CN116286931A - 用于富养罗尔斯通氏菌快速基因编辑的双质粒系统及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及用于富养罗尔斯通氏菌快速基因编辑的双质粒系统及应用。本发明提供的双质粒系统包含第一质粒和第二质粒；所述第一质粒为整合型质粒，包含Cas蛋白表达盒，以及用于将第一质粒整合至富养罗尔斯通氏菌基因组的同源序列；所述第二质粒为复制型质粒，包含sgRNA表达盒，以及同源修复片段。该双质粒系统能够高效导入富养罗尔斯通氏菌中，可以在富养罗尔斯通氏菌中稳定共存并用于CRISPR‑Cas基因编辑，在富养罗尔斯通氏菌中实现高效、快速的基因敲除、插入和替换。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及用于富养罗尔斯通氏菌快速基因编辑的双质粒系统及应用。
背景技术
富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha，也称为Cupriavidus necator)是研究聚羟基脂肪酸酯(PHA)合成的重要模式细菌，也是目前研究较多的用于PHA工业生产的菌株。为了使用该平台菌株高效生产包括不同种类PHA在内的目标产物，需要对其进行基因编辑以实现定向改造，包括基因敲除、基因插入、基因替换等。
现有的对富养罗尔斯通氏菌进行基因编辑的常用技术手段包括基于自杀质粒同源重组的单双交换和CRISPR-Cas9基因编辑系统。其中，传统的单双交换方法通过单交换同源重组获得野生型和重组型的嵌合体，再通过双交换同源重组变为野生型或重组型中的一种，进行一轮基因编辑的实验周期至少为17-19天；并且由于嵌合体双交换同源重组的随机性，获得重组型的效率往往小于50％，尤其对于具有生长劣势的重组突变，往往难以获得目标菌株，使得单双交换方法在编辑成功率上具有较大的不确定性。近年来快速发展的CRISPR-Cas9基因编辑技术在一定程度上解决了该问题，该技术通过靶向目标基因位点的sgRNA介导Cas9蛋白切割基因组上特定序列，形成DNA双链断裂并激活同源重组修复过程，从而获得较高的基因编辑效率。已经报道的应用于富养罗尔斯通氏菌的CRISPR-Cas9系统(Xiong,B.,Li,Z.,Liu,L.,Zhao,D.,Zhang,X.and Bi,C.,2018.Genome editing ofRalstonia eutropha using an electroporation-based CRISPR-Cas9technique.Biotechnology for biofuels,11(1),pp.1-9.)为使用pBBR1载体构建的单质粒系统，其中包含阿拉伯糖诱导型表达的pBAD-Cas9元件、组成型表达的靶向sgRNA、以及由目标基因位点上下游同源臂组成的修复片段，通过电转将该质粒导入富养罗尔斯通氏菌，诱导表达Cas9以后筛选编辑成功的菌株，最后经由连续传代丢失该质粒。然而，虽然上述CRISPR-Cas9单质粒系统基因编辑效率较高，但是一方面pBBR1质粒在富养罗尔斯通氏菌中可独立复制，造成基因编辑完成后不易消除该质粒，且由于质粒携带基因组同源修复片段，可能经由同源重组环入基因组，使得质粒更加难以通过传代消除，获得最后目标菌株的一轮基因编辑实验周期至少24天；另一方面，包含pBAD-Cas9、sgRNA和修复片段等所有元件的单质粒系统超过10kb大小，且构成靶向模块的sgRNA表达盒与修复片段位置上相互分离，不易通过分子克隆构建该质粒，也限制了电转或者接合导入富养罗尔斯通氏菌的效率。
综上，现有的CRISPR-Cas9单质粒系统由于分子操作不便和实验周期过长等问题，极大地限制了其在富养罗尔斯通氏菌中的应用，需要开发一种更加便利和快速的应用于富养罗尔斯通氏菌的CRISPR-Cas系统。
发明内容
本发明提供用于富养罗尔斯通氏菌快速基因编辑的双质粒系统及其应用。
基于富养罗尔斯通氏菌现有的CRISPR-Cas9单质粒系统存在的问题，本发明尝试开发适用于富养罗尔斯通氏菌的CRISPR-Cas双质粒系统。目前富养罗尔斯通氏菌中尚无报道可以共存的双质粒方案，现有的用于大肠杆菌等微生物的CRISPR-Cas9双质粒系统均采用在目标菌株中可以独立复制的双质粒方案，即两个质粒均能够在目标菌株中独立复制，例如pSC101+pMB1、p15A+pMB1等质粒组合。然而，本发明在研发过程中发现，pSC101+pMB1、p15A+pMB1等常用的复制子组合以及pBBR1+pRK2等其他可独立复制的质粒组合在富养罗尔斯通氏菌中均无法实现高效导入和稳定共存，给富养罗尔斯通氏菌的CRISPR-Cas双质粒系统的开发带来了较大的障碍。本发明经不断尝试获得了在富养罗尔斯通氏菌中能够实现高效、快速的基因编辑的CRISPR-Cas双质粒系统。
