異種配列を含む真核細胞ＤＮＡ鎖 の双方の部位特異的な開裂を容易にする制限エンドタクダアーゼ酵素が容易に入 手し得たことによって（・る。直鎖ＤＮＡ鎖上に相補的な“末端“の形成をもた らすような開裂は、結合酵素処理によって形成される再構成ベクター中に異種Ｄ ＮＡが機能的に取込まれる可能性を非常に増大された。雑種形成の確認は、例え ば、分子量を基準として、雑種プラスミドを非雑種から区別し得るようなりロマ トグラフ技法により容易に行なわれる。他の有用な確認技法は、放射性ＤＮＡ雑 種形成を含む。

原核細胞の形質転換における成功に大きく寄与したもう一つの操作“道具“は、 選択可能な“標識“遺伝子配列の利用である。簡単に述べると、望みの異種ＤＮ Ａに加えて、形質転換宿主細胞の非形質転換細胞からの区別を可能とする表現形 質の発現をコードする。工ないし、それ以上のＤＮＡ配列を含む雑種ベクターが 用℃・られる。典型的な標識遺伝子配列は、形質転換した原核細胞が、非形質転 換細胞を殺すか、その生育を強く阻害する、金属、抗生物質および類似の成分を 含む培地中で生残り、増殖することを許すようなものである。

外米の原核細胞または真核細胞遺伝子を取り込むように雑種化された。ｐＢＲ３ ２２のような普及した環状ＤＮＡプラスミドで、エシェリヒア・１（Ｅｓｃｈｅ ｒｉｃｈｉａ　Ｃｏ１１）大腸菌のような宿主微生物を形質転換した成功例に関 する報文は数多し・。比較的多量の異種遺伝子にコードされる蛋白産物が、しば しば形質転換細胞あるし・は、その細胞が増殖した培地から単離され得る。

どちらかといえば予想されることであるが、標準の宿主／ベクタ一方法論を用い ての、異種遺伝子の指図する蛋白合成の望ましい発現を確かにする試みにおける 多くの非成功例について、文献は詳細をほとんど伝えない。少数例では、形質転 換の“失敗“は、単に不完全雑種から結果するものであるが、“非成功“ベクタ ーが、ほかの面では望みの蛋白産物の合成を指図するのに必要な異種遺伝子配列 の全域を含んでいると確認されている場合もそれに劣らず多いのである。同様に 、少数例における不成功は、宿主とベクターとの間にある、−膜化された共存不 能に帰国し得る。しかしながら、多くの列では、安定なベクターの取り込み（広 範な複製および標識遺伝子の表現型の発現を伴う）が行なわれるが、しかし、望 みの蛋白合成の発現は起らない。

異種ＤＮＡ配列によりコードされる蛋白の発現が宿主微生物で失敗することは、 外来ＤＮＡが微生物の染色体中に直接取り込まれた場合を含む組換えＤＮＡ方法 論においても問題であろう。クロマトグラフおよび放射能によるＤＮＡ雑種形成 による検討で、全遺伝子（必要なプロモーターおよび導入配列を含む）の宿主へ の取り込みが確認されていても、その遺伝子によりコードされる蛋白の対応した 発現がないかもしれない。

外来遺伝子に指図された蛋白を、望みの収率でもたらす完全に機能する筈の形質 転換系がうま（ゆかないことを説明するために出された仮説の中には：上で示さ れたように、従って、この分野に於て、天然に存在するもの、および変異微生物 での内在遺伝子に指図される蛋白合成発現を、そして同様に、組換えＤＮＡの方 法論により、外米のＤＮＡで形質転換を受けた微生物における外米遺伝子に指図 される蛋白合成の発現を、高揚するのに役立つ方法および材料て対する一般的な 要求が存在するのである。

