JPH0272881A

JPH0272881A - クラミドモナス　ラインハーティを形質転換する方法およびシステム

Info

Publication number: JPH0272881A
Application number: JP1113528A
Authority: JP
Inventors: Stephen P Mayfield; スティーヴン　ピー　メイフィールド
Original assignee: Scripps Clinic and Research Foundation
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1988-05-05
Filing date: 1989-05-02
Publication date: 1990-03-13
Also published as: EP0342824A1; AU3399789A; DK217089A; PT90482A; DK217089D0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は真核緑藻、クラミドモナス　ラインバーティ（
Ｃｈｌａｍ　ｄｏｍｏｎａｓ　ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ
　　；以下堕ラインバーティという）を高い効率で形質
転換し得る核酸分子に関する。より詳しくいえば、本発
明はコドンの第３ヌクレオヂド塩基位置にアデニンをも
つコドンを本質的に含なまい選択標識遺伝子を含有する
核酸分子を目的とする。また、この核酸分子をＣ，ライ
ンバーティ形質転換体の製造に用いる方法並びに該核酸
分子を含むＣ，ラインバーティ形質転換体をも意図する
。

（従来の技術）モデル光合成生物における形質転換システムの開発は、
組換えＤＮＡ技術によるポリペプチドの製造用の極めて
有用な道具となろう。多大な努力が単細胞緑藻Ｃ，ライ
ンバーティにおける形質転換システムの開発に投入され
ている。しかし、これまではＣ，ラインバーティを形質
転換する努力はバクテリアまたは酵母の選択標識遺伝子
の利用に主眼がおかれ、かつ低効率および低い再現性の
ためにこれら努力は無にされていた。

Ｃ，ラインバーティは単純な真核生物の一種であり、こ
れは光合成装置の調整、合成、組立ておよび機能を研究
するための理想的なモデルである。

Ｃ，ラインバーティは高等植物と同じ光合成機構を利用
しており、また機能並びにタンパク成分両者の点で高等
植物のものと同等な光合成複合体を含んでいる。これに
ついてはチャグ（Ｃｈｕｇ）等のプロシーディングスオ
ブナショナルアカデミーオプサイエンス（Ｐｒｏｃ、　
Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）　ｌｌ５Ａ＋１９７
５．７２．ｐｐ２１７５〜２１７９を参照のこと。しか
し、高等植物に対して、Ｃ，ラインバーティは急速な（
６〜２４時間）複製スケジュールをもち、多くの植物ゲ
ノムの寸法をもつ両分であるゲノムを含み、かつ遺伝的
に十分に特徴付けされている。

形質転換はある細胞に外来ＤＮＡを導入することである
。形質転換は該細胞に導入された外来ＤＮＡ分子によっ
て規定される遺伝子の表現の結果として生ずる新たな表
現型特性を誘発するために、−Ｃに行われる。新しい表
現型を付与するために、純な（該表現型を表現しない）
宿主細胞に導入することのできる外来ＤＮＡ分子は、本
明細書において“形質転換ＤＮＡ分子”と呼ぶ。形質転
ＩＱ　Ｄ　Ｎ　Ａを４人した細胞を同定するのに役立つ
ように、該形質転換ＤＮＡは典型的には、親細胞（非形
質転換細胞）から容易に形質転換細胞を分離することを
可能とする表現型を表現し得るような遺伝子を含む。こ
のような遺伝子は当分野では“選択標識遺伝子”として
知られている。

形質転換ＤＮＡ分子内で使用される典型的な選択標識遺
伝子は生存選択を与えるものである。生存選択は成長阻
害物質抵抗性を付与あるいは成長因子性能のない細胞に
この性能を付与することにより達成できる。

以前のＣ，ラインバーティの形質転換の試みは、選択標
識遺伝子として酵１Ｉｌｌ：ａｒｇ４遺伝子を含む形質
転換ＤＮＡプラスミドを、Ｃ，ラインバーティのａｒｇ
　７変異株に導入することを含んでいた。ロカイソクス
（Ｒｏｃｈａｉｘ）等のネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）
　。

１９８２．２９６．ｐｐ７０〜７３記載の文献参照。

この酵母のａｒｇ　４遺伝子はアルギニン生合成経路の
最後の酵素であるアルギノサクシネートリアーゼ（ＡＳ
Ｌ）をコードする。Ｃ，ラインバーティのａｒｇ７変異
株はＡＳＬを表現できる遺伝子を有しておらず、かつそ
のためにこの酵素を欠いている。アルギニンはＣ，ライ
ンバーティの成長に必須であるので、このａｒｇ　７変
異株はアルギニンを補充した培地中でのみ生育する。即
ちこれはアルギニン栄養要求株である。首尾よい酵母ａ
ｒｇ４　遺伝子のＣ，ラインバーティ　ａｒｇ　７変異
株への導入は、従ってこの変異株に新たな表現型特性を
生せしめることになる。即ち、アルギニン欠乏培地内で
の生存能力が発現され、アルギニン原栄養性となる。

ロカインクス等（同上文献）は酵母ａｒｇ４遺伝子によ
るＣ、ラインバーティのａｒｇ７変異株の形質転換が、
処理細胞１０６当たり約１なる効率、即ちこのａｒｇ　
７遺伝子の自然の復帰率と同じ割合であることを報告し
た。選択されたアルギニン原栄養性コロニーの僅かに５
０％が→ノ・ザンブロ・７ト法による酵母配列を含んで
いた。

ロカイソクス等は、セル（Ｃｅｌｌ）、１９８４．３６
、ｐｐ９２５〜９３１において、酵母ａｒ８４選択標識
遺伝子をｉｏ持する自己複製プラスミドによる同じＣ，
ラインバーティａｒｇ　７変異株の形質転換を報告した
。ここでも、形質転換率は低い値（１０６〜１０７細胞
当たりｌ）であった。更に、形質転換ＤＮＡプラスミド
は不安定であることが立証されており、かつその細胞中
での存在は６０世代後大巾に減少した。

Ｃ，ラインバーティをバクテリアの薬剤耐性遺伝子によ
り形質転換する試みも徒労であることがわかっている。

バクテリアからのクローン化したカナマイシン耐性遺伝
子による形質転換の報告が刊行されたが、同等な低効率
でありしかも導入された遺伝子が該薬剤耐性に応答する
か否か、あるいは耐性が高い頻度でＣ，ラインバーティ
中に現れる自然のカナマイシン耐性であるのか否かにつ
いて幾つかの論争がある。例えば、ハスナイン（ｔｌａ
ｓｎａｉｎ）等のモレキュラーセルバイオロジー（Ｍｏ
ｌｅｃ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ、）、１９８５．５、ｐｐ
３６４７−３６５０参照。

Ｃ，ラインバーティの形質転換に関する以前の報告は、
いくつかの場合において外来ＤＮＡの導入に対する証拠
を示しているが、３つの報告のいずれも導入されたＤＮ
Ａが形質転換細胞中で表現されたことを示していない。

従前の実験で選ばれたすべての表現型特性が形質転換率
またはその近傍の頻度での自然復帰に帰せられるという
事実は、これらの報告された形質転換が同時かつ独立の
選ばれた犠牲への復帰およびゲノムへの外来ＤＮＡの移
入の結果であり得ることを示唆している。