具体地，本发明提供以下技术方案：
本发明提供用于富养罗尔斯通氏菌基因编辑的双质粒系统，所述双质粒系统包含第一质粒和第二质粒；
所述第一质粒为整合型质粒，包含Cas蛋白表达盒，以及用于将第一质粒整合至富养罗尔斯通氏菌基因组的同源序列；
所述第二质粒为复制型质粒，包含sgRNA表达盒，以及同源修复片段。
经实验验证，上述双质粒系统能够成功导入富养罗尔斯通氏菌且两质粒能够在富养罗尔斯通氏菌中稳定共存。
上述复制型质粒为多拷贝独立复制型质粒。
上述第一质粒中，同源序列的作用在于通过同源重组将第一质粒整合至富养罗尔斯通氏菌基因组中，且不依赖于λ-Red重组酶系统。
理论上，富养罗尔斯通氏菌基因组中的任意序列均能作为同源臂介导质粒通过同源重组整合至基因组，但是，本发明在研究中发现，将第一质粒整合至基因组的不同位置的效率存在差异，对应于基因组不同位点的同源序列会造成质粒整合效率的差异，从而影响质粒通过接合等方式导入富养罗尔斯通氏菌的效果。相比于其它位置，将第一质粒整合至富养罗尔斯通氏菌的非功能基因区的效率明显更高，进而可以显著提高第一质粒导入富养罗尔斯通氏菌的效率。
优选地，所述同源序列为位于富养罗尔斯通氏菌基因组的非功能基因区的序列片段。
优选地，所述同源序列的长度不小于500bp。
同源序列可在非功能基因区内选择一段DNA序列，为更好地保证同源重组效率，其长度不小于500bp。
在本发明的一些实施方式中，所述同源序列为位于富养罗尔斯通氏菌基因组的非功能基因区的长度为500-1500bp的序列片段。优选的长度为800-1500bp，更优选为800-1200bp。
在本发明的一些实施方式中，所述同源序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示或与如SEQ ID NO.5所示序列具有至少80％相似性。采用上述同源序列显著提升了第一质粒导入富养罗尔斯通氏菌的效率，能够高效地将第一质粒整合至富养罗尔斯通氏菌基因组中并稳定存在。
上述序列相似性可为至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％。
本领域技术人员可以理解，同源序列的具体核苷酸序列是由目标菌株(待基因编辑的富养罗尔斯通氏菌)的基因组序列决定的，即同源序列需要与目标菌株对应的基因组位置区间的序列相同。因此，针对不同的目标菌株，同源序列的核苷酸序列可能有所差异，上述SEQ ID NO.5来源于野生型富养罗尔斯通氏菌，该序列仅作为示例，任意在富养罗尔斯通氏菌的上述基因组区间内且长度符合上述要求的序列均可以作为同源序列，用于通过同源重组将第一质粒整合至基因组中。
优选地，所述第一质粒的复制子为依赖于pir蛋白的R6K复制子。采用依赖于pir蛋白的R6K复制子更有利于促进第一质粒与第二质粒在富养罗尔斯通氏菌中稳定共存，并保证较高的导入效率。
优选地，所述第二质粒的复制子为能够在富养罗尔斯通氏菌中独立复制的复制子。对于第二质粒的复制子，没有特别限制，只要能在富养罗尔斯通氏菌中独立复制即可，包括但不限于pSC101、pMB1、p15A、pRK2等。
在本发明的一些实施方式中，所述第一质粒的复制子为pR6K，所述第二质粒的复制子为pBBR1复制子。
上述第二质粒包含由sgRNA表达盒和同源修复片段构成的靶向模块，sgRNA靶向目标基因位点并介导Cas蛋白切割基因组的特定序列，形成DNA双链断裂并激活同源重组修复过程，同源修复片段的作用在于在sgRNA介导Cas蛋白切割靶序列后，通过同源重组的方式进行修复，实现靶序列的基因编辑。其中，sgRNA表达盒与同源修复片段的相对位置可以分离，也可以相邻。
优选地，所述第二质粒中，sgRNA表达盒与同源修复片段相邻。本发明发现sgRNA表达盒与同源修复片段相邻时，分子克隆构建质粒的效率明显高于两者分离的情况。
上述相邻优选为直接连接。对于sgRNA表达盒与同源修复片段的连接顺序，可以将sgRNA表达盒连接于同源修复片段的上游或下游。
