CN117286166A - 一种细菌基因组多重编辑方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一种细菌基因组多重编辑方法及其应用。本发明实际提供一种基于改进的dReaMGE重组工程和线性CRISPR‑Cas系统的多重基因组编辑方法经试验证明，其显著提高了在诸如大肠杆菌和伯克氏菌细胞中介导的dsDNA重组工程效率。同时，上述Real‑MGE方法有效消除了对复杂的多gRNA表达载体的需求，减少了细菌基因组工程所需的时间，避免了脱靶效应和细胞毒性，本发明建立ReaL‑MGE技术是探测基因型与表型关系，增强化学生产和菌株优化的潜在且便捷的工具，是对当前基因组工程技术的理想补充，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种细菌基因组多重编辑方法及其应用
技术领域
本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一种细菌基因组多重编辑方法及其应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
细胞工厂的代谢工程一直由细胞遗传内容的变化所驱动，而基因组编辑工具使得发现和评估相关基因和途径以及构建细胞工厂变得更加容易。多重基因组编辑是细菌合成生物学的限速步骤，开发提高多重基因组编辑效率的策略将有利于细胞工厂建设等应用研究和最小基因组生成等基础研究。成簇规则间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白Cas9核酸酶系统最近作为一种高效和通用的工具用于各种生物的基因组编辑。然而，其在细菌中的多重基因组靶向和操作能力往往受到多向导RNA(guide RNA，gRNA)表达装置的构建、同源重组效率以及细胞毒性的限制。当使用CRISPR-Cas9系统切割细菌基因组的多个原始序列时，由于重复序列多，构建多gRNAs表达装置困难。鉴于多gRNA表达构建的困难，最近报道了线性化gRNA表达策略。但由于细菌的同源重组效率较低，该策略尚未成功应用于细菌中。
同源重组工程是利用噬菌体λ衍生的外切酶Redα或RecT和单链蛋白(single-strand annealing protein，SSAP)Redβ或RecT促进细菌的胞内同源重组。基于单链DNA(single strand DNA,ssDNA)的重组已被开发应用于细菌多重基因组工程，包括多重自动基因组工程(MAGE)，可追踪的多重基因组工程(TRMR)，随机基因组突变的定向进化(DIvERGE)和pORTMAGE。然而，由于单链DNA的制备复杂，长片段插入的效率低，这些技术只在大肠杆菌和与之亲缘关系较近的菌株中应用，以实现点突变和短序列编辑。
除了ssDNA重组和基于CRISPR-Cas9的多重基因组工程技术外，在之前的工作中还建立了基于双链DNA(double strand DNA,dsDNA)重组工程的细菌基因组多重编辑技术(dReaMGE)。dReaMGE以dsDNA为底物，在不预修饰基因组或干扰错配修复系统(mismatchrepair，MMR)的情况下，在不同细菌中同时完成多个千碱基规模序列的替换、删除和插入。dReaMGE可以在几天内完成长达数月的基因组工程工作，不需要繁琐的质粒构建、基因组预修饰或大量测序。但dReaMGE也存在筛选效率低、依赖选择标记等应用瓶颈，导致大量基因组系统编辑标签回收工作，在突变株基因组中留下多个重复序列或疤痕。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种细菌基因组多重编辑方法及其应用。具体的，本发明实际提供一种基于改进的dReaMGE重组工程和线性CRISPR-Cas系统的多重基因组编辑方法(Recombineering and Linear-CRISPR assisted Multiplex GenomeEngineering，ReaL-MGE)，经试验证明，其显著提高了在诸如大肠杆菌和伯克氏菌细胞中介导的dsDNA重组工程效率。同时，上述Real-MGE方法有效消除了对复杂的多gRNA表达载体的需求，减少了细菌基因组工程所需的时间，避免了脱靶效应和细胞毒性。基于上述研究成果，从而完成本发明。
