CN115976086B

CN115976086B - 一种细菌CRISPR-Cas9基因编辑的方法和应用

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Publication number: CN115976086B
Application number: CN202310057628.4A
Authority: CN
Inventors: 邱立友; 柴冉; 李亚楠; 高玉千; 张朝辉
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2023-01-19
Filing date: 2023-01-19
Publication date: 2023-08-08
Anticipated expiration: 2043-01-19
Also published as: CN115976086A

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及基因编辑，特别是指一种细菌CRISPR‑Cas9基因编辑的方法和应用。采用同时表达大肠杆菌单链DNA结合蛋白（Single‑stranded DNA‑binding protein，SSB）同源重组修复或非同源重组修复DSB，提高CRISPR/Cas编辑PGPR菌株假单胞菌UW4的基因编辑的效率，转化率为3.3×10⁶CFU/μg质粒DNA，基因编辑效率为100%。

Description

一种细菌CRISPR-Cas9基因编辑的方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及基因编辑，特别是指一种细菌CRISPR-Cas9基因编辑的方法和应用。

背景技术

植物促生根际细菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）在农业生产中的应用越来越广泛，能够减少化肥和农药的使用量，提高作物的可逆性和产量。通过基因工程技术提高PGPR在植物根际的趋化定殖竞争力和促生效果，是提高PGPR使用稳定性和使用效果的有效措施。目前PGPR基因工程改造还缺乏高效简便的方法。

自CRISPR-Cas基因编辑技术创立以来，在微生物、植物、动物和人类中得到了得到了快速广泛的应用，但在细菌中的应用则遇到障碍。将Cas和sgRNA表达质粒转入细菌，或者即使是同时转入同源重组修复序列、没有sgRNA或没有活性的Cas的情况下，转化结果出现很少或没有存活的菌落。原因是Cas的表达和活性对细胞产生毒害，Cas蛋白通过识别原间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif, PAM)与DNA结合影响细胞的生长和代谢，以及细菌中同源重组修复或非同源重组修复由Cas蛋白剪切产生的双链DNA损伤（double-strand break，DSB）序列很低，不能及时修复DSB。为了减少Cas蛋白的毒害，在细菌基因编辑操作中，人们常采用诱导型启动子短时间表达Cas和sgRNA，并同时表达DSB修复蛋白。常用的DSB修复蛋白有噬菌体λ-Red同源重组酶、噬菌体T4 DNA连接酶和分枝杆菌的非同源重组末端结合蛋白Ku和连接酶D等。专利CN 106929528 A公开了一种假单胞菌中新型重组系统及其应用，该专利发现SSB蛋白的表达可以提高含有RedGam的质粒的重组效率，但是却不能提高缺失RedGam的重组效果，且没有用于基因编辑；本课题组进一步研究SSB蛋白的功能，以探索一种可以高效促进CRISPR/Cas9基因编辑且不依赖RecA和RecBCD的新的重组系统及其编辑方法。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提出一种细菌CRISPR-Cas9基因编辑的方法和应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种细菌CRISPR-Cas9基因编辑的方法，步骤如下：

（1）将pCas质粒中的λ-Red同源重组酶基因替换为大肠杆菌的SSB基因，得pCas-SSB质粒；

（2）将pTargetF质粒中的N20序列替换为待编辑基因X的sgRNA识别的靶序列，得pTargetF-X；

（3）构建带有与基因组中待编辑基因X的上下游序列同源的Donor DNA；

（4）将pCas-SSB质粒和pTargetF-X和/或Donor DNA热激或电击转化感受态细胞，经过筛选、鉴定得到基因编辑的转化子，完成基因编辑。

上述步骤（1）中SSB基因选自大肠杆菌。

上述步骤（2）中待编辑基因X为大肠杆菌MG1655的lacZ基因、假单胞菌UW4的wp116基因。

上述Donor DNA的结构为上游同源臂和下游同源臂或者上游同源臂、下游同源臂和二者之间的四环素抗性基因表达盒。

上述上游同源臂与基因X的上游序列同源；下游同源臂与待编辑基因X的下游序列同源。

当待编辑基因X为大肠杆菌MG1655的lacZ基因时，Donor DNA包括上游同源臂和下游同源臂，其中上游同源臂是与lacZ基因上游序列同源的200 bp的片段，下游同源臂是lacZ基因下游序列同源的200 bp的片段。其中感受态细胞与pCas-SSB质粒、pTargetF-X和Donor DNA的体积比为100:1:1:1；pCas-SSB质粒的浓度为200ng/μL、pTargetF-X的浓度为200ng/μL、Donor DNA的浓度为500ng/μL。

