CN112538495A - 基于crispr技术对大肠杆菌k4进行基因插入的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于CRISPR技术对大肠杆菌K4进行基因插入的方法。本发明涉及生物技术基因编辑领域，具体涉及基于CRISPR/Cas9系统的外源基因靶向大肠杆菌中染色体的方法。本发明方法包括：利用导入的λRed同源重组系统和CRISPR系统实现在大肠杆菌K4的LacZ基因中插入靶基因。本发明建立了一种高效、简单的将大肠杆菌传统基因编辑技术与CRISPR系统相结合的靶基因定位插入方法。与现有大肠杆菌K4基因编辑方法相比，本发明提供的方法能够在大肠杆菌中实现高效准确的目的基因插入工作。本发明提供的细菌中基因插入方法操作简便快捷，实验成本较低，尤其适用于高通量基因编辑工作。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术基因敲除领域，具体涉及基于CRISPR/Cas9系统的外源基因靶向大肠杆菌中染色体的方法。
背景技术
大肠杆菌K4(ATCC 23502)的荚膜多糖结构为硫酸软骨素类似物果糖软骨素，提高果糖软骨素产量一直以来都是热点研究问题。目前对大肠杆菌K4进行染色体水平上靶基因的改造有如下两种方法：一是利用其自身RecA同源重组系统编码的重组蛋白介导DNA发生同源重组；二是通过引入外源重组酶λ-Red或RecET提高同源重组效率。上述两种均是通过DNA分子发生双交换实现对靶基因的编辑。这些传统的大肠杆菌K4同源重组技术通常需要外源性辅助质粒以及筛选标记基因，对靶基因进行敲除及插入等实验操作，但当对靶基因进行点突变等更加精准的操作时，这些重组技术存在重组效率低、流程繁琐等缺点，想要大规模应用仍然面临巨大的挑战。
CRISPR/Cas9系统改造的碱基编辑器，是目前对核酸碱基进行点突变应用较为广泛的方法，作为一种新型基因编辑工具，该技术仍存在脱靶率高、编辑窗口局限等问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种将大肠杆菌传统的基因编辑技术与CRISPR/Cas9技术相结合，快速、高效的实现大肠杆菌K4靶基因定点插入的方法。
第一方面，本发明要求保护一种对大肠杆菌K4基因组中靶基因进行定点插入的方法。
本发明所要求保护的对大肠杆菌K4基因组中靶基因进行定点插入的方法，可包括如下步骤：
(1)将质粒pCas9转入大肠杆菌K4，获得大肠杆菌K4 pCas9；
(2)根据靶标基因LacZ设计1对反向互补的引物，所述引物中的一条含靶标基因20个核苷酸序列，以pTarget-F质粒为模板，PCR扩增，获得的PCR产物经过Dpn I消化、磷酸化、T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性转化子，送去测序验证，提取含靶标基因20个核苷酸序列的pTarget-F质粒；
(3)以大肠杆菌K4基因组为模板，根据PgapA基因和待插入基因位点上下游核苷酸序列设计引物P3、P4、P5和P6，PCR扩增待插入的DNA片段；
(4)以大肠杆菌K4基因组为模板，设计引物P1、P2、P7和P8，PCR扩增lacZ上下游同源序列的DNA片段；构建携带待插入基因和lacZ基因上下游同源序列的Donor DNA片段；
(5)将步骤(2)获得的辅助质粒pTarget-F和步骤(4)获得的DNA片段通过电击转化的方法转入大肠杆菌K4 pCas9感受态细胞，获得插入基因的重组大肠杆菌。
进一步，步骤(5)辅助质粒pTarget-F和DONOR DNA片段质量比优选1∶4；
进一步，步骤(5)转入方法为：将辅助质粒pTarget-F和DONOR DNA片段与大肠杆菌K4 pCas9感受态细胞混合，轻弹混匀，加入预冷的电击杯中，将电击杯外侧的冷凝水擦干，放入电转化仪(Bio-Rad)的杯槽中，转化条件：电击后迅速加入液体培养基，30℃静置培养2h进行复苏，离心3min，弃掉多余上清液，将菌体重悬后涂布于LB双抗固体培养基，获得基因重组的大肠杆菌K4；
进一步，步骤(2)所述PCR扩增条件为：PrimeSTAR Max Premix 25μL、1.5μL引物pTargetF-LacZF、1.5μL引物pTargetF-LacZR、模板1μL、dd H2O补足至50μL；反应程序为：98℃ 10s，55℃ 5s，72℃ 15s，30循环；16℃保存。
进一步，步骤(2)所述DpnI条件为：37℃温育5min，70℃灭活15min，利用DNA产物纯化试剂盒直接回收酶切反应液中的DNA进行纯化回收。
进一步，步骤(2)所述连接条件为：Ligation Buffer 5μL、T4PNK 1uL、ddH2O 42μL，37℃温育30-40min，65℃灭活20min。