为实现上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一个方面，提供一种细菌基因组多重编辑方法，所述方法至少包括构建具有线性化gRNA的CRISPR-Cas9系统和改进的dReaMGE系统：在dReaMGE系统基础上修饰有宿主细胞来源的ExoVII，并且敲除ExoVII中xseA亚基，以及过表达ExoVII中xseB亚基；表达Red/ET类型重组酶的表达载体上设置有Cas9基因，且调控所述Cas9基因的启动子与调控Red/ET类型重组酶的启动子不同；构建靶向基因组的线性gRNA以及线性化dsDNA底物，其中，所述线性gRNA受组成型启动子启动表达；所述线性化dsDNA底物带有同源臂；所述同源臂其长度为不大于200bp。
其中，所述靶向基因组的线性gRNA可以为1个或多个，优选为多个，如2个，3个，6个等，本领域技术人员可根据实际需求在现有技术框架下合理设置线性gRNA的数量，在此不做具体限定。
为了进一步提高基因组编辑效率，在所述线性化gRNA的两端添加硫代磷酸化修饰，从而提升重组效率。进一步的，在线性化gRNA的两端添加两个连续的硫代磷酸化修饰。
所述宿主可以为细菌，在本发明的一个具体实施方式中，所述细菌为大肠杆菌或伯克氏菌。
其中，所述线性化dsDNA底物可以为1个或多个，优选为多个，如2个，3个，6个等，所述各线性化dsDNA底物携带有不大于200bp的同源臂靶向不同的靶标序列，且靶向不同靶标位点的dsDNA底物可以带有相同的抗性基因(如氯霉素抗性基因)或不带任何筛选标记。所述同源臂位于dsDNA两端，其长度为不大于200bp，进一步为不大于100bp，具体的，所述线性dsDNA底物两端带有100bp同源臂的30bp异源区域。
敲除所述宿主细胞来源的核酸外切酶VII(ExoVII)中xseA亚基具体方法包括：使用敲除序列(线性同源DNA片段)使得xseA失活；
所述过表达宿主细胞来源的核酸外切酶VII中xseB亚基的具体方法包括：使用诱导型启动子(如鼠李糖启动子)控制所述xseB过表达。
所述Red/ET类型重组酶可以是任何现有已知的Red/ET类型重组酶，本领域技术人员可以根据不同宿主选择能够有效介导重组的Red/ET类型重组酶。
进一步的，所述基因组多重编辑方法具体包括：
S1、重构Red/ET类型重组酶和Cas9表达载体：将宿主细胞来源的核酸外切酶VII中xseB基因置于Red/ET类型重组酶基因后，由第一诱导型启动子(如鼠李糖启动子)控制过表达，将xseA-靶向gRNA和xseA失活组件置于同一表达载体上，进行宿主细胞来源的核酸外切酶VII中的xseA基因失活；所述Cas9基因受第二诱导型/组成型启动子(如PBAD启动子或Pgenta启动子)控制；所述表达载体可以为质粒；
S2、设计靶向基因组的gRNA，由组成型启动子(如PJ23119)启动表达，并构建单独的线性化dsDNA底物；
S3、将带有重组酶质粒的宿主细胞培养至对数生长期，添加第一诱导型启动子对应诱导剂，诱导重组酶的表达；制备感受态细胞，将线性化gRNA和dsDNA底物通过电转化导入到感受态细胞内；
S4、将电转化后的感受态细胞，在低于最适生长温度的温度下进行第一次复苏，在复苏过程中添加dNTPs(GC含量与宿主基因组GC含量相近或者相同)，添加阿拉伯糖诱导剂诱导Cas9表达。
S5、同步骤S3制备宿主细胞感受态，将线性化gRNA通过电转化导入感受态细胞内；
S6、将二次电转化后的感受态细胞，进行第二次复苏。
所述步骤S1中，当所述宿主为大肠杆菌(如大肠杆菌BL21)时，第二诱导性启动子为阿拉伯糖启动子PBAD，此时，步骤S4复苏条件为30℃复苏6小时，步骤S6复苏条件为30℃复苏4小时，同时步骤S6可添加阿拉伯糖诱导剂诱导Cas9表达。
当宿主为伯克氏菌(如伯克氏菌S.brevitalea DSM 7029)时，第二组成型启动子为庆大霉素启动子Pgenta，此时，步骤S4复苏条件为22℃复苏12小时，步骤S6复苏条件为22℃复苏6小时。
所述步骤S4中，外源添加dNTPs的终浓度为10nM。
所述基因组多重编辑方法还包括对步骤S6第二次复苏后获得的单菌落进行鉴定，计算重组效率。
本发明的第二个方面，提供上述方法在如下任意一种或多种中的应用：
(a)基因型与表型关系研究；
(b)化学生产；
(c)基因工程菌株优化。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案中首次公开了一种基于线性CRISPR-Cas系统和改进的dReaMGE系统的细菌基因组多重编辑技术(ReaL-MGE)。与CRISPR-Cas技术相比，上述技术方案可以绕过复杂多gRNA表达载体的构建，避免重复序列存在带来的问题，显著缩短细菌基因组系统工程的时间，能够有效地介导大肠杆菌和伯克氏菌的多重基因组编辑。
