CN110358767B - 一种基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法及其应用 - Google Patents

一种基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因编辑技术领域，尤其涉及一种基于CRISPR‑Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法及其应用。旨在以运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis ZM4为模式菌株，基于CRISPR‑Cas12a系统构建用于运动发酵单胞菌基因组编辑的方法，实现对基因组的定向编辑，为在该菌株中开展理性设计异源代谢途径及细胞工厂用于生物质燃料和生物材料的生产提供一套基因编辑工具，促进代谢工程等相关研究领域的发展。技术要点包括：构建诱导型表达的Cas12a重组菌株及含人工CRISPR表达单元的编辑质粒；设计向导RNA；将向导RNA引物序列退火后连接至编辑质粒中；将靶质粒转入感受态细胞表达编辑。

Description

一种基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑 方法及其应用
技术领域
本发明属于基因编辑技术领域，尤其涉及一种基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法及其应用。
背景技术
近年来，随着合成生物学技术的发展和进步，利用微生物进行代谢工程改造和系统生物学研究受到越来越多的关注。以微生物为载体从廉价的可再生资源中生产生物燃料和增值化学品，为解决的化石资源短缺及其引发的相关环境问题提供了一个可替代方案。运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)作为天然产乙醇菌株，具备独特ED代谢途径和较高的糖发酵效率，并且具有乙醇产量高、产生物量少、乙醇耐受力强、耐高渗透压等理想工业细胞工厂的特性，是目前构建生物燃料及其他生物及平台化合物的工程菌株的优选宿主之一。模型菌株 Z.mobilis ZM4的基因组序列已被确定，并且已被利用系统生物学数据完善了它的基因组注释，其基因组仅为2-M，约有1700多个编码区，有利于基因组规模代谢网络建模和代谢工程实践。目前已经在Z.mobilis实现了乳酸、琥珀酸、2-,3-丁二醇以及聚羟基丁酸(PHB)的尝试。通过去除基因组中生存非必需的区域将有利于降低基因组的复杂度，增强菌株稳定性，提高细胞的生长速度和对目标产物的转化效率，使其成为理想的细胞工厂。
采用系统化、高通量、精准、简便的方法对基因或者基因组的信息进行编辑对于了解生物体内的代谢过程以及基因的功能有着至关重要的作用。经典的基因组编辑技术主要依赖于宿主自身的同源重组(homologous recombination)系统来完成对个体特定基因的改造，利用自杀质粒或者不稳定的复制载体实现对基因组的修改往往需要引入特定的筛选标记或者反向选择系统，但存在效率较低、耗时较长、工作量大的缺点并且这些系统通常受到可用选择标记和宿主中重组酶表达系统的限制，严重制约了相关的研究和应用。因此，开发高效、便捷的基因工程工具，有助于促进相关领域研究和应用的发展。
规律成簇的间隔短回文重复(Clustered Regularly Interspersed ShortPalindromic Repeats， CRISPR)是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御系统，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。利用RNA引导Cas核酸酶可在多种细胞的特定的基因组位点上进行切割、修饰。具有功能性的Cas核酸酶在向导RNA的引导下，特异性的切割基因组并产生双链断裂，由此激活内源性DNA重组修复机制如非同源末端连接和同源重组。经过改造的 CRISPR系统可利用序列特异性核酸酶对目的基因进行定点剪切，促进基因组与供体DNA的重组，定点引入突变，实现基因组的精准编辑，提高细胞体内DNA重组效率。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法及其应用。本发明的目的在于以运动发酵单胞菌Zymomonasmobilis ZM4 为模式菌株，基于CRISPR-Cas12a系统构建用于运动发酵单胞菌基因组编辑的方法，实现对基因组的定向编辑。为在该菌株中开展理性设计异源代谢途径及细胞工厂用于生物质燃料和生物材料的生产提供一套基因编辑的工具，促进代谢工程等相关研究领域的发展。
本发明是这样实现的，一种基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法，包括以下步骤：
步骤1：构建诱导型表达的Cas12a重组菌株；
步骤2：构建含人工CRISPR表达单元的编辑质粒；
步骤3：根据编辑靶位点设计向导RNA，并设计向导RNA引物序列；
步骤4：将向导RNA引物序列经退火后连接至含人工CRISPR表达单元的编辑质粒中，获得靶质粒；
步骤5：将步骤4构建的靶质粒转入感受态细胞，进行表达编辑。
进一步，在步骤4与步骤5之间增加步骤4’：获取供体DNA片段。
进一步，步骤5中，将靶质粒与供体DNA混合，通过电转化方法转入感受态细胞。
进一步，步骤5中，将靶质粒反向PCR扩增后，与供体DNA通过Gibson装配的方法进行连接后转入感受态细胞。
进一步，步骤1中将来源于Francisella novicida的核酸酶Cas12a通过同源重组的方法将其整合到Z.mobilis ZM4基因组中的ZMO0038基因位点，并采用诱导型启动子来控制核酸酶表达量。
进一步，步骤2中，编辑质粒以pEZ15a为载体骨架，进行crRNA的人工表达单元的构建，所述crRNA的人工表达单元由19-nt的重复序列和23-nt的引导序列在组成型启动子PJ23119控制下进行表达，所述重复序列后面插入了两个酶切位点以方便引导序列插入。
进一步，步骤3中从编辑靶位点基因中选择PAM位点TTTN位点下游23bp的序列作为构建靶质粒中向导RNA的靶向引导序列。
进一步，步骤3中的向导RNA引物序列的5′端分别加有与人工表达单元中的酶切位点互补的碱基序列。
如权利要求1或权利要求5-8任一所述的一种基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法在内源质粒消除中的应用。
如权利要求2-8任一所述的一种基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法在点突变或基因敲除或基因插入中的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明开发了一种基于CRISPR-Cas12a系统开发了应用运动发酵单胞菌的基因组编辑的方法进行遗传学操作。该方法有以下的技术优势：
(1)操作简便，由于CRISPR-Cas12a可自己加工形成crRNA，仅需要装配完成靶位点序列，提供适当的修复模板，即可进行基因编辑。
(2)阳性率高，无痕编辑，CRISPR-Cas12a系统能对靶序列持续进行剪切，具有正选压力，无需额外的抗性筛选标记，避免引入抗性基因造成的安全隐患。
(3)适用范围广泛，CRISPR-Cas12a系统可用于多种基因编辑方式如：基因的敲除、基因敲入和定点突变等。
