CN100494384C - T载体及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种T载体及其制备方法，其目的是提供一种具有较高TA克隆效率的T载体及其制备方法，包括pBlueScript II SK(-)的Ampr基因序列，pBlueScriptII SK(-)的ColEI ori序列，pBlueScript II SK(-)的f1 ori序列，pBlueScript IISK(-)的lacZ基因序列，pBlueScript II SK(-)的T3噬菌体启动子序列，pBlueScriptII SK(-)的T7噬菌体启动子序列以及分别位于两个末端的各一个多克隆位点序列，其中，所述Ampr基因序列中的AhdI酶切位点被沉默，所述两个多克隆位点均具有3′突出T末端。本发明的T载体及其制备方法将在基因工程领域中发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域中一种载体及其构建方法，特别涉及一种T载体及其构建方法。
背景技术
PCR(polymerase chain reaction)是分子生物学中的常规实验技术。绝大多数情况下需要将PCR扩增产物克隆到质粒载体上，以便对PCR产物进行测序、体外转录、体外翻译等操作。克隆PCR产物的方法有很多种，但最直接的、最方便的方法是TA克隆。所谓TA克隆就是将3’端具有单个A尾巴的PCR产物克隆到3’端具有单个T尾巴的T载体上。TA克隆的理论依据是：在PCR扩增过程中，由于Taq聚合酶具有不依赖于模板的末端转移酶活性而在PCR产物的3’末端添加单个脱氧核苷酸，并且偏好添加四种脱氧核苷酸中的脱氧腺苷酸(A)(Clark，J.M.，1988.Novelnon-templated nucleotide addition reactions catalyzed prokaryotic andeucaryotic DNA polymerase.Nucleic Acids Res.16，9677-9686；Cha，J.，Bishai，W.，Chandrasegaran，S.，1993.New vectors for direct cloning of PCR products.Gene 136，369-370；Schutte，B.C.，Ranade，K.，Pruessner，J.，Dracopoli，N.，1997.Optimized conditions for cloning PCR products into an XcmI T-vector.BioTechniques 22，40-42)，使得50％以上的PCR产物的3’末端具有单个脱氧腺苷酸，即3’端A尾巴(Ichihara，Y.，Kurosawa，Y.，1993.Construction of new Tvectors for direct cloning of PCR products.Gene 130，153-154)。
目前，T载体的制备方法有3种。第一种方法是利用产生平末端的内切酶将环状质粒酶切成线状质粒，然后利用末端转移酶将单个双脱氧胸腺核苷酸(ddTTP)添加到线状载体的3’端(Holton，T.A.，Graham，M.W.，1991.A simple and efficientmethod for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors.NucleicAcids Res.19，1156)。第二种方法是利用Taq酶的不依赖于模板的末端转移酶活性将单个脱氧胸腺核苷酸(dTTP)添加到线状载体的3’端(Marchuk，D.，Drumm，M.，Saulino，A.，Collins，F.S.，1991.Construction of T-vectors，a rapid andgeneral system for direct cloning of unmodified PCR products.Nucleic AcidsRes.19，1154)。第三种方法是在质粒载体的多克隆位点中引入特定的酶切位点，用相应的内切酶酶切产生3’端具有单个T突出的线性T载体。前两种方法在制备T载体过程中存在加尾效率较低以及线性质粒在加尾过程中其两端的序列有时会被部分删除等问题(Shuman，S.