CN103097537B

CN103097537B - 自删除质粒

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Publication number: CN103097537B
Application number: CN201180032633.5A
Authority: CN
Inventors: 罗基·马尔科·科瑞安恩波格; 马修·威廉·莱肯拜
Original assignee: Cobra Biologics Ltd
Current assignee: Procarrim Ltd.
Priority date: 2010-06-30
Filing date: 2011-06-28
Publication date: 2015-09-16
Anticipated expiration: 2031-06-28
Also published as: US8911999B2; PL2588615T3; DK2588615T3; PT2588615E; US20130164790A1; EP2588615A1; JP2013533743A; EP2588615B1; CN103097537A; JP5889888B2; GB201011046D0; SG186860A1; WO2012001352A1; CA2803340A1; HK1183325A1; ES2506466T3; AU2011273176A1; AU2011273176B2; CA2803340C

Abstract

提供了制备无选择标记基因的质粒的方法，包括在不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组的宿主细胞环境中培养含有选择标记基因的质粒，选择标记基因的侧翼为位点特异性重组酶靶位点，随后在能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组的另一宿主细胞环境中培养所述质粒，从而去除所述选择标记基因。还提供了通过所述方法制备的质粒在制备用于治疗和疫苗目的的重组蛋白、制备治疗性DNA和DNA疫苗以及使用活细菌载体向患者递送重组蛋白和DNA中的用途。

Description

自删除质粒

发明领域

本发明涉及制备无选择标记基因的质粒的方法。具体而言，本发明涉及在一定条件下培养含有选择标记基因的质粒的方法，所述条件允许根据选择标记基因的表达进行选择和选择标记基因的随后去除。本发明还涉及通过本方法制备的质粒在制备用于治疗和疫苗目的的重组蛋白、制备治疗性DNA和DNA疫苗、以及使用活细菌载体向患者递送重组蛋白和DNA中的用途。

通过引用将本文涉及的所有文件并入本文。

发明背景

质粒是自我复制的DNA分子，其天然存在于细菌、古生菌和一些单细胞真核生物，例如酵母。近年来，质粒在生物技术产业中必不可少，可用于表达重组蛋白基因以及作为DNA治疗剂和疫苗。对于这些应用，通常修饰编码感兴趣基因的质粒，并使其在细菌宿主细胞中复制，例如大肠杆菌(Escherichia coli)。质粒通常编码抗生素抗性基因，从而能够实现抗生素选择，抗生素选择是用于鉴定转化后含有质粒的细胞，其中向生长培养基中加入的选择性抗生素能够杀死丢失质粒的细胞。

然而，使用抗生素进行质粒选择和维持有多种弊端。第一，抗生素抗性基因在宿主细胞中的组成型表达对细胞产生代谢负担，这会降低细胞活力并增加质粒丢失的频率。第二，抗生素是生产过程中的额外的污染，发酵过程中的抗生素降解会降低选择压力。第三，对于DNA治疗剂和疫苗，使用抗生素抗性基因会具有在环境中转入病原体的危险，导致产生抗生素抗性病原株。当使用活细菌株作为向患者递送基因的载体时，存在急性危险。因此，需要开发出不使用抗生素抗性基因的质粒选择机制。

已经发展出的备选技术需要表达的选择标记基因，例如能补充宿主染色体中缺失的拷贝的必需基因的功能拷贝。胸苷酸合酶基因thyA(McNeil et al.2000,Appl.Environ.Microbiol.,66:1216-1219)或参与二氨基庚二酸合成的asd基因(Degryse 1991,Mol.Gen.Genet.227:49-51)已经被用作细胞中质粒的选择基因，该细胞中的染色体基因是无功能的。该方法和抗生素选择均有相同的重要缺点：选择标记基因的存在和表达对细胞产生明显的代谢负担，并易于使质粒选择性丢失(Bentley et al.1990,Biotechnol.Bioeng.35:668-681)。

已经开发出了两种更新的技术，其不需要选择标记基因的表达，因此降低细胞的代谢负担。ORT(操纵基因-阻遏蛋白滴定)利用修饰的细菌细胞，其中必需的染色体基因被置于诱导型启动子的控制下。阻遏蛋白与邻近启动子的操纵基因序列结合，阻止必需基因的表达，从而在不存在诱导剂的情况下会导致细胞死亡。当用含有操纵基因序列的多拷贝质粒转化ORT细菌细胞时，通过质粒滴定阻遏蛋白，并使必需基因表达，从而允许细胞生长并因此允许质粒选择和维持(Cranenburgh et al.2001.Nucleic Acids Res.29:e26)。

另一个无选择标记基因的系统(oriSELECT)利用了pMB1复制起点，在分子遗传学研究和开发中使用的大多数质粒中均存在pMBl复制起点。pMBl ori天然产生用来调节其拷贝数的反义RNA，修饰oriSELECT细胞，使得该RNA与对应的有义序列的mRNA相互作用，有义序列被设计在与调节必需基因的的阻遏基因或毒素基因的基因融合体中，使得细胞存活需要质粒的存在(Cranenburgh 2005,WO06/003412)。

这些无选择标记基因的表达系统的缺点在于，需要对微生物细胞的染色体进行遗传修饰。这些修饰在许多物种中存在技术难度，甚至在易于接受遗传操作的物种中，这些修饰耗时并且需要的工作量大。因此，仍需要开发出不含有选择标记基因且不需要对宿主细胞进行遗传修饰的质粒选择系统。

发明描述

本申请的发明人开发出了制备无选择标记基因的质粒的系统。在开发本系统时，本申请的发明人惊奇地发现，在无质粒维持系统的情况下，无选择标记基因的质粒能够在宿主细胞中维持。这个发现是意想不到的，因为在缺少质粒维持系统的情况下，本领域技术人员会预测质粒从宿主细胞中丢失。这个令人惊讶的发现可能是由于在去除选择标记基因之后，细胞内发生的代谢负担大幅降低。

因此，第一方面，本发明涉及制备无选择标记基因的质粒的方法，其包括如下步骤：

a)在第一宿主细胞环境中培养含有选择标记基因的质粒，选择标记基因的侧翼为位点特异性重组酶靶位点，第一宿主细胞环境不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组；以及

b)随后在第二宿主细胞环境中培养质粒，第二宿主细胞环境能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组，从而去除选择标记基因。

宿主细胞环境

术语“宿主细胞环境”包括宿主细胞本身和宿主细胞环境的条件。因此，如果质粒被从第一宿主细胞转移到第二宿主细胞或者如果宿主细胞的条件改变，则宿主细胞环境改变。在后一情况中，第一宿主细胞环境和第二宿主细胞环境是在时间上分开的。通常，通过改变细胞培养的条件来改变宿主细胞中的条件。可以改变的条件包括但不限于渗透浓度、温度、是否存在诱导剂、细胞生长期和能够改变DNA的二级结构或超螺旋的化合物的存在。

因此，第二方面，本发明涉及制备无选择标记基因的质粒的方法，其包括以下步骤：

a)在第一宿主细胞中培养含有选择标记基因的质粒，选择标记基因的侧翼为位点特异性重组酶靶位点，第一宿主细胞不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组；以及

b)随后在第二宿主细胞中培养质粒，第二宿主细胞能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组，从而去除选择标记基因。

第三方面，本发明涉及制备无选择标记基因的质粒的方法，其包括以下步骤：

a)在一定渗透浓度下，在宿主细胞中培养含有选择标记基因的质粒，选择标记基因的侧翼为位点特异性重组酶靶位点，在所述渗透浓度下不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组；以及

b)随后改变宿主细胞的渗透浓度，从而能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组，从而去除选择标记基因。

