KR102253722B1

KR102253722B1 - 전자전달시스템의 플럭스 재설계를 통한 메탄 산화 활성이 향상된 형질전환 메탄자화균

Info

Publication number: KR102253722B1
Application number: KR1020200099764A
Authority: KR
Inventors: 이은열; 덕 안 뉴엔; 이옥경; 현승운
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2020-08-10
Filing date: 2020-08-10
Publication date: 2021-05-21

Abstract

본 발명은 메탄자화균 내 전자전달 시스템의 플럭스 재설계를 통하여 메탄 산화 활성이 향상된 형질전환 메탄자화균 및 이를 활용한 고부가가치 알코올 및 아세톤을 생산하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 전자전달 시스템의 complex IV인 사이토크롬 aa3 산화효소의 결손 및 사이토크롬 c6 (cytochrome c6) 과발현을 통하여 역전자 흐름을 구축하여 pMMO에 전자가 추가로 제공되어 메탄 산화활성이 향상된 형질전환 메탄자화균을 제공한다. 이는 저가의 알칸으로부터 고부가가치 알코올 등의 유용 산물을 제조할 수 있는 원천 기술로 이용 가능하다.

Description

전자전달시스템의 플럭스 재설계를 통한 메탄 산화 활성이 향상된 형질전환 메탄자화균 {Transformed methanotroph with improved methane oxidation activity via flux redesign of electron transfer system}

본 발명은 전자전달시스템의 플럭스 재설계를 통한 메탄 산화 활성이 향상된 형질전환 메탄자화균에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 메탄자화균 내 메탄 산화 메커니즘을 규명하고, 전자전달 시스템의 플럭스 재설계를 통한 메탄 산화 활성이 향상된 형질전환 메탄자화균 및 이를 활용한 고부가 가치의 알코올 및 아세톤 생산 방법에 관한 것이다.

메탄은 셰일가스의 주요성분이며 지구온난화를 일으키는 대표적 온실가스 중 하나로 이산화탄소 대비 배출량은 낮으나, 온난화 지수가 20배이상 높은 것으로 알려져 있다. 이에 따라, 메탄을 유용물질 생산을 위한 탄소원으로 사용하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있으나 아직 연구 초기 단계로 생산수율이 낮아, 산업적으로 활용되기는 어려운 실정이다.

메탄자화균은 메탄을 유일 탄소원 및 에너지원으로 사용할 수 있는 원핵생물이다. 메탄자화균은 메탄산화효소를 보유하고 있어 메탄을 메탄올로 산화시킬 수 있고 일련의 대사과정을 거쳐 바이오매스로 전환할 수 있는 능력을 가지고 있다.

메탄 산화의 대사 네트워크는 미립자메탄산화효소 (particulate methane monooxygenase, pMMO) 및/또는 수용성 메탄산화효소 (soluble methane monooxygenase, sMMO)를 사용하여 메탄을 메탄올로 산화시키는 것으로 시작된다. pMMO가 메탄 전환을 위한 가장 효율적인 효소 시스템이지만, 현재까지 pMMO의 생리학적 전자 공여체 (physiological electron donor)는 정확히 알려져 있지 않다. 현재, 메탄 산화를 위한 3가지 메커니즘 ; 레독스 암 (redox arm), 다이렉트 커플링 (direct coupling), 업힐 전자 이동 (uphill electron transfer)이 고려되고 있다. 레독스 암 (redox arm)은 전자전달시스템에서 복합체 I 에 의해 NADH의 2개의 전자를 유비퀴놀 (UQH2)에 전달하고 이를 pMMO에 제공하는 메커니즘이고, 다이렉트 커플링 (direct coupling)은 PQQ 의존적 메탄올 탈수소효소를 통한 메탄올 산화로부터의얻은 전자가 pMMO로 직접 전달되는 메커니즘이며, 업힐 전자 이동 (uphill electron transfer)은 메탄올 산화로부터 제공된 전자가 복합체 III의 역조작을 통해 유비퀴놀-풀 (ubiquinol-pool)로 다시 공급되고 이는 메탄 산화를 지원한다는 메커니즘이다. 메탄자화균의 메탄 산화를 위해 레독스 암 (redox arm) 메커니즘을 기반으로 한 연구가 진행되었지만, 현재까지 다이렉트 커플링 (direct coupling) 메커니즘이 관찰된 성장 매개변수 (parameter)에 가장 적합하다.

메탄자화균에서 메탄 산화 효율은 세포 성장 및 메탄 전환율에 밀접한 영향을 미치며 메탄 산화는 전자전달 시스템의 전자 흐름에 대한 이해가 중요하다. 대부분의 메탄자화균의 탄소원으로 메탄 또는 메탄올만을 탄소원으로 이용할 수 있어 돌연변이체 제작 등의 실험적 방법을 통한 메탄 산화 메카니즘 규명은 한계가 있다. 따라서 본 발명자들은 자일로스를 탄소원으로 사용할 수 있는 메탄자화균을 활용하여 메탄자화균의 전자전달 시스템을 규명하고 전자전달 시스템의 플럭스를 역전자 흐름으로 재조절함으로써 메탄산화 활성이 향상된 형질전환 메탄자화균을 제공하고자 하였다. 또한 이를 이용하여 저가의 알칸으로부터 고부가가치 알코올 및 아세톤 생산 기술을 확보하고자 하였다.