总之，上述技术方案所建立ReaL-MGE技术是探测基因型与表型关系，增强化学生产和菌株优化的潜在且便捷的工具，是对当前基因组工程技术的理想补充，因此具有良好的实际应用之价值。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1中CRISPR-Cas9系统在大肠杆菌中的线性表达图及优化。
其中，A，向导RNA(gRNA)线性化表达流程图。重组酶和Cas9构建在同一质粒上，受不同的诱导启动子调控。线性化gRNA由组成型启动子J23119控制。第一步是诱导重组酶并电穿孔dsDNA底物进行基因组编辑，然后进行复苏Ⅰ。第二步电转化线性化gRNA进行反向筛选，然后进行复苏Ⅱ。
B，线性化gRNA修饰对三突变的影响。a，不进行第二次电穿孔；b，在线性化gRNA的两端添加两个连续的硫代磷酸化修饰(S)；c，对线性化gRNA不添加任何修饰。
C，线性化gRNA添加量对三突变的影响。
D，Cas9诱导时间对三突变的影响。在复苏I和复苏II中诱导cas9基因，三突变率提高了2.6倍。数值为生物重复的平均值，误差条表示所有(n≥3)生物重复的标准差。P值采用two-tailed Student’s t-test：**P<0.01,****P<0.001。
图2为本发明实施例2和实施例3中ReaL-MGE 1.0和2.0的建立。
其中，A，ReaL-MGE 1.0建立示意图。d，线性化gRNA的CRISPR-Cas9仅用于反向筛选功能；e，线性化gRNA的CRISPR-Cas9具有反向筛选和刺激同源重组的双重功能；f，线性化gRNA的CRISPR-Cas9仅具有刺激同源重组功能；g，线性化gRNA的CRISPR-Cas9具有反向筛选和刺激同源重组的功能，dsDNA底物与线性化gRNA通过gRNA可识别的原始基因组靶序列连接，并被Cas9切割；h，线性化gRNA的CRISPR-Cas9仅具有刺激同源重组功能，dsDNA底物与线性化gRNA通过gRNA可识别的原始基因组靶序列连接，并被Cas9切割；
B，重组、dReaMGE、dReaMGE plus和d-h无痕单区域突变的准确性。
C，ReaL-MGE 2.0构建图，线性化cas9由组成型启动子Pgenta控制。i，线性化CRISPR-Cas9仅用于反向筛选功能；j，线性化CRISPR-Cas9具有反向筛选和刺激同源重组的双重功能；k，线性化CRISPR-Cas9仅具有刺激同源重组功能；l、线性化CRISPR-Cas9具有反向筛选和刺激同源重组的功能，dsDNA底物通过裂解序列与线性化CRISPR-Cas9连接；m，线性化CRISPR-Cas9仅具有刺激同源重组功能dsDNA底物通过裂解序列与线性化CRISPR-Cas9连接。
D，重组、dReaMGE、dReaMGE plus和i-m的无痕单区域突变的准确性。
E，重组、dReaMGE、dReaMGE plus和ReaL-MGE 2.0检测DSM7029无痕单区域突变的准确性。
F，重组、dReaMGE、dReaMGE plus、ReaL-MGE 1.0和ReaL-MGE 2.0介导的无痕三区域突变的准确性。数值为生物重复的平均值，误差条表示所有(n≥3)个生物重复的标准差。P值采用双尾Student’s t检验:****P<0.001。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
本发明的一个典型具体实施方式中，提供一种细菌基因组多重编辑方法，包括：
(1)针对不同的宿主选择能够有效介导同源重组的Red/ET类型重组酶，合适的诱导型启动子、强启动子、抗性标记和骨架质粒；
(2)用(1)中筛选到的诱导型启动子控制重组酶并构建在合适的骨架质粒上，重组酶后添加相应宿主ExoVII的xseB基因共表达，通过鼠李糖启动子控制进行过表达。E.coliBL21中将xseA靶向gRNA和xseA敲除序列(KO region-xseA gRNA-tracRNA)放置在质粒上进行xseA失活。Schlegelella brevitalea DSM 7029中采用线性DNA对xseA进行失活，通过电转化的方式将构建好的重组酶表达质粒导入到宿主细胞中；
(3)通过PCR的方法获得带有能够锚定不同靶标位点短的同源臂(100bp)的dsDNA底物；