（Ｅｓｃｈｅ　ｒｉｃｈｉａ　ｃｏ±員細胞による内在および外来の遺伝子に指 図される蛋白合成の発現が、ｃａｐ　Ｒ（Ｉｏｎ）遺伝子の優性ムコイド変異対 立遺伝子、好ましくはｃａｐＲ９対立遺伝子を１な（・し、多数コピー取り込む ように細胞を形質転換することにより高揚する。

変異ｃａｐＲ９対立遺伝子は、ＤＮＡプラスミド、ｐＢＺ２０１Ｍ９（Ａ、　Ｔ 、　Ｃ，Ｃ，プラスミド述４００４１　）の成分として、一般に入手可能であり 、このプラスミドは、本発明に従うイー・コリー（旦・二ｏｌｉ　）細胞の形質 転逸ヲするのに現在のところ、より好ましいビークルとなる。

本発明の一面においては、天然に存在するあるいは変異をもつイー・コリー（Ｅ −ｃｏｌｉ　）プラスミドにより、細胞を単純に形質転換することにより高揚す る。同じ方法が、蛋白合成を指図する外米の遺伝子が、染色体中に安定に取り込 まれている工：・−＝−リー（Ｅ−ｃｏｌｉ　）菌株における蛋白合成の発現の 高揚にも用い得る。

本発明の他の一面によれば、興味の対象である蛋白をコードする選ばれた外米Ｄ ＮＡ配列を含む第１のベクターで形質転換されたイー・コリー（Ｅ−ｃｏｌ　ｉ ）菌株が、それに加えてＡ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，プラスミド近４００４１のような ｃａｐＲ９対立遺伝子を供給するプラスミドにより形質転換される。さらに、ｃ ａｐＲ９対立遺伝子は、選ばれた外米ＤＮＡ配列と同じ雑種ベクター上に取り込 まれてもよい。そして、両遺伝子（恐ら（は同一プロモーターの支配下にある） は、単一の指標遺伝子を検査することによる形質転換の確認を通じて乙二・コリ ー吐・工旦工）宿主中に同時に導入され得る。

本発明の他の側面ならびに利点は、以下の詳細な説明により明らかになろう。

詳細な説明 本文においては、述語“蛋白“は全機能蛋白のみでなく、ポリペプチドも含むも のとする。蛋白合成における“発現の高揚“は系から単離し得る選択された蛋白 の総量を増大せしめることと定義し、その増大が、系における細胞により合成さ れる蛋白の量の増大によるものでも、その系から収穫可能の形のまま保存されて ℃・る蛋白量の増大によるものでもよい。本文においては、述語“遺伝的に形質 転換すること”とは、乙：・コリー悟・ｃｏｌｔ　）中に選択されたＤＮＡ配列 の安定な取り込みを行なわせることを意味し、それは、染色体中への挿入によっ ても、選択された配列を含むベクターの取り込みによってもよい。

本発明の起源は、部分的に、共同発明者であるマーコヴイツツ（Ｍａｒｋｏ　ｖ ｉｔｚ）およびその共同研究者に２３９頁１９６４年および５４巻１０８４頁１ ９６５年参照。簡単に述べると、この研究は、莢膜多糖および莢膜多糖合成に含 まれる酵素の合成を支配するＡ：・コリー但・ｃｏｌｉ　）　Ｋ　−１２株の制 御遺伝子″ｃａｐＲ“（文献中では“Ｉｏｎ”遺伝子ともされて℃・る）の変異 株を扱ったものである。

ｃａｐＲ遺伝子の成る種の優性変異型を含む細胞は、最小培地で生育した際、明 瞭な“ムコイド“表現型を示すことが注目された。ムコイドの外観は、グルコー ス、ガラクトース、フコース、グルクロン酸。