(4)流程简单，时间周期短，大大减轻原核生物基因组编辑的工作量。
附图说明
图1是内源质粒的消除实验的产物电泳图；
图2是点突变实验的产物电泳图；
图3是点突变实验的产物测序结果；
图4是基因敲除编辑的原理示意图；
图5是基因敲除实验的产物电泳图；
图6是基因敲除实验的产物测序结果；
图7是基因插入编辑的原理示意图；
图8是基因插入实验的产物电泳图；
图9是基因插入实验的产物测序结果；
图10是基因插入实验的流式细胞仪检测结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明披露了一种基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法及其应用，具体如下各实施例所示。
实施例1构建适用于运动发酵单胞菌可诱导基因编辑系统
本发明以运动发酵单胞菌Zymomonas mobilis ZM4为模式菌株，通过构建适用于运动发酵单胞菌可诱导基因编辑系统，实现对基因组的定向编辑，具体实验过程如下：
1.构建诱导型表达的Cas12a重组菌株
在本发明中，首先将来源于Francisella novicida的核酸酶Cas12a通过同源重组的方法将其整合到Z.mobilis ZM4基因组中的ZMO0038位点，并采用诱导型启动子来控制核酸酶表达量，构建重组菌株ZM-Cas12a。
具体构建过程如下：
(1)重组质粒的构建
利用PCR分别扩增Cas12a基因序列，抗性筛选标记(壮观霉素)，诱导型启动子基因序列(四环素诱导启动子)，插入位点上下游的基因序列及反向扩增用于整合的pUC57的载体序列。PCR扩增程序设置为：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸 (根据片段长度按照10s/kb进行设置)，共30个循环；循环反应结束后72℃保持5min；产物经纯化后-20℃保存。PCR扩增条件体系如下：
Figure BDA0002148166380000041
其中，用于扩增Cas12a和诱导型启动子片段的模板均为合成的序列，Cas12a基因序列见 SEQ ID NO:42，启动子Ptet序列见SEQ ID NO:43。扩增壮观霉素抗性基因的来自于公知载体 pEZ15a，用于扩增上下游的基因序列模板来自于发酵单胞菌Zymomonas mobilisZM4的基因组，反向扩增pUC57的模板为pUC57载体，扩增引物如下：
Cas12a-F:gaggagaaaggatctcccatgtcaatttatcaagaatttgtgaacaaatat，见SEQ IDNO:44；
Cas12a-R:ctggcgtcgggcgtgataaaacgaaaggcccagtctttc，见SEQ ID NO:45；
Ptet-F:ttaagacccactttcacatttaag，见SEQ ID NO:46；
Ptet-R:gggagatcctttctcctctttag，见SEQ ID NO:47；
Spe-F:ctgaatatttaacgaaattctcatgtttgacagcttatc，见SEQ ID NO:48；
Spe-R:gaaagtgggtcttaaattcagtactcactacggaattg，见SEQ ID NO:49；
Up-F:ttaggcgagaagggaaagggc，见SEQ ID NO:50
Up-R:tcgttaaatattcagatagacggagat，见SEQ ID NO:51
Down-F:tcacgcccgacgccag，见SEQ ID NO:52；
Down-R:ctcgagtttggatcccaccctctggtgattgtcga，见SEQ ID NO:53；
pUC-F:ggatccaaactcgagtaaggatctccag，见SEQ ID NO:54；
pUC-R:atgtatatctccttcttaaaagatcttttgaatt，见SEQ ID NO:55。
将获取的片段和载体按照3:1的比例进行混合，按照下表反应体系配制完成后，在冰上静置5分钟，然后添加化学感受态，进行化学转化。利用壮观霉素抗性平板进行筛选，挑取单菌落，分别用M13引物通过colony PCR进行验证(PCR扩增程序设置为：98℃预变性3min； 98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸80s，共30个循环)，条带大小与预期一致的通过测序进行验证。
Figure BDA0002148166380000051
(2)转化
将ZM4感受态细胞至于冰上，待其融化后，转导0.1cm的电转杯中，然后加入1μg左右的步骤1构建的质粒，按照1600V，25μF，200Ω的设定程序进行电转。电转程序完成后，将其转入到1mL RM培养基中在30℃条件下静置培养4-6h，然后取200μL左右涂布于100 μg/mL壮观霉素抗性平板上，30℃静置培养2-3天。
(3)重组菌株的筛选
待有菌落生长出来之后，对重组菌株进行菌落PCR检测，PCR扩增程序设置为：98℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸(根据片段长度按照10s/kb进行设置)，共30个循环；循环反应结束后72℃保持5min；反应体系如下：
Figure BDA0002148166380000052
Figure BDA0002148166380000061
条带大小与预期一致的菌株通过测序进行验证，正确的菌株保存待用。
2.构建编辑质粒
CRISPR-Cas系统发挥作用需要引导RNA(crRNA)协助定位，在核酸酶的作用下切割DNA链。为了构建完整的CRISPR系统，需构建编辑质粒。编辑质粒以pEZ15a为载体骨架，进行crRNA的人工表达单元的构建，其由19-nt的重复序列和23-nt的引导序列在组成型启动子PJ23119控制下进行表达，其中重复序列后面插入了两个BsaⅠ的酶切位点以方便引导序列插入。其具体构建过程为，将PJ23119 (TTGACAGCTAGCTCAGTCCTAGGTATAATGCTAGC)，19-nt重复序列 (AATTTCTACTCTTGTAGAT)以及两个BsaⅠ的酶切位点(GGAGACCGAGGTCTCA)串联后组装到pEZ15a载体上。该过程由三方公司完成。
3.在获得含有人工CRISPR表达单元的质粒后，根据具体的编辑需要设计供体DNA、构建靶向性质粒，并将供体DNA整合到靶向性质粒，之后将靶向性质粒转入感受态细胞进行编辑。最终通过菌落PCR及测序验证编辑效果。
在基因敲除和插入的应用当中，分别扩增靶基因上下游的DNA序列，将上游片段、下游片段和插入片段(基因插入实例)进行连接，然后插入到相对应的靶质粒当中。
实施例2基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法在内源质粒消除中的应用
1.靶位点的选取
Z.mobilis ZM4的基因组数据已经被公布，其包含4个内源质粒，并且根据序列的大小分别命名为pZM32(32,791bp)，pZM33(33,006bp)，pZM36(36,494bp)和pZM39(39,266bp)。序列分析表明四个内源质粒菌编辑复制酶，如果将复制酶失活，内源质粒将会失去复制的能力，内源质粒会被从菌株中消除。
本发明分别从内源质粒的复制酶基因中选择PAM位点TTTN位点下游23bp的序列作为构建靶质粒中向导RNA的靶向引导序列，引导核酸酶对靶位点的切割。其中正向引物为5′-AGAT+(靶序列)-3′，反向引物为5′-TGAC+(靶序列互补序列)-3′。