(4)将gRNA表达盒构建在线性载体上，线性载体的两端包括两个连续的硫代磷酸酯(S)键。E.coli BL21中诱导型启动子控制Cas9并构建在重组酶表达质粒上，Schlegelella brevitalea DSM 7029中采用组成型强启动子Pgenta控制Cas9线性表达，组成型强启动子J23119控制gRNA表达，以Cas9片段和多gRNA混合物为模板扩增出多Cas9+gRNA混合物，保证Cas9和gRNA的共同表达和共同转化。
(5)将步骤(2)中的带有重组酶质粒的宿主细胞用合适培养基培养至对数生长期，添加诱导剂，诱导重组酶和宿主xseB的表达，并根据不同宿主细胞的特性制备带有重组酶质粒的宿主细胞感受态，将靶向不同靶标序列的Linear-CRISPR和dsDNA底物通过电转化导入到感受态细胞内；
(6)将电转化后的感受态细胞，在低于最适生长温度的温度下进行复苏，在复苏过程中添加终浓度为10nM的dNTPs(GC含量与宿主基因组GC含量相近或者相同)，添加诱导剂诱导Cas9表达，不同宿主细胞的复苏时间和复苏温度不同(E.coli BL21-30℃，6小时；Schlegelella brevitalea DSM7029-22℃，12小时)。
(7)同(5)制备宿主细胞感受态，将靶向不同靶标序列的Linear-CRISPR底物通过电转化导入到感受态细胞内；
(8)将电转化后的感受态细胞，在低于最适生长温度的温度下进行复苏(E.coliBL21-30℃，4小时；Schlegelella brevitalea DSM7029-22℃，6小时)，添加诱导剂诱导Cas9表达。
(9)将复苏后的感受态细胞离心弃上清后重悬于100μL适宜培养基中，均匀涂布于带有相应抗性的固体培养基平板上，在复苏温度下进行孵育直至单菌落长出；
(10)挑取单菌落进行鉴定，然后在含有相应抗生素的1mL液体培养基中30℃培养6-12小时(E.coli BL21-6小时；Schlegelella brevitalea DSM7029-12小时)后，取100μL菌液与900μL无菌水混合后95℃加热15min，取1μL煮沸样品作为PCR模板。检测引物被设计成用于扩增外源基因与基因组连接处大小为0.5-1.5kb的片段。
将上述方法应用于E.coli BL21和Schlegelella brevitalea DSM 7029中，获得如下结果：
1.本发明方法是将dsDNA底物和两端硫代磷酸修饰的200ng线性多gRNA电穿孔至大肠杆菌BL21感受态细胞中，复苏阶段诱导Cas9，之后再次将线性多gRNA电穿孔至大肠杆菌BL21感受态细胞中，复苏阶段再次诱导Cas9，验证了gRNA线性表达的可行性。使用氯霉素抗性基因(cm)作为唯一的选择标记，dReaMGE介导的大肠杆菌BL21三重突变的效率增加了2.6倍，从12％增加到32％。
2.本发明方法通过将大肠杆菌BL21菌株的xseB基因置于重组酶(Redαβγ)后，由鼠李糖启动子控制过表达，将xseA-靶向gRNA和xseA失活组件(KO region-xseA gRNA-tracRNA)置于同一质粒上，进行xseA失活；第一轮电转化中导入dsDNA底物，以及具有线性化gRNA的CRISPR-Cas9系统来刺激同源重组，第二轮电转化导入线性化gRNA的CRISPR-Cas9用于反向筛选功能。与仅使用CRISPR-Cas9进行反向筛选相比，单区域无痕编辑(用30bp异源区域替换500bp基因组区域)的效率提高了3倍。
3.本发明方法通过原靶序列将用于基因组编辑的dsDNA底物连接在gRNA组件上进行体内切割，使dsDNA底物得以释放。第一轮电转化中导入dsDNA底物+线性化gRNA的CRISPR-Cas9系统来刺激同源重组，第二轮电转化导入线性化gRNA的CRISPR-Cas9用于反向筛选功能，建立了ReaL-MGE 1.0。结果表明，单区域无痕编辑效率比分别转入dsDNA底物和线性化gRNA进一步提高了近20％。
4.本发明方法在大肠杆菌BL21中将Cas9片段与gRNA线性表达载体连接，使CRISPR-Cas9系统完全线性化。第一轮电转化中导入dsDNA底物、xseA失活组件，以及线性化Cas9-gRNA组件来刺激同源重组，第二轮电转化导入线性化Cas9-gRNA组件用于反向筛选，建立了ReaL-MGE 2.0。