酢酸およびピルビン酸からなろ莢膜多糖の過剰生産からなることが決定された。

スザーランド（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ）　、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　１１５ 巻９３５−９４５頁１９６９年参照）。ｃａｐ　Ｒ変異株で観察される莢膜多糖 の過剰生産は、多糖莢膜の生産に関与する少なくとも４種の空間的に離れている オペロンに存在する１０種の酵素の抑制解除に帰因するとされている。マーコヴ イツツ［（Ｍａｒｋｏｖｉｔｚ）　５ｕｒｆｉｃｅ〜４６２頁スザーランド（Ｓ ｕｔｈｅｒｌａｎｄ）編ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ　、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　 １９７７年参照〕ｃａｐ　Ｒ変異株の他の表現型は、以下のものを含む゛溶原性 ファージの溶原化不能〔タカノ（Ｔａｋａｎｏ）　＋Ｐ、　Ｎ、　Ａ、　Ｓ、　 ６８巻１４６９〜１９７３頁１９７１年〕；放射線に対する感受性増大〔ホワー ドーフランダーＪ　、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　８７巻７２０〜７２６頁１９６ ４乍）；異常細胞分裂（Ｗａ　］　ｋｅ　ｒ　ほかＭｄ、　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅ ｔ、　１０８巻２４９〜２５７頁１９７０年およびゲイダ（Ｇａｙｄａ）ほかＪ 、Ｂａｃｔｅｒｉａ　１２７巻１２０８〜１２１６頁。

１９７６年）および、ある種の正常〔ゲイダ（ｃａｙａａ）−往ノ１、Ｍｏ１． 　Ｇｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１７５巻、３２５〜３３２頁、１９７９年〕および 異常蛋白〔ブカリ（Ｂａｋｈａｒｉ）ほかＮａｔｕｒｅ　Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌ　（ Ｌｏｎｄｏｎ）２４３巻、２３８〜２４１頁、１９７３年およびシャインバーブ （Ｓｈｉｎｅｂｅｒｇ）ほかＪ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１１６巻１４６９〜１ ４７１頁、１９７３年〕、同様にラムダ−ビールス蛋白〔ゴツテスマン（Ｇｏｔ ｔｅｓｍａｎ）はが、Ｃｅ　］　Ｉ　＋２４巻、２２５〜２３３頁、’１９８１ 年〕の分解の減少。

ムコイド表現型の研究により、莢膜多糖の過剰生産は、ｇａｌＥＴＫオペロンの 抑制解除を含み、ムコイド表現型そハ自体は、他のｃａｐ　Ｒ変異表現型の原因 とはならないことが示された。例えば、ｃａｐ　Ｒ変異株の旦すニ誘導株では、 残りのｃａｐ　Ｒ変異表現型を引続き示す非ムコイド集落となる。〔マーコヴイ ツツ（Ｍａｒｋｏｖｉｔｚ）　１９７７年、前出、およびゴツテスマン（Ｇｏｔ ｔｅｓｍａｎ）ほかＪ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１３３巻、８４４〜８５１頁、 １９７８年参照〕 ｃａｐ　Ｒ遺伝子のある特定の優性ムコイド対立遺伝子、ｃａｐＲ９と呼ばれる 、は本発明にとって特に有意義である。半数体の状態では、ｃａｐ　Ｒ９株は全 ての標準的表現型（ムコイド外観、放射性感受性ほか）を示す。しかし、ｃａｐ 　Ｒ９対立遺伝子がプラスミド上に、ｃａｐ　Ｒ＋対立遺伝子が染色体上にある 部分２倍体における研究では、変異株（ムコイド）表現体は、野生型（非ムコイ ド）表現型に対し、優性であった。ｃａｐ　Ｒ対立遺伝子（文献中ではＣ−９と されている）ならびに、他の優性変異ムコイド対立遺伝子（Ｃ−６２およびＣ− ６６とされている）に関する討論は、マーコヴイツツ（Ｍａｒｋｏｖｉｔｚ）ほ か、Ｐ、　Ｎ、　Ａ、　Ｓ、　４．５巻１０８４〜１０９１頁１９６５年参照。