，1994.Novel approach to molecular cloning andpolynucleotide synthesis using vaccinia DNA topoisomerase.J.Biol.Chem.265，32678-32684)。与前两种方法相比，第三种方法更快捷、更高效以及更稳定。理论上，可以用来制备T载体的内切酶包括：XcmI(Jo，C.，Jo，S.A.，2001.A simple methodto construct T vectors using Xcm I cassettes amplified by nonspecific PCR.Plasmid 45，37-40；Arashi，N.，Miwa，M.，Shibata，H.，1999.XcmIsite-containing vector for direct cloning and in vitro transcription for PCRproduct.Mol.Biotechnol.12，281-283)、AhdI/Eaml105I/EclHKI/AspEI/NruGI/BspOVI(Jeung，J.U.，Cho，S.K.，Shim，K.S.，Ok，S.H.，Lim，D.S.，Shin，J.S.，2002.Construction of two pGEM-7Zf(+)phagemid T-tail vectors using AhdI-restriction endonuclease sites for direct cloning of PCR products.Plasmid48，160-163；Ichihara，Y.，Kurosawa，Y.，1993.Construction of new T vectorsfor direct cloning of PCR products.Gene 130，153-154)、BfiI/BmrI、HphI/AsuHPI(Mead，D.A.，Pey，N.K.，Herrnstadt，C.，Marcil，R.A.，Smith，L.M.，1991.A universal method for the direct cloning of PCR amplified nucleic acid.Bio/Technology 9，657-663)、MboII/NcuI，BfuI/BciVI，HpyAV/Hin4II。其中XcmI和AhdI及其同裂酶在制备T载体中得到广泛应用。其它内切酶要么因为太昂贵，要么因为在普通的克隆载体上有太多的识别位点，因而在制备T载体中的应用受到限制。在普通含Amp抗性的克隆载体中，例如pUC18、pBlueScript SK载体等，都不具有XcmI酶切位点，但在Amp抗性基因中含有一个AhdI及其同裂酶的酶切位点，因而在这些载体的多克隆位点引入XcmI位点更方便一些，这就是为什么更多人采用XcmI制备T载体(美国专利文献US005487993A；中国专利文献CN1142279C，CN1344795A以及CN1362521A)。如果要引入AhdI及其同裂酶的酶切位点，则必须通过定点突变的方法沉默Amp抗性基因中相应的酶切位点。尽管如此，利用AhdI及其同裂酶制备T载体比起XcmI更有优势，表现在如下几个方面。第一，AhdI有5种同裂酶，其中的4种同裂酶已经商品化，因而加上AhdI有5种内切酶可供选用，而XcmI没有同裂酶(Roberts R.J.，T.Vincze，J.Posfai，and D.Macelis.2003.REBASE：restriction enzymes andmethyltransferases.Nucleic Acids Res.31：418-420)。第二，AhdI内切酶的性能要优于XcmI(Jeung，J.U.，Cho，S.K.，Shim，K.S.，Ok，S.H.，Lim，D.S.，Shin，J.S.，2002.Construction of two pGEM-7Zf(+)phagemid T-tail vectors using AhdI-restriction endonuclease sites for direct cloning of PCR products.Plasmid48，160-163)，且AhdI的市场销售价远低于XcmI(见《NEB产品目录及技术资料》，2003—2004年度)。第三，AhdI及其同裂酶识别11bp的序列，而XcmI识别15bp的序列，因而引入(例如在PCR引物中引入)AhdI及其同裂酶识别序列更容易些。
