CN116004716A - 一种复制型dCas9-FokI系统进行高效基因编辑的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用epi‑dCas9‑FokI系统进行高效基因编辑的方法，具体地公开了一种将附着体元件（EBNA1/oriP）介导融合蛋白dCas9‑FokI表达进行基因编辑的方法，所述epi‑dCas9‑FokI系统由于使用二聚形式产生切割的FokI核酸酶，因此不会破坏sgRNA的识别序列，再利用EBNA1/oriP附着体介导持续表达dCas9‑FokI核酸酶，持续切割未发生敲除的序列，达到提高敲除效率和增加对未发生目的编辑的靶位点进行重复多次编辑的目的。利用该方法可以高效敲除特定核苷酸序列，为基因功能研究提供可行的方法和强大的基因编辑工具。

Description

一种复制型dCas9-FokI系统进行高效基因编辑的方法

技术领域

本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种利用附着体元件EBNA1/oriP使dCas9(dead Cas9)-FokI融合蛋白持续表达从而对基因组区域进行高效敲除的方法。

背景技术

CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御系统，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9基因编辑系统由一个具有核酸内切酶活性的Cas9蛋白和一条单链向导RNA(single guide，sgRNA)组成。sgRNA与Cas9蛋白结合并引导Cas9蛋白靶向到靶位点进行切割，Cas9的两个切割结构域RuvC和HNH分别对DNA双链进行切割，导致双链断裂(double strand breaks，DSB)。机体自身会启动DNA修复机制，分别是非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)和同源重组(homology-directed repair，HR)修复机制。NHEJ是一种错配修复机制，DNA双链通过NHEJ修复会随机产生碱基插入或缺失(insertion and deletions，indels)。HR是一种精准的修复机制，在同源供体存在的情况下，供体中的外源基因片段通过同源重组方式整合到靶位点。基因编辑技术近年来发展迅速，已广泛应用于生命科学相关的各个领域，但目前的研究不远远不能满足人们的需求，例如长片段敲除的效率还比较低。而一些长片段的序列又对动物的生长发育或疾病发挥着至关重要的作用，例如长链非编码RNA(lncRNA)。在哺乳细胞中非编码区域所占比例超过了90％，并且在过去的研究中已经发现多个长非编码转录物参与骨骼肌生长发育，并且还包括许多基因调控和疾病的发生发展至关重要的顺式作用元件，因此研究工具的受限严重影响了研究人员对于长片段非编码序列的研究。

dCas9-FokI(fCas9)与以前开发的锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)相似，即将催化失活的Cas9(D10A和H840A,dCas9)与非特异的FokI限制性核酸内切酶融合表达，只有在两个引导RNA(guide RNA，sgRNA)分别靶向不同链，PAM方向相反且有一定距离的情况下才能同时招募两个没有切割活性的dCas9蛋白，两个FokI核酸酶才能形成二聚体形式，对靶位点DNA进行切割产生DSB，并且不会破坏sgRNA，因此不会破坏dCas9对靶序列的识别。众所周知，使用CRISPR/Cas9进行基因编辑时的一个不可忽视的风险就是sgRNA/Cas9复合物会产生脱靶突变，即脱靶位点与sgRNA的目标序列具有相似的序列，因此在非目标区域也会出现不理想的编辑。有研究表明通过使用成对的nCas9(D10A)进行基因编辑时，可以使脱靶风险相比于单个的野生型Cas9降低50-1500倍，因为只有当成对的sgRNAs以适合的距离同时结合到相反的链时，nCas9才能对靶位点进行切割产生一个DSB，因此降低了脱靶的可能性，dCas9-FokI与双sgRNA的nCas9具有相似的优势因此也可以达到降低脱靶风险的目的。Liu R David团队通过设计了216对sgRNA比较了5-43bp间隔长度的dCas9-FokI编辑效率后发现，当dCas9-FokI的两个sgRNA相距15-25bp时，编辑效率最高，平均能够达到约20％。

人类疱疹病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)与鼻咽癌、胃癌和淋巴瘤等多种恶性肿瘤有关，人类疱疹病毒核抗原1(EBNA1)与复制起点(oriP)结合后，病毒的基因组能够以稳定且游离体的形式存在，使病毒基因组在增殖细胞中依赖宿主的复制方式进行DNA复制。因此，EBNA1/oriP附着体可以使与其结合的外源目的基因在真核细胞内保持游离与染色体的状态随细胞一起复制，并且由于EBNA1的核定位信号位于其蛋白内部因此促进入核、免疫逃逸以及增强转录，达到使目的基因持续高表达的目的。

