CN117660511A

CN117660511A - 一种基于RecET重组系统的类球红细菌基因编辑方法及其应用

Info

Publication number: CN117660511A
Application number: CN202311541267.7A
Authority: CN
Inventors: 谭高翼; 吕东源; 张立新
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2023-11-17
Filing date: 2023-11-17
Publication date: 2024-03-08

Abstract

本发明提供了一种基于RecET重组系统的类球红细菌基因编辑方法及其应用。本发明揭示了一种新型的对类球红细菌进行基因编辑的方法，包括利用RecET重组系统进行基因编辑，其中所述RecET重组系统包括特定来源的5’→3’外切酶PaRecE及单链DNA退火蛋白PaRecT。所述RecET重组系统可以实现在类球红细菌胞内的高效基因编辑，操作过程简单，仅需一个质粒和一个通过PCR获得的携带短同源臂的抗性基因表达盒即可实现基因编辑。本发明的方法具有极高的阳性率，耗时短。

Description

一种基于RecET重组系统的类球红细菌基因编辑方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种基于RecET重组系统的类球红细菌基因编辑方法及其应用。

背景技术

氢能是一种清洁、安全、高效、可持续的能源，被视为21世纪最具发展潜力的新兴能源，是未来能源主体的战略发展方向。生物制氢可通过暗发酵、光发酵、生物光解和微生物电解池等多种方法进行，其中最有效、最快捷的技术是利用太阳能。植物、藻类和光合微生物具有将太阳能转化为生物氢的潜力，称为光发酵制氢技术。通常用于光发酵生物制氢的光发酵微生物的主要类别包括紫色非硫(PNS)细菌。紫色非硫光合细菌表现出高度的代谢灵活性，可以作为光异养、光自养或趋化异养生长。

类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)是一种革兰氏染色阴性的，紫色非硫不产氧光合细菌，是研究光合作用的的模式菌株，属于α变形杆菌门。因其独特的代谢模式以及光合系统的构造，类球红细菌可用于生物制氢。另外其旺盛的卟啉代谢途径和光合系统能衍生多条相关途径化合物的生产，如粪卟啉、血红素、叶绿素以及辅酶Q10和萜类，还被用于生物产氢等工业应用，是一种极具有工业生产价值的高潜力底盘菌株。

然而，在菌株中，对于途径的改造通常涉及基因敲除、替换和修饰等编辑，需要省时高效的基因编辑方法。目前基于pK18自杀质粒介导的同源重组，完全依赖于体内自发的同源双交换重组过程，是一种效率较低的方法。具体体现在，需提供500～1000bp的同源片段，至少需要单交换筛选和双交换筛选两个以上细胞生长周期，且筛选双交换阳性率低，通常需要筛选数十个以上的转化子才能成功获得重组子，是一种效率低、时间长的方法。

另外，目前在类球红细菌中开发的CRISPR/Cas相关的基因编辑方法虽然也有将编辑周期缩短至一个生长周期，但是这类方法通常需要再次构建含有gRNA的质粒，而且仍然需要提供500～1000bp的同源片段作为修复模板，仍然是一种比较繁琐的方法。

因此，本领域非常有必要开发一种适用于类球红细菌的、简易高效的基因编辑方法。来自噬菌体的RecET重组系统是一种依赖短同源片段即可实现同源重组的基因编辑方法。然而，RecET具有严谨的种属特异性。例如，研究证明来自大肠杆菌的lambda Red或RecET重组系统只能在大肠杆菌以及近缘的几个种中高效介导重组，在远缘物种中不表现重组活性。所以需要通过生物信息学手段，并通过实验验证的方法挖掘一组适用于类球红细菌的RecET重组系统。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以在类球红细菌ZX中基于RecET重组系统的基因编辑方法及其应用，为类球红细菌提供一种高效简易的基因编辑方法。

在本发明的第一方面，提供一种利用对类球红细菌进行基因编辑的方法，包括：利用RecET重组系统进行基因编辑；其中，所述RecET重组系统包括：5’→3’外切酶PaRecE，其具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；单链DNA退火蛋白PaRecT，其具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