无论是使用XcmI还是使用AhdI及其同裂酶构建T载体均存在一个潜在的问题：部分酶切的前T载体混杂在T载体中会导致非重组转化子的本底过高(Mead，D.A.，Pey，N.K.，Herrnstadt，C.，Marcil，R.A.，Smith，L.M.，1991.A universal methodfor the direct cloning of PCR amplified nucleic acid.Bio/Technology 9，657-663；Harrison，J.，Molly，P.L.，Clark，S.J.，1994.Direct cloning ofpolymerase chain reaction products in an XcmI T-vector.Anal.Biochem.216，235-236)。目前，解决这一问题最有效的方法是在前T载体的两个XcmI或两个AhdI酶切位点之间引入足够长的间隔DNA，经琼脂糖凝胶电泳后将完全酶切的质粒和部分酶切的质粒分开(Testori，A.，Sollitti，P.，1996.Cloning unmodified PCRproducts using engineered XcmI restriction sites in a portable cassette.Methods Mol.Biol.67，89-100；Jo，C.，Jo，S.A.，2001.A simple method toconstruct T vectors using Xcm I cassettes amplified by nonspecific PCR.Plasmid45，37-40；Jeung，J.U.，Cho，S.K.，Shim，K.S.，Ok，S.H.，Lim，D.S.，Shin，J.S.，2002.Construction of two pGEM-7Zf(+)phagemid T-tail vectors using AhdI-restriction endonuclease sites for direct cloning of PCR products.Plasmid48，160-163)。然而，引入间隔DNA后带来的一个新问题是：由于环型质粒在琼脂糖凝胶电泳中比起分子量相当的线型质粒移动得快，因而，未被酶切的环型质粒(前T载体，带有间隔DNA)往往与分子量小于自身的T载体(不带有间隔DNA)混杂，最终造成非重组转化子的本底过高。
pBlueScript II SK(+/一)载体(GenBank Accession No.X52330)是由pUC载体派生而来的噬菌粒载体(phagemid或phasmid)，除了含有-个Amp抗性基因及一个lacZ基因作为筛选标记外，在多克隆位点的两侧存在T3和T7噬菌体的启动子，同时具有一个单链噬菌体f1的复制起点(pBlueScript II SK(+)和pBlueScript II SK(-)的唯一区别是两者f1的反向相反)。
ccdB基因(GenBank Accession No.AP001918)位于F质粒上，它和ccdA基因一起构成F质粒的ccd(control of cell death)位点。ccd位点通过杀死不含F质粒的大肠杆菌细胞达到稳定F质粒的作用。CcdB蛋白干扰大肠杆菌的DNA促旋酶，因而抑制大多数大肠杆菌菌株(例如DH5α，JM109，DH10B，TOP10)的生长(Bernard，P.，and Couturier，M.，1992.Cell Killing by the F Plasmid CcdB Protein InvolvesPoisoning of DNA-Topoisomerase II Complexes.J.Mol.Biol.226，735-745)。但是大肠杆菌DB3.1菌株中促旋酶的A亚基基因发生了一处突变，突变后的促旋酶可以抵抗CcdB蛋白的毒性效应，因而含有ccdB基因的质粒可以在DB3.1菌株中增殖(Miki，T.，Park，J.A.，Nagao，K.，Murayama，N.，and Horiuchi，T.，1992.Control of Segregation of Chromosomal DNA by Sex Factor F in Escherichia coli.Mutants of DNA Gyrase Subunit A Suppress letD(ccdB)Product Growth Inhibition.J.Mol.Biol.225，39-52)。