본 발명의 목적은 사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochrome aa3 oxidase)를 코딩하는 유전자의 상류 (upstream) 염기서열, 사이토크롬 c6 (cytochrome c6)를 코딩하는 유전자, 사이토크롬 aa3 산화효소 유전자 치환용 카세트 및 사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochrome aa3 oxidase)를 코딩하는 유전자의 하류 (downstream) 염기서열을 포함하는 메탄 산화 활성 증대용 재조합 벡터를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochrome aa3 oxidase)를 코딩하는 유전자가 결실 (deletion) 또는 적중 (knockout)되어 있고, 사이토크롬 c6 (cytochrome c6)를 코딩하는 유전자가 증폭 (amplification)된 2-프로판올 또는 아세톤 생산용 형질전환 메탄자화균을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 메탄자화균, 이의 배양여액 또는 배양산물을 포함하는 2-프로판올 또는 아세톤 생산용 조성물을 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 2-프로판올 또는 아세톤 생산용 키트를 제공하는 데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 메탄자화균을 이용한 2-프로판올 또는 아세톤 생산방법을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochrome aa3 oxidase)를 코딩하는 유전자의 상류 (upstream) 염기서열, 사이토크롬 c6 (cytochrome c6)를 코딩하는 유전자, 서열번호 2로 표시되는 사이토크롬 aa3 산화효소 유전자 치환용 카세트 및 서열번호 3으로 표시되는 사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochrome aa3 oxidase)를 코딩하는 유전자의 하류 (downstream) 염기서열을 포함하는 메탄 산화 활성 증대용 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 상기 재조합 벡터는 사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochrome aa3 oxidase)를 코딩하는 유전자를 녹아웃 (knockout) 시키는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 재조합 벡터는 사이토크롬 c6 (cytochrome c6)를 코딩하는 유전자를 도입 또는 증폭시키는 것을 특징으로 한다.

이어서, 사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochrome aa3 oxidase)를 코딩하는 유전자가 결실 (deletion) 또는 적중 (knockout)되어 있고, 사이토크롬 c6 (cytochrome c6)를 코딩하는 유전자가 증폭 (amplification)된 2-프로판올 또는 아세톤 생산용 형질전환 메탄자화균을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 메탄자화균, 이의 배양액, 이의 배양여액 및 이의 균현탁액 중 적어도 하나를 유효성분으로 포함하는 2-프로판올 또는 아세톤 생산용 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 2-프로판올 또는 아세톤 생산용 키트를 제공한다.

마지막으로, 본 발명은 상기 메탄자화균을 이용한 2-프로판올 또는 아세톤 생산방법을 제공한다.

본 발명은 메탄자화균 내 전자전달 시스템의 플럭스 재설계를 통하여 메탄 산화 활성이 향상된 형질전환 메탄자화균 및 이를 활용한 고부가가치 알코올 및 아세톤을 생산하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 전자전달 시스템의 complex IV인 사이토크롬 aa3 산화효소의 결손 및 사이토크롬 c6 (cytochrome c6) 과발현을 통하여 역전자 흐름을 구축하여 pMMO에 전자가 추가로 제공되어 메탄 산화활성이 향상된 형질전환 메탄자화균으로 기존 메탄자화균 대비 알코올 생산성의 향상을 기대할 수 있다.

도 1은 메탄자화균 M. alcaliphilum 20Z의 전자전달 시스템 역전자흐름을 경로를 나타낸 것이다.
도 2는 사이토크롬 aa3 산화효소를 녹아웃 (knockout) 및 사이토크롬 c6를 과발현을 위해 제작된 재조합 선형 DNA를 나타낸 것이다.
도 3는 사이토크롬 aa3 산화효소를 녹아웃 (knockout)시키고 사이토크롬 c6를 과발현시킨 형질전환 균주 MET 8과 야생형 M. alcaliphilum 20Z의 전기영동사진이다.
도 4은 MET8과 야생형 M. alcaliphilum 20Z의 사이토크롬 c6 (cytochrome c6)에 대한 qRT-PCR 결과에 대한 fold-change를 나타낸 그래프이다.
도 5는 MET8과 야생형 M. alcaliphilum 20Z를 각각 생촉매로 사용하여 프로판 (Propane)에서 2-프로판올 (2-propanol) 및 아세톤 생산성을 비교한 그래프이다.

이하, 본 발명에 대하여 보다 상세하게 설명하도록 한다.

본 발명은 전자전달 시스템의 플럭스 재설계를 통한 메탄 산화 활성이 증대된 형질전환 메탄자화균에 관한 것이다.

도 1은 메탄자화균 M. alcaliphilum 20Z의 전자전달 시스템에서 역전자흐름을 경로를 간단히 도식화하여 나타낸 것이다. 메탄자화균의 전자전달시스템에 대해서 살펴보면, 메탄올 산화를 통해 제공된 전자는 complex IV인 사이토크롬 c 산화환원효소 (cyt aa3, cyt ba3)로 전달되어 최종 전자수용체인 산소로 전달되어 물로 환원된다 (도 1 참조). complex IV는 전자를 운반할 수 있지만 수소이온은 운반하지 못하며 이는 수소이온이 세포주변질 (periplasm)으로 나가는 지점이다. 전자 전달계가 정상적으로 작동한다면, 세포주변질의 양성자 농도가 증가하고 이로 인해 ATP 생성이 동반되는 것이다. 따라서, complex IV인 사이토크롬 c 산화환원효소 (cyt aa3)를 억제한다면 전자 흐름이 바뀌어 역전자 흐름 (reverse electron flow)을 형성함으로써 전자는 complex III와 UQH2를 거쳐 최종적으로 pMMO에 추가 제공되어 메탄 산화 활성의 향상을 기대할 수 있다. 또한, 메탄자화균은 광영양성 유기체 (phototrophic organism)에서 특이적으로 발견되는 사이토크롬 c6 (cytochrome c6)를 보유하고 있어 complex III 및 UQH2로의 역전자 흐름의 추가로 조절할 수 있다.