在一种或多种实施方式中，所述方法包括：

(1)提供用于表达RecET系统的重组表达载体，包括外源的且操作性连接的：启动子，PaRecE表达元件，PaRecT表达元件，oriT；

(2)提供同源重组表达盒，包括外源的且操作性连接的：5’目标基因同源臂、打靶基因、3’目标基因同源臂；其中，所述打靶基因用于替换类球红细菌中的目标编辑基因；较佳地，所述打靶基因为抗性筛选基因；

(3)将(1)的重组表达载体引入到类球红细菌中，获得表达RecET系统的重组类球红细菌；

(4)将(2)的同源重组表达盒引入到(3)的类球红细菌中，使得目标编辑基因被打靶基因同源替换。

在一种或多种实施方式中，所述类球红细菌包括产氢类球红细菌、高产Q10类球红细菌(发明人在先专利申请中)以及野生型类球红细菌。

在一种或多种实施方式中，所述用于表达RecET系统的重组表达载体还包括操作性连接的元件：抗性筛选基因(如KanR)，RepA，ori，抑制子Laclq。

在一种或多种实施方式中，通过接合转移的方法将(1)的重组表达载体引入到类球红细菌中。

在一种或多种实施方式中，通过电转的方法将(1)的重组表达载体引入到类球红细菌中。

在一种或多种实施方式中，通过电转的方法将(2)的同源重组表达盒引入到(3)的类球红细菌中。

在一种或多种实施方式中，所述的基因编辑针对类球红细菌的基因组或游离基因(如位于游离质粒上的基因)。

在一种或多种实施方式中，所述5’目标基因同源臂或3’目标基因同源臂长度40～170bp；较佳地为50～160bp；更佳地为55～150bp(如58、60、65、70、80、90、100、120、140、160bp)。

在一种或多种实施方式中，所述启动子为诱导型启动子或组成型启动子；较佳地，所述启动子为诱导型启动子；更佳地，所述诱导型启动子包括：IPTG诱导型启动子，如P_A1/04/03启动子、P_lac启动子；阿拉伯糖诱导型启动子，如P_BAD启动子。

在一种或多种实施方式中，所述IPTG诱导型启动子为P_A1/04/03启动子，在受到IPTG诱导后，驱动其下游基因的表达，从而表达PaRecE和PaRecT。

在一种或多种实施方式中，步骤(3)中，将(1)的重组表达载体引入到类球红细菌中时，采用电转化的方法；较佳地，电转化中，电击细胞并加入培养基的时候，还加入MgCl₂，孵育；较佳地，所述MgCl₂在培养基中的终浓度2～40mM，更佳地3～35mM(如4mM，5mM，8mM，10mM，15mM，20mM，25mM，30mM，35mM，40mM)。

在本发明的另一方面，提供组合的5’→3’外切酶PaRecE以及单链DNA退火蛋白PaRecT的用途，用于建立RecET重组系统，对类球红细菌进行基因编辑；其中，所述5’→3’外切酶PaRecE具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述单链DNA退火蛋白PaRecT具有SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列。

在一种或多种实施方式中，所述的5’→3’外切酶PaRecE以及单链DNA退火蛋白PaRecT由类球红细菌表达。

在一种或多种实施方式中，建立用于表达RecET系统的重组表达载体，包括外源的且操作性连接的：启动子、PaRecE表达元件、PaRecT表达元件、oriT，将该重组表达在途引入到类球红细菌进行表达。

在一种或多种实施方式中，利用同源重组表达盒来将打靶基因替换类球红细菌中的目标编辑基因；其中，所述同源重组表达盒包括外源的且操作性连接的：5’目标基因同源臂、打靶基因、3’目标基因同源臂；其中，所述打靶基因用于替换类球红细菌中的目标编辑基因；更佳地，所述5’同源臂或3’同源臂长度40～170bp；较佳地为50～160bp；更佳地为55～150bp(如58、60、65、70、80、90、100、120、140、160bp)。

在本发明的另一方面，提供一种重组的类球红细菌，其表达RecET重组系统；所述RecET重组系统包括：5’→3’外切酶PaRecE，其具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；单链DNA退火蛋白PaRecT，其具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