5.本发明方法在Schlegelella brevitalea DSM 7029中利用ReaL-MGE 2.0使得基因组单区域无痕编辑效率提高至3％，是dReaMGE效率的10倍以上。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1：在E.coli中实现gRNAs线性表达。为了证明线性化多gRNA在细菌中表达的可行性，测试了线性化gRNA的CRISPR-Cas9在提高dReaMGE介导的三重突变筛选效率方面的效果。
(1)在大肠杆菌BL21中，通过pBBR1-PRha-Redαβγ-xseB-PBAD-Cas9-Km表达载体表达λ噬菌体重组酶和Cas9。
(2)如图1A所示，设计了靶向基因组三个不同区域的gRNA，J23119启动子启动表达，并构建三个单独的线性化dsDNA底物(氯霉素抗性基因，两端带有100bp同源臂)。序列如下：
(3)将带有重组酶质粒的宿主细胞培养至对数生长期，添加鼠李糖诱导剂，诱导重组酶的表达。制备感受态细胞，将靶向不同靶标序列的gRNA和dsDNA底物通过电转化导入到感受态细胞内；
(4)将电转化后的感受态细胞，在低于最适生长温度的温度下进行复苏(30℃，6小时)，在复苏过程中添加终浓度为10nM dNTPs(GC含量与宿主基因组GC含量相近或者相同)，添加阿拉伯糖诱导剂诱导Cas9表达。
(5)同(3)制备宿主细胞感受态，将靶向不同靶标序列的gRNA通过电转化导入到感受态细胞内；
(6)将二次电转化后的感受态细胞，在30℃复苏4小时，添加阿拉伯糖诱导剂诱导Cas9表达；
(7)将复苏后的感受态细胞离心弃上清后重悬于100μL适宜培养基中，均匀涂布于带有相应抗性的固体培养基平板上，在复苏温度下进行孵育直至单菌落长出；
(8)挑取单菌落进行鉴定，然后在含有相应抗生素的1mL液体培养基中37℃培养6小时，取100μL菌液与900μL无菌水混合后95℃加热15min，取1μL煮沸样品作为PCR模板。检测引物被设计成用于扩增外源基因与基因组连接处大小为0.5-1.5kb的片段。计算正确的单菌落数即为重组效率。检测引物序列如下：
检测引物 引物序列(5’-3’) 编号
BL21-1-check CGCGAACTGGACTCATTGTA SEQ ID NO.7
BL21-2-check ATAACCAGGCTGACGATCAT SEQ ID NO.8
BL21-3-check AGACTTTGTAGCTCTCCCCA SEQ ID NO.9
cm-check ATTGAGCAACTGACTGAAAT SEQ ID NO.10
对实施步骤中三个重要因素：线性化gRNA表达载体的修饰、线性化gRNA表达载体的表达水平、Cas9表达时间设计对照试验进行优化：
(1)线性化gRNA修饰对三突变的影响。实验组分别为a，不进行第二次电转化；b，在线性化gRNA的两端添加两个连续的硫代磷酸化修饰(S)；c，对线性化gRNA不添加任何修饰。结果如图1B所示，在线性化gRNA的两端添加两个连续的硫代磷酸化修饰可以显著提高大肠杆菌BL21三重突变的效率。
(2)线性化gRNA表达载体的表达水平对三突变的影响。实验组中电转时线性化gRNA的添加量分别设置为0ng、50ng、100ng、200ng、400ng、600ng。结果如图1C所示，添加200ng线性化gRNA可以显著提高大肠杆菌BL21三重突变的效率。
(3)Cas9表达时间对三突变的影响。实验组分别在不同实验阶段对cas9基因进行诱导表达，结果如图D所示，在复苏I和复苏II阶段中诱导cas9基因，大肠杆菌BL21三重突变的效率比dReaMGE提高了2.6倍。
综上所述，通过修饰线性化gRNA表达载体(图1A(a))、优化Cas9表达时间(图1A(b))、调整线性化gRNA表达载体水平(图1A(c))，成功实现了多个gRNA的线性化表达。结果显示，使用氯霉素抗性基因(cm)作为唯一的选择标记，dReaMGE介导的大肠杆菌BL21三重突变的效率增加了2.6倍，从12％增加到32％(图1B-D)。本实施例结果证明，多gRNAs在大肠杆菌中线性表达是可行的，可以显著提高dReaMGE介导的多重基因组编辑的筛选效率。
实施例2：ReaL-MGE 1.0的建立及其在大肠杆菌E.coli BL21中的应用。在之前的研究中已证实修饰ExoVII显著提高了大肠杆菌BL21的同源重组能力，经过ExoVII修饰的dReaMGE被命名为dReaMGE plus，接下来在dReaMGE plus的基础上在大肠杆菌BL21中建立具有线性化gRNA的CRISPR-Cas9系统。