본 발명자들은 메탄자화균의 전자전달 시스템 내 역전자 흐름을 구축하여 전자를 최종적으로 pMMO에 공급함으로써 메탄 산화활성이 향상된 형질전환 메탄자화균을 제공하고자 하였다. 이를 위하여 전자전달 시스템의 complex IV인 사이토크롬 c 산화환원효소 (cyt aa3) 활성을 약화 또는 불활성화시키고, 사이토크롬 c6 (cytochrome c6) 단백질을 과발현시킨 형질전환 메탄자화균을 제작하였다. 이어서, 상기 형질전환 메탄자화균이 야생형 메탄자화균에 비해 대사물질 생산이 증대된 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochrome aa3 oxidase)를 코딩하는 유전자의 상류 (upstream) 염기서열, 사이토크롬 c6 (cytochrome c6)를 코딩하는 유전자, 사이토크롬 aa3 산화효소 유전자 치환용 카세트 및 사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochrome aa3 oxidase)를 코딩하는 유전자의 하류 (downstream) 염기서열을 포함하는 메탄 산화 활성 증대용 재조합 벡터를 제공한다.

상기 사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochrome aa3 oxidase)를 코딩하는 유전자의 상류 (upstream) 염기서열은 서열번호 1로 표시되고, 상기 사이토크롬 aa3 산화효소 유전자 치환용 카세트는 서열번호 2로 표시되며, 상기 사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochrome aa3 oxidase)를 코딩하는 유전자의 하류 (downstream) 염기서열은 서열번호 3으로 표시되는 것일 수 있다.

또한, 상기 사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochrome aa3 oxidase)를 코딩하는 유전자의 상류 (upstream) 염기서열은 서열번호 5로 표시되는 사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochrome aa3 oxidase)를 코딩하는 유전자의 상류 영역 (upstream region)에 위치하는 것일 수 있다.

또한, 상기 사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochrome aa3 oxidase)를 코딩하는 유전자의 하류 (downstream) 염기서열은 서열번호 5로 표시되는 사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochrome aa3 oxidase)를 코딩하는 유전자의 하류 영역 (downstream region)에 위치하는 것일 수 있다.

또한, 상기 재조합 벡터는 사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochrome aa3 oxidase)를 코딩하는 유전자를 녹아웃 (knockout) 시키는 것일 수 있다.

또한, 상기 녹아웃 (knockout)은 사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochrome aa3 oxidase)를 코딩하는 유전자의 치환, 결실, 및/또는 삽입을 위해 이루어지는 것일 수 있다.

또한, 사이토크롬 c6 (cytochrome c6)를 코딩하는 유전자 (petJ)는 M. alcaliphilum 20 유래일 수 있으며, 서열번호 4의 염기서열로 구성된 것일 수 있다. 상기 서열번호 4의 서열과 70% 이상, 구체적으로 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서 실질적으로 사이토크롬 c6 (cytochrome c6) 단백질을 발현 가능한 경우, 제한 없이 포함될 수 있다.

또한, 상기 재조합 벡터는 사이토크롬 c6 (cytochrome c6)를 코딩하는 유전자를 도입 또는 증폭시키는 것일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 “사이토크롬 c6 (cytochrome c6)”는 광영양성 유기체 (phototrophic organism)에서 역전자매개체 (reverse electron carrier) 역할을 하는 단백질을 의미하나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 재조합 벡터는 사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochrome aa3 oxidase)를 코딩하는 유전자를 사이토크롬 c6 (cytochrome c6)를 코딩하는 유전자로 치환시키는 것일 수 있으나, 상기 사이토크롬 c6 (cytochrome c6)를 코딩하는 유전자의 삽입 위치는 사이토크롬 c6 (cytochrome c6)를 증폭시키기 위해서 숙주세포 내 어디든 삽입될 수 있으며 특별히 제한되지는 않는다.

또한, 상기 재조합 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA, 재조합 바이러스성 벡터 등 숙주세포에 도입되어 외래 유전자를 전달할 수 있는 것이라면 제한되지 않고 포함할 수 있다. 상기 재조합 바이러스는 레트로 바이러스, 아데노 바이러스, 아데노 부속 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스 및 렌티바이러스로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이어서, 본 발명은 상기 사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochrome aa3 oxidase)를 코딩하는 유전자가 결실 (deletion) 또는 적중 (knockout)되어 있고, 사이토크롬 c6 (cytochrome c6)를 코딩하는 유전자가 증폭 (amplification)된 2-프로판올 또는 아세톤 생산용 형질전환 메탄자화균을 제공한다.

또한, 상기 사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochrome aa3 oxidase)를 코딩하는 유전자 (ctaE, ctaG, ctaD ctaC)는 M. alcaliphilum 20 유래일 수 있으며, 서열번호 5의 염기서열로 구성된 것일 수 있다. 상기 서열번호 5의 서열과 70% 이상, 구체적으로 80% 이상, 보다 구체적으로는 90%이상, 보다 더 구체적으로는 95%이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기서열로서 실질적으로 사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochrome aa3 oxidase) 활성을 가진 단백질을 발현 가능한 경우, 제한 없이 포함될 수 있다.

또한, 상기 형질전환 메탄자화균은 사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochrome aa3 oxidase)의 활성이 약화 또는 불활성화된 것일 수 있다.

또한, 상기 형질전환 메탄자화균은 사이토크롬 c6 (cytochrome c6) 단백질이 과발현된 것일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "메탄자화균 (methanotroph)"은 메탄을 주요 탄소원 또는 에너지원으로 사용하는 세균을 의미한다. 상기 메탄자화균은 본 발명에서 형질전환의 대상이 되는 숙주 균주를 의미한다.

