CN111635914A - 嗜水气单胞菌气溶素基因的敲除质粒及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明适用于基因工程技术领域，提供了嗜水气单胞菌气溶素基因的敲除质粒及其构建方法，其中，所述嗜水气单胞菌气溶素基因的敲除质粒为在带有CRISPR/Cas9系统的质粒中插入有嗜水气单胞菌气溶素基因敲除序列同源但缺失部分碱基序列的同源臂以及sgRNA。本发明通过在带有CRISPR/Cas9系统的质粒的基础上，在特定的位点装入aerA基因敲除序列同源但缺失部分碱基序列的同源臂（XbaⅠ位点插入）和sgRNA，作为同源重组修复模板和靶向序列，达到定点敲除基因的目标，一方面，实现了具有对目标生物基因组的定点编辑功能的CRISPR/Cas9系统的方法；另一方面，所得到的嗜水气单胞菌气溶素基因的敲除质粒，可应用于靶向敲除嗜水气单胞菌气溶素基因，为制备嗜水气单胞菌新型弱毒疫苗奠定基础。

Description

嗜水气单胞菌气溶素基因的敲除质粒及其构建方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种嗜水气单胞菌气溶素基因的敲除质粒及其构建方法。
背景技术
嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)隶属于气单胞菌科气单胞菌属，是一种食源性致病菌，同时也是人-兽-水生动物共患病病原菌。作为一种普遍存在的条件致病菌，嗜水气单胞菌可分泌气溶素、溶血素等外毒素，感染多种水生动物导致急性出血性败血症等，使水产养殖损失巨大，严重影响该行业的发展。近年来，有研究表明，嗜水气单胞菌产生的毒力因子与细菌的致病力密切相关。气溶素是嗜水气单胞菌极其重要的毒力因子之一，由aerA基因表达翻译，具有种属特异性，可作为致病性菌株的标志。气溶素具有很强的细胞毒性、溶血性和肠毒性，低浓度下即可裂解细胞。气溶素前体蛋白经切割C末端肽段之后可形成成熟的气溶素蛋白，它与真核细胞膜表面特异性受体结合，聚合后插入到靶细胞膜中，形成众多细胞膜通道，使胞内渗透压上升，引起细胞裂解。
近年来，在大部分古细菌和细菌中发现了CRISPR，实际上是一种基因编辑器，是细菌用来对抗病毒DNA的免疫系统。CRISPR协同Cas蛋白发挥免疫抑制作用，能抵御噬菌体及质粒等外源遗传物质的入侵。在此之前，最为常用的基因编辑工具酶为锌指核酸酶(ZFN)及转录激活样效应核酸酶(TALEN)。ZFN脱靶效应较高，TALEN也有其局限性，主要表现在蛋白较大，递送比较困难；这两种技术在构建质粒时难度较大，后期操作技术要求高，因此在普通实验室难以实现。传统的基因工程技术多利用同源重组的方法，然而其敲除率低，费时费力。与传统同源交换技术相比，CRISPR/Cas系统的敲除效率高，操作方便快捷，因此在细菌基因组的编辑中大受欢迎。至今为止，尚未见利用CRISPR的cas9基因构建靶向嗜水气单胞菌气溶素基因的敲除质粒的报道。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种嗜水气单胞菌气溶素基因的敲除质粒。
本发明实施例是这样实现的，一种嗜水气单胞菌气溶素基因的敲除质粒，所述敲除质粒为在带有CRISPR/Cas9系统的质粒中插入有嗜水气单胞菌气溶素基因敲除序列同源但缺失部分碱基序列的同源臂以及sgRNA。
本发明实施例的另一目的在于一种嗜水气单胞菌气溶素基因的敲除质粒的构建方法，所述构建方法包括：
根据嗜水气单胞菌气溶素基因，设计sgRNA；
将所述sgRNA与带有CRISPR/Cas9系统的质粒连接，得靶向重组质粒；
以嗜水气单胞菌气溶素基因敲除序列同源但缺失部分碱基序列的同源臂为模板进行Overlap PCR扩增，得同源重组修复模板；
将所述靶向重组质粒与所述同源重组修复模板连接，即得。
本发明实施例提供的嗜水气单胞菌气溶素基因的敲除质粒，是在带有CRISPR/Cas9系统的质粒的基础上，在特定的位点装入aerA基因敲除序列同源但缺失部分碱基序列的同源臂(XbaⅠ位点插入)和sgRNA，作为同源重组修复模板和靶向序列，达到定点敲除基因的目标，一方面，实现了具有对目标生物基因组的定点编辑功能的CRISPR/Cas9系统的方法；另一方面，所得到的嗜水气单胞菌气溶素基因的敲除质粒，可应用于靶向敲除嗜水气单胞菌气溶素基因，为制备嗜水气单胞菌新型弱毒疫苗奠定基础。