在一种或多种实施方式中，所述RecET重组系统如下表达：(a)提供用于表达RecET系统的重组表达载体，包括外源的且操作性连接的：启动子，PaRecE表达元件，PaRecT表达元件，oriT；(b)将(a)的重组表达载体引入到类球红细菌中，获得表达RecET系统的重组类球红细菌。

在本发明的另一方面，提供所述的重组的类球红细菌的用途，用于作为基因编辑的受体菌株，所述基因编辑为基于RecET重组系统的基因编辑。

在本发明的另一方面，提供一种用于进行基因编辑的试剂盒，其中包括：所述的重组的类球红细菌；以及，同源重组表达盒，包括外源的且操作性连接的：5’目标基因同源臂、打靶基因、3’目标基因同源臂；其中，所述打靶基因用于替换类球红细菌中的目标编辑基因；较佳地，所述5’同源臂或3’同源臂长度40～170bp；较佳地为50～160bp；更佳地为55～150bp(如58、60、65、70、80、90、100、120、140、160bp)。

在一种或多种实施方式中，所述试剂盒中还包括细胞培养基以及MgCl₂；更佳地，试剂盒中所述MgCl₂的量为能在培养基中形成终浓度2～40mM，更佳地3～35mM(如4mM，5mM，8mM，10mM，15mM，20mM，25mM，30mM，35mM，40mM)的量。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、用于表达RecET重组系统(RecE和RecT；RecE/T)的表达质粒pIND4-oriT-PaRecET的构建。

图2、delrecET电转ZXET后，阳性重组菌株的验证。

图3、用于同源替换prrA基因的抗性基因表达盒delprrA构建及敲除策略。

图4、敲除类球红细菌中的prrA后，进行阳性重组菌株的验证，观测菌株的颜色变化情况。

图5、利用引物SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14进行阳性重组菌株的验证的凝胶电泳结果。

图6、敲除prrA基因座的阳性单克隆在prrA基因处利用引物SEQ ID NO：13和SEQID NO:14进行阳性重组菌株的验证的测序结果。

具体实施方式

本发明人在深入的研究分析后，揭示了一种新型的对类球红细菌(包括产氢类球红细菌)进行基因编辑的方法，包括利用RecET重组系统进行基因编辑，其中所述RecET重组系统包括特定来源的5’→3’外切酶PaRecE及单链DNA退火蛋白PaRecT。所述RecET重组系统可以实现在类球红细菌胞内的高效基因编辑，操作过程简单，仅需较简单的设计方法，利用短同源臂(60bp内)、一个质粒，通过一次PCR即可实现基因编辑。本发明的方法具有极高的阳性率，耗时短。

如本发明所用，术语“引入”或“转化”是指将外源多核苷酸转移进宿主细胞(本发明中为类球红细菌)。可选地，外源多核苷酸可以整合进入宿主基因组。

如本发明所用，“外源的”或“异源的”基因或蛋白是指并非天然包含在原生物体(本发明中为类球红细菌)基因组中的基因或蛋白，例如可以是突变的蛋白。通常，“外源的”基因或蛋白通过基因工程重组技术被引入到生物体中。

如本文所用，所述的“诱导型启动子”可根据需要在特定细胞生长阶段或特定生长环境下，诱导基因转录的“开”与“关”或者“高”与“低”。根据来源，可将诱导型启动子分为天然存在的启动子和人工构建的启动子。

如本文所用，“目标编辑基因”感兴趣的基因，希望采用本发明的方法来对其进行改造，尤其是敲除，例如可籍此进行功能研究。本发明对合适的目标编辑基因没有特别的限制，其可以是结构基因或非结构基因。例如，所述“目标编辑基因”包括但不限于：结构基因、编码具有特定功能的蛋白的基因、酶、报告基因。

如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的多肽所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、编码多肽的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件是操作性相连的。

如本文所用，所述的“可操作性连接”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

本发明开发的方法基于新型的Red/ET蛋白的重组方法。Red/ET重组技术是一种基于噬菌体重组酶的新型遗传工程技术，其基本原理是通过噬菌体重组酶介导菌体内的同源重组，从而对DNA序列进行修饰，该技术不受酶切位点的限制，若是确定了合适的重组酶，只需用大约35-50bp大小的同源臂就能获得较高的重组效率。