四个内源质粒的向导RNA引物序列如下，其中带下划线的部分与酶切位点互补：
pZM39-F：AGATGTCAAAGCGATATCGGACAATAA，见SEQ ID NO:1；
pZM39-R：TGACTTATTGTCCGATATCGCTTTGAC，见SEQ ID NO:2；
pZM33-F：AGATCCCCCGATATTTCTTTCATGAAT，见SEQ ID NO:3；
pZM33-R：TGACATTCATGAAAGAAATATCGGGGG，见SEQ ID NO:4；
pZM32-F：AGATGAGCGTGTGATGAGCCGGAGGAA，见SEQ ID NO:5；
pZM32-R：TGACTTCCTCCGGCTCATCACACGCTC，见SEQ ID NO:6；
pZM36-F：AGATGGCCGAACAAAATGAGGTTAAAA，见SEQ ID NO:7；
pZM36-R：TGACTTTTAACCTCATTTTGTTCGGCC，见SEQ ID NO:8。
2.构建靶质粒
将向导RNA引物序列连接到实施例1中制备的含有CRISPR表达单元的编辑质粒载体上：首先利用限制性内切酶BsaⅠ将载体进行线性化处理，然后将向导RNA引物对进行退火(10μM的引物各取1μL加水补足至10μL，95℃变性5min，然后冷却至室温备用)。
BsaⅠ酶切反应体系
Figure BDA0002148166380000071
退火的产物与线性化载体使用T4DNA连接酶进行连接，然后通过本领域通用化学转化法转入到大肠杆菌克隆菌株DH5α中进行质粒构建，通过菌落PCR对重组子进行筛选最后通过测序验证。
T4 DNA Polymerase连接反应体系
Figure BDA0002148166380000072
Figure BDA0002148166380000081
3.靶质粒的转化
将实施例1中制备的重组菌的感受态细胞至于冰上，待其融化后，转导0.1cm的电转杯中，然后加入200ng左右的步骤2构建的靶质粒，按照1600V，25μF，200Ω的设定程序进行电转。电转程序完成后，将其转入到1mL RM培养基中在30℃条件下静置培养4-6h，然后取200μL左右涂布于50μg/mL氯霉素抗性平板上，30℃静置培养2-3天。
4.重组菌株的筛选
待有菌落生长出来之后，分别用引物对重组菌株进行菌落PCR检测，PCR体系及程序同实施例1，检测引物如下：
P33-Check-F：AGCTTGATCCATCACCCATATTAC，见SEQ ID NO:9；
P33-Check-R：TCTACCATTGCGGCGTC，见SEQ ID NO:10；
P36-Check-F：TCGCATCTGCCTTGTTTGTATAAG，见SEQ ID NO:11；
P36-Check-R：ATGAATACTGCGCAGAATCAGACTC，见SEQ ID NO:12；
P39-Check-F：ATTACTGAGGAACCGCCTCG，见SEQ ID NO:13；
P39-Check-R：TGCGATTCCAGGATATACGG，见SEQ ID NO:14。
PCR电泳检测结果见图1，结果表明，有三个内源质粒被成功消除，充分说明该方法是一种高效的消除内源质粒的方法，对用于分析质粒的功能以及进行基因组精简提供了一种有效的手段。
实施例3基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法在点突变中的应用
1.靶位点的选取
选择Z.mobilis ZM4基因组中ZMO1237作为靶位点，对其进行点突变，从靶基因中选择 PAM位点TTTN位点下游23bp的序列作为构建靶质粒中向导RNA的靶向引导序列，引导核酸酶对靶位点的切割。其中正向引物为5′-AGAT+(靶序列)-3′，反向引物为5′-TGAC+(靶序列互补序列)-3′。
向导RNA引物序列如下，其中带下划线的部分与酶切位点互补：
Ldh-F：AGATGTAAGCCGCTCATTCAGAAAAAC，见SEQ ID NO:15；
Ldh-R：TGACGTTTTTCTGAATGAGCGGCTTAC，见SEQ ID NO:16。
2.构建靶质粒
将向导RNA引物序列连接到实施例1中制备的含有CRISPR表达单元的编辑质粒上：首先利用限制性内切酶BsaⅠ将载体进行线性化处理，然后将向导RNA引物对进行退火，退火的产物与线性化载体使用T4DNA连接酶进行连接，然后转入到大肠杆菌克隆菌株DH5α中进行质粒构建，通过菌落PCR对重组子进行筛选最后通过测序验证，具体操作过程同实施例2。
3.供体DNA的设计
通过CRISPR-Cas12a系统切割运动发酵单胞菌的基因组，以单链核苷酸(ssDNA)为修复模板对断裂的部分进行修改，同时在靶位点附近改变两个碱基以引入PstⅠ的酶切位。ssDNA的长度为59-nt，其互补于编码DNA的后随链。
ssDNA的序列如下：
59_ss_Ldh：gaacattatggccatgaccttgtttttctgcaggagcggcttaccaaagagacagcaga，见SEQ ID NO:17。
4.编辑质粒的转化
将实施例1中制备的重组菌的感受态细胞至于冰上，待其融化后，转导0.1cm的电转杯中，然后加入200ng左右编辑质粒和1μg ssDNA，按照1600V，25μF，200Ω的设定程序进行电转。电转程序完成后，将其转入到1mL RM培养基中在30℃条件下静置培养4-6h，然后取200μL左右涂布于50μg/mL氯霉素抗性平板上，30℃静置培养2-3天。
5.重组菌株的筛选
待有菌落生长出来之后，分别用引物对重组菌株进行菌落PCR检测，检测引物如下：
Ldh-F：TAGGGTGAGGTTATAGCTATGAAAAAAGTCAATCGTATTGCAGTG，见SEQ ID NO:18；
Ldh-R：GCTTTTTCAAAAAGCTTATTACAATATCGGTGCCATTGTTTC，见SEQ ID NO:19。
利用检测引物进行colony PCR扩增目的基因的序列(PCR扩增程序设置为：98℃预变性3 min；98℃变性10s，55℃退火10s，72℃延伸10s，共30个循环；循环反应结束后72℃保持5min)，PCR体系同实施例1。回收DNA片段后用限制性内切酶PstⅠ对DNA进行酶切。能够对DNA片段进行正确切割的说明其被正确编辑，并通过测序对重组菌株进行进一步的验证。
Figure BDA0002148166380000091
Figure BDA0002148166380000101
酶切产物电泳及测序检测结果见图2和图3，结果表明，CRISPR-Cas12a在ssDNA的协助下，可以高效的对基因组中的碱基进行替换，且与设计的一致，其效率可以高达100％。
实施例4基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法在基因敲除中的应用
1.靶位点的选取
选择Z.mobilis ZM4基因组中ZMO0028作为靶位点，对其进行敲除，原理如图4所示。从靶基因中选择PAM位点TTTN位点下游23bp的序列作为构建靶质粒中向导RNA的靶向引导序列，引导核酸酶对靶位点的切割。其中正向引物为5′-AGAT+(靶序列)-3′，反向引物为5′-TGAC+(靶序列互补序列)-3′。
向导RNA引物序列如下，其中带下划线的部分与酶切位点互补：
0028-F：AGATCCGCAGCGGGTTATTCTGATCAA，见SEQ ID NO:20；