发明内容
本发明的目的是提供具有较高TA克隆效率的T载体。
本发明所提供的T载体，包括pBlueScript II SK(-)的Ampr(Amp抗性基因)基因序列，pBlueScript II SK(-)的ColEI ori(质粒ColEI的复制原点)序列，pBlueScript II SK(-)的f1 ori(单链噬菌体f1的复制原点)序列，pBlueScript IISK(-)的lacZ基因序列，pBlueScript II SK(-)的T3噬菌体启动子序列，pBlueScriptII SK(-)的T7噬菌体启动子序列以及分别位于两个末端的各一个多克隆位点序列，其中，所述Ampr基因序列中的AhdI酶切位点被沉默，所述两个多克隆位点均具有3′突出T末端。
所述3′突出T末端的序列可为：
5′GGACNNT3′
3′CCTGNN5′，其中N为A或T或C或G。
所述位于两个末端的各一个多克隆位点序列可由pBlueScript II SK(-)的中的一个至11个酶切位点序列组成。
其中，pBlueScript II SK(-)中的Amp抗性基因的AhdI酶切位点可通过突变方法沉默，如通过定点突变的方法，将自Amp抗性基因的5′端第783位碱基G突变为C。
所述T载体优选为pSK01-T(其物理图谱如图2所示)或pSK02-T(其物理图谱如图3所示)或pSK03-T(其物理图谱如图4所示)或pSK04-T(其物理图谱如图5所示)。
本发明的第二个目的是提供一种制备上述T载体的方法。
本发明所提供的制备上述T载体的方法，包括以下步骤：
1)将pBlueScript II SK(-)中的Amp抗性基因的AhdI酶切位点沉默；
2)在步骤1)中得到的载体的多克隆位点引入AhdI盒，得到前T载体；所述AhdI盒由ccdB基因序列、紧密连接于所述ccdB基因序列两侧的各一个AhdI酶切位点序列以及紧密连接于所述各一个AhdI酶切位点序列的pBlueScript II SK(-)的多克隆位点中的酶切位点序列组成；
3)用AhdI或AhdI的同裂酶酶切步骤2)中的前T载体，得到T载体。
其中，pBlueScript II SK(-)中的Amp抗性基因的AhdI酶切位点可通过突变方法沉默，如通过定点突变的方法，将自Amp抗性基因的5′端第783位碱基G突变为C。
步骤2)中，AhdI盒可在所述多克隆位点的任意两个酶切位点之间引入，优选为在SalI酶切位点和XbaI酶切位点之间或KpnI酶切位点和SacI酶切位点之间或EcoRI酶切位点和EcoRI酶切位点之间或EagI酶切位点和EagI酶切位点之间引入所述AhdI盒。
所述AhdI盒优选为具有如序列表中序列1、序列2、序列3或序列4所示的核苷酸序列。
序列表中的序列1由343个碱基组成；序列表中的序列2由343个碱基组成；序列表中的序列3由343个碱基组成；序列表中的序列4由373个碱基组成。
所述前T载体优选为pSK01或pSK02或pSK03或pSK04；所述T载体优选为pSK01-T(其物理图谱如图2所示)或pSK02-T(其物理图谱如图3所示)或pSK03-T(其物理图谱如图4所示)或pSK04-T(其物理图谱如图5所示)。
所述AhdI的同裂酶包括Eaml105I/EclHKI/AspEI/NruGI/BspOVI。
本发明制备T载体的方法中的AhdI盒采用ccdB基因作为间隔DNA，使得间隔DNA同时具有间隔两个AhdI酶切位点和作为负选标记的双重作用。以ccdB基因作为间隔DNA的前T载体可以在DB3.1菌株中增殖，当将T载体与PCR产物等组成的连接体系转化普通大肠杆菌菌株(例如DH5α，JM109，DH10B，TOP10)时，混杂到T载体中的前T载体(包括未酶切的环型质粒及部分酶切的线型质粒经连接而成的环型质粒)会杀死大肠杆菌细胞。这样，TA克隆过程中由前T载体造成的非重组转化子本底过高的问题得到彻底解决。此外，一小部分T载体的T尾巴由于种种原因(例如AhdI及其同裂酶以及连接酶等残存的核酸外切酶活性、反复冻融等)会被去除，去除T尾巴的T载体经自身连接产生的转化子是组成非重组转化子本底的另一个来源。本发明的方法通过精确设计AhdI盒使得上述来源的非重组转化子具有完整的lacZ读码框，从而可以经蓝白斑筛选去除这种非重组转化子。