附图说明
图1是本发明实施例提供的嗜水气单胞菌气溶素基因的敲除质粒psg-Donor-BPK764构建流程图；
图2是本发明实施例提供的靶向重组质粒psg-BPK764的扩增结果示意图；
图3是本发明实施例提供的sgRNA的测序鉴定结果示意图；
图4是本发明实施例提供的aerA上同源臂和aerA下同源臂的扩增结果示意图；
图5是本发明实施例提供的aerA-Donor DNA的扩增结果示意图；
图6是本发明实施例提供的重组质粒psg-Donor-BPK764的单酶切示意图；
图7是本发明实施例提供的重组质粒psg-Donor-BPK764中Donor DNA的扩增结果示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在目前已报道的研究中，主要是利用自杀质粒同源重组的传统敲除方法来构建嗜水气单胞菌基因缺失株。而基于基因编辑CRISPR/Cas9技术构建嗜水气单胞菌气溶素基因敲除质粒的办法，目前仍需进一步进行相关研究。本发明利用Cas9基因构建靶向嗜水气单胞菌气溶素基因的敲除质粒，以期用于靶向敲除嗜水气单胞菌气溶素基因，为制备嗜水气单胞菌新型弱毒疫苗奠定基础，该嗜水气单胞菌气溶素基因的敲除质粒是在带有CRISPR/Cas9系统的质粒的基础上，在特定的位点装入aerA基因敲除序列同源但缺失部分碱基序列的同源臂(XbaⅠ位点插入)和sgRNA，作为同源重组修复模板和靶向序列，达到定点敲除基因的目标，实现了具有对目标生物基因组的定点编辑功能的CRISPR/Cas9系统的方法。另外，该敲除质粒针对嗜水气单胞菌气溶素毒力基因aerA进行靶向敲除，破坏气溶素基因结构和功能，达到降低毒力的目的，可进一步用于制备嗜水气单胞菌新型弱毒疫苗的研制，且为其提供思路和方法。
在本发明实施例中，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO:1：GTTCAAGTGGCCACTGGTAG
在本发明实施例中，所述同源臂的序列如SEQ ID NO:2所示。
SEQ ID NO:2：
GTCTGGATCGCATATTGAAGCCAATGTGACTGATATTGTCGTACTCACATGTCACCTGCTGATATATAAGCGCTGGTGAATGTATGTCAATGTTCAATATATTGGGGTTGCTATGCAAAAACTAAAAATAACTGGCTTGTCATTGATCATATCCGGCCTGCTGATGGCACAGGCTCACGCGGCAGAGCCCGTCTATCCAGACCAGCTGCGCCTGTTCTCACTGGGCCAGGAGGTCTGTGGCGACAAGTATCGTCCTATTACTAGAGAAGAAGCCCAGAGCGTTAAAAGCAATATTGTCAATATGATGGGGCAGTGGCAAATAAGCGGCCTGGCCAATGGCTGGGTAATAATGGGGCCGGGTTATAACGGTGAAATAAAACCAGGGACAGCGTCCAATACCTGGTGTTATCCGACCAATCCTGTTACCGGTGAAATACCAACGCTGTCTGCCCTGGATATTCCAGATGGTGACGAAGTCGATGTGCAGTGGCGACTGGTACACGACAGTGCGAATTTCATCAAGCCAACCAGCTATCTGGCGCATTATCTCGGTTATGCCTGGGTGGGTGGCAATCACAGCCAATATGTCGGTGAAGACATGGACGTGACCCGTGATGGCGATGGCTGGGTGATCCGTGGCAACAATGACGGCGGTTGCGAGGGGTATCGTTGTGGCGAGAAGACGGTATGACCTGACGCTGAGTGGCTTCCTGCGCTGGGGCGGCAATGCCTGGTATACCCATCCGGACAACCGCCCGAACTGGAACCACACCTTCGTCATCGGGCCGTACAAGGACAAGGCGAGCAGCATTCGTTACCAGTGGGACAAGCGTTACATCCCGGGTGAAGTGAAGTGGTGGGACTGGAACTGGACCATCCAGCAGAACGGCCTGTCTACCATGCAGAACAACCTGGCCAGAGTGCTACGCCCGGTGCGGGCGGGGATCACCGGCGATTTCAGTGCCGAGAGCCAGTTTGCCGGCAACATCGAGATCGGTGCTCCGGTGCCGCTCGCGGCAGACAGCAAGGTGCGTCGTACCCGCAGCGTGGATGGCGCTGGGCAGGGTCTGAGGCTGGAGATTCCGCTCGATGCGCAAGAGCTCTCCGGGCTTGGCTTCAGCAACGTCAGCCTGAGTGTGACGCCAGCTGCCAATCAATAACGACTGCG