0028-R：TGACTTGATCAGAATAACCCGCTGCGG，见SEQ ID NO:21。
2.构建靶质粒
将向导RNA引物序列连接到实施例1制备的含有CRISPR表达单元的编辑质粒上：首先利用限制性内切酶BsaⅠ将载体进行线性化处理，然后将向导RNA引物对进行退火，退火的产物与线性化载体使用T4DNA连接酶进行连接，然后转入到大肠杆菌克隆菌株DH5α中进行质粒构建，通过菌落PCR对重组子进行筛选最后通过测序验证，具体实验过程同实施例2。
3.构建编辑质粒
将供体DNA序列构建到靶载体上：分别选取靶基因上、下游各700bp左右的序列，通过PCR分别扩增其DNA片段，PCR体系及程序同实施例1第(1)部分。将上一步构建好的靶载体利用引物进行反向PCR扩增(PCR扩增程序设置为：98℃预变性2min；98℃变性 10s，55℃退火10s，72℃延伸(根据片段长度按照10s/kb进行设置)，共30个循环；循环反应结束后72℃保持5min)，然后通过Gibson装配的方法将片段和载体进行连接，然后转入到大肠杆菌克隆菌株DH5α中进行质粒构建，通过菌落PCR对重组子进行筛选最后通过测序验证。
反向扩增的引入如下：
15-反扩-F：ATGTATATCTCCTTCTTAAAAGATCTTTTGAATT，见SEQ ID NO:22；
15-反扩-R：GGATCCAAACTCGAGTAAGGATCTCCAG，见SEQ ID NO:23；
扩增上下游引物如下：
0028-Fup：TTACTCGAGTTTGGATCCTCTGCGCCTATTGATTACGG，见SEQ ID NO:24；
0028-Rup：TATCGAGCCTTTTACTTAAAATAATCTATCG，见SEQ ID NO:25；
0028-Fdown：GCTTTTTGAAAAAGCCGTTTCC，见SEQ ID NO:26；
0028-Rdown：TAAGAAGGAGATATACATGCAGCGGATCAAGGCG，见SEQ ID NO:27。
4.编辑质粒的转化
将实施例1中制备的重组菌的感受态细胞至于冰上，待其融化后，转导0.1cm的电转杯中，然后加入500ng左右的步骤3构建的编辑质粒，按照1600V，25μF，200Ω的设定程序进行电转。电转程序完成后，将其转入到1mL RM培养基中在30℃条件下静置培养4-6h，然后取200μL左右涂布于50μg/mL氯霉素抗性平板上，30℃静置培养2-3天。
5.重组菌的筛选
待有菌落生长出来之后，分别用引物对重组菌株进行菌落PCR检测，具体实验方案同实施例2，检测引物如下：
0028check-F：ATCTGCGCCTATTGATTACG，见SEQ ID NO:28；
0028check-R：TCAAGATTTCAAACAAGCGGTC，见SEQ ID NO:29。
利用检测引物进行colony PCR扩增目的基因的序列，PCR电泳结果及测序结果见图5和图6，CRISPR-Cas12a系统可以定向敲除基因，且测序结果表明敲除的基因与设计的一致，说明该方法是一种精确的基因敲除的方法。
实施例5基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法在基因插入中的应用
1.靶位点的选取
选择Z.mobilis ZM4基因组中ZMO0028作为靶位点，将报告基因mCherry插入基因组中，对ZMO0028进行替换，原理如图7所示。从靶基因中选择PAM位点TTTN位点下游23bp 的序列作为构建靶质粒中向导RNA的靶向引导序列，引导核酸酶对靶位点的切割。其中正向引物为5′-AGAT+(靶序列)-3′，反向引物为5′-TGAC+(靶序列互补序列)-3′。
向导RNA引物序列如下,其中带下划线的部分与酶切位点互补：
0028-F：AGATCCGCAGCGGGTTATTCTGATCAA，见SEQ ID NO:30。
0028-R：TGACTTGATCAGAATAACCCGCTGCGG，见SEQ ID NO:31。
2.构建靶质粒
将向导RNA引物序列连接到含有CRISPR表达单元的质粒上：首先利用限制性内切酶 BsaⅠ将载体进行线性化处理，然后将向导RNA引物对进行退火，退火的产物与线性化载体使用T4DNA连接酶进行连接，然后转入到大肠杆菌克隆菌株DH5α中进行质粒构建，通过菌落PCR对重组子进行筛选最后通过测序验证。具体实验操作同实施例2。
3.构建编辑质粒
将供体DNA序列构建到靶载体上：靶基因上、下游各700bp左右的序列及mCherry表达元件通过PCR分别扩增其DNA片段，PCR体系及程序同实施例1。将上一步构建好的靶载体利用引物进行反向PCR扩增，然后通过Gibson装配的方法将片段和载体进行连接，其中mCherry表达元件被上下游同源臂片段夹在当中，然后转入到大肠杆菌克隆菌株DH5α中进行质粒构建，通过菌落PCR对重组子进行筛选最后通过测序验证。
反向扩增的引入如下：
15-反扩-F：ATGTATATCTCCTTCTTAAAAGATCTTTTGAATT，见SEQ ID NO:32；
15-反扩-R：GGATCCAAACTCGAGTAAGGATCTCCAG，见SEQ ID NO:33；
扩增上下游引物如下：
0028-Fup：TTACTCGAGTTTGGATCCTCTGCGCCTATTGATTACGG，见SEQ ID NO:34；
0028-Rup：TATCGAGCCTTTTACTTAAAATAATCTATCG，见SEQ ID NO:35；
0028-Fdown：GCTTTTTGAAAAAGCCGTTTCC，见SEQ ID NO:36；
0028-Rdown：TAAGAAGGAGATATACATGCAGCGGATCAAGGCG，见SEQ ID NO:37；
扩增报告基因表达元件引物如下：
mCherry-F：TAAGTAAAAGGCTCGATATCGATCAACAACCCGAATCCTATC，见SEQ ID NO:38；
mCherry-R：ACGGCTTTTTCAAAAAGCTTATTTATACAATTCATCCATACCGCCG，见 SEQ IDNO:39。
4.编辑质粒的转化
将实施例1中制备的重组菌的感受态细胞至于冰上，待其融化后，转导0.1cm的电转杯中，然后加入500ng左右步骤3构建的编辑质粒，按照1600V，25μF，200Ω的设定程序进行电转。电转程序完成后，将其转入到1mL RM培养基中在30℃条件下静置培养4-6h，然后取200μL左右涂布于50μg/mL氯霉素抗性平板上，30℃静置培养2-3天。
5.重组菌株的筛选
待有菌落生长出来之后，分别用引物对重组菌株进行菌落PCR检测，检测引物如下：
0028check-F：ATCTGCGCCTATTGATTACG，见SEQ ID NO:40；
0028check-R：TCAAGATTTCAAACAAGCGGTC，见SEQ ID NO:41。
利用检测引物进行colony PCR扩增目的基因的序列，实验结果如图8和图9所示，结果表明，CRISPR-Cas12a系统可以定向插入基因，且测序结果表明敲除的基因与设计的一致。此外，在插入报告基因后利用流式细胞仪进行检测，结果如图10，结果说明报告基因可以在插入位点正常表达。说明该方法是一种精确的基因插入的方法。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 湖北大学
<120> 一种基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法及其应用