本发明的制备T载体的方法可最大限度地降低T载体中混杂的未酶切的环型质粒和部分酶切的线型质粒。
本发明构建的pSKxx系列前T载体(包括pSK01、pSK02、pSK03和pSK04)以及由这些前T载体制备而来的pSKxx-T系列T载体(包括pSKO1-T、pSKO2-T、pSKO3-T和pSKO4-T)是基于pBlueScript II SK(-)构建而成。这些载体具有如下几个方面的特点：
1、具有pBlueScript II SK(-)载体的全部特性。除了含有一个Amp抗性基因及一个lacZ基因作为筛选标记外，在多克隆位点的两侧存在T3和T7噬菌体的启动子，同时具有一个单链噬菌体f1的复制起点。
2、利用定点突变的方法沉默了pBlueScript II SK(-)载体中Amp抗性基因的AhdI酶切位点。沉默AhdI酶切位点的载体命名为pSKΔAhd。Amp抗性基因中发生定点突变前后的碱基(框中的碱基)如下：
突变前的序列：5’
ACGGGGAGTC-3’
突变后的序列：5’
ACGGGGAGTC-3’ 。
3、pSKxx系列前T载体是在pSK△Ahd的多克隆位点中引入AhdI盒构建而成。AhdI盒的核心序列如下(阴影部分显示AhdI酶切位点，框中部分代表ccdB基因序列，N为A或T或C或G，“^”表示酶切割的具体位点)：
4、AhdI盒中的ccdB基因具有间隔DNA和负选标记的双重作用。ccdB作为间隔DNA是指ccdB基因序列将两个AhdI酶切位点间隔开，ccdB基因作为负选标记基因是指含有ccdB基因的质粒转化到普通大肠杆菌菌株细胞后将杀死大肠杆菌细胞。AhdI盒中的ccdB基因可以有三种形式：第一种形式是ccdB基因与其前面的lacZ读码框融合，在lacZ启动子驱动下表达产生融合CcdB蛋白；第二种形式是ccdB基因的前面带有核糖体结合位点(RBS)序列，在lacZ启动子驱动下表达产生CcdB蛋白；第三种形式是ccdB基因的前面带有自身启动子及RBS序列，在lacZ启动子和其自身启动子的双重驱动下表达产生CcdB蛋白。
5、使用AhdI内切酶或其同裂酶(Eaml105I/EcIHKI/AspEI/NruG/BspOVI)酶切pSKxx系列前T载体，酶切体系经琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收的大片段即是相应的T载体。4种T载体的区别在于多克隆位点中酶切位点的种类及数量不同。其中，pSKO2-T具有最少的酶切位点，可以减少高GC含量及回文结构对体外转录的影响，因此pSKO2-T尤其适合于对插入片段进行体外转录。pSKO3-T保留了pBlueScript IISK(-)载体的全部酶切位点，因此可以选择更多的内切酶从T载体上释放插入片段。此外，由于额外引入了一个EcoR I酶切位点，因此可以用EcoR I单酶切从T载体上释放插入片段。pSKO4-T载体的TA克隆位点两侧引入了更多成对的内切酶位点，因此可以用更多的内切酶单酶切鉴定阳性克隆或释放插入片段，其中的NotI酶切位点属于稀有的酶切位点，插入片段中含有该酶切位点的几率很低。
6、当制备的pSKxx-T(包括pSK01-T、pSK02-T、pSK03-T和pSK04-T)系列T载体中的一小部分由于种种原因(例如AhdI及其同裂酶以及连接酶等残存的核酸外切酶活性、反复冻融等)其T尾巴被去除时，这些失去T尾巴的质粒经自身连接后可以形成完整的lacZ读码框，因而可以通过蓝白斑筛选的方法排除这些非重组转化子。
采用本发明的方法制备的T载体进行TA克隆时由于彻底解决了非重组转化子本底过高的问题，因此大大提高了T载体的质量和稳定性。市场上出售的T载体大多数是基于pUC18或pUC19构建而来，本发明制备的pSKxx-T系列T载体是基于pBlueScript II SK(-)构建而成，具有更优良的产品特性。实验证明本发明的T载体分别克隆1.8kb和0.68kb的PCR产物的TA克隆效率在95％以上。本发明的T载体及其制备方法将在基因工程领域中发挥重要的作用。
附图说明
图1A为前T载体pSK01中AhdI盒的结构示意图
图1B为前T载体pSK02中AhdI盒的结构示意图
图1C为前T载体pSK03中AhdI盒的结构示意图
图1D为前T载体pSK04中AhdI盒的结构示意图
图2为pSK01-T的物理图谱
图3为pSK02-T的物理图谱
图4为pSK03-T的物理图谱
图5为pSK04-T的物理图谱
具体实施方式
实施例1、pSK△Ahd的构建