上記のことから、安定なＣ，ラインバーティ形質転換体
を効率良く生成し得ないことの理由を当分野では決めか
ねているように理解される。問題がこの形質転換法の４
人、組込みあるいは表現段階のいずれにあるかが明らが
でない。

７４ｐｓｂｌ遺伝子であり、これは酸素発生促進タンパ
クＮｏ、１　　（ＯＥＥＩ）をコードする〔メイフィー
ルド（Ｍａｙｆｉｅｌｄ）等、ＥＭＢＯ１１９８７，６
、ｐｐ３１３〜３１８〕。ＯＥＥ　１は光化学系■反応
中心コアの一部であって、最近光合成酸素発生に必要で
あることが示されたものである。ＯＥＥ　１の欠損した
Ｃ、ラインバーティ細胞は光独立栄養成長でない。即ち
、ＯＥＥ　１タンパクは光合成に絶対的に必須である。

Ｃ，ラインパーティ核変異株ＦｕＤ４４は０ＥＥＩ表現
能をもたず、そのため光合成酸素発生が完全に欠を員し
ている。ビオシミ力エビオフィジ力アクタ　　（Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ、　　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　八ｃｔａ）　　、
　　１　９　７　９　　、５８１　　、ｐｐ２２８〜２
１５（クワバラ　（Ｋｕｗａｂａｒａ）等〕参照。Ｆｕ
Ｄ４４では、ｐｓｂ　１遺伝子の５′領、域への５ｋｂ
ＤＮＡの挿入は０ＥＥＩ　ｍＲＮＡおよびタンパクの完
全な欠損を生ずる。メイフィールド等の上記文献参照。

（発明が解決しようとする課題および課題解決の手段）本発明は、遺伝子、好ましくは選択標識遺伝子（これは
コドンの第３塩基位置にアデニン残基をもつコドンを実
質的に含まない）を含む、Ｃ，ラインバーティを形質転
換するのに適した核酸分子を提供することを目的とする
。

本質的に約８．５００塩基対のみを含み、エクソンとイ
ントロンとを含む遺伝子を含み、該エクソンがコドンの
第３塩基位置にアデニン残基をもつコドンを実質的に含
まない、Ｃ，ラインバーティを形質転換するのに適した
核酸分子も本発明の目的である。

本発明の更に別の目的は第１構造遺伝子および第２構造
遺伝子に動作可能に結合されたベクタを含み、該構造遺
伝子がコドンの第３塩基位置にアデニン残基をもつコド
ンを実質的に含まないことを特徴とする核酸分子を提供
することにある。

もう一つの態様において、本発明は形質転換核酸分子に
動作可能に結合されたベクタを含み、該核酸分子が本質
的に約８，５００塩基対のみを含み、かつコドンの第３
塩基位置にアデニン残基をもつコドンを実質的に含まな
い遺伝子を含むことを特ｆｈとする組換え核酸分子を提
供することを目的とする。

更に、本発明の目的は、コドンの第３塩基位置にアデニ
ンをもつコドンを実質的に含まない異型遺伝子を含む、
Ｃ，ラインバーティを形質転換するのに適した核酸分子
を提供することにある。

本発明は、またクローン化したＣ、ラインバー±土形質
転換体の製法を提供することを目的とし、該方法は（８
１本発明の核酸分子または組換え核酸分子を、Ｃ，ライ
ンバーティ細胞集団の少なくとも一つに導入して、形質
転換体含有集団を作製する工程、および（ｂｌ該形質転
換核酸分子により誘発される選択可能な表現型を表現す
る該形質転換体含有集団の一細胞をクローニングしかつ
保持する工程を含む。

本発明は更に、本発明の核酸分子または組換え核酸分子
により形質転換されたＣ、ラインバーティ細胞を提供す
ることを目的とする。

Ａ、し護遺伝子：相容性宿主内で、ポリペプチドを表現し得る核
酸シーケンスをいう。従って、遺伝子は構造遺伝子と動
作可能に結合した表現調節領域を含む。

構造遺伝子：遺伝子により表現されるポリペプチドのア
ミノ酸残基配列をコードするＤＮＡ配列を含む該遺伝子
の部分をいう。構造遺伝子は１以」二のイントロンを含
むことができる。

イントロン二転写されるが最終的な（翻訳された）ｍＲ
ＮＡ転写産物には現れない構造遺伝子の一部であり、従
ってコドンを含まない。

エクソン：翻訳されたｍＲＮＡ転写産物をコードする遺
伝子の一部であってコドンを含む。

コドン：遺伝子によって表現されたポリペプチドの一個
のアミノ酸残基をコード化する３個の隣接ヌクレオチド
残基群をいう。コドン内では、５′中央および３′ヌク
レオチド残基位置は夫々ｌ。

２および３と番号付けされ、また典型的には本発明にお
いて夫々第１、第２および第３塩基位置と呼ばれる。

ヌクレオチド：糖部分（ペントース）　、ｇａおよび窒
素含有複素環塩基からなるＤＮＡまたはＲＮＡの七ツマ
ー単位をいう。該塩基はグリコシド炭素（ペントースの
１′炭素）を介して該糖部分に結合しており、この塩基
と糖との組合せがヌクレオシドである。このヌクレオシ
ドがペントースの３′または５′位置に結合した燐酸基
を含む場合、これをヌクレオチドという。

塩基対（ｂｐ）：二本鎖ＤＮＡ分子内のアデニン（Ａ）
とチミン（Ｔ）との組合せまたはシトシン（Ｃ）とグア
ニン（Ｇ）との組合せをいう。

ＲＮＡ分子ではチミンの代りにウラシル（Ｕ）がある。

Ｂ、核貢し辷五ｒｏａ様において、本発明の核酸分子はＣ，ラインバー
ティの形質転換に適している。形質転換核酸分子は更に
、コドンの第３塩基位置にアデニン残基をもつコドンを
実質的に含まない遺伝子、即ちコドン−バイアス（ｃｏ
ｄｏｎ−ｂｉａｓｅｄ）遺伝子を含むことを特徴とする
。

“実質的に含まない”とは該構造遺伝子が該第３塩基位
置に少なくとも約９５％、好ましくは少なくとも約９９
％およびより好ましくは少なくとも約９９．９％上記コ
ドンを含まないことを意味する。該コドン−バイアス遺
伝子は、Ｃ，ラインバーティに対して同種（野生型Ｃ，
シラインバーティ中見出される）または異種（野生型Ｃ
，ラインバーティにはない）のいずれであってもよい。

好ましくは、このコドン−バイアス遺伝子は選択標識遺
伝子であり、より好ましくは生存選択標識遺伝子である
。

好ましい生存選択標識遺伝子はＯＥＥ　１遺伝子（即ち
、ｐｓｂｌ）、アセトラクテートシンターゼ（ＡＬＳ）
遺伝子、アルギノサクシネートリアーゼ（ＡＳＬ）遺伝
子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
（ＣＡＴ）遺伝子などである。好ましい態様において、
該コドン−バイアス遺伝子は予め決定されたエンドヌク
レアーゼ制限サイトを含み、該サイトには該コドン−バ
イアス遺伝子の表現を途絶するために核酸分子を結合で
きる。