<160> 55
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(pZM39-F)
<400> 1
agatgtcaaa gcgatatcgg acaataa 27
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(pZM39-R)
<400> 2
tgacttattg tccgatatcg ctttgac 27
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(pZM33-F)
<400> 3
agatcccccg atatttcttt catgaat 27
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(pZM33-R)
<400> 4
tgacattcat gaaagaaata tcggggg 27
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(pZM32-F)
<400> 5
agatgagcgt gtgatgagcc ggaggaa 27
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(pZM32-R)
<400> 6
tgacttcctc cggctcatca cacgctc 27
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(pZM36-F)
<400> 7
agatggccga acaaaatgag gttaaaa 27
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(pZM36-R)
<400> 8
tgacttttaa cctcattttg ttcggcc 27
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(P33-Check-F)
<400> 9
agcttgatcc atcacccata ttac 24
<210> 10
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(P33-Check-R)
<400> 10
tctaccattg cggcgtc 17
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(P36-Check-F)
<400> 11
tcgcatctgc cttgtttgta taag 24
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(P36-Check-R)
<400> 12
atgaatactg cgcagaatca gactc 25
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(P39-Check-F)
<400> 13
attactgagg aaccgcctcg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(P39-Check-R)
<400> 14
tgcgattcca ggatatacgg 20
<210> 15
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Ldh-F)
<400> 15
agatgtaagc cgctcattca gaaaaac 27
<210> 16
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Ldh-R)
<400> 16
tgacgttttt ctgaatgagc ggcttac 27
<210> 17
<211> 59
<212> DNA
<213> 59_ss_Ldh(59_ss_Ldh)
<400> 17
gaacattatg gccatgacct tgtttttctg caggagcggc ttaccaaaga gacagcaga 59
<210> 18
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Ldh-F)
<400> 18
tagggtgagg ttatagctat gaaaaaagtc aatcgtattg cagtg 45
<210> 19
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Ldh-R)
<400> 19
gctttttcaa aaagcttatt acaatatcgg tgccattgtt tc 42
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(0028-F)
<400> 20
agatccgcag cgggttattc tgatcaa 27
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(0028-R)
<400> 21
tgacttgatc agaataaccc gctgcgg 27
<210> 22
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(15-反扩-F)
<400> 22
atgtatatct ccttcttaaa agatcttttg aatt 34
<210> 23
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(15-反扩-R)
<400> 23
ggatccaaac tcgagtaagg atctccag 28
<210> 24
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(0028-Fup)
<400> 24
ttactcgagt ttggatcctc tgcgcctatt gattacgg 38
<210> 25
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(0028-Rup)
<400> 25
tatcgagcct tttacttaaa ataatctatc g 31
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(0028-Fdown)
<400> 26
gctttttgaa aaagccgttt cc 22
<210> 27
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(0028-Rdown)
<400> 27
taagaaggag atatacatgc agcggatcaa ggcg 34
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(0028check-F)
<400> 28
atctgcgcct attgattacg 20
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(0028check-R)
<400> 29
tcaagatttc aaacaagcgg tc 22