目前尚未有将附着体元件用于dCas9-FokI编辑系统表达的相关报道。本发明通过使用构建附着体介导的dCas9-FokI系统来提高基因敲除效率。由于dCas9-FokI系统的切割是由二聚形式的FokI核酸酶产生的，因此不会破坏sgRNA的识别序列，再利用EBNA1/oriP附着体持续表达dCas9-FokI核酸酶，持续切割未发生敲除的序列，达到提高敲除效率的目的，推动基因编辑技术的发展与应用。

发明内容

为了提高基因编辑效率，本发明提供一种将附着体元件(EBNA1/oriP)介导融合蛋白dCas9-FokI表达进行基因编辑的方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明要求保护一种用于基因编辑的载体，所述载体能够表达如下(A1)和(A2)，并含有如下(A3)和(A4)：(A1)dCas9-FokI融合蛋白，其编码基因的序列如SEQID NO.1所示；(A2)EBNA1蛋白，其编码基因的序列如SEQ ID NO.2所示；(A3)oriP元件，其序列如SEQ ID NO.3所示；(A4)用于插入双sgRNA编码序列的区域，所述区域含有插入位点和位于插入位点上游的启动子。

进一步地，sgRNA编码序列插入位点上游的启动子为U6启动子。

进一步地，所述载体中还含有药物筛选基因(优选puromycin抗性基因)，和/或报告基因(优选ZsGreen报告基因)；药物筛选基因和报告基因存在于同一表达盒中，二者之间由自切割寡肽编码基因连接，所述自切割寡肽可为来源于病毒基因组的2A自切割寡肽，如来自于口蹄疫病毒(FMDV)的F2A肽，来自于马A型鼻炎病毒(ERAV)的E2A肽，来自于明脉扁刺蛾β四体病毒(Thosea asigna virus)的T2A肽，来自于猪捷申病毒-1(PTV-1)的P2A肽，或来自于泰勒病毒2A肽或者来自心肌炎病毒的2A肽。在本发明的具体实施方式中，Csy4蛋白的编码基因和药物筛选基因之间的自切割寡肽编码基因具体为P2A肽编码基因，药物筛选基因和报告基因之间的自切割寡肽编码基因具体为T2A肽编码基因。

优选地，用于基因编辑的载体的全序列如SEQ ID NO.4所示。

第二方面，本发明要求保护上述载体在如下任一中的应用：

(1)对生物体或生物细胞进行基因编辑；

(2)制备用于对生物体或生物细胞进行基因编辑的产品。

第三方面，本发明要求保护利用上述载体对生物体或生物细胞进行基因编辑的方法，包括如下步骤：

(1)若构建2条成对的sgRNA载体进行敲除，需将针对靶基因的第一条sgRNA编码序列的3’端添加scaffold序列，第二条sgRNA的5’端添加U6启动子编码的序列，并将两条sgRNA首尾相连，然后插入到上述载体的插入位点，得到重组载体；

(2)将所述重组载体导入生物体或生物细胞，从而实现对生物体或生物细胞基因组中所述不同靶基因的编辑。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明提供一种利用附着体EBNA1/oriP介导的复制型dCas9-FokI系统对未被破坏引导RNA(sgRNA)识别序列的DNA进行持续切割，从而持续产生DSB，并且利用多对成对sgRNA串联靶向片段进行持续切割从而达到增加发生片段敲除以及增加靶位点的切割次数目的。为基因编辑提供新方法，并为猪遗传改良和抗病育种提供新技术和新材料。

附图说明

图1为本发明epi-dCas9-FokI切割的原理示意图。主要原理：由成对的sgRNA识别靶位点结合dCas9后，与dCas9融合表达的两个FokI核酸酶形成二聚体对靶位点进行切割，同时不会破坏sgRNA的识别序列，再由附着体元件介导dCas9-FokI系统持续表达对只由NHEJ产生的indels的序列继续编辑，直达完成理想编辑为止。

图2为epi-dCas9-FokI-sgRNA载体元件图谱。

图3为epi-dCas9-FokI-VEGFA-双sgRNA载体元件图谱。

图4为epi-dCas9-FokI-TGIF2-双sgRNA载体元件图谱。

图5为dCas9-FokI-VEGFA-双sgRNA载体元件图谱。

图6为dCas9-FokI-TGIF2-双sgRNA载体元件图谱。

图7为实施例中VEGFA基因实验组与对照组靶敲除效率图。

图8为实施例中TGIF2基因实验组与对照组靶敲除效率图。

图9为实施例中VEGFA基因实验组与对照组靶位点indels类型对比图。图9a为VEGFA实验组indels类型，图9b为VEGFA对照组indels类型。

图10为实施例中TGIF2基因实验组与对照组靶位点indels类型对比图。图10a为TGIF2实验组indels类型，图10b为TGIF2对照组indels类型。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1基于EBNA1和oriP元件的附着体dCas9-FokI编辑系统的载体的构建