当待编辑基因X为假单胞菌UW4的wp116基因时，Donor DNA包括上游同源臂、下游同源臂和二者之间的四环素抗性基因表达盒；其中上游同源臂是与wp116基因上游序列同源的140 bp的片段，下游同源臂是与wp116基因下游序列同源的140 bp的片段。其中感受态细胞与pCas-SSB质粒、pTargetF-X和Donor DNA的体积比为100:1:1:1；pCas-SSB质粒的浓度为100ng/μL、pTargetF-X的浓度为200ng/μL、Donor DNA的浓度为200ng/μL。

上述方法在SSB同源重组修复或非同源重组修复双链DNA断裂损伤，促进CRISPR/Cas9基因编辑且不依赖RecA和RecBCD中的应用。

本发明具有以下有益效果：

1、本专利我们采用同时表达大肠杆菌单链DNA结合蛋白（Single-stranded DNA-binding protein，SSB）同源重组修复或非同源重组修复DSB，提高CRISPR/Cas编辑PGPR菌株假单胞菌UW4的基因编辑的效率，转化率为3.3×10⁶CFU/μg质粒DNA，基因编辑效率为100%。

2、pCas-SSB+pTargetF-lacZ和pCas-T4L+pTargetF-lacZ转化大肠杆菌，转化率分别是1.3×10⁶CFU/μg质粒DNA和2.0×10⁶CFU/μg质粒DNA，pCas-SSB比pCas-T4L提高52.6%。pCas-T4L+ pTargetF-lacZ和pCas-SSB+ pTargetF-lacZ的基因编辑效率分别为64.8% 和86.3%，pCas-SSB比pCas-T4L提高33.2%。

3、pCas+pTargetF-lacZ+Donor DNA和pCas-SSB+pTargetF-lacZ+Donor DNA转化大肠杆菌，二者转化率没有差异，基因编辑效率分别为73.4%和89.1%，pCas-SSB+pTargetF-lacZ+Donor DNA同源重组基因编辑效率比pCas+pTargetF-lacZ+Donor DNA提高21.4%。

与pCas相比，pCas-SSB质粒的分子量更小，更易于转化；pCas只能进行同源重组基因编辑，而pCas-SSB不仅能够进行同源重组基因编辑，还能进行非同源重组基因编辑，且同源重组基因编辑效率高于pCas。与pCas-T4L相比，pCas-SSB质粒的分子量更小，更易于转化；pCas-T4L只能进行非同源重组基因编辑，而pCas-SSB不仅能够进行同源重组基因编辑，还能进行非同源重组基因编辑，且非同源重组基因编辑效率高于pCas-T4L。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为pCasΔRed质粒图谱。

图2为质粒pCas-SSB电泳检测结果；其中M，Super DNA Marker（CWBIO，CW2583）；1，SSB基因；2，PCR线性化pCas载体；3，pas-SSB质粒。

图3为pCas-SSB质粒图谱。

图4为pTargetF-lacZ质粒图谱。

图5为构建同源重组敲除大肠杆菌lacZ基因donor DNA PCR产物电泳结果；其中1，融合PCR得到的同源重组片段Donor DNA；2，3，为上下游同源臂的扩增产物；M，DNA Marker2000。

图6为pCas-SSB/pTargetF-lacZ与pCas/pTargetF-lacZ同源重组敲除大肠杆菌lacZ基因的比较；其中，A为CRISPR-Cas9双质粒系统示意图和转化大肠杆菌MG1655平板培养结果； B为CRISPR-Cas9双质粒系统转化大肠杆菌MG1655转化率结果；C为CRISPR-Cas9双质粒系统对大肠杆菌lacZ的基因编辑效率结果；D为随机挑选的10个转化子基因测序结果。

图7为质粒pCas-T4L电泳检测结果；其中M，Super DNA Marker（CWBIO，CW2583）；1，T4连接酶基因；2，pCas载体PCR线性化；3，构建的pCas-T4L质粒。