本发明实施例还提供了所述嗜水气单胞菌气溶素基因的敲除质粒的构建方法，所述构建方法包括：
根据嗜水气单胞菌气溶素基因，设计sgRNA；
将所述sgRNA与带有CRISPR/Cas9系统的质粒连接，得靶向重组质粒；
以嗜水气单胞菌气溶素基因敲除序列同源但缺失部分碱基序列的上、下同源臂为模板进行Overlap PCR扩增，得到同源重组修复模板；
将所述靶向重组质粒与所述同源重组修复模板连接，即得敲除质粒。
在本发明一个优选的实施例中，所述根据嗜水气单胞菌气溶素基因，设计sgRNA的步骤，包括：
根据嗜水气单胞菌气溶素基因以及sgRNA设计规则，设计引物sgRNA-F/R，所述sgRNA-F的序列如SEQ ID NO:3所示，所述sgRNA-R的序列如SEQ ID NO:4所示；
将所述sgRNA-F/R进行稀释处理，退火连接sgRNA。即根据所述sgRNA-F/R，合成sgRNA，退火连接sgRNA获得的产物序列如SEQ ID NO:1所示。
SEQ ID NO:3：ATAGGTTCAAGTGGCCACTGGTAG
SEQ ID NO:4：AAACCTACCAGTGGCCACTTGAAC
在本发明一个优选的实施例中，所述将所述sgRNA与带有CRISPR/Cas9系统的质粒连接的步骤，包括：
将所述sgRNA与BsaⅠ酶切后的带有CRISPR/Cas9系统的质粒连接，连接体系为：退火后的sgRNA片段0.4～0.6pmol，2×T4 DNA Ligase Buffer 10μL，酶切后的带有CRISPR/Cas9系统的质粒20～80ng，T4 DNA Ligase 1μL，加ddH2O至20μL，16～22℃连接3～16h。
在本发明一个优选的实施例中，所述将所述sgRNA与带有CRISPR/Cas9系统的质粒连接，得靶向重组质粒的步骤之后，还包括：
将靶向重组质粒转化至感受态细胞中，进行PCR检测，扩增引物为3×FLAG-F/T7-Term-R，所述3×FLAG-F的序列如SEQ ID NO:5所示，所述T7-Term-R的序列如SEQ ID NO:6所示。
SEQ ID NO:5：GACTACAAAGACCATGACGGTGATTAT
SEQ ID NO:6：CAAAAAACCCCTCAAGACCC
其中，PCR检测过程中，菌液PCR反应体系为：10×PCR Buffer：5μL，dNTPs：1μL，3×FLAG-F：1～2μL，T7-Term-R：1～2μL，模板：2～4μL，Taq酶(2U)：1μL，加ddH2O至50μL；反应条件为：95℃预变性5min，95℃变性30s，45～55℃退火30s，72℃延伸30s，30～35个循环，72℃再延伸10min，4～12℃保存。
在本发明一个优选的实施例中，所述以嗜水气单胞菌气溶素基因敲除序列同源但缺失部分碱基序列的同源臂为模板进行Overlap PCR扩增，得同源重组修复模板的步骤，包括：
分别以aerA-UF/UR和aerA-DF/DR为引物，从嗜水气单胞菌基因组扩增上、下同源臂，所述aerA-UF的序列如SEQ ID NO:7所示，所述aerA-UR的序列如SEQ ID NO:8所示，所述aerA-DF的序列如SEQ ID NO:9所示，所述aerA-DR的序列如SEQ ID NO:10所示；反应体系为：Mix 45μL，上、下游引物各2μL，DNA模板1μL。反应条件：98℃预变性2min，98℃变性10s，59～65℃退火10s，72℃延伸10s，30～35个循环，72℃再延伸1min，4～12℃保存；
以所述上、下同源臂为模板进行Overlap PCR扩增，得到同源重组修复模板DonorDNA。反应体系：Mix 47μL，引物aerA-UF/DR各1μL，上、下同源臂PCR产物各0.5μL。反应条件：98℃预变性2min，98℃变性10s，55～63℃退火10s，72℃延伸15s，进行30～35个循环，72℃再延伸1min，4～12℃保存。