好ましい態様において、形質転換核酸分子は実質的に約
７，５００　ｂｐ　、好ましくは約８，０００　ｂｐお
よびより好ましくは約８，５００　ｂｐからなる。

さらに好ましいのは、エクソンとイントロンとを含むコ
ドン−バイアス遺伝子を含有する形質転換核酸分子であ
り、該エクソンはコドンの第３塩基位置にアデニン残基
をもつコドンを実質的に含まないものである。

更に一層好ましくは、該コドン−バイアス遺伝子のアミ
ノ酸残基配列−コード領域が本質的に複数のコドンから
なり、その各々がその各コドン内の第１および第２の塩
基位置にアデニン、チミジン、グアノシンまたはシトシ
ンを含み、かつ各コドン内の第３塩基位置にチミジン、
グアノシンまたはシトシンを含むような形質転換核酸分
子である。

最も好ましい態様において、該形質転換核酸分子のコド
ン−バイアス遺伝子のコドンは全て以下のものからなる
群のものである。

ＧＣＴ、　　ＧＣＣ，ＣＧＣ，ＡＡＣ，ＧＡＣ，ＴＧＣ
，ＣへＧ、　　ＧＡＧＧＧＣ，ＣＡＣ，ＡＴＴ、　　Ａ
ＴＣ，ＣＴＧ、　　ＡＡＧ、　　ＡＴＧ、　　ＴＴＣ。

ＣＣＣ，ＴＣＣ，ＴＣＧ、　ＡＣＣ，ＴＧＧ、　ＴＡＣ
，ＧＴＣ及びＣＴＧ好ましい形質転換核酸分子は、本質的にプラスミドｐＳ
Ｂｌｏｌの０ＥＥＩ遺伝子含有８．２ｋｂＥｃｏＲＩ　
−Ｋｐｎ　Ｉ制限フラグメントからなる。プラスミドｐ
ＳＢ１０１で形質転換されたエシェリヒア　コリ　（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｉａ　ｃｏｌｉ）　　はメリーランド州
ロックビルのＡＴＣＣに１９８８年５月３日付で寄託さ
れ、承認番号６７６８４として受託されている。

本発明の形質転換核酸分子は当分野で周知の方法を用い
て作ることができる。例えば、所定の遺伝子を含む核酸
分子を、野生型Ｃ，ラインバーティの核ゲノムからクロ
ーニングできる。

更に、化学合成法、例えばマテニーシ（Ｍａｔｔｅｕｃ
ｃｉ）等のジャーナルオブアメリカンケミカルソサイア
テイ−（Ｊ、　　Ａｍ、Ｃｈｅｍ、　　Ｓｏｃ、）、１
９８１．１０３、ｐｐ、　３１８５に記載のホスホトリ
エーテル法を用いて、公知のアミノ酸残基配列をもつタ
ンパクをコードする遺伝子または構造遺伝子を調製する
ことができる。化学的合成法は、予め決められた配列の
核酸分子の形成を可能とすることから、コドンの第３塩
基位置にアデニンをもつコドンを実質的に含まない遺伝
子を形成するのに特に適している。

Ｃ３糾狽メＪｌ辷別そ本発明の組換え核酸分子は動作可能に第１の構造遺伝子
に結合した、好ましくは第２の構造遺伝子にも動作可能
に結合したベクタを含む。動作可能に結合した第１の、
および第２のく存在する場合）構造遺伝子は、コドンの
第３塩基位置にアデニン残基をもつコドンを実質的に含
まない（コドン−バイアス構造遺伝子）。好ましくは、
少なくとも一つの動作可能に結合した構造遺伝子は選択
標識遺伝子であり、より好ましくは生存選択標識遺伝子
である。この動作可能に結合した構造遺伝子はＣ，ライ
ンバーティに対し同種または異種いずれであってもよい
。

好ましい態様において、コドン−バイアス構造遺伝子は
予め決められたエンドヌクレアーゼ制限サイトを含み、
これには該コドン−バイアス構造遺伝子の表現を途絶す
るために核酸分子を結合してもよい。勿論、全遺伝子が
動作可能にベクタに結合されている態様においては、こ
の予め決定された制限サイトは該結合遺伝子のプロモー
タ領域にあり得る。

本明細書で用いる用語“ベクタ”とはヌクレオチド分子
であって、該ベクタゲノムの複製を指向する調節エレメ
ントを有し、かつこれに動作可能にもう一つのヌクレオ
チド分子を結合して、該結合分子の複製をもたらすこと
のできるものを意味する。細胞形質転換でのベクタおよ
びその使用は当分野で周知であり、例えばＤＮＡプラス
ミドベクタ、バクテリオファージベクタ、レトロウィル
スベクタなどが挙げられる。典型的には、ベクタは約１
ｋｂ〜約２００ｋｂの範囲の寸法をもつ。動作可能に結
合した構造遺伝子の表現を指示もしくはこれを可能とす
るベクタは本明細書では“表現ベクタ”と呼ぶ。

コドン−バイアス構造遺伝子を含む核酸分子が動作可能
に結合されたベクタの選択は、当分野で公知の如く、所
定の機能性、例えば複製および／またはタンパク表現並
びに形質転換すべき宿主細胞に直接依存する。これらは
組換え核酸分子の構築の分野に固有の制限である。しか
し、本発明の意図するベクタは少なくともベクタを動作
可能に結合しようとする核酸セグメントに含まれるコド
ン−バイアス構造遺伝子の複製および好ましくは表現を
も指示できるものである。

好ましい態様において、本発明の意図するベクタは複製
の開始点（レプリコン）、即ち宿主細胞内、例えばこの
ベクタで形質転換すべきバクテリアまたはＣ，ラインバ
ーティ宿主細胞などの中で自己複製および染色体外的に
組換え核酸分子を維持する能力を有するＤＮＡシーケン
スを含む。このようなレプリコンは当業界で周知である
。また、原核生物のレプリコンを含むこれらの例は、ま
た典型的にある遺伝子を含み、該遺伝子の表現は形質転
換されるバクテリア宿主に薬剤耐性を付与する。典型的
なバクテリアの薬剤耐性遺伝子はアンピシリンまたはテ
トラサイクリン耐性を付与するものである。

真核生物レプリコンを含むベクタは、また形質転換され
るＥ、コリーなどのバクテリア宿主細胞内でコドン−バ
イアス遺伝子の表現（転写および翻訳）を指示し得る真
核生物プロモータを含むことができる。プロモータはＲ
ＮＡポリメラーゼの結合および転写を起こすことのでき
るＤＮＡ配列によって形成される表現調節要素である。

バクテリア宿主と相容性のプロモータ配列は、典型的に
は本発明のＤＮＡセグメントの挿入に対して有利な制限
サイトを含むプラスミドベクタ内に与えられる。このよ
うなベクタプラスミドの典型例はｐＬｌｃ８、ｐｔＪｃ
９．ｐＢＲ３２２およびｐＢＲ３２９であり、これらは
バイオラドラボラトリーズ社（ＢｉｏｒａｄＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ）　、リソチモンドＣＡから入手できる
。

レトロウィルスベクタの構築並びに利用については、ソ
ルジ（Ｓｏｒｇｅ）等、モレキュラーセルバイオロジー
（！Ｊｏｌ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）、１９８４．４
、ｐｐ１７３０〜３７に記載されている。