图8为pCas-T4L质粒图谱。

图9为pCas-SSB/pTargetF-lacZ与pCas-T4L/pTargetF-lacZ非同源重组敲除大肠杆菌lacZ基因的比较。

图10为同源重组敲除大肠杆菌recA、recBCD和SSB的片段。

图11为菌落PCR验证敲除recA、recBCD和SSB基因的突变株大肠杆菌MG1655-2电泳结果；其中M，DNA Marker 2000；1，出发菌株大肠杆菌MG1655SSB基因PCR扩增结果；2，大肠杆菌MG1655-2SSB基因PCR扩增结果；3，出发菌株大肠杆菌MG1655recA基因PCR扩增结果；4，大肠杆菌MG1655-2recA基因PCR扩增结果；5，出发菌株大肠杆菌MG1655recBCD基因PCR扩增结果；4，大肠杆菌MG1655-2recBCD基因PCR扩增结果。

图12为pCas-SSB/pTargetF-lacZ同源重组和非同源重组敲除大肠杆菌(ΔrecA,ΔrecBCD, ΔSSB)菌株lacZ基因；其中，A为CRISPR-Cas9双质粒系统示意图和转化大肠杆菌MG1655(ΔrecA, ΔrecBCD, ΔSSB)平板培养结果；B为CRISPR-Cas9双质粒系统转化大肠杆菌MG1655(ΔrecA, ΔrecBCD, ΔSSB)转化率结果； C为CRISPR-Cas9双质粒系统对大肠杆菌(ΔrecA, ΔrecBCD, ΔSSB)lacZ的基因编辑效率结果；D为随机挑选的10个非同源重组转化子基因测序结果。

图13为pTargetF-wp116质粒图谱。

图14为重叠PCR构建Donor DNA产物电泳结果；其中1，上游同源臂；2，下游同源臂；3，四环素抗性基因表达盒；4，Donor DNA；M，DNA Marker 2000。

图15为假单胞菌UW4基因编辑转化子菌落PCR验证20个随机挑取的单菌落电泳分析结果；其中1，野生株UW4；2-21，随机挑取的20个单菌落；M，DNA Marker 2000。

图16为假单胞菌UW4基因编辑转化子基因序列测序验证结果；UA，上游同源臂；tet，四环素抗性基因表达盒；DA，下游同源臂。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：pCas-SSB/pTargetF-lacZ与pCas/pTargetF-lacZ同源重组敲除大肠杆菌lacZ基因转化率和基因编辑效率的比较

1.1 菌株与质粒

大肠杆菌DH5α 用于质粒的构建和保存。大肠杆菌MG1655用于基因编辑。细菌培养用培养基是LB培养基，配方是1% [w/v]蛋白胨, 0.5% [w/v]酵母膏, 1% [w/v] NaCl)。大肠杆菌培养温度为 37 °C。

质粒pCas、pTargetF、pBR322和PUC57，购自上海海吉浩格生物科技有限公司。

1.2 pCasΔRed质粒的构建

（1）PCR制备缺失λRed重组酶的pCas线性片段

模板是质粒pCas，引物是

pCasΔRed-F: CGCATCCTCACGATAATATCCGGGTAGGCGCAATCACTTT

pCasΔRed-R：GATATTATCGTGAGGATGCGTTTTTATAACCTCCTTAGAG

PCR反应体系和反应程序见表1。

表1 PCR反应体系与程序

（2）线性片段同源重组自身环化

采用ClonExpress® II One Step Cloning Kit进行。

反应体系：

缺失λRed重组酶的pCas的 PCR产物 300ng/ul 2μL

5 × CE II Buffer 4μL

Exnase II 2μL

去离子水补足20μL

反应条件：

37℃保持30min，转入冰上5min。

（3）质粒pCasΔRed的构建

将上述线性片段同源重组产物转化大肠杆菌DH5α，挑取在含有卡那霉素（25μg/ml）的LB平板上长出的单菌落，摇管培养后提取质粒，测序验证正确即是构建的质粒pCasΔRed（图1）。

1.3 pCas-SSB质粒的构建

将pCas质粒中的λ-Red同源重组酶基因替换为大肠杆菌的SSB即可得到pCas-SSB质粒。

（1）PCR制备SSB同源重组片段

模板是大肠杆菌的基因组DNA，引物是：

SSB1-F：

5’-TCGAGCTCTAAGGAGGTTATAAAAAATGGCCAGCAGAGGCGTAAACAAGGT-3’；

SSB1-R：

5’-ACCCGGATATTATCGTGAGGATGCGTCAGAACGGAATGTCATCATCAAAGT-3’。

下划线区域是SSB基因区域，无下划线的是pCas质粒上的同源区域。

PCR反应体系和反应程序见表1。

（2）pCas质粒PCR扩增线性化

模板为pCas质粒，引物是：

pCas-F: CGCATCCTCACGATAATATCCGGGT

pCas-R: TTTTTATAACCTCCTCCTTAGAGCTCG

PCR反应体系和测序同表1。

（3）同源重组构建pCas-SSB质粒

采用ClonExpress® II One Step Cloning Kit（Vazyme，南京）进行同源重组连接。反应体系和反应程序见表2。

表2 同源重组连接反应体系和程序

得到的同源重组产物转化大肠杆菌DH5α，挑取在含有卡那霉素（25μg/ml）的LB平板上长出的单菌落，摇管培养后提取质粒，经电泳检测（图2）和测序验证正确即是构建的质粒pCas-SSB（图3）。