<210> 30
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(0028-F)
<400> 30
agatccgcag cgggttattc tgatcaa 27
<210> 31
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(0028-R)
<400> 31
tgacttgatc agaataaccc gctgcgg 27
<210> 32
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(15-反扩-F)
<400> 32
atgtatatct ccttcttaaa agatcttttg aatt 34
<210> 33
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(15-反扩-R)
<400> 33
ggatccaaac tcgagtaagg atctccag 28
<210> 34
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(0028-Fup)
<400> 34
ttactcgagt ttggatcctc tgcgcctatt gattacgg 38
<210> 35
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(0028-Rup)
<400> 35
tatcgagcct tttacttaaa ataatctatc g 31
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(0028-Fdown)
<400> 36
gctttttgaa aaagccgttt cc 22
<210> 37
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(0028-Rdown)
<400> 37
taagaaggag atatacatgc agcggatcaa ggcg 34
<210> 38
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(mCherry-F)
<400> 38
taagtaaaag gctcgatatc gatcaacaac ccgaatccta tc 42
<210> 39
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(mCherry-R)
<400> 39
acggcttttt caaaaagctt atttatacaa ttcatccata ccgccg 46
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(0028check-F)
<400> 40
atctgcgcct attgattacg 20
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(0028check-R)
<400> 41
tcaagatttc aaacaagcgg tc 22
<210> 42
<211> 3903
<212> DNA
<213> Cas12a(Cas12a)
<400> 42
atgtcaattt atcaagaatt tgtgaacaaa tatagcctga gcaaaaccct gcgttttgaa 60
ctgattccgc agggtaaaac cctggaaaac attaaagcac gtggtctgat tctggatgat 120
gaaaaacgtg ccaaagacta caaaaaagcc aaacaaatca tcgataaata ccaccagttc 180
ttcatcgaag aaattctgag cagcgtttgc attagcgaag atctgctgca gaattattcc 240
gacgtttatt tcaaactgaa aaaaagcgac gatgataacc tgcagaaaga tttcaaaagc 300
gccaaagata ccatcaaaaa acaaattagc gagtatatca aagacagcga gaaattcaaa 360
aacctgttca accagaatct gatcgatgcc aaaaaaggtc aagaaagcga tctgatcctg 420
tggctgaaac agagcaaaga taatggcatc gaactgttta aagccaacag cgatattacc 480
gatattgatg aagcactgga aatcatcaaa agctttaaag gttggaccac ctactttaaa 540
ggctttcacg aaaatcgcaa aaacgtgtat agcagcaatg atattccgac cagcattatc 600
tatcgcatcg ttgatgataa tctgcctaaa tttctggaaa ataaagccaa atatgaaagc 660
ctgaaagaca aagcaccgga agcaattaac tatgagcaga tcaaaaaaga tctggccgaa 720
gaactgacct ttgacattga ttacaaaacc agcgaagtta accagcgtgt ttttagcctg 780
gatgaagttt ttgaaattgc caacttcaac aactacctga atcagagcgg tatcaccaaa 840
ttcaatacca ttatcggtgg caaattcgtg aatggcgaaa ataccaaacg caaaggcatc 900
aacgaataca ttaatctgta tagccagcag attaacgata aaacgctgaa aaaatacaaa 960
atgagcgtgc tgttcaaaca aattctgtca gataccgaaa gcaaaagctt cgtgattgac 1020
aaactggaag atgatagtga tgttgttacc accatgcaga gcttttatga acaaatcgca 1080
gcgtttaaaa ccgtggaaga gaaatccatt aaagaaaccc tgagcctgct gtttgatgat 1140
ctgaaagcac agaaactgga cctgtccaaa atctacttca aaaacgataa atccctgacc 1200
gatctgagcc agcaggtttt cgatgattat agcgttattg gcaccgcagt tctggaatat 1260
atcacacagc agattgcacc gaaaaatctg gataatccga gcaaaaaaga acaagagctg 1320
atcgccaaaa aaaccgagaa agcgaaatat ctgagcctgg aaacaattaa actggccctg 1380
gaagaattta acaaacaccg cgacattgat aaacagtgcc gctttgaaga aatcctggca 1440
aattttgcag caatcccgat gatctttgat gaaattgcgc agaataaaga taacctggca 1500