第四方面，本发明涉及制备无选择标记基因的质粒的方法，其包括以下步骤：

a)在一定温度下，在宿主细胞中培养含有选择标记基因的质粒，选择标记基因的侧翼为位点特异性重组酶靶位点，在所述温度下不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组；以及

b)随后改变宿主细胞的温度，从而能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组，从而去除选择标记基因。

第五方面，本发明涉及制备无选择标记基因的质粒的方法，其包括以下步骤：

a)在缺少诱导剂的条件下，在宿主细胞中培养含有选择标记基因的质粒，选择标记基因的侧翼为位点特异性重组酶靶位点，在缺少诱导剂的条件下不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组；以及

b)随后向宿主细胞添加诱导剂，从而能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组，从而去除选择标记基因。

第六方面，本发明涉及制备无选择标记基因的质粒的方法，其包括以下步骤：

a)在能改变质粒的DNA二级结构或超螺旋的化合物的存在下，在宿主细胞中培养含有选择标记基因的质粒，选择标记基因的侧翼为位点特异性重组酶靶位点，所述化合物的存在使细胞不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组；以及

b)随后改变细胞内化合物的水平，从而能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组，从而去除选择标记基因。

第七方面，本发明涉及制备无选择标记基因的质粒的方法，其包括以下步骤：

a)在缺少能够作用于位点特异性重组酶靶位点的位点特异性重组酶的条件下，在第一宿主细胞中培养含有选择标记基因的质粒，选择标记基因的侧翼为位点特异性重组酶靶位点，从而细胞不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组；以及

b)随后在能够作用于位点特异性重组酶靶位点的位点特异性重组酶的存在下，在第二宿主细胞中培养质粒，从而去除选择标记基因。

在一个实施方案中，通过上述改变中的一种或多种可以改变宿主细胞环境。

位点特异性重组酶

在一个实施方案中，本发明的方法利用内源性位点特异性重组酶，从而在第二宿主细胞环境中实现选择标记基因的去除。这样是有利的，因为不需要对宿主细胞进行遗传修饰，从而使方法更简单并且更高效。所用术语“内源性”表示位点特异性重组酶来源于与第二宿主细胞环境相同的细胞类型。通常，位点特异性重组酶来源于第二宿主细胞环境，即，第二宿主细胞环境不必接受遗传操作，即含有能够表达位点特异性重组酶的基因。

对于本领域技术人员显而易见的是，作用于本发明方法中的质粒的内源性位点特异性重组酶的性质取决于质粒内存在的位点特异性重组酶靶位点的性质。

利用内源性位点特异性重组酶能提供优于现有技术的优势，因为不需要引入反式外源重组酶。这简化了方法，使方法更快捷、更便宜并且更高效，因为不需要修饰宿主细胞环境来表达重组酶。在其它实施方案中，内源性位点特异性重组酶可以包括XerC、XerD、CodV、RipX、Cre、Int、Xis、P22、Flp和R1中的一个或多个。

在一个实施方案中，内源性位点特异性重组酶可选自Cre、Flp、R、XerC、XerD、RipX和CodV。

在另一个实施方案中，内源性位点特异性重组酶可以是转座酶。

优选地，位点特异性重组酶是XerC和XerD。更优选地，XerC和XerD位点特异性重组酶是内源性的。

在原核细胞中，Xer重组系统对于确保复制后正确的染色体分离以及将由RecA产生的染色体二聚体恢复为单体从而允许复制的染色体分离是必需的。Xer重组酶是酪氨酸重组酶家族的成员，在革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌)中，以XerC和XerD为代表(Blakely et al.Cell 1993,75:351-361)，在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和其它革兰氏阳性细菌中，以CodV和RipX为代表(Sciochetti et al.1999,J.Bacteriol.181:6053-6062)。Xer重组酶作用于染色体上被称为dif的28个碱基对的靶序列(Leslie andSherratt 1995,EMBO J.14:1561-1570；Sciochetti et al.2001,J.Bacteriol.183:1058-1068)。在大肠杆菌中，蛋白FtsK对于Xer重组是必需的(Recchiaet al.1999,EMBO J.18:5724-5734)，并且FtsK同源物在细菌中是广泛保守的，但在古生菌中没有发现(Recchia and Sherratt 1999,Mol.Microbiol.34:1146-1148)。

内源性Xer重组系统已被用于Xer-cise技术，用于在线性DNA分子整合进宿主细胞染色体之后，从染色体中去除抗生素抗性基因(Bloor andCranenburgh 102006,Appl.Environ.Microbiol.72:2520-2525)。

内源性Xer重组系统还具有解离质粒二聚体的功能。为了促进重组，质粒二聚体包含位点特异性重组酶识别位点，该位点与dif功能相同。这些位点是cer和psi。在大肠杆菌质粒ColE1中发现了cer(Summers andSherratt 1984,Cell 36:1097-1103)，在沙门氏菌(Salmonella)质粒pSC101中发现了psi(Cornet et al.1994,J.Bacteriol.176:3188-3195)。

当形成质粒二聚体时，Xer重组系统发挥作用，通过在cer和psi位点进行DNA重组，使二聚体转化为两个单体。然而，与染色体dif位点不同，如果还存在约180bp的附属序列，XerC和XerD只作用于质粒靶位点(Hayes and Sherratt,1997)。cer的附属序列是蛋白PepA(氨基肽酶A)和ArgR(精氨酸生物合成途径阻遏蛋白)的结合位点，psi的附属序列是蛋白PepA和ArcA的结合位点(Colloms et al.1998,Mol Microbiol.28:521-530)。需要这样设置来确保质粒上的Xer重组是定向的，即，只对二聚化作用天然形成的同向重复二聚体解离位点起作用。

由于解离质粒二聚体需要附属序列，所以以前描述的Xer-cise系统不能直接用于质粒。

在一个实施方案中，位点特异性重组酶可以是诱导型或组成型表达的。在一些实施方案中，位点特异性重组酶优选是诱导型的。具体而言，当本发明的方法利用在相同的宿主细胞内存在的第一宿主细胞环境和第二宿主细胞环境时，位点特异性重组酶优选是诱导型的。在这个实施方案中，通过改变渗透浓度、温度、是否存在诱导剂、细胞生长期和能够改变DNA二级结构或超螺旋的化合物的存在中的一个或多个条件，可以诱导重组酶的表达。

重组酶介绍

如上所述，本发明优选的实施方案不需要对维持质粒的第二宿主细胞环境进行遗传修饰。然而，当位点特异性重组酶(例如Xer重组酶系统)在第二宿主细胞环境中不是天然存在时，可以通过向宿主细胞环境中引入编码合适的位点特异性重组酶或转座酶的基因来实施本发明的方法。当第二宿主细胞环境中存在位点特异性重组酶，但需要在第二宿主细胞环境中非天然存在的其它位点特异性重组酶时，也可以运用该方法。在这个实施方案中，可以向第二宿主细胞环境中引入编码所述其它位点特异性重组酶的基因。

可以将编码位点特异性重组酶的基因引入染色体外元件或整合入宿主细胞染色体。适于引入宿主细胞环境的重组酶实例包括但不限于来自噬菌体P1的Cre(Dale and Ow 1991,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:10558-10562)、来自λ噬菌体的Int和Xis(Zubko et al.2000,NatureBiotechnol.18:442-445)和来自酵母的P22(Wulff et al.1993,Mol.Microbiol.9:261-271)、Flp(Datsenko and Wanner 2000,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97:6640-6645)和R(Sugita et al.2000,Plant J.22:461-469)。还可以使用反式表达的转座酶来去除侧翼具有内部解离位点的选择标记基因(Sanchis et al.1997,Appl.Environ.Microbiol.63:779-784)，因此可以以与重组酶相同的方式将转座酶引入宿主细胞环境。