動作可能に核酸分子を補足的粘着末端を介してベクタに
結合するための様々な方法が開発されている。例えば、
挿入すべき核酸セグメントおよびベクタ核酸に補足的ホ
モポリマートラクト（ｔｒａｃｔｓ）を付加することが
できる。このベクタおよび核酸セグメントを、次に該補
足的ホモポリマーテール間に於いて水素結合で結合して
組換え核酸分子を形成する。

■または２以上の制限サイトを含む合成リンカは、ＤＮ
ＡセグメントとＤＮＡベクタとのもう一つの結合法を与
える。このＤＮＡセグメントはエンドヌクレアーゼ制限
消化により得られ、これはバクテリオファージＴ４ＤＮ
ＡポリメラーゼまたはＥ、コリＤＮＡポリメラーゼ■酵
累で処理される。これら酵素は３’　−５’　エキソヌ
クレアーゼ分解活性をもつ突出３′、−本鎖末端を除去
し、かつその重合活性をもつ劣性（ｒｅｃｅｓｓｅｄ）
　　３　’末端で満たされる。従って、これら活性の組
合せはプラントエンドＤＮＡセグメントを生ずる。次に
、このプラントエンドセグメントは、プラントエンドＤ
ＮＡ分子の連結を触媒し得る酵素、例えばバタテリオフ
ァージＴ　４　Ｄ　Ｎ　Ａリガーゼの存在下で、大モル
過剰のリンカ分子と共にインキュベートされる。かくし
て、この反応の生成物はその末端にポリマー状リンカセ
グメントを担持するＤＮＡセグメントである。次に、こ
れらのＤＮＡセグメントを適当な制限酵素で開裂し、か
つこれらＤＮＡセグメントの末端と相容性の末端を生成
する酵素で開裂された表現ベクタに連結される。

様々な制限エンドヌクレアーゼサイトを含む合成リンカ
は、ＣＮニューヘブン、インターナショナルバイオテク
ノロジーズ社（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＢｉｏｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ、）を含む多くの製造元
から市販品として人手できる。

Ｄ、形質転換細胞および培養本発明は、また本発明の形質転換核酸分子または組換え
核酸分子で形質転換された宿主細胞にも関する。（表現
を簡略化するために、本発明の形質転換核酸分子および
組換え核酸分子を、本明細書においてしばしばその表現
上の一般形として“課題核酸（ｓｕｂｊｅｃｔ　ｎｕｃ
ｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ）”なる３吾を用いて表す）。該
宿主細胞は真核または原核のいずれであってもよい。バ
クテリア細胞は好ましい真核宿主細胞であり、典型的に
はＭＤ、ベテスダのベテスダリサーチラボラトリーズ社
（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、）から人手できる巳。

コリ菌株ＤＨ５などのＥ、コリの菌株である。好ましい
原核宿主細胞はＣ，ラインバーティ細胞を含む。課題核
酸による適当な宿主細胞の形質転換は、典型的には細胞
宿主および使用するベクタの型に依存する周知の方法に
より達成される。真核宿主細胞の形質転換については、
例えばコーエン（Ｃｏｈｅｎ）等のＰｒｏｃ、　　Ｎａ
ｔｌ、　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　［ＪＳＡ、　　１
９７２゜６９、ｐ２１１０およびマニアティス（Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ）等の、モレキュラークローニング、アラポ
ラトリー？−マル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ
ｇ、　Ａ　　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｍｍａｌ）　〔
コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−、コールドス
プリングハーバ−１ＮＹ、　１９８２）を参照のこと。

レトロウィルスベクタによる細胞の形質転換については
、例えばソルジ等のＭｏｌ。

Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、１９８４，４、ｐｐ１７３０　
３７；グラハム（Ｇｒａｈａｍ）等のパイロロジー（Ｖ
ｉｒｏｌ、）。

１９７３．５２．ｐ４５６；およびウィグラー（Ｗｉｇ
ｌａｒ）等のＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ
ｃｉ、　ＬＩＳＡ＋　１９７９＋１工、ｐｐ、１３７３
〜７６を参照のこと。

首尾良く形質転換された細胞、即ち形質転換体は周知の
方法で同定できる。例えば、課題核酸の導入により生じ
た細胞はクローニングしてモノクローナルコロニーを生
成し得る。これらのコロニーからの細胞は、サザン（Ｓ
ｏｕ　ｔｈｅｒｎ）のＪ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、、１９７５，９８．ｐ５０３またはペラン（
Ｂｅｒｅｎ　ｔ）等のバイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅ
ｃｈ、）　＋１９８５．３．ｐ２０８などに記載のよう
な方法を用いて、収穫、溶菌され、かつそのＤＮＡ含量
を課題核酸（またはそのＤＮＡ等個物）の存在について
調べることができる。

課題核酸の存在につき直接検定することに加えて、首尾
よい形質転換は、該課題核酸がその含有する構造遺伝子
の表現し得る場合には、周知の免疫学的方法で確ＬＷで
きる。例えば、表現ベクタにより首尾よ（形質転換され
た細胞は抗原タンパク生成物を与える。形質転換された
ものと思われる細胞のサンプルを収穫し、該抗原に特異
的な抗体を用いて該構造遺伝子抗原タンパク生成物につ
き検定される。

かくして、形質転換された宿主細胞自体に加えて、本発
明は、また栄養培地中でのこれら細胞の培養物、好まし
くはモノクローナル（クローン的に均質な）培養物、あ
るいはモノクローナル培養由来の培養物にも関する。好
ましくは、この培養物は組換えで作られたポリペプチド
製品をも含有する。

形質転換された宿主細胞の培養に有用な栄養培地は当分
野で周知であり、かついくつかの製造元から入手できる
。

培養物からの表現されたタンパクの回収法は当分野にお
いて周知であり、かつ周知の生化学的方法を利用して該
培養物のタンパク−含有部分の分画を含む。例えば、タ
ンパク分画法として知られているようなゲル濾過、ゲル
クロマトグラフィー限外濾過、電気泳動、イオン交換、
アフィニティークロマトグラフィーなどを用いて、該培
養物中に見出される表現されたタンパクを単離できる。

更に、免疫化学的方法、例えばイムノアフィニティー、
イムノアトソープションなどを周知の方法を利用して行
うことができる。

Ｅ、Ｃ，ラインバーティ形質転換体の製法本発明はクロ
ーン化Ｃ，ラインバーティ形質転換体の製法を意図する
。この方法はＣ，ラインバーティ細胞集団の少なくとも
一種に課題核酸を導入して、形質転換体含有集団を作成
する工程を含む。

Ｃ，ラインバーティに課題核酸を導入する方法は、バク
テリアおよびせき椎動物細胞に典型的に利用される方法
を含む。簡単にいえば、これらの方法は、典型的には導
入すべき課題核酸、好ましくはプラスミドｐＳＢｌｏ１
の８．２　ｋｂＥｃｏＲＩ　−ＫｐｎＩフラグメントと
純なＣ，ラインバーティ細胞、好ましくはＦｕＤ４４細
胞とを混合することを含む。この混合物を、形質転換−
促進剤（Ｌｒａｎｓ−ｆｏｒｍａｔｉｏｎ−ｆａｃｉｌ
ｉｔａｔｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）　、例えば塩化カルシウ
ム、電場などで、該課題核酸が少なくとも該集団の一種
にはいるのに十分な時間処理する。