利用定点突变的方法沉默pBlueScript SK(-)载体中Amp抗性基因的AhdI酶切位点，得到pSKΔAhd，其具体的构建方法如下：在PCR引物中引入突变的碱基，以pBluescript II SK(-)载体为模板，用Pfu DNA聚合酶进行PCR扩增。其中，PCR扩增引物为(加框的C为引入的突变位点(在原始序列中为G)，阴影部分为突变破坏后的AhdI酶切位点)：
AmpF：5’-CTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGG-3’；
AmpR：5’-TTATCTACAAGGCAAC-3’；
PCR扩增的反应体系为：50μL反应体系中含5U Pfu，0.2mmol/L dNTPs，1×Pfu buffer，引物各10μmol/L，模板5ng左右；PCR扩增的循环程序为：94℃预变性5min，(94℃，30S；60℃，30S；72℃，5min)×30，72℃最后延伸5min。经1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收PCR扩增产物。之后，建立如下连接反应：10μL连接体系中含3U连接酶(Promega)，1×连接Buffer，约50ng PCR产物。4℃连接16小时。将连接产物转化大肠杆菌(DHI0B)后，经蓝白斑及Amp抗性筛选后得到阳性克隆，随机挑取6个阳性克隆，逐一测序，获得AhdI酶切位点被破坏的pBluescript II SK(-)载体，命名为pSKΔAhd。其中，Amp抗性基因中发生定点突变前后的碱基(框中的碱基)如下：
突变前的序列：5’
ACGGGGAGTC-3’
突变后的序列：5’ACGGGGAGTC-3’；
测序引物为：Amp18：5’-AATAGACTGGATGGAGGC-3’。
实施例2、在pSKΔAhd的多克隆位点中引入AhdI盒构建前T载体
以质粒pENTR1A(购自Invitrogen公司)为模板，用CcdB01F和CcdB01R引物进行PCR扩增。PCR扩增的反应体系为：50μL反应体系中含5U Pfu，0.2mmol/L dNTPs，1×Pfu buffer，引物各10μmol/L，模板5ng左右；PCR扩增的循环程序为：94℃预变性5min，(94℃，30S；60℃，30S；72℃，1.5min)×30，72℃最后延伸5min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，将回收的PCR产物和pSK△Ahd质粒分别用SalI和XbaI双酶切，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收。将酶切后的PCR产物与酶切后的pSKΔAhd载体建立如下连接反应体系：10μL连接体系中含3U连接酶(Promega)，1×连接Buffer，约50ng质粒，约50ng PCR产物。4℃连接16小时以上。连接产物按照常规方法转化DB3.1菌株(Invitrogen)。经Amp抗性筛选得到阳性菌落，阳性菌落经测序鉴定得到前T载体pSK01。
pSK02的构建过程除所用的PCR扩增引物是CcdB02F和CcdB02R以及所得到的PCR扩增产物和pSKΔAhd分别用SacI和KpnI双酶切外，其它步骤与pSK01同。
pSK03的构建过程与pSK01和pSK02的构建基本类似，所不同的是用CcdB03F和CcdB03R引物进行PCR扩增，PCR扩增产物和pSKΔAhd质粒分别用EcoRI酶切，酶切后的pSKΔAhd质粒在与酶切后的PCR产物进行连接前用碱性磷酸酯酶处理去除5’-磷酸以防止自身环化。连接产物按照常规方法转化DB3.1大肠杆菌，用M13-47和ccdBR引物进行菌落PCR扩增，鉴定以正向插入(与lacZ读码框方向一致)的阳性克隆，得到pSK03。