对于第二质粒中的靶向模块，可以包含一个或者多个sgRNA和同源修复片段，以实现单基因或者多基因的编辑。
在上述双质粒系统的基础上，本发明还分别在两个质粒中引入了反向筛选(反选)元件，用于在编辑成功后高效地同步消除两个质粒，实现快速反向筛选消除质粒，缩短一轮基因编辑的实验周期。
优选地，所述第一质粒和所述第二质粒还包含反向筛选标记基因。
本发明对于反向筛选基因的选择没有特别限制，只要能够在特定条件下有效反向筛选携带该元件质粒的菌株即可。
在本发明的一些实施方式中，所述反向筛选标记基因为对蔗糖敏感的sacB基因。
上述反向筛选标记基因的上游还可包含用于转录的启动子，也可不含启动子，与质粒中的其它元件共用启动子。
上述第一质粒中的Cas蛋白优选采用诱导表达方式。
优选地，所述Cas表达盒包含诱导型启动子和Cas蛋白编码基因。
本发明对于诱导型启动子的选择没有特别限制，只需在未诱导条件下本底表达较低、且在添加诱导剂后可以激活下游基因转录即可。可选地，所述诱导型启动子包括阿拉伯糖诱导的pBAD启动子、鼠李糖诱导的pRHA启动子、脱水四环素诱导的pTET启动子等。
在本发明的一些实施方式中，所述诱导型启动子为阿拉伯糖诱导的pBAD启动子。
本发明所述的Cas蛋白为具有核酸酶活性的Cas蛋白，可为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型CRISPR/Cas系统中的Cas蛋白。
在本发明的一些实施方式中，所述Cas蛋白为Cas9蛋白。
本发明对Cas9蛋白及其编码基因的来源和序列没有特别限制，只要其不影响Cas9蛋白的功能、并同样能达到基因编辑效果即可。
在本发明的一些实施方式中，所述Cas9蛋白来源于酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)。优选Cas9蛋白的编码基因经过针对富养罗尔斯通氏菌的密码子优化。
上述第二质粒中的sgRNA表达盒优选采用组成型表达方式。
优选地，所述sgRNA表达盒包含组成型启动子、sgRNA编码基因和终止子。
本发明对于组成型启动子的选择没有特别限制，只需能够在富养罗尔斯通氏菌中实现sgRNA的组成型表达即可。
上述sgRNA包含sgRNA scaffold。
在进行基因编辑时还需要连入针对靶基因的N20序列。对于N20序列，本领域技术人员可根据靶基因的序列设计得到。
上述第一质粒和第二质粒可使用不同抗性基因的组合作为双质粒的正向筛选标记，对具体的包含启动子的抗性基因元件没有特别限制，只要两个抗性基因元件可以相互兼容、并有效筛选携带两个质粒的菌株即可，例如第一质粒和第二质粒可分别引入四环素抗性TcR或卡那霉素抗性KanR。
对于本发明构建双质粒系统使用的元件(复制子、功能基因、同源序列、启动子、终止子等)，其具体核苷酸序列没有特别限制，只要其同样能达到基因编辑效果即可。
在本发明的一些实施方式中，所述第一质粒包含R6K复制子、接合转移元件oriT、反选元件sacB、抗性基因TcR、Cas9表达盒、富养罗尔斯通氏菌同源序列。
在本发明的一些实施方式中，所述第二质粒包含pBBR1复制子、接合转移元件oriT、反选元件sacB、抗性基因KanR、同源修复片段(靶基因上下游同源修复片段)、sgRNA表达盒。
在本发明的一些实施方式中，所述第一质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，和/或，所述第二质粒的核苷酸序列为在如SEQ ID NO.8所示序列的基础上连入靶基因特异的sgRNA N20序列(在sgRNA scaffold序列的上游连入)以及同源修复片段序列(优选在sgRNA表达盒的下游)得到。
SEQ ID NO.1所示序列中，第4522位至5712位为pBAD启动子，第5785位至9891位为Cas9蛋白编码基因，第3135位至3521位为pR6K复制子。
SEQ ID NO.8所示序列中，第58位至105位为组成型启动子。
上述双质粒系统的构建可使用本领域常规技术手段，本发明没有特别限制，可以包括酶切连接、Gibson组装、Golden Gate组装等常规方法，只要能实现两个质粒的正确合成即可。
本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞包含以上所述的用于富养罗尔斯通氏菌基因编辑的双质粒系统。