1.4 pTargetF-lacZ质粒的构建

采用点突变试剂盒Fast Mutagenesis System kit (TransGen Biotech, 北京)构建pTargetF-lacZ质粒。

（1）PCR扩增

模板是pTargetF质粒，引物是

sgRNA-LacZ-F：

CAATCCGCCGTTTGTTCCCACGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAA

sgRNA-LacZ-R：

TGGGAACAAACGGCGGATTGACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTG

引物中下划线序列是lacZ基因中N20序列。

PCR反应体系和程序同表1。

（2）消化未突变质粒模板

反应体系和程序见表3。

表3 消化未突变质粒模板反应体系和程序

（3）消化产物转化

消化产物转化大肠杆菌DH5α，挑取在含有大观霉素（25μg/ml）的LB平板上长出的单菌落，摇管培养后提取质粒，测序验证正确即是构建的质粒pTargetF-lacZ（图4）。

1.5 Donor DNA构建

Donor DNA由2部分组成，上游同源臂是与大肠杆菌基因组中lacZ基因上游序列同源的200 bp的片段，下游同源臂是lacZ基因下游序列同源的200 bp的片段。

（1）上游同源臂的PCR扩增

模板是大肠杆菌MG1655的基因组DNA，引物是：

lacZ-UP-F：CGGTAGTGGGATACG

lacZ-UP-R：CCTGCCCGGTTATTAAGCTGTTTCCTGTGTPCR

反应体系和程序同表1。

（2）下游同源臂的PCR扩增

模板是大肠杆菌MG1655的基因组DNA，引物是：

lacZ-DOWN-F：ACACAGGAAACAGCTTAATAACCGGGCAGG

lacZ-DOWN-R：AAAAGCCTAGATAAA

PCR反应体系和程序同表1。

（3）重叠PCR构建Donor DNA

重叠PCR反应体系：

上游同源臂的PCR1 1μL

下游同源臂的PCR2 1μL

2×pfu Mix 12.5μL

ddH₂O 10.5μL

反应程序：

第一步：

第二步:

在上述反应结束后直接再加入引物lacZ-UP-F和lacZ-DOWN-R各0.5μL，继续进行如下反应：

PCR产物电泳结果见图5。

1.6 CRISPR-Cas介导的大肠杆菌MG1655的lacZ基因的同源重组敲除

（1）转化大肠杆菌MG1655

1) 取大肠杆菌MG1655感受态细胞100 μL，解冻后分别加入质粒各1μL（pCas，pCasΔRed，pCas-SSB三者浓度调至200ng/μL，pTargetF-lacZ浓度200ng/μL），donor DNA（500ng/μL）1μL;

2) 将混合液轻轻摇匀，冰上放置20min，于42℃水浴中保温90s，然后迅速冷却2min；

3) 立即向上述试管中分别加入0.9 ml LB液体培养基（加有阿拉伯糖10 mM），摇匀后于30℃复苏震荡培养2h；

4) 取50μL复苏液稀释10倍后均匀涂布于LB抗性平板上（卡那霉素25μg/ml，大观霉素50μg/ml）30℃培养，计算转化率。

5) 同时将稀释后的复苏液均匀涂布于LB抗性平板上，含1mM IPTG， X-gal 40μg/ml，卡那霉素25μg/ml，大观霉素50μg/ml，30℃培养。平板中长出的蓝色菌落为lacZ基因未发生突变的菌落，白色菌落为lacZ基因发生突变的菌落。平板中白色菌落数占总菌落数的百分比即是基因编辑率。转化pCasΔRed+ pTargetF-lacZ+ donor DNA的平板中，没有长出菌落（图6A）。转化pCas+ pTargetF-lacZ+ donor DNA的平板和转化pCas-SSB+ pTargetF-lacZ+ donor DNA的平板中长出有蓝色菌落和白色菌落（图6A），转化率分别是2.02×10⁶CFU/μg plasmid DNA，二者没有差异（图6B），基因编辑效率分别是73.4%和89.1%，pCas-SSB比pCas提高21.4%（图6C）。