1、利用限制性内切酶MluI-HF(NEB，#R3198S)酶切质粒pFokI-dCas9(淼灵，#P5109)，产生线性化的pFokI-dCas9载体作为克隆载体骨架。

2、以pCEP4(invitrogen，v044-50)质粒作为模板，设计并合成特异性扩增引物oriP-F/R和EBNA1-F/R，并在引物的5’端添加相对应的20bp的同源臂，同时EBNA1-R引物上添加Asc1的识别位点，便于后期改造载体。利用2×A8 FastHiFi PCR masterMix(艾德莱，PC8201)高保真酶扩增后得到oriP片段和EBNA1片段。引物序列如表1所示：

表1引物序列

引物名称	序列(5’-3’)
		oriP-F	CGATGTACGGGCCAGATATACGCGccttgttaaccctaaacggg
oriP-R	cgctcaacaccttctcgcgt
		EBNA1-F	acgcgagaaggtgttgagcgcggagctgagtgacgtgacaa
EBNA1-R	CAATAATCAATGTCAACGCGGGCGCGCCgatcctcacaggccgcacc

oriP片段PCR反应体系如表2所示：

表2 oriP片段PCR反应体系

试剂	体积
		2×A8 FastHiFi PCR master Mix	25μl
oriP-F	1μl
		oriP-R	1μl
pCEP4质粒	1ng
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	补足到50μl

PCR程序：98℃3min；98℃10s，58℃15s，72℃100s，30个循环；72℃3min，8℃2min。

扩增产物含有oriP以及同源臂片段(1943bp)的序列如SEQ ID NO.4的第7997-9939位所示。

EBNA1片段的PCR反应体系如表3所示：

表3 EBNA1片段的PCR反应体系

试剂	体积
		2×A8 FastHiFi PCR masterMix	25μl
EBNA1-F	1μl
		EBNA1-R	1μl
pCEP4质粒	1ng
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	补足到50μl

PCR程序：98℃3min；98℃10s，58℃15s，72℃100s，30个循环；72℃3min；8℃2min。

扩增产物EBNA1以及同源臂片段(2544bp)的序列如SEQ ID NO.5所示。

3、根据ClonExpressMultiS One Step Cloning Kit(Vazyme，C113-01)重组克隆试剂盒说明将步骤1线性化的pFokI-dCas9载体和步骤2扩增得到的oriP片段、EBNA1片段混合后在37℃反应30min，反应后的产物转化至化学感受态Fast-T1(vazyme，C505-02)中，挑取单克隆菌液送至武汉奥科鼎盛生物科技有限公司测序鉴定阳性克隆，将构建成功的载体命名为pFokI-dCas9-pCEP4。

pFokI-dCas9-pCEP4的结构描述为：在pFokI-dCas9载体的MluI位点处插入SEQ IDNO.4的第7997-12051位所示DNA片段(oriP和EBNA1)的重组载体。

4、利用Asc1(NEB，#R0558S)酶切pFokI-dCas9-pCEP4质粒，产生线性化的pFokI-dCas9-pCEP4载体作为克隆载体骨架。

5、以pKLV2-U6gRNA5(BbsI)-PGKpuro2AZsG-W(addgene，#67975)质粒作为模板，设计特异性引物U6-F/R和pKLV2-F/R，添加相对应的20bp同源序列，同时U6-F引物上保留了Asc1酶切切点。以plenti-CRISPRV2-GFP(addgege，#82416)质粒作为模板，设计特异性引物scaffold-F/R，在引物5’端添加相对应的20bp的同源臂，同时引物同源臂上都包含Aar1(thermo scientific，ER1581)识别位点，用于后期酶切连接sgRNA。利用KAPA HiFiHotStartReadyMix PCR Kit(Roche，KK2602)高保真酶扩增获得U6启动子片段、scaffold片段以及PGK-Puro-T2A-ZsGreen片段。引物序列如表4所示：

表4、引物序列

引物名称	序列(5’-3’)
		U6-F	ggcctgtgaggatcGGCGCGCCgagggcctatttcccatga
U6-R	gtcctttccacaagatatat
		scaffold-F	tcttgtggaaaggacgaaacaccATGCGCAGGTGCACCTGCGCATgttttagagctagaaatagc
scaffold-R	gaaaagcgcctcccctacccCACCTGAAAAAAGCACCGACTCGGTGCC
		PKLV2-F	gggtaggggaggcgcttttc
PKLV2-R	TCAATGTCAACGCGGGCGCGttagggcaaggcggagccgg