cagatcagca tcaaatatca gaatcaggga aaaaaagacc tgctgcaagc aagtgccgaa 1560
gatgatgtta aagcgattaa agatctgctg gatcagacca ataacctgct gcataaactg 1620
aaaatctttc acattagcca gagcgaggat aaagcgaaca ttctggataa agatgagcac 1680
ttctatctgg tgtttgaaga gtgttatttt gagctggcaa atattgtgcc gctgtataac 1740
aaaatccgca actatattac ccagaaaccg tatagcgacg aaaaattcaa actgaacttt 1800
gagaatagca ccctggccaa tggttgggat aaaaacaaag aaccggataa taccgccatc 1860
ctgttcatta aagatgataa atactatctg ggcgtgatga acaaaaaaaa caacaaaatc 1920
ttcgacgata aagccatcaa agagaataaa ggcgaaggtt acaaaaaaat cgtgtacaaa 1980
ctgctgcctg gtgcgaataa aatgctgccg aaagtgtttt ttagcgccaa atccatcaaa 2040
ttctataacc cgagcgaaga tattctgcgt attcgtaatc atagcaccca taccaaaaat 2100
ggtagtccgc agaaaggcta tgaaaaattc gagttcaaca ttgaggattg ccgcaaattc 2160
atcgacttct acaaacagtc cattagcaaa catccggaat ggaaagactt tggttttcgt 2220
tttagcgata cccagcgcta taacagcatt gatgaatttt atcgcgaagt ggaaaaccag 2280
ggctataaac tgacatttga aaacatcagc gagagctata ttgatagcgt tgtgaatcag 2340
ggtaaactgt acctgtttca gatctataac aaagacttta gcgcctatag caaaggtcgt 2400
ccgaatctgc ataccctgta ttggaaagca ctgttcgatg aacgtaatct gcaggatgtt 2460
gtctacaaac tgaatggtga agcagaactg ttttatcgca aacagagtat cccgaaaaaa 2520
atcacccatc cggcaaaaga agcaatcgcg aacaaaaaca aagataaccc gaaaaaagaa 2580
agcgtgttcg agtatgatct gatcaaagat aaacgcttca ccgaagataa attctttttc 2640
cattgcccga tcaccatcaa ctttaaaagc agcggtgcga acaaattcaa cgatgaaatc 2700
aatctgctgc tgaaagaaaa agccaacgat gttcatattc tgagcattga tcgtggtgaa 2760
cgtcatctgg cctattacac cctggttgat ggtaaaggca atattatcaa acaggacacc 2820
ttcaacatta tcggcaatga tcgtatgaaa accaactacc atgataaact ggcagccatt 2880
gaaaaagatc gtgatagcgc acgtaaagat tggaaaaaaa tcaacaacat taaagaaatg 2940
aaagaaggct acctgagcca ggttgttcat gaaatcgcca aactggtgat tgaatataat 3000
gccattgtgg tgttcgagga tctgaacttc ggtttcaaac gtggtcgttt caaagttgag 3060
aaacaggtgt atcaaaaact ggaaaaaatg ctgatcgaaa aactgaatta cctggtgttc 3120
aaagacaacg aattcgataa aaccggtggt gttctgcgtg catatcagct gaccgcacct 3180
tttgaaacct tcaaaaaaat gggtaaacag accggcatca tctattatgt tccggcaggt 3240
tttacctcca aaatttgtcc ggttaccggc tttgttaatc agctgtatcc gaaatatgag 3300
agcgttagca aaagccaaga gtttttcagc aaatttgata aaatctgcta taacctggac 3360
aaaggctact ttgaattcag ctttgactat aaaaactttg gcgataaagc agccaaaggc 3420
aaatggacca ttgcaagctt tggtagccgt ctgattaact ttcgtaacag cgacaaaaac 3480
cataactggg atacccgtga agtttatccg accaaagagc tggaaaaact gctgaaagat 3540
tacagcattg aatatggtca tggcgaatgt attaaagccg caatttgtgg tgagtccgac 3600
aaaaaattct ttgcaaaact gaccagcgtg ctgaatacca ttctgcagat gcgtaatagc 3660
aaaaccggca ccgaactgga ttatctgatt agtccggttg cagatgtgaa cggcaatttt 3720
ttcgatagcc gtcaggctcc gaaaaatatg ccgcaggatg cagatgcaaa tggtgcctat 3780
catattggcc tgaaaggtct gatgctgctg ggtcgcatta aaaacaatca agaaggcaaa 3840
aaactgaacc tggtgatcaa aaacgaagag tattttgagt tcgtgcagaa taggaataac 3900
taa 3903
<210> 43
<211> 736
<212> DNA
<213> Ptet(Ptet)
<400> 43
ttaagaccca ctttcacatt taagttgttt ttctaatccg catatgatca attcaaggcc 60
gaataagaag gctggctctg caccttggtg atcaaataat tcgatagctt gtcgtaataa 120
tggcggcata ctatcagtag taggtgtttc cctttcttct ttagcgactt gatgctcttg 180
atcttccaat acgcaaccta aagtaaaatg ccccacagcg ctgagtgcat ataatgcatt 240
ctctagtgaa aaaccttgtt ggcataaaaa ggctaattga ttttcgagag tttcatactg 300