pSK04的构建过程分为两步。第一步，以含EGFP基因的pENT-NL质粒(http://deepgreen.stanford.edu/cell imaging site/html/vectors.html)为模板，用EGFPF和EGFPR为引物进行PCR扩增。PCR扩增的反应体系为：50μL反应体系中含5U Pfu，0.2mmol/LdNTPs，1×Pfu buffer，引物各10μmol/L，模板5ng左右；PCR扩增的循环程序为：94℃预变性5min，(94℃，30S；60℃，30S；72℃，2min)×30，72℃最后延伸5min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，将回收的PCR产物及pSKΔAhd分别用SacI和KpnI双酶切，酶切后的PCR产物和pSKΔAhd建立如下连接反应体系：10μL连接体系中含3U连接酶(Promega)，1×连接Buffer，约50ng质粒，50ng PCR产物。4℃连接16小时。连接产物按照常规方法转化大肠杆菌，经Amp抗性筛选得到阳性菌落，阳性菌落经测序鉴定后，得到中间载体pSKEGFP。第二步，以质粒pENTR1A为模板，用CcdB04F和CcdB04R引物进行PCR扩增。PCR扩增的反应体系为：50μL反应体系中含5U Pfu，0.2mmol/L dNTPs，1×Pfu buffer，引物各10μmol/L，模板5ng左右；PCR扩增的循环程序为：94℃预变性5min，(94℃，30S；60℃，30S；72℃，1.5min)×30，72℃最后延伸5min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，将回收的PCR产物和pSKEGFP分别用NotI酶切，酶切后的pSKEGFP用碱性磷酸酯酶处理后与酶切后的PCR产物建立如下连接反应体系：10μL连接体系中含3U连接酶(Promega)，1×连接Buffer，约50ng质粒，50ng PCR产物。4℃连接16小时。连接产物按照常规方法转化DB3.1菌株(Invitrogen)，用M13-47和ccdBR引物进行菌落PCR，鉴定以正向插入(与lacZ读码框方向一致)的阳性克隆，得到pSK04。
用于构建上述前T载体(pSK01、02、03和04)的引物序列如下(左边方框中的序列为酶切位点，中间阴影中的序列为AhdI酶切位点，右边方框中的序列为来自ccdB或EGFP基因的序列)：
CcdB01F：5’-ACTG
GGACTTTAGGTCG
-3’
CcdB01R：5’-AGTC
GGACTTTTGGTC
-3’
CcdB02F：5’-ACTG
GGACTTTAGGTCG
-3’
CcdB02R：5’-AGTC
GGACTTTTGGTC
-3’
CcdB03F：5’-ACTG
GGACTTTAGGTCG
-3’
CcdB03R：5’-AGTC
GGACTTTTGGTC
-3’
EGFPF：5’-ACTG
GAATTCCCGCGGCCGC
-3’
EGFPR：5’-AGTC
GAATTCCCGCGGCCGC
-3’
CcdB04F：5’-ACTG
GACTTTAGGTCG
-3’
CcdB04R：5’-AGTC
GACTTTTGGTC
-3’
M13-47：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’
CcdBR：5’-TCAGCCACTTCTTCCCCGATAACG-3’
前T载体pSK01、pSK02、pSK03和pSK04中的AhdI盒的结构如图1A-图1D所示，图1A-图1D中，两边方框中的序列为酶切位点，阴影中的序列分别为两个AhdI酶切位点，中间方框中的部分代表ccdB基因序列，“^”表示酶切割的具体位点。图1A中两边方框中的序列分别为SalI和XbaI酶切位点，图1B中两边方框中的序列分别为SacI和KpnI酶切位点，图1C中两边方框中的序列均为EcoRI酶切位点，图1D中左方框中的序列包含SacI-EcoRI-SacII-NotI-EagI酶切位点，右方框中的序列包含EagI-NotI-SacII-EcoRI-KpnI酶切位点。图IA-1C中两边方框中的酶切位点以及图1D中左边方框中的第一个酶切位点和右边方框中的最后一个酶切位点分别对应于pBlueScript SK(-)质粒上的酶切位点。
实施例3、pSKxx-T系列T载体的制备及TA克隆效率分析
1、制备T载体
用AhdI分别酶切前T载体pSK01、02、03和04，酶切反应体系如下：20μL酶切体系中含3U AhdI内切酶(购自NEB公司)，1×NEBuffer4，大约1μg质粒。37℃酶切3小时后，经1％琼脂糖凝胶电泳后分别切胶回收大片段。切胶回收纯化的大片段即是相应的T载体。pSK0I-T、pSK02-T、pSK03-T和pSK04-T的物理图谱分别如图2、图3、图4和图5所示。
2、测试TA克隆效率