SEQ ID NO:7：
ATCAGATAAAATATTTCTAGAGTCTGGATCGCATATTGAAG
SEQ ID NO:8：
ACTCAGCGTCAGGTCATACCGTCTTCTCGCCACAAC
SEQ ID NO:9：
GTTGTGGCGAGAAGACGGTATGACCTGACGCTGAGT
SEQ ID NO:10：
TAAATTGCACTGAAATCTAGACGCAGTCGTTATTGATTGG
在本发明一个优选的实施例中，所述将所述靶向重组质粒与所述同源重组修复模板连接的步骤，包括：
回收纯化XbaⅠ酶切后的靶向重组质粒，与所述同源重组修复模板连接，反应体系为：5×CEⅡBuffer 4μL，靶向重组质粒160～200ng，同源重组修复模板45～60ng，ExnaseⅡ2μL，加ddH2O至20μL，37℃反应0.5h。所用试剂购自南京诺唯赞公司的ClonExpress II OneStep Cloning Kit。
下面结合具体实施例对本发明嗜水气单胞菌气溶素基因的敲除质粒及其构建方法做进一步的说明，但这些实施例所提及的具体实施方法只是对本发明的技术方案进行的列举解释，并非限制本发明的实施范围，凡是依据上述原理，在本发明基础上的改进、替代，都应在本发明的保护范围之内。
本发明实施例所用菌株为嗜水气单胞菌ATCC7966，源于中国微生物菌种保藏中心；大肠杆菌DH5α源于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。大肠杆菌JM109源于宝日医生物技术公司的JM109感受态细胞进行培养保种得到；所用带有CRISPR/Cas9系统的质粒为质粒BPK764源于丰晖生物公司。
该嗜水气单胞菌气溶素基因的敲除质粒的构建流程如图1所示，设计sgRNA，将其亚克隆到带有CRISPR/Cas9系统的质粒BPK764质粒中，构建靶向重组质粒；设计Donor DNA序列引物，利用Overlap PCR扩增Donor DNA片段，将该片段插入重组质粒中构建气溶素基因的完整敲除质粒psg-Donor-BPK764，具体包括以下步骤：
sgRNA及同源臂的设计：
根据NCBI提供的嗜水气单胞菌ATCC7966菌株的aerA基因，利用在线设计工具在编码区确定出PAM(Protospacer adjacent motifs，原间隔序列邻近基序)位点为“NGG”的20bp的序列，根据sgRNA设计原则，筛选出1个靶位点，在靶序列的5′端添加BsaⅠ限制性内切酶位点，设计引物sgRNA-F/R，同时设计aerA基因的同源修复片段，在敲除载体上装入同源臂，实现aerA基因在Cas9蛋白敲除的同时，以载体上的aerA基因的同源臂作为修复模板。
相关引物设计见下表1所示：
表1
Figure BDA0002532444380000091
注:单下划线为酶切位点，双下划线为质粒同源序列，虚线为Overlap PCR互补序列。
psg-BPK764敲除质粒的构建：
①将sgRNA-F/R稀释至终浓度为100μmol/L，退火连接sgRNA，反应条件为95℃变性10min，自然降温到25℃。
②将上述产物与BsaⅠ酶切后的质粒BPK764连接。连接体系：退火后的sgRNA片段0.5pmol，2×T4 DNA Ligase Buffer 10μL，酶切后的BPK764质粒60ng，T4 DNA Ligase 1μL，加ddH2O至20μL，22℃连接3h。
③将连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中，在氯霉素抗性营养肉汤平板(终浓度为34μg/mL)上筛选阳性克隆，进行菌落PCR检测，扩增引物为3×FLAG-F/T7-Term-R。检测结果如图2所示的靶向重组质粒psg-BPK764扩增结果，M为标准物质DL5000；1为质粒BPK764的扩增产物，大小为348bp；2为靶向重组质粒psg-BPK764的扩增产物，大小为312bp；而图3示出了sgRNA的测序鉴定结果，综合图2-3可得结论：空载体BPK764质粒的扩增产物大小(348bp)与靶向重组质粒psg-BPK764的扩增产物大小(312bp)均与预期结果一致，且sgRNA连接位置方向完全正确。将该质粒命名为psg-BPK764。
psgRNA-Donor-BPK764质粒的构建：