优选地，所述宿主细胞为微生物，包括但不限于大肠杆菌等。
本发明提供以上所述的用于富养罗尔斯通氏菌基因编辑的双质粒系统或所述宿主细胞在富养罗尔斯通氏菌基因编辑或工程化富养罗尔斯通氏菌构建中的应用。
本发明对富养罗尔斯通氏菌进行的基因编辑用途，可以涵盖基因敲除、基因插入、基因替换等。
本发明的双质粒系统可用于富养罗尔斯通氏菌。
本发明对于富养罗尔斯通氏菌的具体菌株没有特别限制，任意具有基因编辑需求的富养罗尔斯通氏菌均可使用本发明的双质粒系统进行基因编辑。
在本发明的一些实施方式中，所述富养罗尔斯通氏菌为富养罗尔斯通氏菌H16(Ralstonia eutropha H16，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC1.7092)及其衍生菌株。所述“衍生菌株”是指已经在富养罗尔斯通氏菌中进行基因改造的菌株，包括但不限于，已经用现有的手段进行了基因编辑的富养罗尔斯通氏菌，或者已经用本发明双质粒系统进行过基因编辑的菌株。
本发明提供一种富养罗尔斯通氏菌的基因编辑方法，所述方法包括：将所述用于富养罗尔斯通氏菌基因编辑的双质粒系统导入富养罗尔斯通氏菌中得到第一重组菌，诱导所述重组菌中Cas9蛋白的表达进行基因编辑，得到第二重组菌，消除第二重组菌中的第一质粒和第二质粒。
具体地，所述基因编辑方法包括以下步骤：
1)将第一质粒和第二质粒共同导入富养罗尔斯通氏菌出发菌株中，得到第一重组菌；
2)在第一重组菌中诱导表达Cas9蛋白，在组成型表达的sgRNA引导下切割基因组上目标基因位点的序列，诱导同源重组的发生，在修复片段的帮助下，获得编辑成功的第二重组菌；
3)在编辑成功后对第二重组菌消除第一质粒和第二质粒，获得目标重组菌。
上述基因编辑方法中，将双质粒导入出发菌株的手段可以是接合转移、电转等常用的质粒导入方法。
在本发明的一些实施方式中，所述双质粒导入方法为接合转移。
上述基因编辑方法中，诱导表达Cas9蛋白的诱导剂浓度和诱导时间没有特别限制，只要能够在诱导后对菌液进行目标基因位点的PCR检测发现明显的编辑条带即可。优选地，诱导型启动子使用pBAD，诱导剂使用0.02％-0.2％(w/v)的L-阿拉伯糖，诱导时间为24-72小时。
上述基因编辑方法中，用以反向筛选含sacB元件质粒的蔗糖浓度可以在1％-10％(w/v)范围。
上述基因编辑方法中，使用的大肠杆菌菌株(例如S17-1)、细菌培养基组分(例如TYGA培养基)、培养条件(例如30℃液体培养过夜、30℃平板培养2天)等，均为常规方法，本发明对这些条件没有特别限制，可以实现同等效果的其他方式也可以使用。
本发明的有益效果在于：本发明构建了适用于富养罗尔斯通氏菌基因编辑的双质粒系统，该双质粒系统能够高效导入富养罗尔斯通氏菌中，可以在富养罗尔斯通氏菌中稳定共存并用于CRISPR-Cas基因编辑，在富养罗尔斯通氏菌中实现高效、快速的基因敲除、插入和替换。
相比于现有的富养罗尔斯通氏菌CRISPR-Cas9单质粒系统，本发明的双质粒系统至少具有以下优势：1)使用单质粒系统完成一轮基因编辑实验周期至少24天，而使用本发明的双质粒系统完成一轮基因编辑实验周期仅需12天，成倍缩短了时间；2)单质粒系统的质粒大小超过10kb，而本发明使用的靶向基因位点的pTarget质粒小于6kb，极大地方便了分子克隆操作。因此，本发明的双质粒系统显著提高了富养罗尔斯通氏菌的定向改造效率。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中富养罗尔斯通氏菌CRISPR-Cas9基因编辑双质粒系统的pCas9质粒图谱，包括R6K复制子、接合转移元件oriT、反选元件sacB、抗性基因TcR、诱导型表达的pBAD-SpyCas9、1kb环入富养罗尔斯通氏菌的同源序列。
图2为本发明实施例2中富养罗尔斯通氏菌CRISPR-Cas9基因编辑双质粒系统的pTarget质粒图谱，包括pBBR1复制子、接合转移元件oriT、反选元件sacB、抗性基因KanR、靶基因上下游同源修复片段(△B1497-H1、△B1497-H2)、sgRNA表达盒，其中sgRNA表达盒由组成型启动子、N20、sgRNA scaffold、rrnB T1终止子组成；N20决定了sgRNA的靶向特异性，进而决定了SpyCas9的切割特异性，针对不同靶基因需要设计不同的N20再连入pTarget质粒中。