この変異株−表現型の優性は、ｃａｐ　Ｒ十遺伝子がプラスミド上に、そしてｃ ａｐ　Ｒ９変異が染色体（１１） 上にあるときは逆転する。これらの変異は、ｃａｐ　Ｒ（Ｊａｎ）遺伝子産物が 、同一の豆粒子からなるオリゴマーとして機能することを示唆するものと解釈さ れている。この仮説によれば、ｃａｐ　Ｒ９遺伝子は、欠陥亜粒子をコードする ことになろ’）ｏ　ｃａｐＲ９が多コピー状（Ｆ　／プラスミドにつ（・ては多 分２〜３倍）に存在すると、欠陥亜粒子が、オリゴマー中で支配的となり、変異 表現型が発現されよう。この状態は、野性型が多コピーになると逆転するであろ う。ｃａｐＲ９対立遺伝子は、その表現型がオーカー（ナンセンス）サプレッサ ーにより部分的に復帰することから、短縮したポリペプチド産物をコードすると 信じられている。〔マーコヴイツツ（Ｍａｒｋｏｖｉｔｚ）　＆ｈ　ＩＪ’、二 Ｂａｃｔｅｒｉｏ１．９４巻３３８〜３９５頁１９６７年およびマーコヴイツツ （Ｍａｒｋｏｖｉｔｚ）　１９７７年前出］請求の範囲に記載のイー・コリー（ Ｅ、ｃｏｌｉ　）はイー・コリー（Ｅ、ｃｏｌｉ　）の如何なる菌株であること もできる。好適には乙：・コリー（旦、姐１ｉ）Ｋ−１２である。特に下記のも のが好適である二イー−コリー（Ｅ　、　ｃｏｌｉ）Ｋ−１２ＡＴＣＣｅ　１２ ４３５ＡＴＣＣｅ１４９４８ ＡＴＣＣｅ２５２５２ ＡＴＣＣｅ２５２５７ ＡＴＣＣ２７０２０ イー・コリー（Ｅ、　ｃｏｌｉ）Ｋ−１２ＡＴＣＣ２７１６１ＡＴＣＣ２７３２ ５ 実施例１ 内在遺伝子に指図される蛋白合成の発現の高揚に至る本発明の方法の実施例は、 共同発明者であるツ工−ンバウアー（Ｚｅｈｎｂａｕｅｒ）およびマーコヴイッ ッ（Ｍａｒｋｏｖｉｔｚ）の、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１４３巻８５２〜８６ ３頁（１９８０年８月２７日発行）に掲載された報文中に認められる。

簡単に要約すると、その中で述べられている方法は、紫外線照射によるＤＮＡの 損傷に対し、修復不能ヲ示す乙二・コリー恒、二江）Ｃ３Ｒ６０３株の使用を含 んで（・た。その細胞が、ＤＮＡ損傷における小さな標的を代表するプラスミド により形質転換され、その後に紫外線照射を受けると、その細胞は一般的Ｋ、プ ラスミドによりコードされる蛋白の発現は可能であるが、染色体によるものは発 現しな（・。

試験用の細胞が野性型ｃａｐ　Ｒ遺伝子を含むプラスミドｐＢＺ２０１およびｃ ａｐ　Ｒ９変意を含むｐＢ２２０１Ｍ９の両方で形質転換された。用いられた形 質転換法はアヴ二（Ａｖｎｉ）ほか、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　１２９巻、３５ ８〜３６６頁１９７７年に述べられたものである。（ＤＮＡプラスミドｐＢ２２ ０１Ｍ９は、出願人によりＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｆｕｒｅ　Ｃｏ １１ｅｃｔｉｏｎ　＋１　２　３　０　１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ　、 Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　。