①分别以aerA-UF/UR和aerA-DF/DR为引物，从ATCC7966基因组扩增上、下同源臂，反应体系为：Mix 45μL，上、下游引物各2μL，DNA模板1μL。反应条件：98℃预变性2min，98℃变性10s，59-65℃退火10s，72℃延伸10s，35个循环，72℃再延伸1min，4℃保存。结果如图4所示的aerA上同源臂和aerA下同源臂的扩增结果，M为标准物质DL5000；1为aerA上同源臂扩增产物，大小为725bp；2为aerA下同源臂扩增产物，大小为521bp，得结论：aerA上同源臂(725bp)和aerA下同源臂(521bp)与预期相符。
②以上述扩增产物为模板进行Overlap PCR，得到同源重组修复模板Donor DNA，反应体系：Mix 47μL，引物aerA-UF/DR各1μL，上、下同源臂PCR产物各0.5μL。反应条件：98℃预变性2min，98℃变性10s，55～63℃退火10s，72℃延伸15s，进行35个循环，72℃再延伸1min，4℃保存。结果如图5所示的aerA-Donor DNA扩增结果，M为标准物质DL5000；1为aerA-Donor DNA扩增产物，大小为1210bp；结论为：Donor DNA(1210bp)序列与预期相符。
③回收纯化XbaⅠ酶切后的psg-BPK764质粒，与同源重组修复模板Donor DNA连接，反应体系：5×CEⅡBuffer 4μL，线性psg-BPK764质粒160ng，Donor DNA 46ng，ExnaseⅡ2μL，加ddH2O至20μL，37℃反应0.5h。结果如图6所示的重组质粒psg-Donor-BPK764的单酶切，M为标准物质DL10000；1为XbaⅠ单酶切重组质粒，经XbaⅠ酶切后产生两条条带，大小分别为8019bp、1174bp；结论为：重组质粒经XbaⅠ酶切后产生两条条带(8019bp、1174bp)，与预期相符。
④将上述产物转化至DH5α化学感受态细胞中，在氯霉素抗性平板(终浓度为34μg/mL)上进行筛选，经酶切、PCR鉴定及测序验证正确后将该质粒命名为psg-Donor-BPK764。结果如图7所示的敲除质粒psg-Donor-BPK764中Donor DNA的扩增结果，M为标准物质DL5000；1为敲除质粒psg-Donor-BPK764的扩增产物，大小为1210bp；结论为：PCR扩增产物大小(1210bp)与预期相符。证明psg-Donor-BPK764重组质粒构建与预期一致。
本发明实施例提供的psg-Donor-BPK764敲除质粒是在BPK764质粒的基础上，在特定的位点装入aerA基因敲除序列同源但缺失部分碱基序列的同源臂(XbaⅠ位点插入)和sgRNA，作为同源重组修复模板和靶向序列，达到定点敲除基因的目标。同时，采用同源重组技术，通过扩增目的条带、回收，载体的酶切线性化，组装等过程将sgRNA片段与同源重组修复臂片段先后亚克隆到同一载体上，实现了具有对目标生物基因组的定点编辑功能的CRISPR/Cas9系统的方法。
值得注意的是，本发明实施例虽然只提及一种sgRNA、Donor DNA序列引物以及质粒限定为BPK764质粒，但在不脱离本发明构思的前提下，还可以通过上述设计思路设计不同的sgRNA、用带有CRISPR/Cas9系统的其它质粒、设计不同的Donor DNA序列引物、利用Overlap PCR扩增Donor DNA片段等变形方案也都属于本发明的保护范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0002532444380000131
Figure BDA0002532444380000141
Figure BDA0002532444380000151
Figure BDA0002532444380000161
序列表
<110> 电子科技大学中山学院
<120> 嗜水气单胞菌气溶素基因的敲除质粒及其构建方法
<150> 2020105034372
<151> 2020-06-05
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gttcaagtgg ccactggtag 20
<210> 2
<211> 1168