质粒上的选择标记基因的侧翼为被引入宿主细胞环境的重组酶系统的位点特异性重组酶靶位点。如上文所述，当使用内源性位点特异性重组酶系统时，本发明的方法也能发挥作用。

位点特异性重组酶靶位点

本发明方法中使用的存在于质粒内的选择标记基因的侧翼为位点特异性重组酶靶位点。

位点特异性重组酶靶位点是位点特异性重组酶所针对的染色体或质粒DNA序列的一部分。当位点特异性重组酶靶位点按前后顺序存在时，一个或多个位点特异性重组酶能够作用于所述位点，从而去除位于所述位点之间的DNA部分。

在本发明的范围内，术语位点特异性重组酶靶位点还包括转座酶靶位点。

如上述讨论，Xer重组酶系统对于原核细胞是内源性的，并利用酪氨酸重组酶XerC和XerD来解离染色体和质粒二聚体。

在一个实施方案中，位点特异性重组酶靶位点可以能够结合XerC和/或XerD。

在一个实施方案中，位点特异性重组酶靶位点可以是任何XerC和/或XerD结合位点。可以从宿主细胞染色体和质粒中鉴定出示例性的位点。

通过组合来自质粒和染色体的天然存在的质粒二聚体解离位点，可以形成位点特异性重组酶靶位点。这样的杂合位点的实例是dif-psi杂合位点，也被称为pif位点(Cornet et al.1994,J.Bacteriol.176:3188-3195)，在下面的表1中给出了pif位点的序列。pif位点与psi只有一个核苷酸不同，但其能够促进质粒和染色体上的Xer重组。通过制备杂合序列和使用诸如Barre et al.2000描述的简单的重组测试(Genes Dev.14:2976-2988)来测定这些杂合序列作为质粒二聚体解离位点的能力，可以开发出能用于本发明方法中的其它杂合位点。

染色体或质粒的局部超螺旋被认为是Xer重组中重要的因素，因此可能存在以下情况，渗透浓度条件或周围的DNA序列能够通过通常仅在染色体上发挥功能的位点(如dif)而促进质粒上的Xer重组。因此，在一个实施方案中，位点特异性重组酶靶位点可以是dif位点。

在其它实施方案中，位点特异性重组位点可以类似于下面表1中列出的任何位点或SEQ ID NO:17、20或23中的任意一个。如果位点特异性重组酶靶位点包含SEQ ID NO:1-9、17、20或23中的任意一个或由SEQ ID NO:1-9、17、20或23中的任意一个组成，则认为该位点特异性重组酶靶位点与SEQ ID NO:1-9、17、20或23中的一个类似。如果位点特异性重组酶靶位点与SEQ ID NO:1-9、17、20或23中任意一个具有50％或更高的序列一致性，则认为该位点特异性重组酶靶位点与SEQ IDNO:1-9、17、20或23中的一个类似。或者，位点特异性重组酶靶位点可以与SEQ ID NO:1-9、17、20或23中的一个具有60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列一致性。这可以相当于与SEQ ID NO:1-9、17、20或23中的任意一个相比，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个核苷酸取代。包含SEQ ID NO:1-9、17、20或23中任意一个的15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33或34个核苷酸的片段的序列也包含在本发明的范围内。以上描述的片段或变体序列可能够结合XerC和/或XerD。

对于本领域技术人员显而易见的是，质粒中包括的位点特异性重组酶靶位点的性质取决于本发明方法涉及的第一和第二宿主细胞环境中内源性的位点特异性重组酶。

本发明的方法提供的优于现有技术方法的优势在于，不需要反式引入外源重组酶。因此，第二细胞环环境中的内源性位点特异性重组酶必须能作用于位点特异性重组酶靶位点。然而，这并不表示位点特异性重组酶靶位点必须对于过程发生的细胞也是内源性的。例如，有证据表明，来自一个物种的位点特异性重组酶能够作用于来自另一个物种的位点特异性重组酶靶位点(Neilson et al.1999,Mol.Microbiol.31:915-926)。此外，位点特异性重组酶已被证实能解离不同的位点(Cornet et al.1994,J.Bacteriol.176:3188-3195)，例如大肠杆菌dif位点和psi-dif杂合体(pif位点)。

真核细胞也包含用于去除两个位点特异性重组酶靶位点之间的DNA的天然的位点特异性重组酶。例如，通过FRT位点之间的DNA重组，酵母2μm质粒的Flp重组酶能够反转质粒的区域。因此，在一个实施方案中，位点特异性重组酶靶位点可以是FRT位点。

表1：本发明中使用的位点特异性重组酶的示例性结合位点和它们的结合位点

在一个实施方案中，位点特异性重组酶靶序列可以彼此是相同的。在另一个实施方案中，位点特异性重组酶靶序列可以彼此不同。

如以上讨论，需要附属序列来指导质粒上位点特异性重组酶靶位点之间的位点特异性重组。因此，在一个实施方案中，一个或多个位点特异性重组酶靶位点可以与一个或多个附属蛋白的结合位点在功能上相关联。

附属蛋白的结合位点通常称为附属位点。

在一个实施方案中，附属序列可以是附属蛋白PepA、ArgR或ArcA中一个或多个的结合位点。在具体实施方案中，附属序列可以包含ArgR或ArcA之一和PepA的结合位点。

在一个实施方案中，附属序列可以与下文显示的序列类似，其中ArgR/ArcA结合位点用虚线下划线示出，XerCD结合位点用实线下划线示出。PepA结合ArgR/ArcA结合位点附近的附属序列，但确定位置没有限定。

如果附属位点包括SEQ ID NO：17、20或23中任意一个或由SEQ IDNO：17、20或23中任意一个组成，则认为该附属位点与以下列出的一个位点类似。如果附属位点与SEQ ID NO：17、20或23中任意一个具有50％或更高的序列一致性，则认为该附属位点与以下列出的一个位点类似。或者，附属位点可以与SEQ ID NO：17、20或23中任意一个具有60％、70％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列一致性。这可以相当于与SEQ ID NO：17、30或23中的任意一个相比，具有1、2、3或4个核苷酸取代。包含SEQ ID NO：17、20或23中任意一个的8、9、10、11、12、13、14、15、16、17个核苷酸的片段的序列也包括在本发明的范围内。以上描述的片段或变体序列可能够结合PepA、ArgR或ArcA。

来自pSC101的psi位点和附属序列(SEQ ID NO:15)

gcctcccgtggggaaaaaatcatggcaattctggaagaaatagcgctttcagccggcaaacctgaagccggatctgcgattctgagcaacaccagaacagcccgtttgcgggcagcaaaacccgtacttttggacgttccggcggttttttgtggcgagtggtgttcgggcggtgcgcgcaagatccattatgttaaacgggcga

来自ColE1的cer位点和附属序列(SEQ ID NO:18)

gtgaaaccatgaaaaatggcagcttcagtggattaagtgggggtaatgtggcctgtaccctctg cggttaaaatttatcaggcgcgatcgcgcagtttttagggtggtttgttgccatttttacctgtctgctgccgtgatcgcgctgaacgcgttttagcggtgcgtacaattaagggattatggtaaatccactt