尽管Red/ET重组技术在个别类型的细菌种属(如大肠杆菌的Redαβγ系统)中得到开发应用。然而该类系统具有强的种属特异性，很少可以在不同种属细菌之间表现出交叉重组活性。针对类球红细菌，本领域现有技术中并没有挖掘到适于在该菌株中通过dsDNA实现同源重组的酶；实验也显示，现有商品化的酶无法用于该菌株。本发明人在前期工作中，利用生物信息学手段进行了深入的挖掘，确定了能够适配的RecET重组酶。发明人的实验结果显示，可以实现在一个细胞周期中完成基因编辑，具有高效性，靶向编辑的阳性率很高。

因此，本发明开发了在类球红细菌中可以使用的基于RecET重组酶系统的高效简易的基因编辑工具。传统的类球红细菌基于自发同源重组的基因编辑方法需要两个细胞周期的单双交换筛选，时间长，效率低。而如果采用单链法，利用此类酶，则无法实现抗性筛选，且效率低，只限于寡碱基编辑、无法插入片段，基因组改造有局限性。本发明在类球红细菌近缘种属中发掘的RecET系统在诱导型启动子的控制下，可以在最短一个细胞生长周期内，通过携带长度60bp内的同源臂的抗性基因表达盒替换片段，以转化(如电转化)的方式实现高效的基因敲除。该方法与其他方法对比具有明显的优势。扩充了类球红细菌的合成生物学遗传改造表达工具。

本发明中，运用了经广泛筛选而获得的适合于类球红细菌的酶，包括：5’→3’外切酶PaRecE(简称PaRecE)，单链DNA退火蛋白PaRecT(简称PaRecT)。作为本发明的优选方式，所述RecET来自Paracoccuceae Bacterium isolate SJ630(JADZAO010000044.1)，PaRecE(MCC6863620.1)和PaRecT(MCC6863621.1)的氨基酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所使用的DNA序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

所述的PaRecE是一种5’→3’外切酶，PaRecT是一种单链DNA退火蛋白，可结合在由前者切割的DNA单链末端，介导与同源目标序列退火以实现同源重组，该方法可以介导60bp以内的短同源臂重组，对比前述一般方法具有明确的简易性的特点。

本发明还包括所述酶的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的天然酶相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

在本发明中，所述酶还包括(但并不限于)：若干个(通常为1-20个，更佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1-2个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括酶的活性片段和活性衍生物。所述“酶”还包括(但并不限于)：与所述的酶的氨基酸序列具有80％以上，较佳地85％以上，更佳地90％以上，进一步更佳地95％以上，如98％以上、99％以上序列相同性的保留其蛋白活性的衍生的蛋白。

本发明还提供了编码本发明酶或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

编码所述突变体的成熟蛋白的多核苷酸包括：只编码成熟蛋白的编码序列；成熟蛋白的编码序列和各种附加编码序列；成熟蛋白的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

“编码蛋白的多核苷酸”可以是包括编码此蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白的方法。

本发明中，酶多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。“重组表达载体”可以是能在宿主体内复制和稳定的任何质粒和载体。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

多种方法能用于构建含酶编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

在本发明的优选实施方案中，化学合成的RecE和RecT操纵子包括如SEQ ID NO:5所示的序列，将该序列作为模板，使用引物SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7扩增上述SEQ IDNO:5序列，构建入线性化的含有oriT的pIND4质粒中，所述构建位置位于pIND4载体的NcoI和HindIII酶切位点之间，位于IPTG诱导的P_A1/04/03启动子下游。所得到的质粒名称为pIND4-oriT-PaRecET。