图3为本发明实施例2中使用CRISPR-Cas9双质粒系统敲除富养罗尔斯通氏菌B1497基因的敲除效率检测结果，其中，A、B和C分别为重组菌1(包含pCas9质粒和pTarget-B1497质粒)在不同浓度(0％、0.02％、0.2％，w/v)诱导剂诱导24小时后的菌液PCR鉴定结果，B和C的DNA marker条带与A相同，野生型为2557bp，敲除型为1228bp。
图4为本发明实施例3中使用TYGA无抗蔗糖平板反选，消除CRISPR-Cas9双质粒，其中，A为富养罗尔斯通氏菌经双质粒系统诱导、PCR鉴定发生有效编辑的重组菌2在含5％(w/v)蔗糖TYGA固体平板上反选后的生长情况，生长条件为30℃恒温培养箱培养2天；B为蔗糖反选后，平板上生长的单克隆同时在3种TYGA固体抗性平板复刻后的生长情况，其中TYGA+Apr为含50μg/mL安普霉素的TYGA固体培养基，TYGA+Apr+Tet为含50μg/mL安普霉素+10μg/mL四环素的TYGA固体培养基，TYGA+Apr+Kan为含50μg/mL安普霉素+250μg/mL卡那霉素的TYGA固体培养基。
图5为本发明实施例5中pTarget质粒上sgRNA表达盒与靶基因上下游同源修复片段分离的结构示意图。
图6为本发明实施例5中sgRNA表达盒与修复片段相对位置不同的pTarget质粒的分子克隆效率对比，其中，pTarget(相连)质粒为pTarget(sgRNA表达盒与靶基因上下游同源修复片段相连)；pTarget(分离)质粒为pTarget(sgRNA表达盒与靶基因上下游同源修复片段分离)。
具体实施方式
本发明提供的用于富养罗尔斯通氏菌基因编辑的双质粒系统，该系统由两个质粒组成：第一质粒(pCas9)使用依赖于pir蛋白的R6K复制子，在作为质粒供体的大肠杆菌中可以正常复制，但是在富养罗尔斯通氏菌中无法独立复制，通过在该质粒中插入富养罗尔斯通氏菌同源序列作为整合型质粒，用于诱导型表达Cas9蛋白，并且不需要使用λ-Red重组酶系统；第二质粒(pTarget)使用在大肠杆菌和富养罗尔斯通氏菌中均可独立复制的多拷贝质粒复制子(如pBBR1复制子)，用于提供靶向模块，组成型表达sgRNA、并以目标基因位点的上下游同源臂作为同源修复片段。两个质粒分别包含不同的抗性基因元件，用于双质粒组合的正向筛选。该双质粒系统可以通过接合转移高效导入富养罗尔斯通氏菌，并在液体和固体培养中稳定共存，实现富养罗尔斯通氏菌的高效基因编辑。进一步地，本发明在上述双质粒系统中，通过引入sacB反选元件实现双质粒的同步高效消除，显著缩短了基因编辑实验周期，实现了富养罗尔斯通氏菌的快速基因编辑。此外，本发明还通过优化靶向模块中sgRNA表达盒与修复片段的相对位置使得分子克隆更加便捷，提高了质粒的构建效率。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。其中分子生物学实验包括质粒构建、感受态细胞制备、化学转化、培养基配制等，主要参照《分子克隆实验指南》第三版，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002。
以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中，所用的酶试剂采购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司(Vazyme Biotech Co.,Ltd)和NewEngland Biolabs(NEB)公司，质粒提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，DNA片段回收试剂盒购自美国Omega公司，Gibson组装试剂盒购自天地人和生物科技有限公司，相应的操作步骤严格按照产品说明书进行。所用的DNA片段可以使用商业化合成获得，如通过药明生物技术有限公司的DNA片段合成订单。
以下实施例中的大肠杆菌S17-1λpir(ATCC编号BAA-2428),可购自美国菌种保藏中心American Type Culture Collection。富养罗尔斯通氏菌H16(Ralstonia eutrophaH16)，来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号CGMCC 1.7092。