来自pJHCMWl的mwr位点和附属序列(SEQ ID NO:21)

aagaagaacatcggaaacaggacttactccggctgaatggtgtgaaattctgcgctatgcacttg ccgtaaaaacagagcctgcgcgtttctggcgggtmcgggtggtttgttgcctgtmaccggtttcccgtcagaaacgccctgagggcctctcaggcggtgcacgcaacagatgttatggtaaatacaatg

选择标记基因

选择标记基因可以是能够用于检测核酸分子是否存在的任何基因。

通常，本领域中使用抗生素抗性基因来鉴定含有某一核酸分子的细胞。因此，在一个实施方案中，选择标记基因是抗生素抗性基因，通过在含有抗生素的培养基中培养，抗生素抗性基因允许鉴定出含有质粒的细胞。抗生素抗性基因在本领域中是已知的，并且可以使用其中的任何基因。可使用的抗生素抗性基因的实例包括但不限于能赋予卡那霉素、新霉素、链霉素，庆大霉素、氨苄青霉素、氯霉素、四环素、新霉素、杀菌素、潮霉素、嘌呤霉素、红霉素、林可霉素和博来霉素抗性的基因。Neu 1992,Science 257 1064-1073中描述了本发明可使用的其它抗生素抗性基因。

在可选的实施方案中，选择标记基因能允许产生宿主细胞缺少、但又是宿主细胞必需的代谢物。在一个实施方案中，选择标记基因可以参与培养宿主细胞的培养基中不存在的氨基酸的氨基酸生物合成途径。在另一个实施方案中，选择标记基因可以是胸苷酸合酶基因thyA或参与二氨基庚二酸合成的asd基因。

无选择标记基因的质粒是缺少选择标记基因的质粒。

第一宿主细胞环境

第一宿主细胞环境不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组，位点特异性重组酶靶位点位于选择标记基因的侧翼。因此，选择标记基因保留在质粒中，从而允许根据选择标记基因的表达来选择含有质粒的细胞。

在一个实施方案中，如果少于50％的质粒发生位点特异性重组，则细胞不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组。在另一个实施方案中，如果少于40％、30％、20％、15％、10％、5％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％或0％的质粒发生位点特异性重组，细胞不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组。

突变

在一个实施方案中，第一宿主细胞环境可包括基因中的突变，所述基因编码参与质粒的位点特异性重组的一个或多个蛋白。

优选地，编码位点特异性重组酶(例如XerC或XerD)的基因没有突变。因为需要这些蛋白来进行染色体分离，在缺少这些蛋白的有功能形式的情况下，染色体分离将不能发生，并且第一宿主细胞环境没有活力。

在一个实施方案中，可以突变编码附属蛋白PepA、ArgR或ArcA中一个或多个的染色体基因。

如上述讨论，质粒在cer位点的位点特异性重组需要PepA和ArgR，而psi位点的位点特异性重组需要PepA和ArcA。因此，编码这些附属蛋白的基因中一个或多个中的突变将阻止在第一宿主细胞环境中发生位点特异性重组。因此，当质粒存在于第一宿主细胞环境中时，质粒会保留选择标记基因，并且选择压力能够用于选择含有质粒的细胞。

对编码PepA、ArgR或ArcA蛋白中一个或多个的基因进行的突变可以是失活突变。可以通过编码这些附属蛋白中一个或多个的一个或多个核苷酸的插入、缺失或取代来产生这种突变。

在另一个实施方案中，在第一宿主细胞环境中可以存在突变，其阻止一个或多个附属蛋白的表达。这种突变可以存在于编码参与附属蛋白表达的蛋白的基因中。或者，可以过表达能阻止附属蛋白mRNA的翻译的阻遏蛋白或反义序列。

在一个优选的实施方案中，第一宿主细胞环境包括PepA基因中的突变，因为这会使细胞不能在cer或psi位点发生重组。

可用作第一宿主细胞环境的附属蛋白突变体可以是选自DS957、DS941pepA、DS941arcA2、DS941arcA::Tn5(2.3)(Colloms et al.1998Mol.Microbiol.28(3):521-530)、ECK4253和ECK3226(Baba et al.2006,Mol.Systems Biology(2006)doi:10.1038/msb4100050)的大肠杆菌突变株。

渗透浓度

在另一个实施方案中，由于第一宿主细胞环境的渗透浓度不允许重组发生，第一宿主细胞环境可以不能实现位点特异性重组位点之间的重组。

在该实施方案中，位点特异性重组酶靶位点可以是来自肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)质粒pJHCMWl的mwr位点。这个位点与cer有关，并且邻近于结合PepA和ArgR的附属序列(Pham et al.2002,J.Bacteriol.184:1607-1616)。在高盐浓度下，该渗透调节序列不允许产生高效的Xer重组，但当L培养基中盐浓度低于0.5％NaCl时，Xer重组可以发生，这是因为DNA超螺旋发生变化(Trigueros et al.2009,Nucleic AcidsRes.37:3580-3587)。

因此，在这个实施方案中，第一宿主细胞环境的渗透浓度可以高于或等于209mmol/kg(0.5％NaCl)。通过在含有0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％NaCl的培养基中培养第一宿主细胞环境，可以将第一宿主细胞环境的渗透浓度的水平保持在高于群体中所有质粒完全重组需要的水平，因为这个浓度范围能允许保留足够比例的未重组质粒。理想情况下，第一宿主细胞环境的浓度高于0.5％。宿主细胞被转移到的第二环境具有少于0.1％NaCl，理想地是0％NaCl。

温度

在另一个实施方案中，由于第一宿主细胞环境的温度高于或低于实现重组需要的温度，第一宿主细胞环境可以不能实现位点特异性重组位点之间的重组。

诱导剂

在另一个实施方案中，由于第一宿主细胞环境中缺少诱导剂，第一宿主细胞环境可以不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组。发生重组可以需要这样的诱导剂。

能改变质粒二级结构或超螺旋的化合物

为了在位点特异性重组酶靶位点之间发生重组，质粒必需具有重组酶和附属蛋白分别接近位点特异性重组酶靶位点和附属序列的正确的二级结构和超螺旋。因此，在一个实施方案中，因为存在能产生不允许位点特异性重组酶和/或附属蛋白接近质粒上相关位点的质粒二级结构或超螺旋的化合物，第一宿主细胞环境可以不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组。这样的化合物可以插入DNA，例如溴化乙锭。

缺少位点特异性重组酶

在其它实施方案中，由于缺少能作用于位点特异性重组酶靶位点的位点特异性重组酶，第一宿主细胞环境可以不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组。

第二宿主细胞环境

第二宿主细胞环境能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组，位点特异性重组酶靶位点位于选择标记基因的侧翼。因此，通过位于选择标记基因侧翼的位点特异性重组酶靶位点之间的重组，可以从质粒去除选择标记基因。

在一个实施方案中，如果多于1％的细胞能够进行质粒上的位点特异性重组，细胞能够实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组。在其它实施方案中，如果多于2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％的质粒发生位点特异性重组，细胞能够实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组。

活性PepA、ArgA和ArcA

在一些实施方案中，第一宿主细胞环境包含在编码附属蛋白PepA、ArgR和ArcA的基因中的一个或多个中的失活突变，因此，第二宿主细胞环境可以包含PepA、ArgR和ArcA中一个或多个的活性形式。优选地，第二宿主细胞环境包含ArgR和ArcA中至少一个以及PepA的活性形式，这样能够在cer或psi位点实现重组。在一个实施方案中，第二宿主细胞环境可以包含在第一宿主细胞环境中失活的任何附属蛋白的活性形式。