（2）转化子验证

从转化pCas + pTargetF-lacZ + donor DNA的平板和转化pCas-SSB+ pTargetF-lacZ + donor DNA的平板中，随机挑取10个白色菌落，进行菌落PCR，PCR产物送华大基因测序。菌落PCR使用的引物是

lacZ-F：CGGTAGTGGGATACGACGAT

lacZ-R：CGGTTGGAATAATAGCGAGA

反应体系是：

蘸取菌落在10μL ddH₂O搅拌，取1μL

2×pfu Mix 12.5μL

lacZ-F 0.5μL

lacZ-R 0.5μL

ddH₂O 10.5μL

反应程序：

将PCR产物测序，发现所有随机挑选的20个白色菌落中，均发生了正确的同源重组敲除lacZ基因（图6D）。

实施例2：pCas-T4L/pTargetF-lacZ与pCas/pTargetF-lacZ非同源重组敲除大肠杆菌lacZ基因转化率和基因编辑效率的比较

2.1 pCas-T4L质粒的构建

（1）噬菌体T4连接酶基因（简写为T4L）片段的合成

根据GenBank登录号1258680序列，委托华大基因合成。

（2）PCR扩增同源重组片段

扩增带同源臂的T4L片段，模板是合成的T4L片段，引物是：

SSB1T4L-F：

5’-TCGAGCTCTAAGGAGGTTATAAAAAATGATTCTTAAAATTCTGAACGAAAT-3’；

SSB1-R：

5’-ACCCGGATATTATCGTGAGGATGCGTCATAGACCAGTTACCTCATGAAAAT-3’；

下划线区域是T4L基因区域，无下划线区域是pCas质粒上的同源区域。

扩增pCas质粒，使其线性化，模板是pCas质粒，引物是：

pCas-F: CGCATCCTCACGATAATATCCGGGT

pCas-R: TTTTTATAACCTCCTCCTTAGAGCTCG

PCR反应体系和反应程序同表1。

（3）同源重组构建pCas-T4L质粒

采用ClonExpress® II OneStep Cloning Kit（Vazyme，南京）进行同源重组连接。反应体系和反应程序同表2。

得到的同源重组产物转化大肠杆菌DH5α，挑取在含有卡那霉素（25μg/ml）的LB平板上长出的单菌落，摇管培养后提取质粒，经电泳检测（图7）和测序验证正确即是构建的质粒pCas-SSB（图8）。

2.2 CRISPR-Cas介导的大肠杆菌MG1655的lacZ基因的非同源重组敲除

（1）转化大肠杆菌MG1655

1) 取大肠杆菌MG1655感受态细胞100 μL，解冻后分别加入质粒各1μL（pCas-T4L，pCasΔRed，pCas-SSB三者浓度调至200ng/μL，pTargetF-lacZ浓度200ng/μL）。

5) 同时将稀释后的复苏液均匀涂布于LB抗性平板上，含1mM IPTG， X-gal 40μg/ml，卡那霉素25μg/ml，大观霉素50μg/ml，30℃培养。转化pCasΔRed+ pTargetF-lacZ的平板中，没有长出菌落（图9A）。转化pCas-T4L+ pTargetF-lacZ的平板和转化pCas-SSB+pTargetF-lacZ的平板中长出有蓝色菌落和白色菌落（图9A），转化率分别是1.3x10⁶CFU/μg质粒DNA和2.0x10⁶CFU/μg质粒DNA，pCas-SSB比pCas-T4L提高52.6%（图9B）。转化pCas-T4L+pTargetF-lacZ和转化pCas-SSB+ pTargetF-lacZ的基因编辑效率分别为64.8% 和 86.3%，pCas-SSB比pCas-T4L提高33.2%（图9C）。