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtctggatcg catattgaag ccaatgtgac tgatattgtc gtactcacat gtcacctgct 60
gatatataag cgctggtgaa tgtatgtcaa tgttcaatat attggggttg ctatgcaaaa 120
actaaaaata actggcttgt cattgatcat atccggcctg ctgatggcac aggctcacgc 180
ggcagagccc gtctatccag accagctgcg cctgttctca ctgggccagg aggtctgtgg 240
cgacaagtat cgtcctatta ctagagaaga agcccagagc gttaaaagca atattgtcaa 300
tatgatgggg cagtggcaaa taagcggcct ggccaatggc tgggtaataa tggggccggg 360
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tgtgcagtgg cgactggtac acgacagtgc gaatttcatc aagccaacca gctatctggc 540
gcattatctc ggttatgcct gggtgggtgg caatcacagc caatatgtcg gtgaagacat 600
ggacgtgacc cgtgatggcg atggctgggt gatccgtggc aacaatgacg gcggttgcga 660
ggggtatcgt tgtggcgaga agacggtatg acctgacgct gagtggcttc ctgcgctggg 720
gcggcaatgc ctggtatacc catccggaca accgcccgaa ctggaaccac accttcgtca 780
tcgggccgta caaggacaag gcgagcagca ttcgttacca gtgggacaag cgttacatcc 840
cgggtgaagt gaagtggtgg gactggaact ggaccatcca gcagaacggc ctgtctacca 900
tgcagaacaa cctggccaga gtgctacgcc cggtgcgggc ggggatcacc ggcgatttca 960
gtgccgagag ccagtttgcc ggcaacatcg agatcggtgc tccggtgccg ctcgcggcag 1020
acagcaaggt gcgtcgtacc cgcagcgtgg atggcgctgg gcagggtctg aggctggaga 1080
ttccgctcga tgcgcaagag ctctccgggc ttggcttcag caacgtcagc ctgagtgtga 1140
cgccagctgc caatcaataa cgactgcg 1168
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ataggttcaa gtggccactg gtag 24
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaacctacca gtggccactt gaac 24
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gactacaaag accatgacgg tgattat 27
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caaaaaaccc ctcaagaccc 20
<210> 7
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atcagataaa atatttctag agtctggatc gcatattgaa g 41
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
actcagcgtc aggtcatacc gtcttctcgc cacaac 36