进一步地，在优选实施方案中，上述质粒是通过转化入Escherichia Coli S17-1菌株中，通过该菌株的接合转移至受体菌类球红细菌中。类球红细菌受体菌为ZX。优选地，构建该菌株的方法具体为：将携带测序正确的质粒pIND4-oriT-PaRecET的E.coli S17-1菌株在含有25μg/mL卡那霉素的LB中培养至OD 0.6-1，将ZX菌株在无抗TSB培养基中培养至OD为1。各取1mL(1OD)的受体菌和供体菌，ddH₂O洗涤两次，取200μL ZX和30μL S17-1，混合后低在0.22μm滤膜覆盖的无抗种子培养基上。32℃培养22小时后，收集滤膜上的菌苔至1毫升水中，取40μL涂在卡那霉素25μg/mL加5μg/m奈啶酮酸的种子板上。32℃培养4天后，挑取单克隆验证，PCR阳性后传代得到携带pIND4-oriT-PaRecET的类球红细菌菌株，称为ZXET。

在本发明的优选实施例中，提供了一种具体的编辑方法，描述如下：

(1)替换片段的获得：将带有目标序列同源臂设计为引物的5’端，将含有阿伯拉霉素的抗性基因和其启动子的片段采用PCR的方法获得，用切胶回收的方法获得纯化后的替换片段delApr。该片段显示在SEQ ID NO:13.

(2)将前述ZXET菌株，取培养4天的含有单克隆的平板，挑取5-10个单克隆于5mL含有上述卡纳霉素抗性的TSB液体培养基中，32℃，220rpm培养过夜，约～12小时，OD700nm为2.0～3.0之间，取适量培养物转瓶，用TSB稀释至5mL，终OD700为1.0。此时加入1/1000浓度的1M IPTG，使其终浓度为1mM。32℃，220rpm培养，诱导3h。

(3)本步骤所得细胞OD在1.8～2.2之间。之后取2OD菌/管，洗涤3次，洗涤溶剂为冷的灭菌水。最后离心完保留60～100μL溶液，加入1μg delApr片段，混合均匀，放置于冰上10min。电转。电转条件为2500V，25μF，200Ω，2mm.电转方法为指数放电方法，电转持续时间一般为5ms。

(4)之后加入1mL无抗TSB，复苏培养3h，32℃220rpm。

(5)离心，涂布至10μg/mL阿伯拉霉素的种子板上。3℃恒温培养箱，培养4天，出现单菌落。可用于下步验证。

(6)阳性克隆验证方法：菌落PCR方法，使用靶基因上下游外部引物对替换片段进行PCR扩增，详见实施例，电泳结果为既定大小的条带时认定为阳性。可将测序结果进行比对。所得单克隆即为阳性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

摇床培养条件为32℃，220rpm；

培养箱条件为32℃；

除TSB外，所述种子板培养基，配方为：酵母提取物15g，磷酸氢二钾1g，氯化钠2g，硫酸亚铁0.1g，硫酸镁0.5g，水1L；pH7.0-7.2；加入2％琼脂粉制成种子平板。

实施例1、构建用于基因编辑的PaRecET系统

1、用于RecET系统的功能蛋白的筛选

本发明人发现，对于类球红细菌这一种细菌，其具有种属特殊的DNA修复蛋白体系，利用短同源臂(60bp内)、一个质粒，通过一次PCR来实现基因编辑难以做到，只能依赖长同源臂的自发同源重组进行基因编辑。而且进化距离距大肠杆菌较远，不能使用大肠杆菌中使用的RecET系统直接进行编辑，以往人们对类球红细菌进行基因编辑时，必需至少两次，而未实现利用短同源臂一次完成、且以往运用CRISPR一次法时需要设计两个质粒、方法复杂。

经过PSI-BLAST、物种16SrDNA进化树构建、基因组搜索等方法进行深入的筛选、研究和实验分析，发明人选择到性能优异的功能蛋白：利用WGS数据集中的ParacoccuceaeBacterium isolate SJ630(ACCESSION:JADZAO010000044.1)基因组中的两种蛋白，分别命名为PaRecE(MCC6863620.1，氨基酸序列如氨基酸序列如SEQ ID NO:1，核苷酸序列如SEQID NO:3)和PaRecT(MCC6863621.1，氨基酸序列如SEQ ID NO:2，核苷酸序列如SEQ ID NO:4)，用于建立RecET系统。