（2）转化子验证

从转化pCas-T4L + pTargetF-lacZ的平板和转化pCas-SSB + pTargetF-lacZ的平板中，随机挑取10个白色菌落，进行菌落PCR，PCR产物送华大基因测序。菌落PCR使用的引物是

lacZ-F：CGGTAGTGGGATACGACGAT

lacZ-R：CGGTTGGAATAATAGCGAGA

反应体系是：

反应程序：

将PCR产物测序，发现所有随机挑选的20个白色菌落中，均发生了非同源重组敲除lacZ基因。转化pCas-T4L/pTargetF-lacZ得到的突变转化子基因敲除发生在Cas9的PAM序列CGG上游的1-3个碱基，敲除片段的长度在32-252 bp，平均值为104 bp。其中有5个样品的敲除连接处有1或2个微同源区（标红色的碱基）（图9D）。转化pCas-SSB/pTargetF-lacZ得到的突变转化子基因敲除也是发生在Cas9的PAM序列CGG上游的1-3个碱基，敲除片段的长度在45-214 bp，平均值为121 bp。其中有6个样品的敲除连接处有1-3个微同源区（标红色的碱基）（图9E）。

实施例3：SSB同源重组和非同源重组修复双链DNA促进CRISPR/Cas9基因编辑不依赖RecA和RecBCD

3.1 大肠杆菌MG1655-2 (ΔrecA, ΔrecBCD, ΔSSB)菌株的构建

（1）同源重组片段的合成

同源重组片段的图谱见图10。序列如SEQ ID No.1所示。

（2）同源重组敲除大肠杆菌recA、recBCD和SSB的质粒PUC57-TH的构建

将上述构建的同源重组片段与质粒PUC57，都进行EcoRI和BamHI双酶切后再进行酶连，然后转化大肠杆菌DH5α，挑取在含有氨苄青霉素（100μg/ml）的LB平板上长出的单菌落，摇管培养后提取质粒，经电泳检测和测序验证正确即是构建的质粒。

（3）质粒PUC57-TH转化大肠杆菌MG1655

将质粒PUC57-TH转化大肠杆菌MG1655，挑取在含有氨苄青霉素（100μg/ml）的LB平板上长出的单菌落，进行菌落PCR检测敲除recA、recBCD和SSB基因的突变株。使用的引物有：

用于扩增recA基因

RecA-F：GCGGTGAAGGCATTA

RecA-R：CGATAAACGCACAGGT

用于扩增recBCD基因

RecBCD-F：CCATCGCATTGCTGA

RecBCD-R：CGGAAATCACCGAGAT

用于扩增SSB基因

SSB-F：CAGGTTTGTTTCCCG

SSB-R：GCCGCTGAACTGATT

PCR反应体系和反应程序同1.6（2）。

经菌落PCR验证，得到敲除recA、recBCD和SSB基因的突变株大肠杆菌MG1655-2（图11）。

3.2 CRISPR-Cas介导的大肠杆菌MG1655-2的lacZ基因的同源重组和非同源重组敲除

（1）转化大肠杆菌MG1655-2

1) 取大肠杆菌MG1655-2感受态细胞100 μL，解冻后分别加入质粒各1μL（pCasΔRed，pCas-SSB三者浓度调至200ng/μL，pTargetF-lacZ浓度200ng/μL），donor DNA（500ng/μL）1μL;

5) 同时将稀释后的复苏液均匀涂布于LB抗性平板上，含1mM IPTG， X-gal 40μg/ml，卡那霉素25μg/ml，大观霉素50μg/ml，30℃培养。转化pCasΔRed+ pTargetF-lacZ+donor DNA的平板中，没有长出菌落（图12A）。转化pCas-SSB+ pTargetF-lacZ+ donor DNA的平板和转化pCas-SSB+ pTargetF-lacZ的平板中长出有蓝色菌落和白色菌落（图12A），转化率分别是1.98×10⁶CFU/μg质粒DNA和2.01×10⁶CFU/μg质粒DNA，二者没有差异（图12B），基因编辑效率分别是87.5%和86.0%，二者也没有差异（图12C）。

（2）转化子验证

从转化pCas-SSB+ pTargetF-lacZ+ donor DNA的平板和转化pCas-SSB+pTargetF-lacZ的平板中各随机挑取10个白色菌落，进行菌落PCR，PCR产物送华大基因测序。菌落PCR使用的引物、反应体系和反应程序，同2.2（2）。

PCR产物测序发现，从转化pCas-SSB+ pTargetF-lacZ+ donor DNA的平板中随机挑取的10个白色菌落，均发生了正确的同源重组敲除lacZ基因，测序结果同图6D。从转化pCas-SSB+ pTargetF-lacZ的平板中随机挑取的10个白色菌落，测序发现均发生了非同源重组敲除lacZ基因。转化子基因敲除发生在Cas9的PAM序列CGG上游的1-3个碱基，敲除片段的长度在47-186 bp，平均值为109 bp。其中有4个样品的敲除连接处有1个微同源区（标红色的碱基）（图12D）。