Ｍａｒｙｌａｎｄ　２．　Ｏ８５２に寄託されており、プラスミドは、Ａ、　Ｔ 、　Ｃ，Ｃ，プラスミドｌ’４４００４１と指定されて℃・る）。プラスミドｐ ＢＺ２０１で形質転換した細胞およびプラスミドｐＢ２２０１Ｍ９で形質転換し た細胞とともに、非形質転換（対照）Ｃ８Ｒ６０３細胞を全て紫外線照射した。

Ｕ、　Ｖ、処理細胞を含む培養液に、放射性標識した３５Ｓ−メチオニンを添加 し、細胞から収穫した蛋白は、その後電気泳動解析にかけられた。

対照のＣ３Ｒ６０３細胞は、標識蛋白を示さなかった。野性型プラスミドで形質 転換した細胞は、二種の明瞭な蛋白を示し、その中の一つは、そのプラスミドに コードされた野性型ｃａｐ　Ｒ遺伝子に特徴的なものであった。ｃａｐ　Ｒ９プ ラスミドで形質転換したＣ３Ｒ６０３細胞は、ｃａｐ　Ｒ９遺伝子に特徴的な標 識された蛋白だけでなく、対照のＣ３Ｒ６０３あるいは、ｐＢＺ２０１プラスミ ドで形質転換した細胞中には存在しない多数の未同定蛋白をも示した。

実施例２ 外米遺伝子の高揚した発現を行なわせた本発明の実施例は、発明者との共同で、 シカゴ大学生化学部のドナルド　エフ、スタイナ＝（Ｄｏｎａｌｄ　Ｆ、　５ｔ ｅｉｎｅｒ）およびシュ　ジン　チャン（Ｓｈｕ　Ｊｉｎ　Ｃｈａｎ　）により （１４） なされた研究の以下の記述により与えられる。

＋ ｒ　Ｋ　ｍ　Ｋ　誘導体）を常法によりプラスミドＰＥＸ２を含むように形質転 換した。プラスミドＰＥＸ２は、ラット、プロインシュリン遺伝子を含むプラス ミドｐＲｒ−１１より誘導される〔チャン（ＣｈａｎＭｔ　上、Ｐ、　Ｎ、　Ａ 、、　３．７６巻５０３６〜５０４０頁１９７９年〕プラスミドＰＥＸ２は、ラ ットプロインシュリン伝令ＲＮＡおよび蛋白の合成の発現が起るようにｐＲＩ」 １１の適当な位置に挿入されたｌａｃプロモーターＤＮＡを含むように操作され たものである。ラットプロインシュリン産物に対するラジオイムノアッセイ〔ル ーヘンシュタイン（Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ）はが、Ｄｉａｂｅｔｅｓ１９巻５４ ６〜５５３頁１９７０年〕法は、培養液１ノ中にわずか０５ナノグラムの存在を 検出し得るにも拘らず、形質転換培養細胞には、プロインシュリン産物が検出さ れなかった。

その°“うまくゆかなかった“形質転換細胞は、その後さらにｃａｐ　Ｒ９プラ スミド、ｐＢＺ２０１’Ｍ９（Ａ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，プラスミドＭ４００４１） で形質転換された。ｃａｐ　Ｒ９対立遺伝子で形質転換された細胞の産物は、」 二連のようにラジオイムノアッセイにかけられ、１ノあたり約６０ナノグラムの プロインシ（１５） ニリンの存在が明らかにされた。これは、細胞あたり約１００分子に相当てる。

上記二つの実施例の最初のものは、プラスミドｐ　Ｂ　２２０１　Ｍ　９　（Ａ 、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，Ｎｌ　４．　ＯＯ４１）を取り込む形質転換により大腸菌株 における内在遺伝子に支配される蛋白合成の発現の高揚を目的とする本発明の方 法が実行可能であることを示しているのであるが、どのようなりＮＡプラスミド 、ある℃・は、同様なりＮＡベクター（例えば、細胞形質転換の関連ではしばし ばプラスミドＤＮＡとなされて℃・るバクテリオファージＤＮＡ）も、ｃａｐ　 Ｒ９遺伝子あるいはｃａｐ　Ｒの他の優性ムコイブ変異対立遺伝子を取り込むよ うに適当につくられること、そして、そのようにしてつくられた雑種が、本発明 の実際に用℃・られ得るのは明らがであろう。形質転換細胞中で、ｐＢＺ２０１ より、より多し・、あるいはより少ないコピーを与えるようなプラスミドも使用 されよう。