渗透浓度

在一些实施方案中，第一宿主细胞环境中的渗透浓度保持在低于发生重组需要的渗透浓度，因此，通过提供高于实现重组需要的渗透浓度，可以使第二宿主细胞环境能够实现重组。

当位点特异性重组酶靶位点类似于来自肺炎克雷伯菌质粒pJHCMW1的mwr位点时，可以实施这个实施方案。

在这个实施方案中，第二宿主细胞环境具有的渗透性对应于少于0.5％的盐浓度。在一个实施方案中，第一宿主细胞环境中的渗透性可对应于高于0.55％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％或更高的盐浓度。

对于本领域技术人员显而易见的是，可以以多种方式实现第一宿主细胞环境和第二宿主细胞环境间渗透浓度的变化。在一个实施方案中，可以通过使用无盐培养液稀释第一宿主细胞环境来改变渗透浓度，从而将第一宿主细胞环境转变为第二宿主细胞环境。或者，将来自含盐的第一培养液的细胞离心，产生细胞团，移除含盐的上清液，然后在无盐的培养液中重悬细胞。

温度

在一些实施方案中，第一宿主细胞环境被保持在高于或低于实现重组需要的温度，因此，通过提供高于或低于实现重组需要的温度，可以使第二宿主细胞环境能够实现重组。

对于本领域技术人员显而易见的是，可以以多种方式实现第一宿主细胞环境和第二宿主细胞环境间温度的变化。在一个实施方案中，通过改变培养宿主细胞的温度来改变温度。

诱导剂

在一些实施方案中，由于第一宿主细胞环境中缺少诱导剂而使第一宿主细胞环境不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组，因此，通过加入诱导剂可以使第二宿主细胞环境能够实现重组。

对于本领域技术人员显而易见的是，可以以多种方式向细胞添加诱导剂。在一个实施方案中，通过在培养宿主细胞的培养液中加入诱导剂来添加诱导剂，从而将第一宿主细胞环境转变为第二宿主细胞环境。

能改变质粒二级结构或超螺旋的化合物

在一些实施方案中，由于存在能产生不允许位点特异性重组酶和/或附属蛋白接近质粒上相关位点的质粒二级结构或超螺旋的化合物，第一宿主细胞环境不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组，因此，通过去除所述化合物可以使第二宿主细胞环境能够实现重组。

对于本领域技术人员显而易见的是，可以以多种方式从细胞去除化合物。将来自含有化合物的第一培养液的细胞离心，产生细胞团，可以移除含有化合物的上清液，以及在无该化合物的培养液中重悬细胞。

存在位点特异性重组酶

在一些实施方案中，由于缺少能够作用于位点特异性重组酶靶位点的位点特异性重组酶而使第一宿主细胞环境不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组，因此，在存在能够作用于位点特异性重组酶靶位点的位点特异性重组酶时，第二宿主细胞环境能够实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组。

能够作用于位点特异性重组酶靶位点的位点特异性重组酶可以由第二宿主细胞环境中单独的质粒编码，或者，当第二宿主细胞环境是单独的宿主细胞时，位点特异性重组酶可以被合并到第二宿主细胞的染色体中。

宿主细胞环境的选择

在一个实施方案中，第二宿主细胞可以是肠杆菌科的成员(例如自埃希氏菌属(Escherichia)、志贺氏菌属(Shigella)或沙门氏菌属(Salmonella))。在这个实施方案中，第一宿主细胞环境可以是含有pepA或argR/arcA突变体的大肠杆菌株。这将确保第一宿主细胞环境中存在的XerC和XerD蛋白不能重组第一宿主细胞环境中的位点特异性重组酶靶位点。

如果在第一宿主细胞环境中存在第二宿主细胞环境中重组所需的Xer重组酶和附属蛋白靶位点，则这个实施方案可行。

然而，如果第一宿主细胞环境与第二宿主细胞环境在进化上分歧非常大而使得Xer重组系统在第一宿主细胞环境中的质粒上的位点特异性重组酶识别位点没有功能，则第一宿主细胞环境不必是pepA或argR/arcA突变体。

在另一个实施方案中，第一宿主细胞环境可以是原核细胞，并且质粒可以包含FRT位点特异性重组酶靶位点。由于原核细胞不含有重组FRT位点所需的Flp重组酶，所以位点特异性重组酶靶位点不会在第一宿主细胞环境中发生重组，并且在第一宿主细胞环境中不需要对编码附属蛋白中一个或多个的基因进行突变。在这个实施方案中，第二宿主细胞环境应当是能够在FRT位点之间实现位点特异性重组的真核细胞，例如酵母细胞，这样第二宿主细胞环境中能够发生FRT位点间的重组，从而去除选择标记基因。

宿主细胞转化

应理解，用含有选择标记基因的质粒转化第一宿主细胞环境，选择标记基因的侧翼为位点特异性重组酶靶位点。

在一些实施方案中，第一宿主细胞环境和第二宿主细胞环境形成在不同细胞中，因此，含有侧翼为位点特异性重组酶靶位点的选择标记基因的质粒被从第一宿主细胞环境移除并转化入第二宿主细胞环境中。宿主细胞转化的方法是本领域公知的并且描述于，例如Sambrook(Molecular Cloning；A Laboratory Manual(分子克隆：实验手册),第二版,1989)。从第一宿主细胞环境分离含有侧翼为位点特异性重组酶靶位点的选择标记基因质粒的方法也是本领域公知的并且描述于，例如Sambrook中(Molecular Cloning；A Laboratory Manual(分子克隆：实验手册),第二版,1989)。在一个优选的实施方案中，通过电穿孔实施转化。

在一些实施方案中，第一宿主细胞环境和第二宿主细胞环境形成在不同的细胞中，将质粒转化入每个宿主细胞环境的方法可以是相同的，也可以是不同的。

细胞培养

在第一步骤中，在一定条件下，在第一宿主细胞环境中培养含有侧翼为位点特异性重组酶靶位点的选择标记基因的质粒，所述条件使第一宿主细胞环境不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组。在这个步骤中，可以在存在选择压力的情况下，培养细胞，从而仅保持含有质粒的细胞。

在第二步骤中，在一定条件下，在第二宿主细胞环境中培养含有侧翼为位点特异性重组酶靶位点的选择标记基因的质粒，所述条件使第二宿主细胞环境能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组，从而去除选择标记基因。合适的细胞培养条件是本领域已知的。在一个实施方案中，细胞培养条件可以包括25-42℃的温度，理想的是30-37℃，在能提供生长需要的全部营养的培养液或琼脂平板中进行培养。最常见的条件是37℃、在LB琼脂或LB培养基中进行培养。

对于本领域技术人员显而易见的是，选择标记基因不会立刻被去除。因此，第二宿主细胞环境可以在初始时包括选择压力，从而确保在初始时仅保持含有质粒的细胞。

在一个实施方案中，方法可以还包括在细胞培养中维持无选择标记基因的质粒的步骤。这个步骤可以在去除选择标记基因之后进行。

本申请的发明人惊奇地发现，根据本发明方法制备的无选择基因的质粒能够在缺少质粒维持系统的情况下在第二宿主细胞环境中维持。这一点令人意想不到，因为本领域技术人员会预期到在缺少质粒维持系统的情况下，质粒会丢失。可能的原因是，由于缺少选择标记基因的表达而使代谢负担降低，因而根据本发明方法制备的质粒能够得到维持。