以下实施例中的LB液体培养基配方为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g，去离子水1L。
LB固体培养基配方为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、琼脂粉15g，去离子水1L。
TYGA液体培养基配方为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、葡萄糖3g、硫酸铵3g，去离子水1L。
TYGA固体培养基配方为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、葡萄糖3g、硫酸铵3g、琼脂粉15g，去离子水1L。
含5％蔗糖的TYGA固体培养基配方为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、蔗糖50g、葡萄糖3g、硫酸铵3g、琼脂粉15g，去离子水1L。
在实际培养过程中，可向上述培养基中加入一定量的抗生素以维持质粒的稳定性和反向筛选接合供体大肠杆菌，包括安普霉素(使用终浓度为50μg/mL)、四环素(使用终浓度为10μg/mL)、卡那霉素(针对大肠杆菌的使用终浓度为50μg/mL，针对富养罗尔斯通氏菌的使用终浓度为250μg/mL)。
实施例1用于富养罗尔斯通氏菌基因编辑的CRISPR-Cas9双质粒系统的构建
1、pCas9质粒的构建
pCas9质粒的组成如图1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
使用高保真酶(
Max Super-Fidelity DNA Polymerase)PCR分别扩增3个目的片段，目的片段信息见表1，PCR反应体系见表2，PCR反应程序见表3；对PCR产物进行电泳，切胶回收获得纯化的目的片段；然后使用Gibson组装试剂盒(天地人和，SmartAssembly Cloning Kit)实现三片段连接；最后使用化学转化方法导入感受态细胞S17-1。使用含10μg/mL四环素的抗性LB固体平板筛选转化子，通过PCR鉴定和Sanger测序验证序列正确。
表1
表2
表3
2、pTarget质粒的构建
pTarget质粒的核苷酸序列为在如SEQ ID NO.8所示序列基础上，针对不同的基因编辑靶基因，在sgRNA scaffold序列的上游连入靶基因特异的N20序列，并连入同源修复片段序列(优选在sgRNA表达盒的下游)得到，与pCas9质粒共同实现靶基因的基因编辑。
pTarget质粒的构建可采用商业化合成、PCR扩增和组装等方式。通过PCR鉴定和Sanger测序验证质粒的序列正确。
实施例2利用CRISPR-Cas9双质粒系统进行富养罗尔斯通氏菌的基因编辑
本实施例利用实施例1的CRISPR-Cas9双质粒系统敲除富养罗尔斯通氏菌的B1497基因。
在富养罗尔斯通氏菌H16_B1497基因序列中选取AGACGCGCCCCGTAGCAGTT(SEQ IDNO.3)为sgRNA，对应的PAM序列为CGG；该基因的上下游同源修复片段H1/H2序列如SEQ IDNO.4所示。将上述N20序列和同源修复片段连入实施例1的pTarget质粒中，得到靶向B1497基因的pTarget-B1491质粒，其完整序列如SEQ ID NO.2所示，结构示意图如图2所示，在进行其它靶基因的基因编辑时，将SEQ ID NO.2中的sgRNA N20序列和同源修复片段替换为目标靶基因对应的N20序列和同源修复片段即可。
将pCas9质粒和pTarget-B1491质粒分别转入大肠杆菌S17-1λpir，得到菌株S17-1(pCas9)和S17-1(pTarget-B1491)；然后通过接合转化法将pCas9质粒和pTarget-B1491质粒同时转入富养罗尔斯通氏菌Re_H16中，得到重组菌Re_H16(pCas9+pTarget-B1491)。
具体的接合转化方法为：(1)单克隆培养，在超净台中分别挑取供体菌S17-1(pCas9)、S17-1(pTarget-B1491)的单克隆于3mL含10μg/mL四环素抗性的LB液体培养基和50μg/mL卡那霉素抗性的LB液体培养基中、37℃ 220rpm培养16小时，挑取受体菌Re_H16的单克隆于3mL TYGA液体培养中、30℃ 220rpm培养过夜(16小时)。(2)无抗接合，过夜培养后在超净台中分别取400μL菌液S17-1(pCas9)、400μL菌液S17-1(pTarget-B1491)、400μL菌液Re_H16于1.5mL体积离心管中混合均匀，4000rpm离心4分钟后弃上清，将离心管底部的混合菌体用50μL无抗TYGA液体培养基重悬混合后，全部取出滴在TYGA无抗固体平板上，将平板置于30℃恒温培养箱培养过夜(16小时)。