2、构建pIND4-oriT-PaRecET质粒

化学合成含有RecE和RecT操纵子的核苷酸序列(SEQ ID NO:5)，以该序列作为模板，使用引物SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7扩增上述SEQ ID NO:5序列，将扩增产物构建入线性化的含有oriT的pIND4质粒中，所述构建位置位于pIND4载体的NcoI和HindIII酶切位点之间，位于IPTG诱导的P_A1/04/03启动子(参见APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY,Oct.2009,p.6613-6615)下游。所得到的质粒称为pIND4-oriT-PaRecET(图1)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示(其中1591-3763是所述的recET基因片段)。

3、构建携带PaRecET元件的菌株(ZXET)

发明人的实验证明该系统在类球红细菌的不同亚株中具有较好的兼容性，而各菌株中实施的方法高度相似，所以以下实施例以ZX菌株(获自上海植物生理生态研究所合成生物学元件与数据库))为例进行例证。另外，此实施例同时构建了在大肠杆菌中充分表征的EcRecET和lambda Red重组酶，还有另外数个挖掘的RecET候选蛋白，以证明其严谨的物种特异性，相关结果一同展示在表1中。

获取携带PaRecET元件的菌株(ZXET)，采取选自以下方法一或方法二的方案：

方法一：接合转移

将含有pIND4-oriT-PaRecET质粒的大肠杆菌S17-1菌株和类球红细菌ZX分别培养至OD600：0.6和OD700：1.0，取1mL两种菌分别置于2个1.5mL离心管中。

12000rpm，离心1min；

去上清，加入800μL灭菌水，洗涤，12000rpm，离心1min；

同上，重复2次；

最后加入1mL灭菌水重悬菌体，取200μL类球红细菌ZX和30μL大肠杆菌S17-1混匀，将混合后的菌液滴在0.22μm的灭菌滤纸片上，滤纸片覆盖在无抗种子板上。待表面溶液蒸发后，放入培养箱中32℃培养20小时。之后取40μL划线涂在前述双抗种子固体培养基上。32℃培养4-5天后挑取单克隆进行验证，使用引物进行验证，得到阳性接合子。将该单克隆接入5mL含有卡纳霉素的TSB培养基中32℃220rpm过夜培养，25％甘油保种。得到含有PaRecET的菌株，称为ZXET。

方法二：电转法制备ZXET

使用一般商用质粒小量提取试剂盒提取上述质粒。

将过夜培养的ZX转接，此时菌株OD700nm大约为2.0～3.0，将上述培养物转接稀释至0.6，培养2h左右至OD700为1.0左右。每份样品取2mL菌液至离心管中，12000rpm离心1min，去上清；

加入600μL无菌去离子水，重悬洗涤，12000rpm离心1min，重复3次。

弃去上清，加入100μL无菌去离子水，将pIND4-oriT-PaRecET进行电转。电转后立即加入1mL无抗TSB，摇床孵育2h。

12000rpm离心1min，去上清，50μL重悬后涂布在含有卡那霉素(Kanamycin)的抗种子板上。放入培养箱中培养4～5天。挑取数个单克隆验证，验证方法同方法一。

得到含有PaRecET的菌株ZXET。

4、用于同源替换的抗性基因表达盒delrecET的制备

以SEQ ID NO:12为模板、利用SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示序列的引物扩增，将获得的产物进行切胶回收，回收方法按照市售的琼脂糖凝胶回收试剂盒，即获得用于同源替换的阿伯拉抗性基因表达盒delrecET，该表达盒为线性双链DNA。

该表达盒包括依次连接的：5’同源臂(60bp)、阿伯拉抗性基因、3’同源臂(60bp)。

实施例2、同源重组法替换pIND4-oriT-PaRecET质粒上的recET阅读框

1、delrecET电转ZXET

取平板活化的ZXET的5-10单克隆于5毫升含有卡纳抗性的TSB培养基中，32℃220rpm培养OD700至2.0-3.2之间，取上述培养物稀释至新鲜的5mL含有卡纳抗性的培养基中，其终浓度OD700为1，并加入终浓度为1mM IPTG，置于32℃，220RPM培养3小时。