在其它实施方案中，方法额外包括从第一和/或第二宿主细胞环境中提取无选择标记基因的质粒的步骤。分离质粒的方法是本领域公知的，包括但不限于根据基于Birnboim and Doly 1979,Nucleic Acids Res.7:1513-1523的方法的离心和通过通过碱裂解纯化。从第二宿主细胞环境中提取后，可以分析DNA。

宿主细胞类型

第一和第二宿主细胞环境可以形成于任何细胞类型。第一和第二宿主细胞环境可以是相同的细胞类型，或者它们可以是不同的细胞类型。当第一和第二宿主细胞环境是相同的细胞类型时，它们可以是不同的株。在第一和第二宿主细胞环境形成于相同细胞的一些实施方案中，第一和第二宿主细胞环境是相同的细胞类型。

在一个实施方案中，第一宿主细胞环境和/或第二宿主细胞环境可以是原核细胞。在该实施方案中，第一宿主细胞环境和第二宿主细胞环境可以是细菌细胞。

在一个实施方案中，第一宿主细胞环境和/或第二宿主细胞环境可以是革兰氏阴性细菌细胞。在该实施方案中，第一宿主细胞环境和第二宿主细胞环境可以独立地选自埃希氏菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、农杆菌属(Agrobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)和弧菌属(Vibrio)。此外，在该实施方案中，第一宿主细胞环境和第二宿主细胞环境可以独立地选自大肠杆菌和肠沙门氏菌(Salmonella enterica)(包括伤寒沙门氏菌(Serovars Typhi)和鼠伤寒沙门氏菌(Typhimurium))。

在另一个实施方案中，第一宿主细胞环境和/或第二宿主细胞环境可以是革兰氏阳性细菌细胞。在这个实施方案中，第一宿主细胞环境和第二宿主细胞环境可以独立地选自芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、李斯特菌属(Listeria)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)和分枝杆菌属(Mycobacterium)。此外，在该实施方案中，第一宿主细胞环境和第二宿主细胞环境可以独立地选自枯草芽孢杆菌或牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)(例如BCG株)。

在另一个实施方案中，第一宿主细胞环境和/或第二宿主细胞环境可以是古生菌。在这个实施方案中，第一宿主细胞环境和/或第二宿主细胞环境可以是酵母。此外，在该实施方案中，第一宿主细胞环境和第二宿主细胞环境可以独立地选自汉逊酵母属(Hansenula)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)和裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)。。

在另一个实施方案中，第一宿主细胞环境和/或第二宿主细胞环境可以是能够复制质粒的非真菌真核细胞。在这个实施方案中，第一宿主细胞环境和第二宿主细胞环境可以独立地选自衣藻属(Chlamydomomas)、网柄菌属(Dictyostelium)和内阿米巴属(Entamoeba)。

当细胞是原核细胞时，细胞可以是RecA⁺细胞或RecA^-细胞。

在本发明的范围内，任意推荐的宿主细胞类型是减毒的或未减毒的宿主细胞。

应理解，本发明的范围内考虑到了第一和第二宿主细胞环境的全部组合。

感兴趣的基因

在一个实施方案中，在本发明方法中使用的质粒包含感兴趣的基因。感兴趣的基因可以编码期望重组产生或可在治疗上使用的任何核苷酸或蛋白。

在其它实施方案中，感兴趣的基因可以是在治疗上或预防上有用的蛋白。在另一个实施方案中，基因可以是适合作为疫苗使用的基因。

一步法

通常，可以按照上文所述，利用第一宿主细胞环境和第二宿主细胞环境来实施本发明方法。然而，在可选的实施方案中，可以合成或化学连接质粒，并且将质粒直接转化入第二宿主细胞环境。这个方法将不需要第一宿主细胞环境。因此，本发明包括利用单一宿主细胞环境的方法，所述单一宿主细胞环境能够实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组，从而去除选择标记基因。

该可选方法具有意想不到的优点，即，在缺少质粒维持系统的情况下，去除选择标记基因之后，第二宿主细胞环境内维持质粒。

质粒

在一个实施方案中，本发明还包括通过本发明方法制备的无选择标记基因的质粒。该质粒可以从第二宿主细胞环境分离和/或纯化。

在另一个实施方案中，本发明还包括含有通过本发明方法制备的无选择标记基因的质粒的第二宿主细胞环境。

在另一个实施方案中，本发明包括包含根据本发明方法制备的质粒和药学上可接受的的赋形剂的组合物。

含有质粒的宿主细胞

在一个实施方案中，本发明还包括含有无选择标记基因的质粒的宿主细胞。这样的宿主细胞也可以描述为缺少质粒维持系统。在一个实施方案中，宿主细胞内的质粒包含残留的位点特异性重组酶靶位点。残留的位点特异性重组酶靶位点是初始存在的两个位点特异性重组酶靶位点间重组后在质粒上留下的位点。因此，在一个实施方案中，宿主细胞内的质粒可以包含单一的位点特异性重组酶靶位点。这允许含有通过本发明方法制备的质粒的宿主细胞不同于含有通过其它方法制备的质粒的宿主细胞，通过其它方法制备的质粒不含有残留的位点特异性重组酶靶位点。如果需要，宿主细胞可以包含质粒维持系统，例如上文讨论的ORT(操纵基因-阻遏蛋白滴定)或oriSELECT。

在一个实施方案中，宿主细胞可以包含编码诱导型位点特异性重组酶的基因。诱导型位点特异性重组酶可以存在于宿主细胞染色体上。

在一个实施方案中，宿主细胞可以是未修饰的宿主细胞。

只能通过本发明的方法制备不含有质粒维持系统的未修饰的宿主细胞，因为之前未预期的是，不含有质粒维持系统的宿主细胞能够保留质粒。

宿主细胞可以是上文结合本发明方法讨论的任意细胞类型。例如，宿主细胞可以是革兰氏阴性细菌细胞(例如来自埃希氏菌属、沙门氏菌属、志贺氏菌属、农杆菌属、假单胞菌属或弧菌属)、革兰氏阳性细菌细胞(例如来自芽孢杆菌属、链霉菌属、李斯特菌属、乳杆菌属、乳球菌属或分枝杆菌属)、古生菌、酵母细胞(例如来自汉逊酵母属、毕赤酵母属、酵母属或裂殖酵母属)或能够复制质粒的非真菌真核生物(例如来自衣藻属、网柄菌属或内阿米巴属)。

宿主细胞中的质粒上含有的残留的位点特异性重组酶靶位点可以是结合本发明方法讨论的任意位点特异性重组酶靶位点，包括Ecdif、cer、psi、pif、mwr、Bsdif、loxP、FRT和RS。

如以下讨论，这样的宿主细胞可利于用作治疗剂或疫苗。

在另一个实施方案中，本发明包括组合物，所述组合物包含含有无选择标记基因的质粒的未修饰的宿主细胞和药学上可接受的赋形剂。

质粒和宿主细胞的用途

在本发明的范围内，根据本发明方法制备的质粒和在缺少质粒维持系统的情况下包含质粒的宿主细胞可以有多种用途。

根据本发明方法制备的质粒和在缺少质粒维持系统的情况下包含质粒的宿主细胞主要可用于治疗。治疗可以是治疗性的或预防性的。

作为治疗剂和疫苗的重组蛋白的制备

在一个实施方案中，可以使含有无选择标记基因的质粒的转化细胞(即第二宿主细胞环境)生长在营养培养基瓶或发酵罐中来产生重组蛋白，后期收获重组蛋白，用作蛋白治疗剂或蛋白疫苗。