(1)重构重组酶和Cas9表达载体：如图2A所示，将大肠杆菌BL21菌株的xseB基因置于重组酶(Redαβγ)后，由鼠李糖启动子控制过表达，将xseA-靶向gRNA和xseA失活组件(KOregion-xseA gRNA-tracRNA)置于同一质粒上，进行xseA失活；
(2)设计了靶向基因组单区域(500bp)的gRNA，J23119启动子启动表达，并构建单独的线性化dsDNA底物(两端带有100bp同源臂的30bp异源区域)；
(3)将带有重组酶质粒的宿主细胞培养至对数生长期，添加鼠李糖诱导剂，诱导重组酶的表达。制备感受态细胞，将gRNA和dsDNA底物通过电转化导入到感受态细胞内；
(4)将电转化后的感受态细胞，在低于最适生长温度的温度下进行复苏(30℃，6小时)，在复苏过程中添加终浓度为10nM dNTPs(GC含量与宿主基因组GC含量相近或者相同)，添加阿拉伯糖诱导剂诱导Cas9表达。
(5)同(3)制备宿主细胞感受态，将gRNA通过电转化导入感受态细胞内；
(6)将二次电转化后的感受态细胞，30℃复苏4小时，添加阿拉伯糖诱导剂诱导Cas9表达；
(7)将复苏后的感受态细胞离心弃上清后重悬于100μL适宜培养基中，均匀涂布于带有相应抗性的固体培养基平板上，在复苏温度下进行孵育直至单菌落长出；
(8)挑取单菌落进行鉴定，然后在含有相应抗生素的1mL液体培养基中37℃培养6小时，取100μL菌液与900μL无菌水混合后95℃加热15min，取1μL煮沸样品作为PCR模板。检测引物被设计成用于扩增外源基因与基因组连接处大小为0.5-1.5kb的片段。计算正确的单菌落数即为重组效率。检测引物序列如下：
检测引物 引物序列(5’-3’) 编号
BL21-1-check CGCGAACTGGACTCATTGTA SEQ ID NO.7
cm-check ATTGAGCAACTGACTGAAAT SEQ ID NO.10
如图2A(d)-(h)所示，在大肠杆菌BL21中，设计不同实验组对CRISPR-Cas9系统的功能进行优化，比较重组、dReaMGE、dReaMGE plus和d-h基因组无痕单区域突变的准确性：
(1)d：第一轮电转化导入dsDNA底物，第二轮电转化导入线性化gRNA的CRISPR-Cas9仅用于反向筛选功能。
(2)e：第一轮电转化中导入dsDNA底物，以及具有线性化gRNA的CRISPR-Cas9系统来刺激同源重组，第二轮电转化导入线性化gRNA的CRISPR-Cas9用于反向筛选功能。结果表明，与仅使用CRISPR-Cas9进行反向筛选相比，单区域无痕编辑(用30bp异源区域替换500bp基因组区域)的效率提高了3倍(图2B)。
(3)f：第一轮电转化中导入dsDNA底物，以及具有线性化gRNA的CRISPR-Cas9系统来刺激同源重组，第二轮电转化仅电击。
(4)g：通过原靶序列将用于基因组编辑的dsDNA底物连接在gRNA盒上进行体内切割，使dsDNA底物得以释放。第一轮电转化中导入dsDNA底物+线性化gRNA的CRISPR-Cas9系统来刺激同源重组，第二轮电转化导入线性化gRNA的CRISPR-Cas9用于反向筛选功能。结果表明，单区域无痕编辑效率比e进一步提高了近20％(图2B)。
(5)h：第一轮电转化中导入dsDNA底物+线性化gRNA的CRISPR-Cas9系统来刺激同源重组，第二轮电转化仅电击。
图2A(g)所示策略定义为ReaL-MGE 1.0(Recombineering and Linearizeded-CRISPR assisted Multiplex Genome Editing technology,ReaL-MGE)。
实施例3：ReaL-MGE 2.0的建立及其在大肠杆菌BL21和伯克氏菌S.brevitaleaDSM 7029中的应用。前期工作中发现，可能是由于Cas9蛋白的细胞毒性，Cas9基因无论构建在何种拷贝水平的质粒上，都不能成功转移到非模式细菌S.brevitalea DSM 7029中。因此，本部分通过CRISPR-Cas系统和启动子筛选实现cas9基因与gRNA的线性化共表达，以降低Cas蛋白的细胞毒性，扩大CRISPR-Cas系统的应用范围。
出发菌株：伯克氏菌DSM 7029、大肠杆菌BL21。以DSM 7029为例：
(1)重构重组酶和Cas9表达载体：如图2C所示，将伯克氏菌DSM 7029菌株的xseB基因置于重组酶(Redγ-Redαβ7029)后，由鼠李糖启动子控制过表达。采用线性DNA对xseA进行失活；