同様に、ｃａｐ　Ｒ９のような莢膜多糖、ｃａｐ　Ｒ１遺伝子の優性ムコイド変 異がイー・コリー（Ｅ　、　ｃｏｌｉ）における外米遺伝子による蛋白合成発現 の高揚に用いられる際には、外米遺伝子を取り込んだプラスミドによる第１の形 質転換および、ｃａｐ　Ｒ遺伝子を取り込んだベクターによる駆２の形質転換を 行なう笑（１６） 施例２について多くの代替方法が存在する。変異遺伝子は直接染色体中に取り込 まれ得る。選択された外来遺伝子とｃａｐ　Ｒ９遺伝子の両方による（二・ユリ −（Ｅ、ｃｏｌｉ）宿主の同時形質転換は、両遺伝子を取り込んでいる単一の雑 種ベクターを用いろことによりなされた。例えば、ＤＮＡプラスミドｐＢ２２０ １　Ｍ９それ自体も興味の対象となる蛋白ビコードする選ばれた外来遺伝子を取 り込むように、さらに雑種化され得る。

上記の例は共に、蛋白のイー・コリー（Ｅ　、　ｃｏｌｉ）細胞からの直接単離 に関連したものであるが、形質転換したイー・コリー（Ｅ、ｃｏｌｉ）細胞の増 殖した培養液から興味の対象である蛋白産物を収穫することも企図されている。

同様に、二つの例は、＜二・ユリ−（Ｅ、　ｃａｄｉ）　Ｋ　−１２株を用いて （・るが、本発明は、他の株にも等しく応用し得る。

例えば、ｃａｐ　Ｒ９遺伝子の、内在および外来遺伝子より指図される蛋白合成 の発現高揚における機能様式の詳細は、現在完全には説明されていない。従って 、以下に述べられる機能に対して提示しである理論は、本発明に限界を与えるよ う意図されて（・ない。

本発明の一つの理論に従うと、優性ムコイド変異遺伝子によってコードされた蛋 白は、宿主中の核酸特表昭５８−５０１４（ＩＧ（６） （特に伝令ＲＮＡ　）に結合し、分解を阻止することによって安定化する機能を もつ。その結果、蛋白の形成を高揚することにより発現の高揚をもたらす。

この理論は上述の実施例１で得られた結果を合理的に説明する。より詳細にいえ ば、照射を受けた試験細胞中で、有意な量の未同定標識蛋白が出現したことは、 照射（そして染色体の不活性化）以前に形成されたｍ　ＲＮＡへのｃａｐ　Ｒ蛋 白の結合によったものであり得る。そのように安定化され分解から保護されたｒ ｒ＋ＲＮＡは、標識メチオニンを取込む蛋白の合成に翻訳可能な鋳型として作動 することが出来る。

本発明の機能に関する代替理論は、変異対立遺伝子によってコードされる蛋白が 、野性型ｃａｐ　Ｒ蛋白のもつ、細胞内で“異物“と認められるような宿主によ って合成された蛋白を分解する活性を減少させる能力に、その基盤を有する。こ の理論は、実施例２で得られた著るしい結果に対する説明を与える。