实施例4：利用pCas-SSB/pTargetF-wp116同源重组敲除假单胞菌UW4wp116基因

假单胞菌UW4（Pseudomonassp. UW4）：一种美国农业研究菌种保藏中心保藏编号为NRRL B-50193（保藏日为2008年6月9日）的、可公开获得的常用菌株（美国农业研究菌种保藏中心，英文全称AgrieultutalResearch Service Culture Colleetion，简称NRRL，该中心位于伊利诺伊州皮契里亚，为一个由美国农业部农业研究中心支持的政府性质的菌种保藏中心）。该菌基因组中（基因组序列GenBank登录号：CP003880）。

wp116基因是假单胞菌UW4的一个趋化受体基因，GenBank登录号是WP_015093116。

4.1 pTargetF-wp116质粒构建

采用点突变试剂盒Fast Mutagenesis System kit (TransGen Biotech, 北京)构建pTargetF-wp116质粒。

（1）PCR扩增

模板是pTargetF质粒，引物是

sgRNA-wp116-F：

CCGCGGCCTGATCGAACAACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAA

sgRNA-wp116-R：

GTTGTTCGATCAGGCCGCGGACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCTG

引物中下划线序列是wp116基因中N20序列。

PCR反应体系和程序同表1。

（2）消化未突变质粒模板

反应体系和程序见表3。

（3）转化DH5α感受态细胞

消化产物转化大肠杆菌DH5α，挑取在含有大观霉素（25μg/ml）的LB平板上长出的单菌落，摇管培养后提取质粒，测序验证正确即是构建的质粒pTargetF-wp116（图13）。

4.2 Donor DNA构建

Donor DNA由3部分组成，上游同源臂是与假单胞菌UW4基因组中 wp116基因上游序列同源的140 bp的片段，下游同源臂是与假单胞菌UW4基因组中 wp116基因下游序列同源的140 bp的片段，上游同源臂和下游同源臂之间是四环素抗性基因表达盒。

（1）上游同源臂的PCR扩增

模板是UW4的基因组DNA，引物是：

116UP-F：AGCTATTCGCCCATACATCG

116UP-R：CCTGCCCGGTTATTAAGCTGTTTCCTGTGT

PCR反应体系和程序同表1。

（2）下游同源臂的PCR扩增

模板是UW4的基因组DNA，引物是：

116DOWN-F：CGCATCTCGATATAGATACGGCAGATCATCATTCCG

116DOWN-R： CTTGGGTCATGCTCTGCATGG

PCR反应体系和程序同表1。

（3）四环素抗性基因表达盒的PCR扩增

模板是pBR322质粒，引物是：

Tet-F：GGAAACGTCAGCGTCAAAAATTCTCATGTTTGACAG

Tet-R：CGGAATGATGATCTGCCGTATCTATATCGAGATGCG

PCR反应体系和程序同表1。

（4）重叠PCR构建Donor DNA

反应体系见表4。

表4 PCR反应体系与程序

反应程序：

第一步：

第二步:

在上述反应结束后直接再加入引物116UP-F和116DOWN-R各0.5μL，继续进行如下反应：

PCR产物电泳后切胶纯化得到Donor DNA。PCR产物电泳结果见图14。

4.3 CRISPR-Cas编辑假单胞菌UW4的wp116基因

（1）假单胞菌UW4感受态细胞制备

挑取预先活化的假单胞菌UW4单菌落于含有4ml LB液体培养基的试管中，30℃，220r/min摇床培养过夜。1%的接种量将试管中菌液转入100mlLB液体三角瓶培养基中，30℃，220r/min摇床培养。培养到菌液OD600达到0.5-0.6时，将菌液倒入预冷的50ml离心管中，进行冰浴10min，使培养物充分进行预冷。4℃，5000r/min离心8分钟收集菌体。弃去上清液，用40ml预冷的ETM电转缓冲液洗涤菌体，4℃，5000r/min离心8min去掉上清，重复洗涤三次。将洗涤后的菌体重悬于适量的ETM中，分装100μL/管备用。