상기 메탄자화균은 메탄 등 C₁화합물을 에너지원으로 사용할 수 있는 것인한 특별히 이에 제한되지 않으나, 메틸로모나스 속 (Methylomonas), 메틸로박터속(Methylobacter), 메틸로코커스 속 (Methylococcus), 메틸로스페라 속(Methylosphaera), 메틸로칼덤 속 (Methylocaldum), 메틸로글로버스 속(Methyloglobus), 메틸로사르시나 속 (Methylosarcina), 메틸로프로펀더스 속(Methyloprofundus), 메틸로썰머스 속 (Methylothermus), 메틸로할로비우스 속(Methylohalobius), 메틸로게아 속 (Methylogaea), 메틸로마리넘 속(Methylomarinum), 메틸로벌럼 속 (Methylovulum), 메틸로마리노범 속(Methylomarinovum), 메틸로러브럼 속 (Methylorubrum), 메틸로파라코커스 속(Methyloparacoccus), 메틸로시스티스 속 (Methylocystis), 메틸로셀라 속 (Methylocella), 메틸로캡사 속 (Methylocapsa), 메틸로퍼룰라 속 (Methylofurula), 메틸아시디필럼 속 (Methylacidiphilum), 메틸아시디마이크로븀 속 (Methylacidimicrobium), 메틸로마이크로븀 (Methylomicrobium) 속 또는 메틸로시 너스 속 (Methylosinus) 균주 일 수 있으며, 구체적으로 메틸아시디마이크로븀 알칼리필리엄 (Methylomicrobium alcaliphilum) 20Z일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 “형질전환”은 미생물이 외부로부터 주어진 DNA를 받아들여 미생물의 유전적 성질이 변하는 것을 의미한다.

또한, 상기 형질전환은 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술, 예들 들어, 전기천공법 (electroporation), 전기주입법 (electroinjection), 미세주입법 (microinjection), 인산칼슘공동-침전법 (calcium phosphate co-precipitation), 염화캄슘/염화루비듐법, 레트로바이러스 감염 (retroviral infection), DEAE-덱스트란 (DEAE-dextran), 양이온 리포좀 (cationic liposome)법, 폴리에틸렌 글리콜 침전법 (polyethylene glycol-mediated uptake), 유전자총 (gene gun) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용되는 용어 "형질전환 메탄자화균"은 상기 메탄자화균의 유전자를 도입하거나 또는 제거하여 형질을 전환시킨 균주를 의미한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 메탄 산화 활성 증대를 위하여, 형질전환 메탄자화균 XYL1 내에 사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochrome aa3 oxidase)를 코딩하는 유전자를 녹아웃 (knockout)시키고 그 위치에 사이토크롬 c6 (cytochrome c6)를 코딩하는 유전자를 도입하여 형질전환 메탄자화균 MET8을 얻었다.

상기 XYL1은 야생형 메틸아시디마이크로븀 알칼리필리엄 (Methylomicrobium alcaliphilum) 20Z을 자일로스를 탄소원으로 이용 가능하도록 제작된 형질전환 메탄자화균을 말한다.

이어서, 본 발명은 상기 형질 전환 메탄자화균, 이의 배양여액 또는 이의 배양산물을 포함하는 2-프로판올 또는 아세톤 생산용 조성물을 제공한다.

또한, 상기 배양산물은 균주의 배양물, 배양상등액, 파쇄물 및 이들의 분획물로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

더욱 구체적으로, 상기 배양상등액은 균주의 배양물을 원심분리하여 수득할 수 있고, 상기 파쇄물은 균주를 물리적으로 또는 초음파처리하여 수득할 수 있으며, 상기 분획물은 상기 배양물, 배양상등액, 파쇄물 등을 원심분리, 크로마토그래피 등의 방법에 적용하여 수득할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 용어 “조성물”은 목적 물질을 생산하기 위한 다양한 물질을 혼합한 것으로서, 미생물 배양배지, 탄소원, 미량 원소 및 미생물 종균이 포함된 것을 의미한다.

본 발명의 2-프로판올 또는 아세톤 생산용 키트는 상기 조성물을 포함하여 2-프로판올 또는 아세톤을 생산하는데 사용될 수 있는데, 특별히 이에제한되지 않으나, 상기 반응에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있고, 구체적인 예로 상기 아세톤 생산에 사용되는 완충액, 상기 아세톤 생산을 수행하기 위한 반응용기, 상기 2-프로판올 또는 아세톤 생산을 수행하기 위한 진탕배양기, 상기 2-프로판올 또는 아세톤 생산 반응을 수행하기 위한 타이머 등을 포함할 수 있다.

마지막으로, 본 발명은 상기 형질전환 메탄자화균을 메탄 (methane)이 포함된 배양배지에서 배양하는 단계를 포함하는 2-프로판올 또는 아세톤 생산방법을 제공한다.

또한, 상기 방법은 상기 배양된 형질전환 메탄자화균으로부터 생산된 2-프로판올 또는 아세톤을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "배양"은 목적하는 세포 또는 조직 등을 인공적으로 조절한 환경 조건에서 생육하는 것을 의미한다. 상기 환경 조건은 대표적으로 영양소, 온도, 삼투압, pH, 기체 조성, 빛 등이 있으나, 직접적인 영향을 주는 것은 배지이며, 배지는 크게 액체배지와 고체배지로 나뉠 수 있다. 본 발명의 형질전환 메탄자화균의 배양은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다.

구체적으로, 상기 배양은 상기 형질전환 메탄자화균으로부터 2-프로판올 또는 아세톤을 생산할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정 (fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 메탄자화균의 배양에 사용되는 것으로 알려진 NMS (nitrate mineral salts) 배지를 사용할 수 있고, 메탄자화균에 따라 상기 배지에 포함된 성분 또는 이의 함량을 적절히 조절한 배지를 사용할 수 있으나, 이에 특별히 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 생산방법은 배양액으로부터 2-프로판올 또는 아세톤을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 2-프로판올 또는 아세톤을 회수하는 단계는 배양 방법에 따라 당업계에 공지된 적합한 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 공지된 2-프로판올 또는 아세톤 회수 방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증발, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해 (예를 들면 암모늄 설페이트 침전), 크로마토그래피 (예를 들면 HPLC, 이온교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법이 사용될 수 있다.