进一步，步骤(3)所述PCR条件为：PrimeSTAR Max Premix 25μL、1.5μL引物P3、1.5μL引物P4、模板1μL、dd H2O补足至50μL；反应程序为：98℃ 10s，55℃ 5s，72℃ 5s，30循环；16℃保存。
PrimeSTAR Max Premix 25μL、1.5μL引物P5、1.5μL引物P6、模板1μL、dd H2O补足至50μL；反应程序为：98℃ 10s，55℃ 5s，72℃ 3min，30循环；16℃保存。
进一步，步骤(4)所述PCR条件为：PrimeSTAR Max Premix 25μL、1.5μL引物P1、1.5μL引物P2或者1.5μL引物P7、1.5μL引物P8、模板1μL、dd H2O补足至50μL；反应程序为：98℃10s，55℃ 5s，72℃ 10s，30循环；16℃保存。
PrimeSTAR Max Premix 25μL、1.5μL引物P1、1.5μL引物P8、模板各0.5μL、dd H2O补足至50μL；反应程序为：98℃ 10s，55℃ 5s，72℃ 3min，30循环；16℃保存。
本发明所述LB琼脂培养基终浓度组成为：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L、琼脂粉15g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。
附图说明
图1为实施例1 pTargetF-lacZ质粒载体图谱。
图2为实施例1质粒pTarget-F经PCR扩增后的凝胶电泳图，M为DL2000Marker，泳道1-6代表平行的6个相同的质粒pTarget-F PCR产物。
图3为实施例1同源臂1、PgapA、glmM-GGGS-glmS和同源臂2的DNA片段融合PCR产物凝胶电泳图，M为10kb Ladder Marker，泳道1代表融合PCR产物。
图4为实施例1大肠杆菌K4重组株的菌落PCR验证凝胶电泳图，M为10kb LadderMarker，泳道1-2代表随机挑取5个转化子进行验证后两个阳性转化子PCR结果，结果显示为成功重组大肠杆菌K4株。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1大肠杆菌K4中PgapA-glmM-GGGS-glmS基因的定点插入
1、将pCas9质粒点电转导入大肠杆菌K4，记为大肠杆菌K4 pCas，包括以下步骤：
(1)挑取大肠杆菌K4单菌落接种于5mL LB液体试管中培养12h，进行二次活化，将二次活化的菌液按1∶100接种到100mL新鲜的LB液体培养基中，220rpm振荡培养至OD600＝0.6左右停止培养，将菌液置于冰中30min，4℃ 6000rpm离心10min，弃上清，用预冷的50mL超纯水洗涤菌体，4℃ 6000rpm离心10min，弃上清，25mL预冷超纯水进行二次洗涤，离心，弃上清，二次洗涤后用1mL预冷超纯水重悬菌体，100μL每管分装至1.5mL离心管中，迅速贮存于-80℃冰箱中。
(2)转化：将贮存在-80℃冰箱中的大肠杆菌K4感受态细胞置于冰盒中解冻，100μL感受态细胞中加2-6μL pCas质粒，轻弹使其混合均匀，加入预冷的电击杯(0.1cm)中，将电击杯外侧的冷凝水擦干，放入电转化仪(Bio-Rad)的杯槽中，转化条件：1.8KV、电阻200Ω、电容25μF，电击后迅速加入900μL LB液体培养基，30℃静置培养2h进行复苏，8000g/min离心3min，弃掉多余上清液，将菌体重悬后涂布于LB固体培养基(Kan，终浓度为50mg/L)，30℃过夜培养。转化子通过菌落PCR验证。记为大肠杆菌K4 pCas。
2、辅助质粒pTargetF-lacZ的构建
(1)以pTarget-F质粒(源自Jiang et al.，Appl Environ Microbiol，2015，81：2506-2514)为模板，通过引物pTargetF-LacZF(含有LacZ 20个核苷酸，即N20)和pTargetF-LacZR进行PCR，扩增得到线性化pTargetF-LacZ PCR产物。
pTargetF-LacZF：CATTTTTTGATGGACCATTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT；(SEQ IDNO.1)
pTargetF-LacZR：ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGC；(SEQ ID NO.2)
PCR的具体条件为：
优选的，98℃ 10s，55℃ 5s，72℃ 3min，30循环；16℃保存。