PCR扩增程序和扩增体系如下：

表5 PCR扩增体系

组分	体积
		KAPA聚合酶	25μL
上游引物(10μM)	1.5μL
		下游引物(10μM)	1.5μL
质粒模板	1μL
		<![CDATA[ddH<sub>2</sub>O]]>	21μL
Total	50μL

表6 PCR扩增程序

6、根据ClonExpressMultiS One Step Cloning Kit(vazyme，C113-01)重组克隆试剂盒说明将步骤4线性化的pFokI-dCas9-pCEP4载体和步骤5扩增得到的U6启动子片段、scaffold片段、PGK-Puro-T2A-ZsGreen片段混合后在37℃反应30min，反应后的产物转化至化学感受态Fast-T1(Vazyme，C505-02)中，挑取单克隆菌液送至武汉奥科鼎盛生物科技有限公司测序鉴定阳性克隆，将构建成功的载体命名为epi-dCas9-FokI-sgRNA，其序列如SEQID NO.4所示，载体图谱见图2。

7、以Aar1(thermo scientific，ER1581)酶切epi-dCas9-FokI-sgRNA载体，根据不同成对sgRNA设计特异性引物sgRNA-F/R(2个位点的成对sgRNA引物如表7所示)，添加20bp同源臂，同时添加sgRNA(2个位点sgRNA序列如表8所示)，以合成载体T-scaffold-U6载体(序列如SEQ ID NO.8)为模板，利用KAPA HiFi HotStartReadyMix PCR Kit(Roche，KK2602)高保真酶扩增获得双sgRNA片段。

表7 2个位点成对sgRNA向导引物序列

表8 2个位点sgRNA序列

引物名称	序列(5’-3’)
		VEGFA-sgRNA1	GGGTGGGGGGAGTTTGCTCC
VEGFA-sgRNA2	ATTCCCTCTTTAGCCAGAGC
		TGIF2-sgRNA1	GGGATGGGAGTGTGCAGTAA
TGIF2-sgRNA2	CCAGTAGGCATCTGCCAAGA

8、根据ClonExpressMultiS One Step Cloning Kit(vazyme，C112-01)重组克隆试剂盒说明将步骤7线性化的epi-dCas9-FokI-sgRNA载体和步骤7扩增得到的成对sgRNA片段混合后在37℃反应30min，反应后的产物转化至化学感受态Fast-T1(Vazyme，C505-02)中，挑取单克隆菌液送至武汉奥科鼎盛生物科技有限公司测序鉴定阳性克隆，将构建成功的载体命名为epi-dCas9-FokI-VEGFA-双sgRNA(SEQ ID NO.6)和epi-dCas9-FokI-TGIF2-双sgRNA(SEQ ID NO.7)。VEGFA和TGIF2位点的载体，图谱分别见图3和图4。

9、以SgrDI(thermo scientific，ER2031)和AscI(thermo scientific，ER1892)酶切epi-dCas9-FokI-VEGFA-双sgRNA和epi-dCas9-FokI-TGIF2-双sgRNA载体。设计引物连接切口，连接引物如表9所示：

表9 连接引物序列

引物名称	序列(5’-3’)
		Linker-F	tcgaGTGCGGCCTGTGAGGATCGG
Linker-R	cgcgCCGATCCTCACAGGCCGCAC

将合成的连接引物序列的寡核苷酸干粉离心后用ddH₂O溶解稀释至终浓度为10μM，然后把对应的上下游sgRNA引物各取5μL于PCR管中振荡混匀，简短离心，退火杂交，形成双链oligo，退火程序为95℃，10min；65℃，30min。利用DNA Ligation Kit(Takara，6023Q)，将退火后的产物，于16℃金属浴反应1h，连接到SgrDI和AscI酶切的epi-dCas9-FokI-VEGFA-双sgRNA和epi-dCas9-FokI-TGIF2-双sgRNA载体回收后的骨架中，得到2个位点的对照表达载体，分别为dCas9-FokI-VEGFA-双sgRNA载体和dCas9-FokI-TGIF2-双sgRNA载体，图谱分别见图5和图6。