（2）电击转化

将100μL感受态细胞与质粒DNA（1μL pCas-SSB，100ng/μL；1μL pTargetF-wp116，200ng/μL；Donor DNA 200ng)混匀，加入预冷的2 mm电击杯中（电击杯置于冰上），加入时避免产生气泡。擦干电击杯表面的水，将其正确放入电转化仪的样品槽中，电压1.8kV、电阻200Ω、电容25μF。电击后立即加入0.9 ml LB液体培养基（加阿拉伯糖，10mM）。将电击杯中的混合培养液转移至灭菌10ml试管中，30℃，220r/min摇床复苏2h。取100μL复苏液均匀涂布于LB抗性平板上（四环素浓度：15μg/ml，卡那霉素25μg/ml，大观霉素50μg/ml）。静置后，倒置平板，30℃过夜培养观察结果。

（3）转化子验证

随机挑取20个单菌落，进行菌落PCR，PCR产物送华大基因测序。菌落PCR使用的引物是

UAF：AGCTATTCGCCCAT

DAR：CTTGGGTCATGCTCT

菌落PCR反应体系和反应程序见表5。

表5 PCR反应体系与程序

挑取的20个单菌落经PCR验证和PCR产物测序验证，均为发生同源重组敲除了wp116的转化子。菌落PCR产物的电泳分析结果见图15，PCR产物测序结果见图16。

（4）转化率和基因编辑效率

计算转化平板中的菌落数，计算得到转化率为3.3×10⁶CFU/μg质粒DNA。随机挑取的20个单菌落经菌落PCR和测序验证，均为正确同源重组敲除wp116的转化子，因此，基因编辑效率为100%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种不依赖RecA和RecBCD的基于CRISPR-Cas9的细菌基因编辑方法，其特征在于，步骤如下：

（3）构建带有与待编辑基因X的上下游序列同源的同源臂的Donor DNA；

（4）将pCas-SSB质粒和pTargetF-X热激或电击转化感受态细胞，经过筛选、鉴定得到基因编辑的转化子，完成基因编辑，所述感受态细胞选自大肠杆菌；或

将pCas-SSB质粒、pTargetF-X和Donor DNA热激或电击转化感受态细胞，经过筛选、鉴定得到基因编辑的转化子，完成基因编辑，所述感受态细胞选自大肠杆菌或假单胞菌；

所述步骤（1）中pCas-SSB质粒的制备方法为：

（1.1）PCR制备SSB同源重组片段

模板是大肠杆菌的基因组DNA，引物是：

SSB1-F：

5’-TCGAGCTCTAAGGAGGTTATAAAAAATGGCCAGCAGAGGCGTAAACAAGGT-3’；

SSB1-R：

5’-ACCCGGATATTATCGTGAGGATGCGTCAGAACGGAATGTCATCATCAAAGT-3’

（1.2）PCR扩增线性化pCas载体，

模板为pCas质粒，引物是：

pCas-F: CGCATCCTCACGATAATATCCGGGT

pCas-R: TTTTTATAACCTCCTCCTTAGAGCTCG，

将线性化载体pCas与PCR制备得到的SSB同源重组片段进行同源重组连接，即得pCas-SSB。

2.根据权利要求1的方法，其特征在于：所述步骤（2）中待编辑基因X为大肠杆菌MG1655的lacZ基因或假单胞菌UW4的wp116基因。

3.根据权利要求1-2任一项所述的方法，其特征在于：所述Donor DNA包含上游同源臂和下游同源臂，或包含上游同源臂、下游同源臂和二者之间的四环素抗性基因表达盒。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述上游同源臂与待编辑基因X的上游序列同源；下游同源臂与待编辑基因X的下游序列同源。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：大肠杆菌MG1655的lacZ基因的Donor DNA包括上游同源臂和下游同源臂，其中上游同源臂是与基因组中lacZ基因上游序列同源的200 bp的片段，下游同源臂是与基因组中lacZ基因下游序列同源的200 bp的片段。

6.根据权利要求4所述的的方法，其特征在于：假单胞菌UW4的wp116基因的Donor DNA包括上游同源臂、下游同源臂和二者之间的四环素抗性基因表达盒；其中上游同源臂是与基因组中wp116基因上游序列同源的140 bp的片段，下游同源臂是与基因组中wp116基因下游序列同源的140 bp的片段。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（4）中感受态细胞与pCas-SSB质粒、pTargetF-X和Donor DNA的体积比为100:1:1:1；pCas-SSB质粒的浓度为200ng/μL、pTargetF-X的浓度为200ng/μL、以及Donor DNA的浓度为500ng/μL。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（4）感受态细胞与pCas-SSB质粒、pTargetF-X和DonorDNA的体积比为100:1:1:1；pCas-SSB质粒的浓度为100ng/μL、pTargetF-X的浓度为200ng/μL、以及DonorDNA的浓度为200ng/μL。