三抗筛选阳性接合子：在超净台中，用涂布棒将上述平板上过夜培养的菌苔全部刮下、均匀涂布在含10μg/mL四环素抗性+50μg/mL安普霉素抗性+250μg/mL卡那霉素抗性的TYGA三抗固体平板上，将平板置于30℃恒温培养箱培养2天。平板上长出的单克隆，即为重组菌1：Re_H16(pCas9+pTarget-B1491)。
CRISPR-Cas9双质粒系统的诱导表达条件为：将重组菌1分别接种于含0％、0.02％、0.2％的L-阿拉伯糖的TYGA三抗(10μg/mL四环素抗性+50μg/mL安普霉素抗性+250μg/mL卡那霉素抗性)液体培养基中，以2mL液体体积在30℃恒温培养箱、24孔板中、800rpm培养24小时后，进行菌液PCR鉴定，获得含有成功编辑基因型的重组菌2。
根据PCR鉴定结果(图3)可知：该CRISPR-Cas9双质粒系统可以对富养罗尔斯通氏菌的B1497基因进行高效敲除；从图3的C可以看出，在0.2％浓度诱导剂、24小时诱导后，菌液可发生较为完全的基因编辑，体现为对应于敲除型1228bp大小的单一核酸电泳条带。
实施例3基于sacB反选元件同步消除富养罗尔斯通氏菌中CRISPR-Cas9双质粒
1、TYGA无抗复刻
取在实施例2中PCR鉴定已发生有效编辑(敲除型条带亮度大于野生型条带亮度)的10μL重组菌2在TYGA无抗平板上进行复刻，将平板置于30℃恒温培养箱中培养过夜。
2、TYGA无抗蔗糖平板反选消除双质粒
蔗糖反选：挑取上述在TYGA无抗平板复刻长出的菌苔，用接种环将菌苔全部刮取至400μL无菌水中，混合均匀；然后取20～50μL在含5％(w/v)蔗糖的TYGA无抗平板上涂布筛选，将平板置于30℃恒温培养箱培养2天，观察上述蔗糖平板单克隆生长情况(图4的A)。
抗性复刻确定双质粒丢失：挑取8～16个单克隆复刻，每个单克隆同时复刻至3种抗性平板上(含50μg/mL安普霉素的TYGA固体平板、含50μg/mL安普霉素+10μg/mL四环素的TYGA固体平板、含50μg/mL安普霉素+250μg/mL卡那霉素的TYGA固体平板)，将平板置于30℃恒温培养箱培养1天。根据3种抗性平板生长情况(图4的B)，可见大部分复刻的菌株在含50μg/mL安普霉素的TYGA固体平板上可以生长，而在含50μg/mL安普霉素+10μg/mL四环素的TYGA固体平板和含50μg/mL安普霉素+250μg/mL卡那霉素的TYGA固体平板上均不能生长，显示CRISPR-Cas9双质粒已高效地同步消除，由此获得重组菌3。
实施例4pCas9质粒的同源序列对双质粒接合的接合效率的影响
双质粒系统中pCas9质粒使用富养罗尔斯通氏菌同源序列，通过同源重组整合进入富养罗尔斯通氏菌基因组。pCas9质粒的整合位置只要不破坏必需基因的开放读码框，同源序列长度在500bp以上保证同源重组效率即可。本发明在以上可行方案的基础上进一步探索，发现了表现更佳的同源序列及整合位置，但需要理解的是，该优选同源序列并不意味着唯一优选，本领域技术人员仍存在继续探索其他优选同源序列和整合位置的可能性，而探索结果并未超出本发明的保护范围。以下列举本发明尝试的2种同源序列作为示例。
分别在富养罗尔斯通氏菌的基因组上选定了1kb大小的同源序列1(SEQ ID NO.5)和同源序列2(SEQ ID NO.6)，构建了2个不同的pCas9质粒：pCas9-同源序列1、pCas9-同源序列2，质粒构建方法同实施例1的步骤1。
将以上2个pCas9质粒通过化学转化导入感受态细胞S17-1，得到菌株S17-1(pCas9-同源序列1)和S17-1(pCas9-同源序列2)，质粒通过PCR鉴定和Sanger测序，验证序列正确。
将质粒pCas9-同源序列1、pCas9-同源序列2分别与pTarget-B1491共接合导入富养罗尔斯通氏菌Re_H16中，接合转化方法同实施例2。
统计TYGA三抗筛选平板上生长的单克隆个数(表4，三次平行实验)，比较得出：本发明选定的同源序列1作为位于非功能基因区的同源片段，相比另一个位于tRNA区域的同源序列2，实现了更高的双质粒接合效率。