또한, 상기 형질전환 메탄자화균은 탄소원으로 메탄을 제공하는 배양배지에서 배양할 때 야생형 메탄자화균에 비해 메탄 산화 활성이 증대되어 대사물질의 생산이 향상된 것일 수 있다. 상기 대사물질은 2-프로판올 또는 아세톤일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 배양액에 존재하는 2-프로판올의 농도를 분석한 결과, 야생형 메탄자화균과 비해 2-프로판올의 농도가 45배 이상 높은 것을 확인하였다 (도 5 참조). 이는, 본 발명의 메탄자화균은 프로판을 2-프로판올로 전환하므로, 2-프로판올의 생산에 매우 유용하게 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.

이하, 본 발명의 실시예를 첨부된 도면을 참고하여 보다 상세하게 설명하도록 한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐, 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아닐 것이다.

<실시예 1> 균주의 준비 및 배양 조건

본 발명에서 사용한 균주는 하기 표 1에 나타내었다. M. alcaliphilum 20Z 균주는 500 ml의 베플 플라스크 (baffled flask)에서 50 ml NMS를 제공하고 스크류 캡을 이용하여 입구가 밀봉된 상태로 배양되었다. 탄소원으로는 가스치환기 (gas-tight syringe)를 이용하여 배양배지의 50 부피%로 메탄을 첨가하였다.

종속 영양 성장을 위해, 제작된 M. alcaliphilum 20Z를 탄소원으로서 메탄을 대신하여 10 g/L 자일로스 (xylose)가 포함된 배지에서 배양하였다. 성장률 실험을 위해 각 배양의 초기 광학밀도는 OD₆₀₀ = 0.05로 설정하였다. 배양된 균주는 50 ㎍/mL 카나마이신, 10 ㎍/mL 겐타마이신, 30 ㎍/ mL 제오신, 50 ㎍/mL 스펙티모마이신을 포함하는 배지에 접종하여, 재조합 플라스미드를 함유하는 메탄자화균을 선택하였다.

균주	특징	문헌
Escherichia coli DH5α		선행문헌
Escherichia coli K12 MG1655		선행문헌
Methylotuvimicrobium alcaliphilum 20Z	Wild-type, used as host strain	선행문헌
XYL1	M. alcaliphilum 20Z harboring pXyl	선행문헌
MET8	M. alcaliphilum 20Z with deletion of aa3 oxidation while integration of petJ (MEALZ_0938)	본 발명

<실시예 2> 형질전환을 위한 재료 및 도구

M. alcaliphilum 20Z 및 E. coli K12 MG1655의 gDNA는 Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 분리하였고, PCR은 표 2의 프라이머와 Lamp Pfu polymerase (BioFACT, 대전, 대한민국)를 사용하여 수행하였다. PCR 정제 키트 및 겔 추출 키트는 Gene all 제품을 사용하였다. 올리고뉴클레오티드 및 DNA 서열 분석은 Macrogen에 의뢰하여 합성하였다. NAD-dependent MDH는 한국생명공학 연구원에서 제공되었다.

프라이머	서열	특징
pAWP89-For	TAGTTGTCGGGAAGATGCGT	For amplifying pAWP89 backbone which contained P_tacpromoter
pAWP89-Rev	AGCTGTTTCCTGTGTGAATA
C6_F1-For	ATCAAAACGATGGCGGGACT
C6_F2-Rev	CGGATAATAAGGCGCCCAGT
aa3-F1-For	CCGGAAAACCGGTCGGATAA	Construction of linear fragment for deletion of aa3 oxidase and integration of cytochrome c6 driving by P_tacpromoter
aa3-F1-Rev-Tac	CAACAGCTCATTTCAGAGGTCGATAACAGGGCATCAAA
c6-For-Inter	CTCTGAAATGAGCTGTTGACAATTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAGGTATTCACACAGGAAACAGCTATGAGTAAATCTTTAAAAATCGCT
c6-Rev-Inter	GCCGATGATTAATTGTCATTACCAGCCTTTTTTTGCCTGT
Kan-For	TGACAATTAATCATCGGC
Kan-Rev	CGACAGTGCCCTGAGGTT
aa3-F2-For	AACCTCAGGGCACTGTCGAATTTCCTCTCCTGTGTTGA
aa3-F2-Rev	GCCTCGATACCGGTGCAATA
C6-qPCR-For	TGCTCAGGCCAATGATGTT	qRT-PCR for cytochrome c6 (petJ)
C6-qPCR-Rev	CCGAAACGCTTTCGATTTCTTC	qRT-PCR for cytochrome c6 (petJ)
rpoD-qPCR-For	CAACAGCAGTCCCAACTTAAAC	qRT-PCR for rpoD
rpoD-qPCR-Rev	CCGATCCCATTTCCCTCATATAC	qRT-PCR for rpoD

<실시예 3> 재조합 벡터 제작

사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochrome aa3 oxidase)를 코딩하는 유전자의 상류 (upstream) 염기서열 (서열번호 1) 및 하류 (downstream) 염기서열 (서열번호 3), 사이토크롬 c6 (cytochrome c6)를 코딩하는 유전자 (서열번호 4) 및 서열번호 2로 표시되는 사이토크롬 aa3 산화효소 유전자 치환용 카세트를 포함하는 다수의 DNA 단편의 조립한 재조합 벡터 제작을 위해, 프라이머를 통해 각각 두 개의 단편 사이에 20 개의 염기가 중첩 (overlap)되도록 도입되었다. 이들 단편을 증폭시키고 정제하여 재조합 선형 DNA를 제작하고 Gibson aseembly를 사용해 벡터를 제작하였다. Gibson aseembly로부터의 반응 혼합물을 PCR의 주형으로서 사용하였다. 생성된 생성물을 겔 정제 키트 (Geneall, 한국)를 사용하여 정제하였다. 본 발명에서 구축된 재조합 선형 DNA는 표 3 및 도 2에 나타내었다. 도 2는 사이토크롬 aa3 산화효소를 녹아웃 (knockout) 및 사이토크롬 c6를 과발현을 위해 제작된 재조합 선형 DNA를 나타낸 것이다.