野性型ｃａｐ　Ｒ遺伝子によりコードされる蛋白の活性に関する徹底的な分析の 過程で、遺伝子産物の活性が、ＡＴＰ−加水分解−依存性プロテアーゼ活性（」 ユ、カゼインの存在下で示された）および、ＤＮＡにより促進される第二のＡＴ Ｐアーゼ活性を（１８） ４６〜５６頁１９８１年およびツエンハウエル（Ｚｅｈｎｂａｕｅｒ）ほかＰ、 　Ｎ、　Ａ、　Ｓ、　７８巻、２０４３〜２０４７頁１９８１住参照。しがしな がら、ｃａｐＲ９の遺伝子産物は、ＡＴＰ−依存プロテアーゼ活性を示さず、カ ゼイン存在下で失際上ＡＴＰアーゼ活性がなく、そして、ＤＮＡ−依存ＡＴＰア ーゼ活性は大幅に減ってし・た。ｃａｐ　Ｒとｃａｐ　Ｒ９蛋白の両方の混合物 を用（・た試験管内の実験では、野性型蛋白のプロテアーゼ活性の有意な減少が 示された。生体内で、変異蛋白が野性型蛋白と結合（そして活性を抑制）するに せよ、不活性と推定される変異蛋白が、単に野性株蛋白より、より効果的に結合 部位に対し競合するにせよ、全体の結果は、野性型ｃａｐ　Ｒ遺伝子のプロテア ーゼ産物による分解が減少するという形である種の蛋白の発現が高揚したように 見える。

このようにして、変異遺伝子の存在および、その産物が転写あるし・は翻訳段階 で作動する結果として蛋白合成を定量的に高揚させるにせよ、あるいは、合成さ れた蛋白の酵素的な分解を遮断する保護作用によるにせよ、全体の結果では、内 在および外米の遺伝子により指図される蛋白合成の単離可能な生産物の総量がよ り多いという意味にお℃・て、蛋白合成の発現が高揚したことになる。

本発明は、イー・コリー（Ｅ　、　ｅｏｌ　ｉ）　信王細胞中での、外米遺伝子 によってコードされる蛋白の生産を確実にするための前述の方法に加えて、改良 法をも含んでいる。この改良法は、莢膜多糖ｃａｐ　Ｒ（Ｉｏｎ）遺の優性ムコ イド変異対立遺伝子（特にｃａｐ　Ｒ９対立遺伝子）をもつ乙：・コリー（Ｊ　 、　ｉ！１ＬＬＬ）細胞の使用を含む方法がより好ましいが、劣性変異をも含む 他のｃａｐ　Ｒ変異をもった細胞を使用するものも含まれる。この改良方法論の 実施例は、特にｃａｐ　Ｒ（Ｉｏｎ）遺伝子中に劣性と推定される。染色体変異 が有るかドナルド　エフ・スタイナー（Ｄｏｎａｌｄ　Ｆ、　５ｔｅｉｎｅｒ） とシュ　ジン　チャン（Ｓｈｕ　Ｊｉｎ　Ｃｈａｎ　）が行った業績の以下の記 述により与えられる。

実施例３ 平行した実験は、ラットプロインシュリン遺伝子を含むＰＥＸ２プラスミドを形 質転換ベクターとして用いる実施例２に従って行なわれた。第１の実験旦懲、匣 、　ｐｔｒ−３）であった。−ＬすにＡ変異は、ｃａｐ　Ｒ遺伝子以外のプロテ アーゼを指図する遺伝子（２０） の変異である〔チェング（Ｃｈｅｎｇ）旦食、Ｊ　、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｎ１４ ０巻、１２５〜１３０頁１９７９年〕。第２の実験の宿主株は（二・コリー但、 μ辻囮に−１２゜８４４〜８５１頁、１９８１年参照〕であった。ラットプロイ ンシュリンに対するラジオイムノアッセイは、実施例２で述べた方法によって行 なわれた。

第】の実験の宿主細胞中にはプロインシュリン生産は認められなかった。ラット プロインシュリンは、宿主株がｃａｐ　Ｒ（Ｉｏｎ）遺伝子中に変異を含んで℃ ・る第２の実験の宿主細胞中に認められた。