tttttctgta ggccgtgtac ctaaatgtac ttttgctcca tcgcgatgac ttagtaaagc 360
acatctaaaa cttttagcgt tattacgtaa aaaatcttgc cagctttccc cttctaaagg 420
gcaaaagtga gtatggtgcc tatctaacat ctcaatggct aaggcgtcga gcaaagcccg 480
cttatttttt acatgccaat acaatgtagg ctgctctaca cctagcttct gggcgagttt 540
acgggttgtt aaaccttcga ttccgacctc attaagcagc tctaatgcgc tgttaatcac 600
tttactttta tctaatctag acatcattaa ttcctaattt ttgttgacac tctatcgttg 660
atagagttat tttaccactc cctatcagtg atagagaaaa gtattcaaat gatctaaaga 720
ggagaaagga tctccc 736
<210> 44
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Cas12a-F)
<400> 44
gaggagaaag gatctcccat gtcaatttat caagaatttg tgaacaaata t 51
<210> 45
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Cas12a-R)
<400> 45
ctggcgtcgg gcgtgataaa acgaaaggcc cagtctttc 39
<210> 46
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Ptet-F)
<400> 46
ttaagaccca ctttcacatt taag 24
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Ptet-R)
<400> 47
gggagatcct ttctcctctt tag 23
<210> 48
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Spe-F)
<400> 48
ctgaatattt aacgaaattc tcatgtttga cagcttatc 39
<210> 49
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Spe-R)
<400> 49
gaaagtgggt cttaaattca gtactcacta cggaattg 38
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Up-F)
<400> 50
ttaggcgaga agggaaaggg c 21
<210> 51
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Up-R)
<400> 51
tcgttaaata ttcagataga cggagat 27
<210> 52
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Down-F)
<400> 52
tcacgcccga cgccag 16
<210> 53
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Down-R)
<400> 53
ctcgagtttg gatcccaccc tctggtgatt gtcga 35
<210> 54
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(pUC-F)
<400> 54
ggatccaaac tcgagtaagg atctccag 28
<210> 55
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(pUC-R)
<400> 55
atgtatatct ccttcttaaa agatcttttg aatt 34

Claims (9)

1.一种基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：构建诱导型表达的Cas12a重组菌株；将来源于Francisella novicida的核酸酶Cas12a通过同源重组的方法将其整合到Z.mobilis ZM4基因组中的ZMO0038基因位点，并采用诱导型启动子来控制核酸酶表达量；
步骤2：构建含人工CRISPR表达单元的编辑质粒；
步骤3：根据编辑靶位点设计向导RNA，并设计向导RNA引物序列；
步骤4：将向导RNA引物序列经退火后连接至含人工CRISPR表达单元的编辑质粒中，获得靶质粒；
步骤5：将步骤4构建的靶质粒转入感受态细胞，进行表达编辑。
2.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法，其特征在于，在步骤4与步骤5之间增加步骤4’：获取供体DNA片段。
3.根据权利要求2所述的一种基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法，其特征在于：步骤5中，将靶质粒与供体DNA混合，通过电转化方法转入感受态细胞。
4.根据权利要求2所述的一种基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法，其特征在于：步骤5中，将靶质粒反向PCR扩增后，与供体DNA通过Gibson装配的方法进行连接后转入感受态细胞。
5.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法，其特征在于：步骤2中，编辑质粒以pEZ15a为载体骨架，进行crRNA的人工表达单元的构建，所述crRNA的人工表达单元由19-nt的重复序列和23-nt的引导序列在组成型启动子PJ23119控制下进行表达，所述重复序列后面插入了两个酶切位点以方便引导序列插入。
6.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法，其特征在于：步骤3中从编辑靶位点基因中选择PAM位点TTTN位点下游23bp的序列作为构建靶质粒中向导RNA的靶向引导序列。
7.根据权利要求5所述的一种基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法，其特征在于：步骤3中的向导RNA引物序列的5′端分别加有与人工表达单元中的酶切位点互补的碱基序列。
8.如权利要求1或权利要求5-7任一所述的一种基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法在内源质粒消除中的应用。
9.如权利要求2-7任一所述的一种基于CRISPR-Cas12a系统的运动发酵单胞菌基因组编辑方法在点突变或基因敲除或基因插入中的应用。
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