벡터	특징
F1(aa3)-pTac-c6-kan-F2(aa3)	Expression of cytochrome c6 and deletion of aa3 oxidase

<실시예 4> 유전자 녹아웃 (knockout)을 위한 ZS, GR, SPC 카세트 제작

ZS 카세트는 P_tac 프로모터 및 Streptoalloteichus hindustanus 로부터의 lacZ 및 제오신 (zeocin) 내성 유전자의 SD 서열의 조합에 의해 구축되었다. SPC 카세트도 유사한 방법으로 구성하였다. 프로모터, SD 서열 및 젠타마이신 (gentamicin) 내성 유전자를 함유하는 GR 카세트를 pCM351 벡터로부터 직접 증폭시켰다. 유전자 결실을 위해서, 사이토크롬 aa3 산화효소를 코딩하는 유전자에 인접하는 600-800 bp의 서열은 M. alcaliphilum 20Z 로부터 증폭되었고, Gibson assembly-기반 fusion PCR을 이용하여 ZS, GR, SPC 카세트와 함께 조립하여 서열번호 2로 표시되는 사이토크롬 aa3 산화효소 치환용 카세트 Kan-cassette를 제작하였다.

<실시예 5> M. alcaliphilum 20Z의 전기 천공법 기반 유전자 조작 방법

M.alcaliphilum 20Z 균주의 50ml 배양액을 약 0.6의 광학 밀도 (OD₆₀₀)에 도달할 때까지 성장시켰다. 이후, 5,000rpm, 4 ℃에서 10 분간 원심분리하고, 50ml의 차가운 물에 재현탁하여 세포를 수득하였다. 상기 세포 펠릿을 차가운 물로 2회 세척하고, 생성된 펠릿을 증류수 100ml에 재현탁하였다. 세포 현탁액 50μL를 500ng의 DNA 플라스미드와 부드럽게 혼합하고, 혼합물을 차가운 1mm 큐벳 (Bio-Rad)으로 옮겼다. 전기천공은 1.3kV, 25㎌ 및 200Ω으로 설정된 Gene Pulser Xcell^TM 전기천공 시스템 (Bio-Rad)을 사용하여 수행하였다. 즉, NMS 1ml를 세포에 첨가한 후, 세포 회수를 위해 0.1% 메탄올을 포함하는 180ml 혈청 병에서 10ml NMS 배지로 옮겼다. 30℃에서 밤새 교반하며 배양 후, 세포를 실온에서 10분 동안 5,000rpm으로 원심 분리하고, 1ml 배지에 재현탁하여 항생제가 함유된 NMS 배지에 도말하였다. 이중 교차 클론은 콜로니 PCR 및 시퀀싱에 의해 확인되었다.

<실시예 6> in silico에서 플럭스 균형 분석 및 MCMC 샘플링을 통한 물질대사 흐름 분석

in silico에서 물질대사 전자전달과정을 분석하기 위해, M. alcaliphilum의 게놈-스케일 모델인 iIA407 와 COBRApy의 플럭스 균형 분석 (flux balance analysis, FBA) 및 MCMC (Markov chain Monte Carlo) 샘플링을 수행하였다. 각각 모델의 반응에서 플럭스 분포 (flux distribution)는 MCMC (Markov chain Monte Carlo) 샘플링을 통해 결정되었다. 탄소원 (메탄과 메탄올)에 대한 흡수율은 각각 11.7mmol/gDW/h와 22 mmol/gDW/h로 제한되었다. 바이오매스 목적 함수(biomass objective function, BOF)는 플럭스 균형 분석 (flux balance analysis, FBA)으로 계산한 최적 증가율 95% 이하로 설정되었다. 따라서, MCMC (Markov chain Monte Carlo) 샘플링 방법에 의한 샘플 플럭스 (flux) 분포는 차선의 (sub-optimal) 플럭스 분포로 나타낼 수 있다. MCMC (Markov chain Monte Carlo) 샘플링은 10만개의 실현 가능한 플럭스를 가진 optGpSampler 샘플링 알고리즘에 의해 수행되었다. 바이오매스 목적 함수 (biomass objective function, BOF)에 대한 평균 플럭스 값이 정상화된 후 각 반응의 플럭스 값을 사용하여 추가 분석을 수행하였다. 그 결과는 도 1에 간단히 모식화하여 나타내었다. 도 1은 메탄자화균 M. alcaliphilum 20Z의 전자전달 시스템 역전자흐름을 경로를 나타낸 것이다.

<실시예 7> 분석 방법

7-1. 생체 내 MMO 효소 분석

균주는 충분한 탄소원과 함께 30 °C에서 230 rpm으로 진탕 (shake)하고 NMS 배지에서 전 배양 (precultured) 하였다. 그 후 NMS 배지로 세포를 2회 세척하고, 새로운 NMS 배지에서 OD₆₀₀=0.5까지 성장시켰다. 메탄 (methan) 또는 프로판 (propane)은 배양배지의 50 부피% 로 첨가하였다. 샘플은 HPLC를 이용한 2-프로판올, 아세톤 생산 분석 위해 시료로 채취하였다.