PCR扩增后的产物通过1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图2所示。电泳结果在理论值大小位置出现了单一的特异性条带，用DNA Fragment Purification Kit(购于TaKaRa公司)对其进行纯化回收。
(2)用DpnI处理纯化的PCR产物降解模板质粒：
优选的，37℃水浴15min，反应结束后，试剂盒对其进行纯化回收。
(3)磷酸化、T4DNA连接酶连接：
优选的，37℃温育30-40min，65℃灭活20min。16℃连接过夜。
(4)取步骤(3)得到的产物转化50μL大肠杆菌DH5α感受态细胞：
优选的，冰浴30min，42℃热激90s后迅速置冰上1～2min，加入950μL、37℃预热的LB培养基中，混匀30℃，200rpm培养1h，涂布于含有100μg/mL壮观霉素的LB琼脂培养基上，37℃培养12h，挑取阳性菌落，送公司测序(金唯智)。
序列分析结果，得到含有正确N20部分的pTargetF-LacZ，质粒图谱如图1所示。测得序列如下(SEQ ID NO.13)：
3.同源修复DNA(DONOR DNA)的制备。
(1)以大肠杆菌K4(ATCC23502)为模板，进行菌落PCR扩增出两段LacZ上下游同源臂DNA片段，引物如下：
P1：GGATCCGCCAGACGCCACTGCTGCCA；(SEQ ID NO.3)
P2：TTCGATGGTGTCCGGGATCTCGTCAGTATCCCCGTTTACA；(SEQ ID NO.4)
P7：CGGTTGAGTAACACGATGACTACGCGGGTTCC；(SEQ ID NO.9)
P8：CAACTGCCGTTCGACGATATCGATTTTTCTGCTTTAGATCTTTCTTTTG；(SEQ ID NO.10)
(2)以大肠杆菌K4为模板，进行菌落PCR扩增出PgapA基因(SEQ ID NO.11)，引物如下：
P3：GCATCATATCCTTCCAGACCTTTAAAATTCGGGGCGC；(SEQ ID NO.5)
P4：CGCGCCCTCTTTCTAGTATATTCCACCAGCTATTTGTTAGTGAA；(SEQ ID NO.6)
以pETM6R2为模板，PCR扩增glmM-GGGS-glmS基因，引物如下
P5：TATACTAGAAAGAGGGCGCGGC；(SEQ ID NO.7)
P6：GTCATCGTGTTACTCAACCGTAACCGATTTTG；(SEQ ID NO.8)
(3)以上述PCR产物为模板，以P1和P8为引物进行融合PCR制备DONOR DNA片段；
1％琼脂糖凝胶电泳对PCR产物鉴定；融合PCR电泳结果如图3所示；结果有单一的特异性条带，大小为4408bp，纯化回收备用；
PCR的具体条件为：
优选的，98℃ 10s，55℃ 5s，72℃ 10s，30循环；16℃保存；
融合PCR的具体条件为：
优选的，95℃ 5min；95℃ 1min，55℃ 30s，72℃ 2min，30循环；72℃延伸10min；15℃保存。
融合PCR产物进行测序分析(金唯智)检测是否含有待插入基因部分，并附带送测引物。
送测引物如下：
P9：GCTTCGGCCTGGTAATGGCCC；(SEQ ID NO.14)
测得序列如下(SEQ ID NO.12)：
4、大肠杆菌K4 pCas感受态制备
(1)挑取一个单菌落，转移到装有10mL LB液体培养基的试管内；在30℃条件下220rpm培养，当OD600≈0.1时加入20mM L-Arabinose；继续于30℃条件下220rpm培养，直至OD600≈0.4；
(2)置于冰中预先冷却30min；吸取培养液1mL到预冷的1.5mL无菌EP管内，4℃，4000g离心10min；
(3)弃上清，加1mL预冷灭菌蒸馏水重悬菌体；于4℃条件4000g，离心10min；于超净台弃上清，加入1mL预先冷却过的10％甘油轻轻重悬菌体，重复此步骤3次；于4℃条件4000g，离心10min；于超净台内弃去上清液，加入80μL预先冷却过的10％甘油轻轻重悬菌体后备用。
5、转化：将1μg步骤2制备pTargetF-LacZ质粒(SEQ ID NO.4)和4μg步骤3制备的DONOR DNA片段(SEQ ID NO.11)与100μL大肠杆菌K4 pCas感受态细胞混匀，冰浴30min，将混合物42℃热激90s之后迅速置冰上1～2min，加入950μL、30℃预热的LB培养基中，混匀后30℃，200rpm培养1h。
pTargetF-LacZ质粒与DONOR DNA产物质量比为1∶2～1∶8，优选1∶4。
6、将步骤5菌液离心弃上清800μL后，剩余部分混匀，取50μL菌液涂布于含有50μg/mL卡那霉素和50μg/mL壮观霉素的LB琼脂培养基上，30℃培养12～24h，挑取转化子。