治疗性DNA和DNA疫苗的制备

在另一个实施方案中，可以使含有无选择标记基因的质粒的转化细胞(即第二宿主细胞环境)生长在营养培养基瓶或发酵罐中来产生DNA序列，后期收获DNA序列，用作DNA治疗剂或DNA疫苗。DNA治疗剂或DNA疫苗通常采用质粒的形式，但也可以通过质粒的后续处理而采用线性DNA分子的形式。这样的处理可以包括使用限制性核酸内切酶。

使用活细菌载体向动物递送重组蛋白和DNA

在另一个实施方案中，可以将含有无选择标记基因的质粒的转化细胞(即第二宿主细胞环境)直接给予需要治疗的动物。在这个实施方案中，细胞环境可以是减毒的或未减毒的。在这个实施方案中，细胞可以将其内容物释放到患者中，从而产生治疗或免疫效应。例如，减毒的沙门氏菌(Salmonella)可用于将表达重组抗原的质粒经口递送至胃肠道内衬的粘膜免疫系统(Leckenby et al.2009,Microb.Pathog.46:201-206)。或者，例如当细胞是农杆菌属的成员时，含有无选择标记基因的质粒的第二宿主细胞环境可用于将质粒DNA直接递送至植物，从而实现遗传修饰(Ebinuma et al.2001,Plant Cell Rep.20:383-392)。

可以通过本领域已知的任何方法，将上文所述的无选择标记基因的质粒或含有质粒的细胞给予患者。这些方法包括但不限于口服给药、真皮内给药、皮下给药、肌肉内给药、粘膜内给药、静脉内给药、腹腔内给药或经鼻给药。

在本发明的范围内，所要治疗的患者可以是需要治疗的任何动物，包括人、鱼、狗、猫、猴、山羊、骆驼、猪、绵羊、大鼠、小鼠和马。

在另一个实施方案中，本发明包括接种患者或治疗患者的方法，所述方法包括给予患者药学上可接受的量的含有无选择标记基因的质粒的转化细胞或根据本发明方法制备的质粒。

在另一个实施方案中，本发明包括含有无选择标记基因的质粒的转化细胞或根据本发明方法产生的质粒，所述细胞和质粒可用于接种患者或治疗患者疾病。

在其它的实施方案中，本发明包括含有无选择标记基因的质粒的转化细胞或根据本发明方法产生的质粒，所述细胞和质粒可用于制备接种患者或治疗患者疾病的药物。

试剂盒和试剂盒中使用的宿主细胞

在一个实施方案中，本发明包括用于实施本发明的方法的试剂盒。

试剂盒可以包含下述或由下述组成：

i)第一宿主细胞环境，其包含含有选择标记基因的质粒，选择标记基因的侧翼为位点特异性重组酶靶位点，其中第一宿主细胞环境不能实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组；以及

ii)第二宿主细胞环境，其能够实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组，从而去除选择标记基因。

在一个实施方案中，试剂盒中的第一和第二宿主细胞环境可以存在于分别的细胞，即，试剂盒包含第一宿主细胞和第二宿主细胞。试剂盒中存在的宿主细胞可以是任何细胞类型。具体而言，宿主细胞可以来自上文结合本发明方法讨论的任意细胞类型。

第一宿主可以包含基因中的突变，所述基因编码参与质粒的位点特异性重组的一个或多个蛋白。优选地，在第一宿主细胞中可以突变编码附属蛋白PepA、ArgR或ArcA中一个或多个的染色体基因。

由于存在内源性XerC/XerD和/或附属蛋白PepA、ArgR或ArcA中一个或多个的活性形式，第二宿主细胞可以能够实现位点特异性重组酶靶位点之间的重组。

位点特异性重组酶靶位点可以是结合本发明方法讨论的任意位点特异性重组酶靶位点。

试剂盒还可以包括技术说明书。

本发明还提供了宿主细胞，该细胞适于作为本发明的试剂盒或方法中的第一宿主细胞环境。具体而言，本方法提供了包含质粒的宿主细胞，所述质粒含有选择标记基因，选择标记基因的侧翼为位点特异性重组酶靶位点，其中宿主细胞还在编码附属蛋白PepA、ArgR或ArcA中一个或多个的染色体基因的一个或多个中包含失活突变。

根据本发明该方面的宿主细胞可以来自任意细胞类型。具体而言，宿主细胞可以来自上文结合本发明方法讨论的任意细胞类型。

上文所述以及试剂盒中的宿主细胞的质粒上包含的位点特异性重组酶靶位点可以是结合本发明方法讨论的任意位点特异性重组酶靶位点。这些宿主细胞的质粒上的选择标记基因可以是上文结合本发明方法讨论的任意选择标记基因。

以下通过举例的方式更详细地描述本发明。应理解，可以对实施例中描述的系统进行修改。

附图简要说明

图1展示了本发明优选的实施方案中的方法的示意图，通过本方法，可以从质粒去除抗生素抗性基因。

图2展示了质粒pORT3CMV、pORT3aCMV和pORT4CMV的示意图。

图3A)展示了在大肠杆菌pepA突变株DS957中扩增的质粒pORT3CMV和pORT4CMV(“Ac.seq.”是指含有pepA和ArgR/ArcA结合位点的附属序列，“cat”是氯霉素抗性基因；未注明其它质粒元件)。B)展示了将质粒转化入未突变的大肠杆菌株DH1之后，通过同向重复的psi位点和附属序列的Xer重组从pORT3CMV产生质粒pORT3aCMV。C)在琼脂糖凝胶上展示了在大肠杆菌DH1的每天次培养中pORT3CMV和pORT4CMV的质粒制备物。

图4展示了质粒pSC2c及其衍生质粒pSC2，在pSC2中，在Xer重组事件后，cat基因已经被去除。

图5A)展示了通过同向重复的psi位点和附属序列处的Xer重组，从pSC2c产生质粒pSC2；B)展示了含有NdeI消化的pSC2c和pSC2的琼脂糖凝胶，pSC2c来自大肠杆菌pepA突变株DS957，pSC2是通过在鼠伤寒沙门氏菌株SL3261中4天次培养而产生的。

实施例1

从pORT1构建真核表达质粒pORT1-CMV(Cranenburgh et al.2001.Nucleic Acids Res.29:e26)。用NruI和PvuII酶切表达载体pcDNA3.1(+)(Invitrogen,Carlsbad,CA)，从而去除包含P_CMV和bGH pA的区域。将该片段连入已被HincII和Ecl136II酶切的pORT1，产生pORT1-CMV。

使用引物5'ACYC和3'ACYC，通过PCR从pACYC184(New EnglandBiolabs,Hitchin,U.K.)中扩增氯霉素抗性基因cat；之后使用AvrII进行酶切，使用碱性磷酸酶进行去磷酸化，然后用FseI进行酶切。用引物对5AvrTPSI、3AvrPSI和引物对5FsePSI、3fSEPSI产生编码pSC101(DSMZ,Braunschweig,Germany)中psi基因座的两个PCR产物；分别使用AvrII和FseI将这些PCR产物进行酶切。使用AvrII和FseI酶切pORT1-CMV质粒，并进行去磷酸化。

利用三片段连接，将pORT1-CMV、pACYC184和AvrII-酶切的psiPCR产物组合起来，产生中间质粒，命名为pORTcatPSI。然后，用FseI对这个质粒进行酶切，去磷酸化，并与FseI-酶切的psi PCR产物连接，产生载体pORT3-CMV(psi位点处于同向重复方向)和pORT4-CMV(psi位点处于反向重复方向)。