用Taq DNA聚合酶分别以NCEDF和NCEDR为引物PCR扩增拟南芥NCED3(1.8kb，GenBank Accession No.AT3G14440)和以DREBF和DREBR为引物PCR扩增DREB1A(680bp，GenBank Accession No.At4g25480)基因片段。引物序列如下：
NCEDF 5’-AACGGATCCATGGCTTCTTTCACGGCAACGGC-3’
NCEDR 5’-AACGAGCTCTCACACGACCTGCTTCGCCAAATC-3’
DREBF 5’-AAGGATCCTTCTGATCAATGAACTCATTTTCTG-3’
DREBR 5’-AACACGTGGTTTTAATAACTCCATAACGATACG-3’
PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收。建立8个连接反应体系，反应体系如下：10μL连接体系中含3U连接酶(Promega)，1×连接Buffer，大约50ng的T载体和大约92ng的NCED3或35ng的DREB1A，4℃连接16小时以上。连接产物按照常规方法转化大肠杆菌DH10B，并进行蓝白斑筛选。每个连接体系分别随机挑选30个白斑进行菌落PCR鉴定，计算阳性克隆所占的百分比。结果表明，pSK01、02、03和04与DREB1A建立的连接反应的TA克隆效率均为100％(30/30)；pSK01、02、03和04与NCED3建立的连接反应的TA克隆效率分别为100％(30/30)、100％(30/30)、96％(29/30)和96％(29/30)。8个连接体系转化大肠杆菌后的蓝斑数量与总菌落数的比值均低于5％。这些结果表明，本发明制备的T载体具有很高的TA克隆效率。
序列表
<160>4
<210>1
<211>343
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
<210>2
<211>343
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
<210>3
<211>343
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
<210>4
<211>373
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
Claims (4)
1、一种T载体，其特征在于所述T载体的结构包括pBlueScript II SK(-)的Ampr基因序列，pBlueScript IISK(-)的ColEI ori序列，pBlueScript IISK(-)的f1 ori序列，pBlueScript II SK(-)的1acZ基因序列，pBlueScript II SK(-)的T3噬菌体启动子序列，pBlueScript II SK(-)的T7噬菌体启动子序列以及分别位于两个末端的各一个多克隆位点序列，所述Ampr基因序列中的AhdI酶切位点被沉默，所述两个多克隆位点均具有3′突出T末端；
并且所述T载体是用包括以下步骤的方法构建的：
1)将pBlueScript IISK(-)中的Amp抗性基因的AhdI酶切位点沉默；
2)在步骤1)中得到的载体的多克隆位点引入AhdI盒，得到前T载体；所述AhdI盒由ccdB基因序列、紧密连接于所述ccdB基因序列两侧的各一个AhdI酶切位点序列以及紧密连接于所述各一个AhdI酶切位点序列的pBlueScript II SK(-)的多克隆位点中的酶切位点序列组成；所述ccdB基因的GenBank序列号为No.AP001918；
3)用AhdI或AhdI的同裂酶酶切步骤2)中的前T载体，得到T载体。
2、根据权利要求1所述的T载体，其特征在于：所述3′突出T末端的序列为：
5′GGACNNT3′
3′CCTGNN5′，其中N为A或T或C或G。
3、根据权利要求1或2所述的T载体，其特征在于：所述位于两个末端的各一个多克隆位点序列由pBlueScript IISK(-)的中的一个至11个酶切位点序列组成。
4、根据权利要求3所述的T载体，其特征在于：所述T载体为如图2所示的pSK01-T或如图3所示的pSK02-T或如图4所示的pSK03-T或如图5所示的pSK04-T。
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