これについては、例えばミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）等のＰ
ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ
、　１９８８．　８５゜ｐｐ、　８５６〜８６０を参照
のこと。

好ましい態様において、形質転換体含有集団は、該細胞
中に該形質転換核酸が導入されている約１時間以内、好
ましくは約３０分以内、より好ましくは約１５分以内、
突然変異誘発剤、例えば紫外輻射、Ｘ−線輻射、ヒドロ
キシルアミン、ニトログアニジン、ブロモウラシル、亜
硝酸などで処理される。

次いで、導入された該課題核酸によって誘発される表現
型を表す形質転換体含有集団の細胞を典型的には限界希
釈法でクローニングし、保持される。該導入された課題
核酸が生存性選択標識遺伝子（Ｃ，ラインバーティ形質
転換体を表現し得る）を含む場合、クローニングは通常
まず非形質転換細胞を生存させない培地内で、あらゆる
非形質転換細胞が死滅するのに十分な時間該形質転換体
−含有集団を維持（培養）することにより達成される。

生存細胞を選別し、クローニングし、かくしてクローン
を得る。

２９組換えポリペプチドの一１１法本発明のもう一つの局面は、Ｃ，ラインバーチ王形質転
換体を用いて、ポリペプチド、好ましくは−ｑエラΔ−
乙かニニデコーに対し異種のポリペプチドを製造する方
法に関する。

この方法は、本発明のＣ，ラインバーティ異種タンパク
表現形質転換体を含む栄養培地の使用を含む培養の開始
を必要とする。この培養を該形質転換体が、該形質転換
体を生成するのに使用された課題核酸によってコードさ
れたポリペプチドを表現するのに十分な時間続ける。次
に、表現されたタンパクを該培養物から回収する。

Ｇ０表１１三至二叉もう一つの態様において、本発明はプラスミドｐＳＢ１
０１のＥｃｏＲＩ−８ａｌ　Ｉ　　０ＥＥＩ−由来のエ
ンドヌクレアーゼ制限フラグメントを含む、約３０００
　ｂｐのプロモータＤＮＡ分子にも関する。“ＯＥＥ　
１−由来”なる用語はプロモータＤＮＡ分子が、第２図
に示した−１５３ヌクレオチド残基部分から３′−末端
位の一３７ヌクレオチド残基までのＤＮＡ配列を含むこ
とを意味する。

本発明では、Ｃ，ラインバーティを形質転換するのに適
した表現促進核酸分子をも意図し、これはプラスミドｐ
ＳＢ１０１プラスミドのＥｃｏＲＩＳａｆＩ　　０ＥＥ
Ｉ−由来のエンドヌクレアーゼ制限フラグメントおよび
プロモータに対して異種の構造遺伝子に動作可能に結合
した該プロモータＤＮＡ分子を含む。“プロモータに対
し異種の構造遺伝子”とは０ＥＥ１構造遺伝子以外の遺
伝子を意味する。

本発明は、またＣ、ラインバーティの形質転換法および
Ｃ，ラインバーティ形質転換体（これらは夫々本発明の
表現促進核酸分子を利用または包含する）並びにレプリ
コンに動作可能に結合した本発明のプロモータＤＮＡ分
子を含む表現ベクタをも意図する。

（実施例）以下の実施例は本発明を例示するものであり、これを制
限するものではない。

当分野で周知の方法を利用して組換えプラスミドｐＳＢ
１０１を構築した。この方法については、例えばマニチ
ス（Ｍａｎｉｚｔｉｓ）等のモレキュラークローニング
ニアラボラトリ−マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕ
ａｌ）　、コールドスプリングハーバ−ラボラトリーズ
、ＮＹコールドスプリングハーバ−（１９８３）を参照
のこと。

タラミドモナスストックセンタ（Ｃｈ　Ｉａｍｙｄｏｍ
ｏｎａｓＳｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ　（ボタニデパート
メント、デュークユニバーシティ、デユラン、Ｎ　Ｃ（
Ｂｏｔａｎｙ　Ｄｅｐｔ。

Ｄｕｋｅ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、口ｕｒｈａｎ＋　Ｎ
Ｃ））から得た野生型のＣ，ラインパーティ株１３７ｃ
を用いて、野生型○ＥＥＩ遺伝子を含むＥＭＢＬ３ゲノ
ムライブラリを、メイフィールド（Ｍａｙｆｉｅｌｄ）
等のＥＭＢＯＪ、。

１９８７．６．ｐｆｌ、３１３〜３１８に記載のように
して作製した。このＯＥＥ　１遺伝子に結合したＥＭＢ
Ｌ３ベクタはＥｃｏＲＩとＫｐｎＩにより完全に制限エ
ンドヌクレアーゼ消化して第１図に示した３、２ｋｂの
ＤＮＡセグメント（Ｅｃｏ　ＲＩ　−Ｋｐｎ　Ｉ制限フ
ラグメント）を得た。

この８．２　ｋｂ　ＥｃｏＲＩ　−Ｋｐｎ　Ｉ　ＤＮＡ
セグメントを、ｐＵＣｌ　９のＥｃｏＲＩおよびＫｐｎ
　Ｉ制限サイトにて該プラスミドベクタ、ｐＵｃ１９　
　（ＮＪ。

ビス力タウェイのファルマーシア社（Ｐｈａｒｍａｃ　
ｉａ）　）、に連結（動作可能に連結）して、好ましい
本発明の組換え核酸分子である組換えプラスミドｐＳＢ
ｌｏ１を作製した。その構造を第１図に模式的に図示し
た。

ｐＳＢｌｏｌは通常のバクテリア形質転換法によってＥ
、コリ菌株ＪＭ１０９（ファルマシア社）に導入した。

第１図の下部には、８．２ｋｂＯＥＥ１遺伝子−含有形
質転換核酸分子を含む組換えＤＮＡプラスミドｐＳＢｌ
ｏ１が示されている。本図の上部には、３ｉ０ＥＥ１構
造遺伝子内のイントロン（白抜き部分）およびエクソン
（黒塗り部分）の位置を示す。

アミノ酸残基配列開始コドン（ＡＴＧ）および停止コド
ン（ＴＡＡ）のおよその位置も図示しである。ＢＮ　８
．２　ｋｂフラグメントおよびｐＳＢｌｏｌ内の制限エ
ンドヌクレアーゼサイトのおよその位置は以下の如くで
ある：　ＥｃｏＲＩ　　（Ｒ）、Ａｖａｌ（Ａ）。

ＰｓｔＩ　　（Ｐ）　、　　Ｈｉｎｄ　ｍ　（Ｈ）　、
　　Ｓａｌ　Ｉ　　（Ｓ）　。

Ｘｈｏｌ　　（Ｘ）およびＫｐｎＩ　　（Ｋ）、およそ
５００ヌクレオチド塩基対（ｂｐ）のバーも尺度として
示しである。

第１図の底部にはｐｓ８１０１組換えプラスミド内のｐ
Ｕｃ１９プラスミドクローニングベクタ配列および８．
２　ｋｂＥｃｏＲＩ　−Ｋｐｎ　Ｉフラグメントの位置
をも示しである。また、ｐＵｃ１９−由来のアンピシリ
ナーゼ選択標識遺伝子（Ａｍｐγ）および複製のプラス
ミド源（Ｅ、コリｏｒｉ）　も図示した。