表4
实施例5pTarget质粒上sgRNA表达盒与同源修复片段的相对位置对分子克隆效率的影响
在构建pTarget质粒过程中，对比了pTarget质粒上sgRNA表达盒与靶基因上下游同源修复片段的相对位置对分子克隆效率的影响；在测试过程中，以敲除基因B1497为例，构建了2个pTarget质粒。
其中pTarget(sgRNA表达盒与靶基因上下游同源修复片段相连)质粒的序列如SEQID NO.2所示，该质粒简称pTarget(相连)。
其中pTarget(sgRNA表达盒与靶基因上下游同源修复片段分离)质粒的序列如SEQID NO.7所示，该质粒简称pTarget(分离)，该质粒中sgRNA表达盒与修复片段的相对位置参考文献(Xiong,B.,Li,Z.,Liu,L.,Zhao,D.,Zhang,X.and Bi,C.,2018.Genome editing ofRalstonia eutropha using an electroporation-based CRISPR-Cas9technique.Biotechnology for biofuels,11(1),pp.1-9.)的排布方式。
质粒pTarget(分离)的图谱如图5所示，构建方法同实施例1的步骤2。
为构建以上pTarget质粒，pTarget(相连)进行两片段Gibson组装，pTarget(分离)则需进行四片段Gibson组装。Gibson组装后，通过化学转化方法导入感受态细胞S17-1，使用含50μg/mL卡那霉素抗性的抗性LB固体平板筛选转化子。图6的转化子生长结果显示，pTarget(相连)的连接转化效率远高于后者pTarget(分离)。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.用于富养罗尔斯通氏菌基因编辑的双质粒系统，其特征在于，所述双质粒系统包含第一质粒和第二质粒；
所述第一质粒为整合型质粒，包含Cas蛋白表达盒，以及用于将第一质粒整合至富养罗尔斯通氏菌基因组的同源序列；
所述第二质粒为复制型质粒，包含sgRNA表达盒，以及同源修复片段。
2.根据权利要求1所述的用于富养罗尔斯通氏菌基因编辑的双质粒系统，其特征在于，所述同源序列为位于富养罗尔斯通氏菌基因组的非功能基因区的序列片段。
3.根据权利要求2所述的用于富养罗尔斯通氏菌基因编辑的双质粒系统，其特征在于，所述同源序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示或与如SEQ ID NO.5所示序列具有至少80％相似性。
4.根据权利要求1所述的用于富养罗尔斯通氏菌基因编辑的双质粒系统，其特征在于，所述第一质粒的复制子为依赖于pir蛋白的R6K复制子；
所述第二质粒的复制子为能够在富养罗尔斯通氏菌中独立复制的复制子。
5.根据权利要求1～4任一项所述的用于富养罗尔斯通氏菌基因编辑的双质粒系统，其特征在于，所述第二质粒中，sgRNA表达盒与同源修复片段相邻。
6.根据权利要求1～4任一项所述的用于富养罗尔斯通氏菌基因编辑的双质粒系统，其特征在于，所述第一质粒和所述第二质粒还包含反向筛选标记基因。
7.根据权利要求1～4任一项所述的用于富养罗尔斯通氏菌基因编辑的双质粒系统，其特征在于，所述Cas表达盒包含诱导型启动子和Cas蛋白编码基因；
和终止子。
8.宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含权利要求1～7任一项所述的用于富养罗尔斯通氏菌基因编辑的双质粒系统。
9.权利要求1～7任一项所述的用于富养罗尔斯通氏菌基因编辑的双质粒系统或权利要求8所述的宿主细胞在富养罗尔斯通氏菌基因编辑或工程化富养罗尔斯通氏菌构建中的应用。
10.一种富养罗尔斯通氏菌的基因编辑方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求1～7任一项所述的用于富养罗尔斯通氏菌基因编辑的双质粒系统导入富养罗尔斯通氏菌中得到第一重组菌，诱导所述重组菌中Cas9蛋白的表达进行基因编辑，得到第二重组菌，消除第二重组菌中的第一质粒和第二质粒。
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