7-2. qRT-PCR

전체 RNA는 박테리아 시약 RNAprotect (Qiagen, Hilden, Germany)로 안정화 시킨 후, 제조사의 프로토콜에 따라 RNase-Free DNase Set (Qiagen)를 처리하여 DNA 오염을 제거하고 RNeasy Mini Kit (Qiagen)를 사용하여 추출하였다. cDNA는 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific, Waltham, USA)를 사용하여 준비하고, qRT-PCR의 주형으로서 사용하였다. qRT-PCR은 GoTaq qPCR Master Mix (Promega)을 사용하여 수행하였다. 각 유전자에 대한 임계값 (cycle threshold, Ct)을 결정하고, 하우스키핑 유전자 (housekeeping gene)로 rpoD를 사용하여 정규화하고, ΔΔCt 방법을 사용하여 두 표본사이에 상대적인 발현 (Relative expression) 계산하였다.

<실시예 8> 전자 전달 제어를 통한 메탄 산화 효율 향상

실시예 6의 대사 흐름 분석을 통해 사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochrom aa3 oxidase)는 complex IV에서 주요 구성성분이며, 사이토크롬 c6 (cytochrome c6)는 역전자흐름에서 작용되는 주요 구성성분임을 확인하였다. 따라서, M. alcaliphilum 20Z에서 역전자흐름 (reverse electron flow)이 존재하면 환원제 (reductant) 가용성을 향상시키기 위한 기작의 엔지니어링 가능하다는 것을 확인하기 위해, M. alcaliphilum 20Z를 형질전환 시켜 MET8을 제작하고 qRT-PCR 및 생체내 MMO (methane monooxygenase) 분석을 수행하고자 하였다.

이를 위하여, 자일로스를 탄소원으로 사용할 수 있는 형질전환 균주 XYL1에 사이토크롬 aa3 산화효소를 녹아웃 (knockout)시킴과 동시에 P_tac 프로모터를 사용하여 사이토크롬 c6를 도입한 형질전환 균주 MET8을 제작하였다. 형질전환 여부는 전기영동 결과를 통해 확인하였으며 그 결과는 도 3에 나타내었다. 도 3는 사이토크롬 aa3 산화효소를 녹아웃 (knockout)시키고 그 위치에 사이토크롬 c6를 과발현 시킨 형질전환 균주 MET 8과 야생형 M. alcaliphilum 20Z의 전기영동사진이다.

형질전환 균주 MET8의 사이토크롬 c6 과발현과 환원제의 과잉생산을 실시예 7에 기재한 방법으로 qRT-PCR 및 2-프로판올 분석을 통해 확인하였다. 그 결과는 도 4 및 5에 나타내었다. 도 4은 MET8과 야생형 M. alcaliphilum 20Z의 사이토크롬 c6 (cytochrome c6)에 대한 qRT-PCR 결과에 대한 fold-change를 나타낸 그래프이고, 도 5는 MET8과 야생형 M. alcaliphilum 20Z를 각각 생촉매로 사용하여 프로판 (Propane)에서 2-프로판올 (2-propanol) 및 아세톤 생산성을 비교한 그래프이다. 야생형 M. alcaliphilum 20Z 대비 본원발명의 MET8 균주에서 2-프로판올 (2-propanol)의 생산량이 현저하게 증가함을 확인하였다.

또한, 도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 형질전환 균주 MET8의 사이토크롬 c6는 야생형 M. alcaliphilum 20Z에 비해 약 6배 이상 과발현되었음을 알 수 있다. 이러한 결과는 마찬가지로 MET8에서 프로판의 바이오트랜스폼 (biotransformation)에서 야생형 M. alcaliphilum 20Z보다 45배 이상 높게 나타나는 것을 확인하였다. qRT-PCR 및 프로판 분석을 통해 형질전환 균주 MET8의 역전자흐름이 활성화되었으며 메탄 산화 효율이 증대된 형질전환 균주 MET8에서 더 많은 환원제가 존재한다는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 본 발명의 메탄자화균은 전자전달 시스템 조절 통해 역전자흐름 경로를 활성화시켜 많은 환원제를 생산할 수 있으며, 이는 메탄 산화 활성이 향상시켜 대사물질 생산능이 현저히 상승된 형질전환 메탄자화균이라는 것을 의미한다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 구체적인 실시예를 상세하게 설명되었으나, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서 다른 구성요소를 추가, 변경, 삭제 등을 통하여, 퇴보적인 다른 발명이나 본 발명 사상의 범위 내에 포함되는 다른 실시예를 용이하게 제안할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구의 범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구의 범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Transformed methanotroph with improved methane oxidation activity via flux redesign of electron transfer system <130> GKH20P-0065-KR <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 309 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cytochome aa3 oxidase upstream region <400> 1 atgagtaaat ctttaaaaat cgctttattt tctgcgctgt cgttaactgc ggtaggcgtt 60 gctcaggcca atgatgtttt taataaaaat tgcgtcgctt gtcatgccgg cggtaaaaac 120 gttatgaatc cggataaaac tctctcttca gagagtttgg aaaaaaacgg cgtgaattct 180 ttggatgcaa tcaaaaaact ggtttctgaa ggcaagtccc caatgccggg atttgcatcg 240 actttgagta aagaagaaat cgaaagcgtt tcggcctatg tcctggaaca ggcaaaaaaa 300 ggctggtaa 309 <210> 2 <211> 1029 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kan-cassette <400> 2 tgacaattaa tcatcggctc gtataatgta taaaagaaaa agttaagggg tgttatgagc 60 catattcaac gggaaacgtc ttgctcgagg ccgcgattaa attccaacat ggatgctgat 120 ttatatgggt ataaatgggc tcgcgataat gtcgggcaat caggtgcgac 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Claims