自己消化酵素を２種の別々の培養物、即ち野生型−ｑエ
ラΔ−乙か二二テコ一の成熟型（＋）および成熟型（−
）を用いて以下のように調製した。これらの野生型Ｃ，
ラインバーティ株１３７Ｃ接合型（＋）および（−）（
これらはｗｔ”またはＷじとも記される）はクラミドモ
ナスストックセンタ（デュークユニバーシティー、ＮＣ
デユラン）から別々の培養物として得られ、これらをＴ
ＡＰ培地で培養した。

濃厚ベイジャリンク　（Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋ）溶液（
４×ベイジヤリンク）を、１６ｇのＮＨａＣｌ、２ｇの
ＣａＣｌ　ｚ　・２ＨｚＯおよび２ｇのＭｇ５Ｏａ　・
７ＨｚＯと１７！の水とを混合することにより調製した
。

濃厚燐酸カリウム溶液を、１４．３４ｇの１ｈｌｌＰｏ
、、７、２６　ｇのＫ）１．ＰＯ２およびｐＨを６．９
に調節するのに十分な４　Ｋ　ＯＨ溶液を１１の水に混
合することにより調製した。

１元素溶液を、（ａ）５５０ｍｆｆの水に１１．４ｇの
１ｈＢ（ｈ　、２２　ｇの７．ｎ５Ｏａ　・７１１ｚＯ
１５，０６ｇのＭｎＣｊ！　ｚ　・４ＨｚＯ１４，９９
ｇのＦｅ５Ｏａ　−ＩＬＯｌｌ、６１　ｇのＣｏ（１２
ｚ　’　６１１ｚＯ、Ｌ、５７　ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ
ｚＯおよび１．１ｇの（Ｎｔ１４）Ｊｏｙ（ｈ４・４＋
１２０をこの順で混合し、次いでこの混合物を１００℃
に加熱し、ｆｂ）　５０ｇのＥＤＴＡ　（エチレンジア
ミンテトラ酢酸（２すＩ・リウム）を混合かつ加熱して
水２５０ｍＪに溶かし、次いで加熱したこの溶液を溶液
（δ）に加えて溶液ａｂを得、ｆｃ）この溶液ａｂを８
０℃に冷却して、２０％ＫＯＩＩを用いてｐ　Ｈ６，５
〜６．８に調節し、（ｄｌ溶液ａｂの最終体積を１１に
調節し、次いでこの体積を調節した溶液を室温にて２週
間維持し、および（ｅｌファフトマン＃１濾祇（ＮＪ、
　クリフトンのファ・ノドマン（Ｗｈａ　ｔｍａｎ）社
）上で該溶液を３回吸引濾過することにより調製した。

９７５ｍ７！の水、２．４２　ｇのＴｒｉｓ　−ＩＩＣ
ｊ２．２５ｍｆｆの４×ベイジヤリンク溶液、１ｍＡの
１Ｍｅ酸カリウム（ｐＨ７，０）　、１ｍｌの微量元素
溶液および１ｍｌの氷酢酸を混合することによってＴＡ
Ｐ培地を調製した。

寒天支持体（２０Ｗ／Ｎ％寒天；デイフコ（Ｄｉｒｃｏ
）、Ｍｌ、デトロイト）中にＴＡＰ培地を含有する６個
の径９０ｍｍの使い捨てペトリ皿に、４×１０６讐ｔ゛
細胞を接種し、同じ一組のベトリ皿に同様にＷｔ−細胞
を接種した。これら２組のペトリ皿を光照度（ＨＬ：約
２０００〜４０００１ｕｘの紫外光）照射下で４日育生
した。その後、各プレート上の細胞を２０ｍｌのＮＦＩ
ＩＳＭＩ／２ＰＯ，培地を用いて再懸濁し、各接合型を
プールした。このプールを、次にＨＬＬの下で回転シェ
ーカー（１５０ｒｐｍ　）を用いて連続的に攪拌するこ
とにより培養した。

ＮＦＨ５ＭＩ培地、９７４ｔａｌの水、２５ｍ１の２Ｘ
ＰＯ。

および１ｍｌの微量元素溶液を混合して調製した。

れ゛およびれ一細胞は、各培養物の細胞の少なくとも約
８０％が接合挙動し得るまで培養した。

接合挙動能は少量のれ゛細胞のアリコートとれ細胞とを
混合し、光学顕微鏡にて、接合挙動に関与している、即
ち単細胞並びに動的状態（非結合）を維持しているもの
に対して対結合している全細胞数の割合を目視観察する
ことにより決定した。

回転撹拌の２時間後に、プールしたＷｔ”および１ｌｌ
ｔ−細胞の培養物を夫々側々に採取し、夫々につき細胞
濃度を測定し、ベック７７　（Ｂｅｃｋｍａｎ）　ｌ　
３．ｌ　ロータ〔ベツクマンインストルメンツ　（Ｂｅ
ｃｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）　、　ＣＡバロア
ルト〕を用いて室温にて１０分間２００Ｏｒｐｍにて遠
沈した。得られたベレットを１×１０８細胞／Ｉｌｌβ
なる濃度でＮＦＨ３ＭＩ／２ＰＯ□培地に再懸濁し、Ｈ
ＬＯ下で両培養物が接合するまで、即ち８０〜９０％の
細胞が接合挙動能を示すまで回転撹拌を続けた。

等量の成熟ｗｔ＝とＷｔ＝培養物を混合し、撹拌せずに
４分間放置した。その後、この混合物をベックマン１３
．１０−タ内で２００Ｏｒｐｍにて、４℃で５分間遠沈
して、培養上澄から細胞を分離した。この上澄を集め、
５Ｓ−３４ツルバールロータ（Ｓｏｒｖａｌｌ　ｒｏｔ
ｏｒ　；デュポン（Ｄｕ　Ｐａｎｔ）　；　ＤＥ。

ウイルミングトン）を用いて４℃にて１５分間、１７、
　ＯＯＯｒｐｍにて再遠沈し、得られた上澄を集め、自
己消化溶液を形成した。

５−フルオロデオキシウリジンおよびメトロニダヅール
処理により、野生型の１３７０から変異株Ｃ，ラインバ
ーティＦｕＤ４４を調製し、メイフィールド等のＥＭＢ
ＯＪ、、１９８７．旦、　ｐｐ、３１３〜３１８に記載
のようにＴＡＰ培地内で培養した。ＦｕＤ４４の培養体
はＡＴＣＣに１９８８年５月３日付で寄託し、その承認
番号はである。

ＦｕＤ４４培養物を、Ｔ　Ａ　Ｐ培地中にて１ｍｌにつ
き約ｌＸｌ０’細胞となるまで育生し、この培養物２０
ｍ！を１３．１０−タ中で２００Ｏｒｐｍにて５分間遠
心して、該細胞をペレットとした。この細胞ペレットを
自己消化液４．０ｍｌ中に再懸濁し、この再懸濁細胞を
室温にて１時間回転振盪機内に保持して、ＦｕＤ４４細
胞壁を十分に消化させて、プロトプラスト含有溶液を形
成した。