7、用鉴定引物P1和P8进行菌落PCR验证转化子，得到阳性菌提取基因组DNA用引物P1和P8进行PCR结果如图4。鉴定引物在靶标基因外侧，在插入株中因待插入基因替换原靶标基因导致其序列长度为4408bp(泳道1、2)，实验结果与预期相符，表明该方法能够成功获得大肠杆菌K4重组株。
所有经检测的转化子中靶标基因有2/5被待插入基因替换，因此采用本方法敲除大肠杆菌的阳性率可达40％。
综上所述，本发明建立了一种CRISPR/Cas9系统介导的快速、简单和高效的大肠杆菌基因定点插入方法，将传统与现代基因编辑技术相结合，为大肠杆菌K4基因编辑的研究提供了有效的工具。为发酵生产果糖软骨素奠定了科学理论以及实践基础。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种对大肠杆菌K4基因组进行定点插入的方法，包括如下步骤：
(1)将质粒pCas9转入大肠杆菌K4，获得大肠杆菌K4 pCas9；
(2)根据靶标基因设计1对反向互补的引物，所述引物中的一条含靶标基因20个核苷酸序列，以pTarget-F质粒为模板，PCR扩增，获得的PCR产物经过Dpn I消化、磷酸化、T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选获得含靶标基因20个核苷酸序列的pTarget-F质粒，即为辅助质粒pTarget-F；
(3)构建携带待插入基因和lacZ基因上下游同源序列的Donor DNA段；
(4)将步骤(2)获得的辅助质粒pTarget-F和步骤(3)获得的DNA片段通过电击转化的方法转入大肠杆菌K4 pCas9感受态细胞，获得插入靶标基因的重组大肠杆菌。
2.如权利要求1所述一种对大肠杆菌K4基因组进行定点插入的方法，其特征在于步骤(1)中大肠杆菌K4(ATCC23502)订购于Addgene。
3.如权利要求1所述一种对大肠杆菌K4基因组进行定点插入的方法，其特征在于步骤(2)靶标基因20个核苷酸序列设计方法为：使用www.rgenome.net/cas-designer网站进行设计。
4.如权利要求1所述一种对大肠杆菌K4基因组进行定点插入的方法，其特征在于步骤(3)待插入序列为gapA-glmM-GGGS-glmS。
5.如权利要求1所述一种对大肠杆菌K4基因组进行定点插入的方法，其特征在于靶标基因为LacZ基因，所述方法为：
(1)将质粒pCas9转入大肠杆菌K4，获得大肠杆菌K4 pCas9；
(2)根据靶标基因和插入基因设计2对反向互补的引物pTarget-F-LacZF和pTarget-F-LacZR，所述引物pTarget-F-LacZF含靶标基因20个核苷酸序列，以pTarget-F质粒为模板，PCR扩增，获得的PCR产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选获得含靶标基因20个核苷酸序列的辅助质粒pTarget-F-LacZ；
pTarget-F-LacZF：CATTTTTTGATGGACCATTTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTT；
pTarget-F-LacZR：ACTAGTATTATACCTAGGACTGAGC；
(3)以大肠杆菌K4基因组为模板，根据PgapA核苷酸序列设计引物P3和P4，PCR扩增PgapA的DNA片段；
P3：GCATCATATCCTTCCAGACCTTTAAAATTCGGGGCGC；
P4：CGCGCCCTCTTTCTAGTATATTCCACCAGCTATTTGTTAGTGAA：
(4)以pETM6R2为模板，根据glmS-GGGS-glmM核苷酸序列设计引物P5和P6，PCR扩增glmM-GGGS-glmS的DNA片段；
P5：TATACTAGAAAGAGGGCGCGGC；
P6：GTCATCGTGTTACTCAACCGTAACCGATTTTG；
(5)以大肠杆菌K4基因组为模板，根据靶基因lacZ的上下游同源臂设计引物P1、P2、P7和P8，PCR扩增同源臂1和同源臂2的DNA片段；
P1：GGATCCGCCAGACGCCACTGCTGCCA；
P2：TTCGATGGTGTCCGGGATCTCGTCAGTATCCCCGTTTACA；
P7：CGGTTGAGTAACACGATGACTACGCGGGTTCC；
P8：CAACTGCCGTTCGACGATATCGATTTTTCTGCTTTAGATCTTTCTTTTG；
(6)以步骤(3)、(4)和(5)步骤获得的DNA片段为模板，使用步骤(4)的引物P1和P8，PCR扩增获得DONOR DNA片段；
(7)将步骤(2)获得的辅助质粒pTarget-F和步骤(6)获得的DNA片段转化大肠杆菌K4pCas9感受态细胞。转化子通过菌落PCR(引物P1/P8)验证结果。
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