(2)设计了靶向基因组单区域(500bp)的gRNA，并置于cas9基因后构建单独的线性化dsDNA底物(两端带有100bp同源臂的30bp异源区域)，cas9基因置于Pgenta后，gRNA置于PJ23119后；
(3)将带有重组酶质粒的宿主细胞培养至对数生长期，添加鼠李糖诱导剂，诱导重组酶的表达。制备感受态细胞，将Cas9-gRNA组件和dsDNA底物通过电转化导入到感受态细胞内；
(4)将电转化后的感受态细胞，在低于最适生长温度的温度下进行复苏(22℃，12小时)，在复苏过程中添加终浓度为10nM dNTPs(GC含量与宿主基因组GC含量相近或者相同)。
(5)同(3)制备宿主细胞感受态，将Cas9-gRNA盒通过电转化导入感受态细胞内；
(6)将二次电转化后的感受态细胞，在22℃条件下复苏6小时；
(7)将复苏后的感受态细胞离心弃上清后重悬于100μL适宜培养基中，均匀涂布于带有相应抗性的固体培养基平板上，在复苏温度下进行孵育直至单菌落长出；
(8)挑取单菌落进行鉴定，然后在含有相应抗生素的1mL液体培养基中30℃培养12小时，取100μL菌液与900μL无菌水混合后95℃加热15min，取1μL煮沸样品作为PCR模板。检测引物被设计成用于扩增外源基因与基因组连接处大小为0.5-1.5kb的片段。计算正确的单菌落数即为重组效率。检测引物序列如下：
检测引物 引物序列(5’-3’) 编号
7029-check AGATCACCGTGTCATGCAG SEQ ID NO.15
cm-check ATTGAGCAACTGACTGAAAT SEQ ID NO.10
如图2C(i)-(m)所示，在完成CRISPR-Cas9系统的完全线性化之后，下一个目标是通过优化Cas9-gRNA盒的表达载体来提高编辑效率，在大肠杆菌中：
(1)i：第一轮电转化导入dsDNA底物和失活xseA的DNA线性片段，第二轮电转化导入线性化Cas9-gRNA盒仅用于反向筛选。
(2)j：第一轮电转化中导入dsDNA底物、失活xseA的DNA线性片段，以及线性化Cas9-gRNA组件来刺激同源重组，第二轮电转化导入线性化Cas9-gRNA组件用于反向筛选。
(3)k：第一轮电转化中导入dsDNA底物、失活xseA的DNA线性片段，以及线性化Cas9-gRNA组件来刺激同源重组，第二轮电转化仅电击。
(4)l：通过原靶序列将用于基因组编辑的dsDNA底物连接在gRNA组件上进行体内切割，使dsDNA底物得以释放。第一轮电转化中导入失活xseA的DNA线性片段，dsDNA底物+线性化gCas9-gRNA组件来刺激同源重组，第二轮电转化导入线性化gCas9-gRNA组件用于反向筛选。
(5)m：第一轮电转化中导入失活xseA的DNA线性片段，dsDNA底物+线性化gCas9-gRNA组件来刺激同源重组，第二轮电转化仅电击。
结果如图2D所示，各实验组中图2C(j)所示策略大肠杆菌BL21单区域替换效率最高，将其定义为ReaL-MGE 2.0。为了评估ReaL-MGE 2.0的普遍性，随后在S.brevitalea DSM7029中采用了ReaL-MGE 2.0。结果如图2E所示，ReaL-MGE 2.0显著提高了单区域编辑效率，比dReaMGE提高了十倍以上，这一结果也表明线性化表达可以降低CRISPR-Cas9系统的细胞毒性。
如图2F所示，通过比较利用重组、dReaMGE、dReaMGE plus、CREATE、ReaL-MGE 1.0和ReaL-MGE 2.0等5种不同的多重基因组工程技术对大肠杆菌BL21进行无痕三区域编辑(同时替换3个500bp基因组区域)的效率，进一步验证了ReaL-MGE促进细菌多重基因组工程的能力。所使用技术都利用dsDNA作为基因组编辑底物。结果显示，ReaL-MGE 2.0介导的无痕三区域编辑效率为0.31％(4/1440)，而ReaL-MGE 1.0的效率为0.52％(7/1440)。然而，重组、dReaMGE、dReaMGE plus和CREATE在1440个突变体中没有产生三突变体。