本分野に習熟した人々は、上述の発明の実際において、多数の修飾ならびに変法 を思いつくことが期待される。従って、添付の請求の範囲中に示しであるような 制限のみを、その北につけるべきである。

Ｈ表明５８−５（１１４０Ｇ　（７）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　外米性遺伝子を取込んだエシェリヒア・ニュー　（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ 　ｃｏｌｉ）内での外米遺伝子に指図される蛋白合成の発現を高揚させる方法に おいて、細胞が莢膜多糖、ｃａｐ　Ｒ１遺伝子の優性ムコイド変異対立遺伝子を 取り込むように遺伝的に形質転換する段階からなることを特徴とする前記方法。 ２、　当該優性ムコイド変異対立遺伝子が、ｃ　ａ　ｐＲ９対立遺伝子である特 許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３　当該の形質転換の段階が、ＤＮＡプラスミドｐ　Ｂ　Ｚ　２０１　Ｍ　９　 （Ａ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，プラスミド％４００４１）による形質転換を含む請求の 範囲第１項に記載の方法。 ４、　エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉつ内にお（・ て、選択された外米遺伝子によりコードされる蛋白を生産する方法にお℃・で、 ａ）当該外米遺伝子を取り込むように細胞を遺伝的に形質転換する。 ｂ）莢膜多糖、　ｃａｐ　Ｒ＋遺伝子の優性変異対立遺伝子を取込むように細胞 を遺伝的に形質転換する。 ｃ）（ａ）および（ｂ）の段階に従って形質転換した細（２２） 胞を増殖させる。そして、 ｄ）当該外米遺伝子によりコードされ、（Ｃ）の段階に従って増殖した細胞によ り生産される蛋白を単離する ことからなることを特徴とする改良方法。 ５　当該優性ムコイド変異対立遺伝子が、ｃａｐＲ９対立遺伝子である請求の範 囲第４項の改良方法。 ６、（ｂ）の段階が、ＤＮＡプラスミドｐＢＺ２０１Ｍ　９　（Ａ、　Ｔ、　Ｃ ，Ｃ，プラスミドＮＱ４００４］、）を用いて実施される請求の範囲第４項の改 良方法。 ７、（ａｌおよび（ｂ）の段階が、選択された外米遺伝子および、当該優性ムコ イド変異対立遺伝子の両方を含む単一の形質転換ベクターを用℃・て実施される 請求の範囲第４項の改良方法。 ８、当該優性ムコイド変異対立遺伝子が、ｃａｐＲ９対立遺伝子である請求の範 囲第７項における改良方法。 ９　当該単一形質転換ベクターが、当該の選択される外米遺伝子を含むように雑 種化されたＤＮＡプラスミドｐ　Ｂ　２２０１　Ｍ　９　（Ａ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ ，プラスミドｌ’＆４００４１）である請求の範囲第７項の改良方法。 １０　請求の範囲第４項の改良された方法による工より合成され単離された蛋白 生成物。 １１．　エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　匡山内での、内在遺 伝子に指図される蛋白合成の発現を高揚させる方法にお（・て、細胞が莢膜多糖 。 ｃａｐ　Ｒ、遺伝子の優性ムコイド変異対立遺伝子を含むプラスミドを取込むよ うに遺伝的に形質転換する段階からなることを特徴とする前記方法。 １２　当該の優性ムコイド変異対立遺伝子が、ｃａｐ　Ｒ９対立遺伝子である請 求の範囲第１１項に記載の方法。 １３、当該の形質転換の段階が、ＤＮＡプラスミドｐ　Ｂ　Ｚ　２０１　Ｍ　９ 　（Ａ、　Ｔ、　Ｃ，Ｃ，プラスミド陥４００４１）による形質転換からなる請 求の範囲第１１項に記載の方法。