次に、このプロトプラスト含有溶液を、１ｍＩ！当たり
１０７細胞なる濃度までＴＡＰ培地と混合して、更に混
合することにより以下のものを含む溶液を形成した：（
１１ＦｕＤ４４から調製し、かつ２２５μｇ　／　ｍ　
ｌなる濃度で加えられたキャリヤＤＮＡ、（２１７，５
％ＰＢＧ６，０００　（ポリエチレングリコール６．０
００；オートクレーブ処理；ＭＯ。

セントルイスのシグマケミカル（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ
ｉｃａｌＣｏ、）および（３１ＥｃｏＲＩおよびＫｐＮ
Ｉで最後まで消化されたｐＳＢＩ　ＯｌＤＮＡ　（Ｉ　
Ｑμｇ／ｍｌなる濃度で添加）。この希釈した細胞１１
Ｔｌｌを使い捨てキュベツト中にて氷に漬け、トランス
フエクタ３００エレクトロボーレーションシステム（Ｂ
ＴＸ、ＣＡ、サンジエゴ）を用いて、約２００Ｖに充電
された５００μＦキヤパンクから４ｍｍのギャップを横
切る単一電気パルス照射した。

エレクトロポーレーシヲン後、細胞培養物を氷上に１時
間保ち、次いで３ｍｆｆのＴＡＰ培地をこの細胞に加え
、かつこの培養物をＨＬ下で室温にて１６〜２４時間回
転攪拌状態に保った。次いで、この培養物を前と同様に
２０００ｒｐｍにてベレット化し、この細胞ペレットを
２５０μｌのＨ３Ｍ培地（７２５ｍｌの水、２５ｒｎ！
！の４×ヘイジヤリンク溶液、５０ｍ７！の２　ＸＰＯ
２および１ｍＮの微量元素溶液を混合することにより調
製した）に再懸濁し、この再ＱＱ細胞を、２０％寒天中
にＨ３Ｍ培地を含む９０ｎ＋ｍ径のベトリ皿上で平板培
養した。

平板培養した細胞をＨＬ下に室温にてｌＯ〜１４日間保
ち、その後形質転換体ＦｕＤ４４を育生し、不連続な可
視コロニーを形成した。これを以下形質転換体という。

上記形質転換法は、典型的にはプレート当たり約５０〜
１５０形質転換体コロニーを形成し、最大約１７５形質
転換体を形成した。

形質転換率の存意の増加が、エレクトロボーレーション
後約２４時間、該培養物を紫外光（ＵＶ）に暴露した場
合に観察された。この改良法は、エレクトロボーレーシ
ョンに付されたＦｕＤ４４細胞をＨ３Ｍプレート上で平
板培養した後１０分間の待ち時間を設け、次いで約３フ
イートの距離に配置された４８インチ径３０Ｗの殺菌灯
（モデル６３０Ｔ８、ジェネラルエレクトリック　（Ｇ
ｅｎｅｒａｌＥｌｅｃｔｒｉｃ）社、ＯＨクリーブラン
ド）からのＵＶ光に直接（皿を覆わずに）１０分間暴露
する工程を含む。このＵＶ露光後、皿を回収し、上記の
如く室温にて、ＨＬの下で１０〜１４日間保った。

この改良法を利用すると、プレート当たり約２５０〜３
００個の形質転換体が得られ、かついくつかの場合には
プレート当たり５００個もの形質転換体が得られた。

実施例２ｂで記載のようにして生成した５種の形質転換
体を無作為に選択して、０ＥＥ１選択標識遺伝子が純な
ＦｕＤ４４細胞内に安定に導入されて、該０ＥＥ１遺伝
子生成物を表現し得る形質転換体を生成することを立証
する特徴付けを更に行った。

細胞性ＤＮＡを野生型Ｃ５ラインバーティ、変異ＦｕＤ
４４、変異ＦｕＤ４４　　Ｒ２および各５種の形質転換
体を周知の方法で単離した。各単離ＤＮＡを制限エンド
ヌクレアーゼ消化にかけ、以下に述べるように０ＥＥ１
遺伝子−特異的プローブを用いたサザンブロソト法によ
り解析した。使用したプローブは５ｋｂ　Ｐｓｔｌ　Ｆ
ｕＤ　４４細胞性ＤＮＡ制限フラグメントおよび０．５
ｋｂＰｓｔｌＦｕＤ４４−Ｒ２細胞ＤＮＡ制限フラグメ
ントにハイブリダイゼーションする。

第２図に０ＥＥ１タンパクをコードするｃＤＮＡのヌク
レオチド配列と、該タンパクの推定アミノ酸残基配列を
示した。このヌクレオチド配列は、塩基−１５３から塩
基１５８９までの連続した形動として表された単一文字
ヌクレオチド塩基コードを用いて左から右即ち５′−末
端から３′−末端方向に示され、塩基番号は線形配列の
上方に付されている。このＯＥＥ　ｌタンパクの推定ア
ミノ酸残基配列は、アミノ−末端の残基１　（Ｍ）から
カルボキシ−末端の残基（Ｋ）までの残基の連続した線
形列として表された単一文字アミノ酸残基コードを用い
て、アミノ−末端からカルボキシ−末端の方向で、即ち
左から右の方向で示されている。

ここで、残基番号は余白部に該配列の左に示されている
。

この読取枠は該ヌクレオチド配列下方に推定アミノ酸残
基配列を置くことにより示されている。

従って、各アミノ酸残基配列を表す単一文字は対応する
コドン内の第２　（中央）の塩基の下方に示されている
。

野生型（Ｗｔ）　、変異ＦｕＤ　４４　（ｍｕ）、Ｆｕ
Ｄ４４の自然復帰棒（ＦｕＤ４４　　Ｒ２；Ｒ２）およ
び無作為選択された５種の形質転換体からのゲノムＤＮ
Ａを、ＥｃｏＲＩ　＋　Ｋｐｎ　Ｉ　　（パネルＡ）ま
たはＰｓｔｌ　　（パネルＢ）を用いて制限エンドヌク
レアーゼ消化し、アガロースゲル上で電気泳動させ、二
十ロセルロース上にプロットし、かつ（”Ｐ）標識ＯＥ
Ｅ　１−特異的プローブとハイブリダイゼーションした
。

ＥｃｏＲＩとＫｐｎＩで消化された単離ＤＮＡのサザン
分析は、正確に野生型の制限フラグメントパターンと同
じであると思われるパターンをもつ形質転換体がないこ
とを示した（第３図、パネルＡ）。

第３図のパネルＢに示したように、形質転換体すべての
細胞ＤＮＡは野生型と同じ寸法のＰｓ　ｔｌ制限フラグ
メントを含む。しかし、第３図は、また両度異体が、野
生型０ＥＥ１遺伝子内に遺伝子途絶インサートの存在を
示す、より大きなＰｓＬＩフラグメントを含むことも立
証している。