在实施例2、3中，成功在细菌中建立了线性化的CRISPR-Cas系统和dReaMGE plus，建立了Real-MGE系列技术。ReaL-MGE可以将Cas蛋白、gRNA和dsDNA底物整合到单一线性化载体上，从而使重组效率提高了30倍。在Real-MGE变体中，Real-MGE 1.0成为能够耐受与CRISPR-Cas9系统相关的细胞毒性的细菌的最有效和最合适的选择。另一方面，ReaL-MGE2.0整合了完整的线性化CRISPR-Cas9系统，能够显著提高对CRISPR-Cas9系统耐受性较差的非模式细菌(如S.brevitalea DSM 7029)的同源重组效率。值得注意的是，ReaL-MGE有效地促进了跨越多个千碱基的基因组区域的无痕删除、替换和插入，这对于现有的CRISPR-Cas或重组技术(如CREATE、MAGE和poRTMGE)来说是一项具有挑战性的壮举。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一种细菌基因组多重编辑方法，其特征在于，所述方法至少包括构建具有线性化gRNA的CRISPR-Cas9系统和改进的dReaMGE系统：在dReaMGE系统基础上修饰有宿主细胞来源的ExoVII，并且敲除ExoVII中xseA亚基，以及过表达ExoVII中xseB亚基；表达Red/ET类型重组酶的表达载体上设置有Cas9基因，且调控所述Cas9基因的启动子与调控Red/ET类型重组酶的启动子不同；构建靶向基因组的线性gRNA以及线性化dsDNA底物，其中，所述线性gRNA受组成型启动子启动表达；所述线性化dsDNA底物带有同源臂；所述同源臂其长度为不大于200bp。
2.如权利要求1所述的细菌基因组多重编辑方法，其特征在于，所述靶向基因组的线性gRNA为1个或多个。
3.如权利要求1所述的细菌基因组多重编辑方法，其特征在于，在所述线性化gRNA的两端添加硫代磷酸化修饰，进一步的，在线性化gRNA的两端添加两个连续的硫代磷酸化修饰。
4.如权利要求1所述的细菌基因组多重编辑方法，其特征在于，所述宿主为细菌，进一步的，所述细菌为大肠杆菌或伯克氏菌。
5.如权利要求1所述的细菌基因组多重编辑方法，其特征在于，所述线性化dsDNA底物为1个或多个，优选为多个；各线性化dsDNA底物携带有不大于200bp的同源臂靶向不同的靶标序列；且靶向不同靶标位点的dsDNA底物带有相同的抗性基因或不带任何筛选标记；所述同源臂位于线性化dsDNA底物两端，其长度为不大于100bp。
6.如权利要求1所述的细菌基因组多重编辑方法，其特征在于，敲除ExoVII中xseA亚基具体方法包括：使用敲除序列使得xseA失活；
过表达ExoVII中xseB亚基的具体方法包括：使用诱导型启动子控制所述xseB过表达。
7.如权利要求1-6任一项所述的细菌基因组多重编辑方法，其特征在于，具体方法包括：
S1、重构Red/ET类型重组酶和Cas9表达载体：将宿主细胞来源的核酸外切酶VII中xseB基因置于Red/ET类型重组酶基因后，由第一诱导型启动子控制过表达，将xseA-靶向gRNA和xseA失活组件置于同一表达载体上，进行宿主细胞来源的核酸外切酶VII中的xseA基因失活；所述Cas9基因受第二诱导型/组成型启动子控制；所述表达载体为质粒；
S2、设计靶向基因组的gRNA，由组成型启动子启动表达，并构建单独的线性化dsDNA底物；
S3、将带有重组酶质粒的宿主细胞培养至对数生长期，添加第一诱导型启动子对应诱导剂，诱导重组酶的表达；制备感受态细胞，将线性化gRNA和dsDNA底物通过电转化导入到感受态细胞内；
S4、将电转化后的感受态细胞，在低于最适生长温度的温度下进行第一次复苏，在复苏过程中添加dNTPs，添加阿拉伯糖诱导剂诱导Cas9表达；
S5、同步骤S3制备宿主细胞感受态，将线性化gRNA通过电转化导入感受态细胞内；
S6、将二次电转化后的感受态细胞，进行第二次复苏。
8.如权利要求7所述的细菌基因组多重编辑方法，其特征在于，所述步骤S1中，当所述宿主为大肠杆菌时，第二诱导性启动子为阿拉伯糖启动子PBAD，此时，步骤S4复苏条件为30℃复苏6小时，步骤S6复苏条件为30℃复苏4小时，同时步骤S6添加阿拉伯糖诱导剂诱导Cas9表达；
当宿主为伯克氏菌时，第二组成型启动子为庆大霉素启动子Pgenta，此时，步骤S4复苏条件为22℃复苏12小时，步骤S6复苏条件为22℃复苏6小时；
所述步骤S4中，外源添加dNTPs的终浓度为10nM。
9.如权利要求7所述的细菌基因组多重编辑方法，其特征在于，所述基因组多重编辑方法还包括对步骤S6第二次复苏后获得的单菌落进行鉴定，计算重组效率。
10.权利要求1-9任一项所述细菌基因组多重编辑方法在如下任意一种或多种中的应用：
(a)基因型与表型关系研究；
(b)化学生产；
(c)基因工程菌株优化。
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