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gttgtggcga gaagacggta tgacctgacg ctgagt 36
<210> 10
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
taaattgcac tgaaatctag acgcagtcgt tattgattgg 40

Claims (9)

1.一种嗜水气单胞菌气溶素基因的敲除质粒，其特征在于，所述敲除质粒为在带有CRISPR/Cas9系统的质粒中插入有嗜水气单胞菌气溶素基因敲除序列同源但缺失部分碱基序列的同源臂以及sgRNA。
2.根据权利要求1所述的嗜水气单胞菌气溶素基因的敲除质粒，其特征在于，所述sgRNA的序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1所述的嗜水气单胞菌气溶素基因的敲除质粒，其特征在于，所述同源臂的序列如SEQ ID NO:2所示。
4.一种根据权利要求1-3任一权利要求所述的嗜水气单胞菌气溶素基因的敲除质粒的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
根据嗜水气单胞菌气溶素基因，设计sgRNA；
将所述sgRNA与带有CRISPR/Cas9系统的质粒连接，得到靶向重组质粒；
以嗜水气单胞菌气溶素基因敲除序列同源但缺失部分碱基序列的同源臂为模板进行Overlap PCR扩增，得同源重组修复模板；
将所述靶向重组质粒与所述同源重组修复模板连接，即得敲除质粒。
5.根据权利要求4所述的嗜水气单胞菌气溶素基因的敲除质粒的构建方法，其特征在于，所述根据嗜水气单胞菌气溶素基因，设计sgRNA的步骤，包括：
根据嗜水气单胞菌气溶素基因以及sgRNA设计规则，设计引物sgRNA-F/R，所述sgRNA-F的序列如SEQ ID NO:3所示，所述sgRNA-R的序列如SEQ ID NO:4所示；
将所述sgRNA-F/R进行稀释处理，退火连接sgRNA。
6.根据权利要求4所述的嗜水气单胞菌气溶素基因的敲除质粒的构建方法，其特征在于，所述将所述sgRNA与带有CRISPR/Cas9系统的质粒连接的步骤，包括：
将所述sgRNA与BsaⅠ酶切后的带有CRISPR/Cas9系统的质粒连接，连接体系为：退火后的sgRNA片段0.4~0.6pmol，2×T4 DNA Ligase Buffer 10μL，酶切后的带有CRISPR/Cas9系统的质粒20~80ng，T4 DNA Ligase 1μL，加ddH2O至20μL，16~22℃连接3~16h。
7.根据权利要求4所述的嗜水气单胞菌气溶素基因的敲除质粒的构建方法，其特征在于，所述将所述sgRNA与带有CRISPR/Cas9系统的质粒连接，得靶向重组质粒的步骤之后，还包括：
将靶向重组质粒转化至感受态细胞中，进行PCR检测，扩增引物为3×FLAG-F/T7-Term-R，所述3×FLAG-F的序列如SEQ ID NO:5所示，所述T7-Term-R的序列如SEQ ID NO:6所示。
8.根据权利要求4所述的嗜水气单胞菌气溶素基因的敲除质粒的构建方法，其特征在于，所述以嗜水气单胞菌气溶素基因敲除序列同源但缺失部分碱基序列的同源臂为模板进行Overlap PCR扩增，得同源重组修复模板的步骤，包括：
分别以aerA-UF/UR和aerA-DF/DR为引物，从嗜水气单胞菌基因组扩增上、下同源臂，所述aerA-UF的序列如SEQ ID NO:7所示，所述aerA-UR的序列如SEQ ID NO:8所示，所述aerA-DF的序列如SEQ ID NO:9所示，所述aerA-DR的序列如SEQ ID NO:10所示；
以所述上、下同源臂为模板进行Overlap PCR扩增，得到同源重组修复模板。
9.根据权利要求4所述的嗜水气单胞菌气溶素基因的敲除质粒的构建方法，其特征在于，所述将所述靶向重组质粒与所述同源重组修复模板连接的步骤，包括：
回收纯化XbaⅠ酶切后的靶向重组质粒，与所述同源重组修复模板连接，反应体系为：5×CEⅡBuffer 4μL，靶向重组质粒160~200ng，同源重组修复模板 45~60ng，ExnaseⅡ 2μL，加ddH2O至20μL，37℃反应0.5h。
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