ｍＲＮＡを５種の選ばれた形質転換体の各々から単離し
、以下のようにしてノーザンブロットハイプリダイゼー
ションにより分析した（第４図参照）。即ち、野生型、
変異体ＦｕＤ４４および無作為に選ばれた５種の形質転
換体からＲＮＡを単離し、変性ホルムアルデヒドゲル上
で電気泳動し、ナイロン膜上にエレクトロプロ・ノドし
、かつ（３２ｐ　）−標識０ＥＥ２−特異的（パネルＡ
）または０ＥＥＩ−特異性（パネルＢ）プローブを用い
てハイブリダイゼーションした。ノーザンプロットを０
ＥＥ２特異的プローブでプロービングすることにより、
ＦｕＤ４４細胞および形質転換体は野生型のものと同じ
ＯＥＥ２ｍＲＮＡを表現することが立証された（第４図
パネル）。このノーザンブロソトの第４図に示された結
果（パネルＢ）は、非形質転換変異体において表現され
たｍＲＮＡ種に対照的に、野生型とは区別できないＯＥ
Ｅ　１特異的ｍＲＮＡをすべての形質転換体が蓄積する
ことを示した。

これらのデータは形質転換体中における０ＥＥ１遺伝子
配列の存在を示している。更に、形質転換体中のＯＥＥ
ｌｍＲＮＡの濃度は野生型細胞中におけるよりも著しく
大きいように思われ、このことは選択標識表現用のこの
システムを用いた場合における表現の可能性を立証して
いる。

形質転換された細胞中でのタンパク表現を解析するため
に、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）　に付されている細胞溶
解液のイムノプロットを調製した。この細胞溶解液の調
製、５ＤＳ−ＰＡＧＥ条件、タンパクプロットおよびこ
こで用いた抗体イムノプロット法はメイフィールド等の
ＥＭＢＯＪ、。

１９８７．６．ｐｐ、３１３〜３１８に記載されている
。

第５図に示したイムツブ０．７ト試験の結果は、ＯＥＥ
　ｌタンパクがすべての形質転換セルライン中で表現さ
れ、また野生型ＯＥＥ　ｌタンパクとは免疫学的に識別
し得ないことを示している。予想されるように、０ＥＥ
１タンパクは形質転換されていないＦｕＤ４４細胞中で
は表現されない。

上記の特定の態様および実施例を含む本明細書の記載は
本発明を例示するためのものであり、これを限定するも
のと考えるべきでなはい。多数の変更、改良が真の本発
明の精神並びに範囲を逸脱することなしに実施できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、クローン化０ＥＥ１遺伝子を含む８．２ｋｂ
の形質転換核酸分子を模式的に表す図であり、第２図は、ＯＥＥ　１タンパクをコードするｃＤＮＡの
ヌクレオチド配列および該タンパクの推定アミノ酸残基
配列を示す図であり、第３図は、実施例２Ｃに述べるよ
うに、旦工文インバーティ形質転換体のサザンブロソト
分析のオートフルオログラム（ａｕ　ｔｏｆ　Ｉｕｏｒ
ｏｇｒａｍ）を示す図であり、第４図は、実施例２Ｃに示すようにＣ，ラインバーティ
形質転換体のノーザンブロソト分析のオートフルオログ
ラムを示す図であり、および第５図は、野生型、変異株
ＦｕＤ４４および無作為に選んだ５種の形質転換体中で
表現されたＯＥＥ　１タンパクのイムノブロッティング
分析の結果を示す図であり、該タンパクは、実施例２Ｃ
に述べるように、ＳＯ３の存在下でポリアクリルアミド
ゲル上で電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付され、ニト
ロセルロースにエレクトロブロッティングされ（Ｅｌｅ
ｃｔｒｏｂｌｏｔｔｅｄ）かつ０ＥＥ１−特異性抗体に
より可視化されている。図面の、ンユ内容に変更−シ）派

Claims

【特許請求の範囲】

（１）コドンの第３塩基位置にアデニン残基をもつコド
ンを実質的に含まない遺伝子を含む、￥クラミドモナス
￥￥ラインハーティ￥を形質転換するのに適した核酸分
子。
（２）該遺伝子のすべてのコドンが以下のものからなる
群の一種である請求項１記載の核酸分子。【遺伝子配列があります】
（３）該遺伝子が￥クラミドモナス￥￥ラインハーティ
￥のＯＥＥ１遺伝子である請求項２記載の核酸分子。
（４）本質的に、約８，５００塩基対のみを含み、かつ
エクソンとイントロンとを含む遺伝子を包含し、該エク
ソンが第３塩基位置においてアデニン残基を持つコドン
を実質的に含まないことを特徴とする￥クラミドモナス
￥￥ラインハーティ￥を形質転換するのに適した核酸分
子。
（５）本質的にプラスミドｐＳＢ１０１のＥｃｏＲＩ−
ＫｐｎＩ制限フラグメントからなる核酸分子。
（６）構造遺伝子および選択標識遺伝子に動作可能に結
合されたベクターを含み、該構造遺伝子および該選択標
識遺伝子が、コドンの第３塩基位置にアデニン残基をも
つコドンを実質的に含まないことを特徴とする組換え核
酸分子。
（７）形質転換ＤＮＡ分子に動作可能に結合されたベク
タを含み、該形質転換ＤＮＡ分子が本質的に約８，５０
０の塩基対のみを含み、かつコドンの第３塩基位置にア
デニン残基をもつコドンを実質的に含まない遺伝子を含
有することを特徴とする組換え核酸分子。
（８）該核酸分子がプラスミドｐＳＢ１０１である請求
項７記載の核酸分子。
（９）￥クラミドモナス￥￥ラインハーティ￥に対し異
型である遺伝子を含み、該遺伝子がコドンの第３塩基位
置にアデニン残基をもつコドンを実質的に含まないこと
を特徴とする、￥クラミドモナス￥￥ラインハーティ￥
を形質転換するのに適した核酸分子。
（１０）該異型遺伝子が生存性選択標識遺伝子である請
求項９記載の核酸分子。
（１１）￥クラミドモナス￥￥ラインハーティ￥に対し
異型の構造遺伝子に動作可能に結合したベクターを含み
、該構造遺伝子がコドンの第３塩基位置にアデニン残基
をもつコドンを実質的に含まないことを特徴とする組換
え核酸分子。
（１２）（ａ）請求項６記載の核酸分子を￥クラミドモ
ナス￥￥ラインハーティ￥細胞集団の少なくとも一つに
導入して、形質転換体含有集団を作製する工程；（ｂ）該形質転換ＤＮＡ分子によって誘発される表現型
を表現する該形質転換体含有集団の一細胞をクローニン
グしかつ保持する工程を含むクローン化した￥クラミド
モナス￥￥ラインハーティ￥形質転換体の製法。
（１３）請求項１記載の核酸分子で形質転換された￥ク
ラミドモナス￥￥ラインハーティ￥細胞。
（１４）プラスミドｐＳＢ１０１のＥｃｏＲＩ−Ｓａｌ
ＩＯＥＥ１−由来のエンドヌクレアーゼ制限フラグメン
トを含むＤＮＡ分子。
（１５）プロモータを含み、該プロモータはこれに対し
て異型の構造遺伝子に動作可能に結合されており、該プ
ロモータはプラスミドｐＳＢ１０１のＥｃｏＲＩ−Ｓａ
ｌ I ＯＥＥ１−由来のエンドヌクレアーゼ制限フラグ
メントを含むことを特徴とする￥クラミドモナス￥￥ラ
インハーティ￥を形質転換するのに適した核酸分子。