将冻存的菌株DH1(pORT3a-CMV)和DH1(pORT4-CMV)接种在固体生长培养基中，培养后获得单克隆。将每个菌株的单克隆接种在LB培养基中培养。这些培养物称为“第0天”，然后将这些培养物培养24小时。测量600nm下的光密度，按照确定的光密度，接种“第1天”培养物，培养“第1天”培养物24小时。重复这个程序，直至细胞总代数超过40。每天取出标准化的样品，冻存，以便后期分析。利用“mini-prep”从冻存样品中提取质粒DNA，通过琼脂糖凝胶电泳检查DNA。

pORT3-CMV中的位点特异性重组酶靶位点在正确的相对方向(同向重复)，这样未修饰的大肠杆菌DH1细胞中的Xer重组产生无抗生素抗性基因的质粒pORT3a-CMV。在重复培养周期(4天)中，质粒稳定保持。pORT4-CMV质粒与pORT3-CMV的不同之处仅在于位点特异性重组酶靶位点在不正确的相对方向(反向重复)。当pORT4-CMV被转化入相同的未修饰的大肠杆菌DH1株时，Xer重组不能发生，因此保留了抗生素抗性基因。仅仅两天重复培养后，来自抗生素抗性基因的代谢负担导致细胞丢失了pORT4-CMV。这证明：在细菌细胞中保留了无选择标记基因的质粒，而未对所述细菌细胞经进行修饰，使其包含活性质粒维持系统。

实施例2

为了构建低拷贝数表达载体pSC2c，使用引物Tetlaccat1和Tetlaccat2扩增pORT3-CMV的侧翼具有psi的cat基因盒，并在其上游引入lac操纵基因。将该PCR产物克隆入pCR2.1，产生pCRcatpsi。使用引物a101和as101，通过PCR扩增pSC101的复制原点，并将其克隆入pCR2.1-TOPO，产生pCR101。将包含侧翼具有psi的cat基因盒的pCRcatpsi的BspHI片段与pCR101的BspHI片段连接，产生p101cat。使用引物Ndepag1和Bsppag1从沙门氏菌基因组DNA中通过PCR产生pagC启动子。将PCR产物克隆入pCR2.1，产生pCRpag1。使用PCR引物Notpag1和Notpag2，从pCRpag1扩增pagC启动子。将经NotI处理的PCR产物克隆入经NotI酶切的p101cat，产生pSC2c。需要的话，将大肠杆菌pepA突变株用于克隆操作。

将pSC2c质粒转化入鼠伤寒沙门氏菌SL3261，首先，在含有氯霉素的LB琼脂平板上选择转化子。分离单克隆，并在无抗生素的LB培养基中过夜培养。Xer重组导致cat基因被删除，产生pSC2，并且鉴定出了SL3261(pSC2)的氯霉素敏感克隆。

为了评价质粒的保持性，在LB培养基中接种SL3261(pSC2)的单克隆，并培养24小时(在图5B中标为“第1天”)。测量600nm下的光密度，按照确定的光密度，开始第二LB培养基培养。重复这个操作4天，直至细胞的总代数超过40。每天收集标准化的细胞样品，并提取质粒DNA。通过NdeI消化使这些质粒DNA线性化，并进行琼脂糖凝胶电泳。使用从大肠杆菌pepA突变株DS957制备的质粒DNA作为参照(图5B中的pSC2c)。在4天重复培养中，质粒稳定维持，这表明本发明也适用于沙门氏菌中的低拷贝数质粒。

参考文献

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Claims

1.制备无选择标记基因的质粒的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在第一细胞内环境中培养含有选择标记基因的质粒，所述选择标记基因的两边侧翼为位点特异性重组酶靶位点，所述第一细胞内环境不能实现所述位点特异性重组酶靶位点之间的重组，所述位点特异性重组酶靶位点选自Ecdif、cer、psi、pif或mwr，其中所述第一细胞内环境中的编码PepA、ArgR或ArcA的基因中的一个或多个中发生突变，使得编码PepA、ArgR或ArcA的基因中的一个或多个失活，其中所述质粒包含附属蛋白的附属序列，并且所述附属序列与所述位点特异性重组酶靶位点能形成二聚化作用天然形成的同向重复二聚体解离位点；以及

b)随后在第二细胞内环境中培养所述质粒，所述第二细胞内环境能够实现所述位点特异性重组酶靶位点之间的重组，从而去除所述选择标记基因，所述第二细胞内环境包含ArgR或ArcA和PepA的活性形式，并包含选自XerC或XerD的位点特异性重组酶。

2.如权利要求1所述的方法，还包括以下步骤：

c)在细胞培养中维持所述无选择标记基因的质粒。

3.如权利要求1所述的方法，还包括以下步骤：

d)从所述第二细胞内环境分离所述无选择标记基因的质粒。

4.如权利要求2所述的方法，还包括以下步骤：

d)从所述第二细胞内环境分离所述无选择标记基因的质粒。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述第一细胞内环境和所述第二细胞内环境在不同的细胞内。

6.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述第一细胞内环境和所述第二细胞内环境在相同的宿主细胞中形成。

7.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述选择标记基因是抗生素抗性基因。

8.如权利要求5所述的方法，其中所述选择标记基因是抗生素抗性基因。

9.如权利要求6所述的方法，其中所述选择标记基因是抗生素抗性基因。

10.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述选择标记基因能允许产生在所述第一和/或第二细胞内环境中缺少，但又是所述第一和/或第二细胞内环境必需的代谢物。

11.如权利要求5所述的方法，其中所述选择标记基因能允许产生在所述第一和/或第二细胞内环境中缺少，但又是所述第一和/或第二细胞内环境必需的代谢物。

12.如权利要求6所述的方法，其中所述选择标记基因能允许产生在所述第一和/或第二细胞内环境中缺少，但又是所述第一和/或第二细胞内环境必需的代谢物。

13.如权利要求1-4、8、9、11和12中任一项所述的方法，其中所述第一细胞内环境和/或所述第二细胞内环境是革兰氏阴性细菌细胞。

14.如权利要求5所述的方法，其中所述第一细胞内环境和/或所述第二细胞内环境是革兰氏阴性细菌细胞。

15.如权利要求6所述的方法，其中所述第一细胞内环境和/或所述第二细胞内环境是革兰氏阴性细菌细胞。

16.如权利要求7所述的方法，其中所述第一细胞内环境和/或所述第二细胞内环境是革兰氏阴性细菌细胞。

17.如权利要10所述的方法，其中所述第一细胞内环境和/或所述第二细胞内环境是革兰氏阴性细菌细胞。

18.如权利要求13所述的方法，其中所述第一细胞内环境和所述第二细胞内环境独立地选自埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、农杆菌属(Agrobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)和弧菌属(Vibrio)。

19.如权利要求14-17中任一项所述的方法，其中所述第一细胞内环境和所述第二细胞内环境独立地选自埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、农杆菌属(Agrobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)和弧菌属(Vibrio)。

20.如权利要求1-4、8、9、11、12和14-18任一项所述的方法，其中所述质粒编码一个或多个感兴趣的基因。

21.如权利要求5所述的方法，其中所述质粒编码一个或多个感兴趣的基因。

22.如权利要求6所述的方法，其中所述质粒编码一个或多个感兴趣的基因。

23.如权利要求7所述的方法，其中所述质粒编码一个或多个感兴趣的基因。

24.如权利要求10所述的方法，其中所述质粒编码一个或多个感兴趣的基因。

25.如权利要求13所述的方法，其中所述质粒编码一个或多个感兴趣的基因。

26.如权利要求19所述的方法，其中所述质粒编码一个或多个感兴趣的基因。