사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochrome aa3 oxidase)를 코딩하는 유전자의 상류 (upstream) 염기서열, 사이토크롬 c6 (cytochrome c6)를 코딩하는 유전자, 사이토크롬 aa3 산화효소 유전자 치환용 카세트 및 사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochrome aa3 oxidase)를 코딩하는 유전자의 하류 (downstream) 염기서열을 포함하는, 메탄 산화 활성 증대용 재조합 벡터에서,
상기 사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochrome aa3 oxidase)를 코딩하는 유전자의 상류 (upstream) 염기서열은 서열번호 1로 표시되고,
상기 사이토크롬 aa3 산화효소 유전자 치환용 카세트는 서열번호 2로 표시되며,
상기 사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochrome aa3 oxidase)를 코딩하는 유전자의 하류 (downstream) 염기서열은 서열번호 3으로 표시되는 것인, 메탄 산화 활성 증대용 재조합 벡터.
제1항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochrome aa3 oxidase)를 코딩하는 유전자를 녹아웃 (knockout) 시키는 것을 특징으로 하는, 메탄 산화 활성 증대용 재조합 벡터.
제1항에 있어서,
상기 사이토크롬 c6 (cytochrome c6)를 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 메탄 산화 활성 증대용 재조합 벡터.
제1항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 사이토크롬 c6 (cytochrome c6)를 코딩하는 유전자를 도입 또는 증폭시키는 것을 특징으로 하는, 메탄 산화 활성 증대용 재조합 벡터.
제1항에 있어서,
상기 사이토크롬 c6 (cytochrome c6)는 광영양성 유기체 (phototrophic organism)에서 역전자매개체 (reverse electron carrier)인 것인, 메탄 산화 활성 증대용 재조합 벡터.
제1항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochrome aa3 oxidase)를 코딩하는 유전자를 사이토크롬 c6 (cytochrome c6)를 코딩하는 유전자로 치환시키는 것을 특징으로 하는, 메탄 산화 활성 증대용 재조합 벡터.
제1항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 선형 DNA, 플라스미드 DNA 또는 재조합 바이러스성 벡터인 것을 특징으로 하는, 메탄 산화 활성 증대용 재조합 벡터.
사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochrome aa3 oxidase)를 코딩하는 유전자가 결실 (deletion) 또는 적중 (knockout)되어 있고, 사이토크롬 c6 (cytochrome c6)를 코딩하는 유전자가 증폭 (amplification)된, 메탄 산화 활성 증대용 형질전환 메탄자화균.
제8항에 있어서,
상기 사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochorome aa3 oxidase)를 코팅하는 유전자는 서열번호 5의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 메탄 산화 활성 증대용 형질전환 메탄자화균.
제8항에 있어서,
상기 형질전환 메탄자화균은 사이토크롬 aa3 산화효소 (cytochrome aa3 oxidase)의 활성이 약화 또는 불활성화된 것인, 메탄 산화 활성 증대용 형질전환 메탄자화균.
제8항에 있어서,
상기 형질전환 메탄자화균은 사이토크롬 c6 (cytochrome c6) 단백질이 과발현된 것인, 메탄 산화 활성 증대용 형질전환 메탄자화균.
제8항에 있어서,
상기 메탄자화균은 메틸로모나스 속 (Methylomonas), 메틸로박터 속 (Methylobacter), 메틸로코커스 속 (Methylococcus), 메틸로스페라 속 (Methylosphaera), 메틸로칼덤 속 (Methylocaldum), 메틸로글로버스 속 (Methyloglobus), 메틸로사르시나 속 (Methylosarcina), 메틸로프로펀더스 속 (Methyloprofundus), 메틸로썰머스 속 (Methylothermus), 메틸로할로비우스 속 (Methylohalobius), 메틸로게아 속 (Methylogaea), 메틸로마리넘 속 (Methylomarinum), 메틸로벌럼 속 (Methylovulum), 메틸로마리노범 속 (Methylomarinovum), 메틸로러브럼 속 (Methylorubrum), 메틸로파라코커스 속 (Methyloparacoccus), 메틸로시스티스 속 (Methylocystis), 메틸로셀라 속 (Methylocella), 메틸로캡사 속 (Methylocapsa), 메틸로퍼룰라 속 (Methylofurula), 메틸아시디필럼 속 (Methylacidiphilum), 메틸아시디마이크로비움 속 (Methylacidimicrobium), 메틸로마이크로비움 속 (Methylomicrobium) 또는 메틸로시너스 속 (Methylosinus) 균주인, 메탄 산화 활성 증대용 형질전환 메탄자화균.
제12항에 있어서,
상기 메틸아시디마이크로비움 속 균주는 메틸아시디마이크로비움 알칼리필리엄 (Methylomicrobium alcaliphilum) 20Z인, 메탄 산화 활성 증대용 형질전환 메탄자화균.
제8항 내지 제13항 중 어느 한 항의 메탄자화균, 이의 배양여액 또는 이의 배양산물을 포함하는, 메탄 산화 활성 증대용 조성물.
제14항에 있어서,
상기 배양산물은 균주의 배양물, 배양상등액, 파쇄물 및 이들의 분획물로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 메탄 산화 활성 증대용 조성물.
제14항의 조성물을 포함하는, 2-프로판올 또는 아세톤 생산용 키트.
제8항 내지 제13항 중 어느 한 항의 형질전환 메탄자화균을 메탄 (methan)이 포함된 배양배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 2-프로판올 또는 아세톤 생산방법.
제17항에 있어서,
상기 방법은 상기 배양된 형질전환 메탄자화균으로부터 생산된 2-프로판올 또는 아세톤을 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 2-프로판올 또는 아세톤 생산방법.