实施例2、基于附着体元件介导的dCas9-FokI编辑系统在HEK293T细胞中的应用

1、转染前一天，将状态良好的HEK293T细胞铺板于6孔板中，加入新鲜培养基培养至细胞汇合度为80-90％时可用于转染。

2、按照polyplus公司jetprime转染说明书进行转染，每个六孔板细胞转染2.5μg的质粒，根据表10实验设计转染相应载体，其中epi-dCas9-FokI为改进载体，dCas9-FokI组为对照载体。转染时使用2％的FBS/DMEM完全培养基，转染4h-6h后更换为含有10％FBS/DMEM完全培养基。

表10 实验组和对照组设计

实验组(epi-dCas9-FokI组)	对照组(dCas9-FokI组)
		epi-dCas9-FokI-VEGFA-双sgRNA	dCas9-FokI-VEGFA-双sgRNA
epi-dCas9-FokI-TGIF2-双sgRNA	dCas9-FokI-TGIF2-双sgRNA

3、转染24h后可通过荧光显微镜观察ZsGreen荧光蛋白的表达来测试转染效率，之后都使用含有2μg/mL Puromycin的10％FBS培养基进行培养，富集转染成功细胞并且给附着体元件施加压力防止质粒丢失。分别在第0天、第3天、第6天、第10天、第15天收集部分各组细胞，利用NCBI在线网站设计特异性引物扩增上述位点，所用引物为VEGFA-KO-F/R和TGIF2-KO-F/R，扩增序列如表11所示：

表11 VEGFA和TGIF2引物序列

引物名称	序列(5’-3’)
		VEGFA-KO-F	AAGCAACTCCAGTCCCAAAT
VEGFA-KO-R	GCTGCTCGCTCCATTCAC
		TGIF2-KO-F	CAGAGGGCTGCTGAGATG
TGIF2-KO-R	TGTATGAAAGGGAACCAAAA

利用KAPA HiFi Hot Start Ready Mix PCR Kit对细胞基因组进行扩增，体系以及程序见实施例1。利用胶回收试剂盒对所述PCR产物进行胶回收后进行高通量测序(deepsequence)，利用软件CRISPResso2对结果进行分析，将VEGFA和TGIF2位点的实验组测序结果和对照组测序结果进行比较分析得出敲除频率(图7和图8)和indels类型对比(图9和图10)。

结果表明，在转染epi-dCas9-FokI系统并用Puromycin富集0-15d后，VEGFA和TGIF2位点的敲除效率随着富集时间的增加而提高，在富集第15天时达到最高，敲除效率都在90％左右，而转染dCas9-FokI系统的敲除效率都在20％以下。以Puromycin富集15d为例，VEGFA和TGIF2位点实验组的indels类型明显多于对照组。

综上所述，通过使用EBNA1/oriP附着体介导的dCas9-FokI系统，将附着体EBNA1/oriP与dCas9-FokI结合起来，可大幅度提高基因编辑效率。由于dCas9-FokI系统的切割是由二聚形式的FokI核酸酶产生的，因此不会破坏sgRNA的识别序列，再利用EBNA1/oriP附着体持续表达dCas9-FokI核酸酶，持续切割未发生敲除的序列，进而增加切割次数，相比于现有常规技术，该方法一方面可提高基因敲除效率，另一方面，有望提高基因敲入与大片段删除效率，推动基因编辑技术的发展与应用。

Claims (8)

1.一种用于基因编辑的载体，其特征在于，所述载体能够表达如下（A1）和（A2），并含有如下（A3）和（A4）：

（A1）dCas9-FokI融合蛋白，其编码基因的序列如SEQ ID NO.1所示；

（A2）EBNA1蛋白，其编码基因的序列如SEQ ID NO.2所示；

（A3）oriP元件，其序列如SEQ ID NO.3所示；

（A4）用于插入双sgRNA编码序列的区域，所述区域含有插入位点和位于插入位点上游的启动子。

2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，sgRNA编码序列插入位点上游的启动子为U6启动子。

3.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述载体中还含有药物筛选基因和/或报告基因。

4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述药物筛选基因为puromycin抗性基因；所述报告基因为ZsGreen报告基因。

5.一种用于基因编辑的载体，其特征在于：所述载体的全序列如SEQ ID No.4所示。

6.含有权利要求1-5中任一项所述载体的重组菌。

7.权利要求1-5中任一项所述载体的应用，其特征在于，包括：

（B1）对生物体或生物细胞进行基因编辑；

（B2）制备用于对生物体或生物细胞进行基因编辑的产品。

8.一种对生物体或生物细胞进行基因编辑的方法，包括如下步骤：

（C1）将针对靶基因的双sgRNA编码序列插入到权利要求1-5中任一项所述载体的插入位点，得到重组载体；

（C2）将所述重组载体导入生物体或生物细胞，从而实现对生物体或生物细胞基因组中靶基因的编辑。

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