取2OD上述培养物至1.5毫升离心管中，4℃1200rpm离心，弃上清，用1毫升预冷的无菌去离子水洗涤重悬，重复上述操作3次。

去掉上清加入60-100μL无菌去离子水和1μg delrecET混匀，置于冰上孵育5min。将上述混合物加入2毫米电击杯，电场强度为12.5kV/cm，25μF，200Ω，电转时间为4.0-5.1ms。电击后迅速加入1毫升无抗TSB，置于摇床培养3小时。

培养结束后，离心12000rpm，2min，弃上清将菌液加入少量无菌水重悬，涂布于含有10微克/毫升的阿伯拉抗性种子平板上。置于培养箱，培养4天后，观察单菌落情况。

2、阳性重组菌株的验证

挑取10个单菌落进行菌落PCR验证，引物为SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16，重组成功的PCR条带大小应为2500bp。

PCR结果如图2所示，以DNA Marker为标准，图中各个测试样本的泳道中的扩增产物条带为大小2500bp，证明该RecET重组酶具有编辑活性，且靶向编辑作用高效而准确。

该实验中，可实现在重组表达RecET重组酶后，将表达其的基因进行删除。

实施例3、ParecET用于敲除类球红细菌的prrA基因

1、用于同源替换prrA基因的抗性基因表达盒delprrA构建及敲除策略

靶向敲除类球红细菌基因组中的全局调控因子prrA，其表达与类球红细菌的叶绿素合成密切相关，其被敲除将使得菌株颜色退化。

敲除策略如图3。以SEQ ID NO:12为模板，用SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11作为引物扩增，获得扩增产物；按照与实施例1的“2”中相同的方法获得用于同源替换prrA基因的抗性基因表达盒，称为delprrA。其中，5’同源臂和3’同源臂的长度分别为60bp。

2、敲除类球红细菌中的prrA

取平板活化的ZXET，按照与实施例2中相同的方法培养诱导洗涤制作电转感受态细胞。加入1微克用于同源替换的抗性基因表达盒delprrA。按照实施例2完全相同的方法进行电转化(以delprrA电转ZXET)，直至获得单菌落。

3、阳性重组菌株的验证

首先，重组子在该实施例中表现出颜色退化的表型，即从红色变为淡粉色如图4。

对数个单克隆进行菌落PCR验证，利用外部基因组引物SEQ ID NO:13和SEQ IDNO:14对编辑后的菌落进行目标基因区域扩增，阴性克隆结果即原始基因组大小为865bp，阳性克隆大结果小应为1461bp。如图5所示，阳性条带大小为在1500bp左右的位置，结合测序结果，如图6所示，证明数个单克隆均为阳性克隆。

实施例2与实施例3的结果证明，本发明全新鉴定了尤其匹配类球红细菌的基因编辑的重组酶系统，所述重组酶在类球红细菌中具有优异的编辑活性。当用于进行基因编辑时，本发明的重组酶系统具有更加省时高效的优势。

实施例4、不同RecET系统的编辑效率分析

不同来源RecET系统在大肠杆菌和类球红细菌中的编辑效率对比如表1。

表1

实施例5、提升类球红细菌的电转化效率以提升编辑效率

根据实施例2、3中的原理，编辑使用的是电击转化的方法将打靶基因片段转入受体菌中，所以电转化的效率也直接影响了编辑效率。发明人发现，在电转化后的孵育液中加入一定浓度的二价镁离子可以极大地提高电转化效率。

1、电转pIND4-oriT质粒至类球红细菌

细胞培养、电转策略以及验证方法均以实施例2中所述进行，其中pIND4-oriT为实施例2中pIND4-oriT-PaRecET质粒的原始骨架。关键不同在于，在电击后加入无抗TSB后且加入MgCl₂溶液、之后进行摇床孵育。添加镁离子(终浓度)对电转和编辑效率的影响如表2所示。

表2

2、在ParecET用于敲除类球红细菌的prrA基因的策略中优化编辑效率

细胞培养、编辑策略以及验证方法均以实施例3中所述进行，唯一不同在于，在电击后加入无抗TSB后再加入100μL 250mM的MgCl₂溶液。

该实验结果表明，在电穿孔后加入镁离子可以提高转化效率，同时非常显著地提高编辑效率。

序列信息

SEQ ID NO:1:

MNTSTQTITTTFKTGIYPTLDNDAYHSGPGISKSGLWTIYTKSPAHYRSTPRKVTNAFDIGQAAHIAILEPETYEARVSRGPDDRRGNKWTDASAYAASIGKLLLTSSDYDKGLLMRDAVHADVRIHAIITGGTAQIEHSGFWTDPVTDVLCKCRPDLYRPDLGIMLDLKSTISAHPDDFAKSVINYGYHAQEAWYSNGYRANGQALEGFVFLAIEKADPFVCALYELPPSIIADGDAICRKALDHYAECLRTDTWPGYSGEITELSFKRWAYSETQPEIEEAA

SEQ ID NO:2:

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SEQ ID NO:3:

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SEQ ID NO:4:

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SEQ ID NO:5:

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SEQ ID NO:17

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以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

Claims

1.一种利用对类球红细菌进行基因编辑的方法，包括：利用RecET重组系统进行基因编辑；其中，所述RecET重组系统包括：

5’→3’外切酶PaRecE，其具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

单链DNA退火蛋白PaRecT，其具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述5’目标基因同源臂或3’目标基因同源臂长度40～170bp；较佳地为50～160bp；更佳地为55～150bp。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述启动子为诱导型启动子或组成型启动子；较佳地，所述启动子为诱导型启动子；更佳地，所述诱导型启动子包括：IPTG诱导型启动子，如P_A1/04/03启动子、P_lac启动子；阿拉伯糖诱导型启动子，如P_BAD启动子。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，将(1)的重组表达载体引入到类球红细菌中时，采用电转化的方法；较佳地，电转化中，电击细胞并加入培养基的时候，还加入MgCl₂，孵育；较佳地，所述MgCl₂在培养基中的终浓度2～40mM，更佳地3～35mM。

6.组合的5’→3’外切酶PaRecE以及单链DNA退火蛋白PaRecT的用途，用于建立RecET重组系统，对类球红细菌进行基因编辑；其中，

所述5’→3’外切酶PaRecE具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

所述单链DNA退火蛋白PaRecT具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的5’→3’外切酶PaRecE以及单链DNA退火蛋白PaRecT由类球红细菌表达；

较佳地，建立用于表达RecET系统的重组表达载体，包括外源的且操作性连接的：启动子、PaRecE表达元件、PaRecT表达元件、oriT，将该重组表达在途引入到类球红细菌进行表达；

较佳地，利用同源重组表达盒来将打靶基因替换类球红细菌中的目标编辑基因；其中，所述同源重组表达盒包括外源的且操作性连接的：5’目标基因同源臂、打靶基因、3’目标基因同源臂；其中，所述打靶基因用于替换类球红细菌中的目标编辑基因；更佳地，所述5’同源臂或3’同源臂长度40～170bp；较佳地为50～160bp；更佳地为55～150bp。

8.一种重组的类球红细菌，其表达RecET重组系统；所述RecET重组系统包括：5’→3’外切酶PaRecE，其具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；单链DNA退火蛋白PaRecT，其具有SEQID NO:2所示的氨基酸序列；

较佳地，所述RecET重组系统如下表达：(a)提供用于表达RecET系统的重组表达载体，包括外源的且操作性连接的：启动子，PaRecE表达元件，PaRecT表达元件，oriT；(b)将(a)的重组表达载体引入到类球红细菌中，获得表达RecET系统的重组类球红细菌。

9.权利要求8所述的重组的类球红细菌的用途，用于作为基因编辑的受体菌株，所述基因编辑为基于RecET重组系统的基因编辑。

10.一种用于进行基因编辑的试剂盒，其中包括：

权利要求8所述的重组的类球红细菌；以及

同源重组表达盒，包括外源的且操作性连接的：5’目标基因同源臂、打靶基因、3’目标基因同源臂；其中，所述打靶基因用于替换类球红细菌中的目标编辑基因；较佳地，所述5’同源臂或3’同源臂长度40～170bp；较佳地为50～160bp；更佳地为55～150bp；

较佳地，所述试剂盒中还包括细胞培养基以及MgCl₂；更佳地，试剂盒中所述MgCl₂的量为能在培养基中形成终浓度2～40mM，更佳地3～35mM的量。