CN118086349A - 一种联合Cas9和自然切离的细菌中可移动遗传元件的敲除方法 - Google Patents
一种联合Cas9和自然切离的细菌中可移动遗传元件的敲除方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种联合Cas9和自然切离的细菌中可移动遗传元件的敲除方法，包括以下步骤：(1)设计针对MGE序列的sgRNA，将表达sgRNA和Cas9的pMBLcas9‑sgRNA质粒转移到目标细菌中，筛选阳性接合子；(2)培养阳性接合子，产生Cas9/sgRNA复合物消除MGE；(3)将步骤(2)的细菌培养物划线在不含抗生素的固体培养基上，以获得单菌落；(4)挑选单菌落，检测MGE的消除情况，获得MGE敲除菌株。该方法不仅推动细菌中MGEs的研究，而且对于快速生成工业生产等商业用途菌株具有重要意义。
Description
技术领域
本发明属于生物领域，具体涉及一种联合Cas9和自然切离的细菌中可移动遗传元件的敲除方法。
背景技术
可移动遗传元件(mobile genetic elements，MGEs)，包括噬菌体、质粒、转座子、整合性转移元件、和毒力岛和抗性岛等基因岛，在细菌基因组中广泛存在。在生态系统中，这些MGEs携带着与增强宿主适应性相关的基因，如抗生素抗性基因、毒力基因等，促进着细菌宿主的环境适应性和进化。然而，在生物技术领域，一些MGEs在工业生产菌株中的存在可能导致问题。例如，原噬菌体可能发生裂解-溶解转换，在宿主细胞内复制增殖并释放子代噬菌体，最终导致细菌裂解，引发发酵过程失控，同时也会对发酵产品质量造成不利影响；毒力岛上毒素蛋白的表达可能导致细菌培养物的污染，质粒携带的抗生素抗性基因的表达会造成抗生素抗性基因传播，这在生物技术和环境中构成严重问题。因此，工业生产菌株在使用前需要尽量清除原噬菌体、毒力岛和抗性岛等不利于生产的MGEs。在科学研究中，为了更清晰地阐明这些MGEs的作用，也需要建立完善的MGEs敲除方法。
MGEs以多种形式存在于细菌细胞内，包括整合在基因组中的整合形式，以及类似质粒的环状形式。有些MGEs，如噬菌体，甚至可以在细菌细胞质中复制，以多个拷贝的环状形式存在。对整合形式存在的MGEs而言，其在细菌宿主中扮演着双重角色，不仅通过携带的基因增强宿主的适应性，也可以通过整合/切除过程改变细菌基因组。整合/切除过程可能导致整合位点的基因启动子或编码序列的改变，甚至导致基因中断，影响宿主细菌的生理功能。开发一种既不会人为影响整合位点序列，又能完整敲除掉整合和环状形式的MGEs非常重要。
已报道了一些针对特定MGEs的敲除方法。比如用紫外光处理宿主细菌、在高温下培养细菌，或者添加化学试剂来处理细菌破坏质粒复制的质粒清除方法。其他方法，如利用质粒不相容性，也被用来清除细菌中的质粒。然而，这些方法并不适用于去除已整合到细菌基因组中的MGEs。为解决这一问题，最初用于单基因敲除的同源重组敲除方法被用于去除整合型MGEs。其中一种方法是一步灭活法(one-step inactivation approach)，已成功用于从大肠杆菌基因组中去除隐匿性原噬菌体。该方法利用噬菌体λRed重组酶，利用敲除区域的短同源序列，将目标噬菌体替换为一个抗性基因。引入抗生素基因对工业生产是不利的。另一种方法是利用自杀质粒进行同源重组敲除。例如，在Pseudomonasputida KT2440中，使用自杀质粒pK18sacBmob删除了11个基因组岛。这种方法是无标记的，但在遗传操作之前需要准确预测MGE附着位点。无论是一步灭活法还是使用自杀质粒，由于都需要利用敲除片段两侧的同源序列进行同源重组，可能无法有效去除MGEs的环状外染色体形式，且可能影响整合位点的侧翼基因。
表达相应的切除酶/重组方向因子(excisionase/recombinationdirectionality factors,RDF)也被用于细菌基因组中一些MGEs的去除。例如，过表达切除酶/促进噬菌体的切离，成功地从大肠杆菌和希瓦式菌中去除了P4和P2噬菌体。然而，并非所有MGE都编码切除酶/重组因子，或者有些MGEs编码新型切除酶/重组因子需要事先用实验鉴定非常耗时。
因此，开发简单可行的能够靶向完全去除细菌中MGEs的遗传操作技术至关重要。
发明内容
传统的质粒消除策略无法有效去除MGEs的整合形式，而基于同源重组的技术则难以有效去除环状形式，且可能影响整合位点的侧翼基因。过表达切离酶/重组方向因子受限于一些可移动遗传元件不表达切离酶。因此，我们提供全新的一种联合Cas9和自然切离的细菌中可移动遗传元件的敲除方法(以下简称Cas9-NE方法)，该方法依赖于CRISPR/Cas9系统的双链切割活性和MGE的自然切除，不仅可以实现对特定MGE的整合和环状多拷贝形式的一步去除，而且不会对整合位点侧翼序列造成人为影响。
为实现上述的目的，本发明采用如下技术方案：
一种联合Cas9和自然切离的细菌中可移动遗传元件的敲除方法，其包括以下步骤：
(1)设计针对MGE序列的sgRNA，将表达sgRNA和Cas9的pMBLcas9-sgRNA质粒转移到目标细菌中，筛选阳性接合子；
(2)将阳性接合子在含有氯霉素和L-阿拉伯糖的培养基中培养，产生Cas9/sgRNA复合物，靶向消除MGE；
(3)将步骤(2)得到的细菌培养物划线在不含抗生素的固体培养基上，以获得单菌落；
(4)挑选单菌落，检测MGE的消除情况，获得MGE敲除菌株。
优选地，所述设计针对MGE序列的sgRNA为设计针对MGE序列的20-nt的碱基互补配对区域的特异sgRNA。
优选地，所述表达sgRNA和Cas9的pMBLcas9-sgRNA质粒的构建方法包括如下步骤：设计引物引入与sgRNA互补配对的碱基序列，用该引物以pgRNA-bacteria质粒为模板，扩增获得2584bp的PCR片段，然后以该PCR产物为模板，用sg-F、sg-R引物扩增获得581bp的PCR片段，将该片段用连接至pMBLcas9质粒，构建表达sgRNA和Cas9的质粒pMBLcas9-sgRNA，所述sg-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述sg-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选地，将阳性转接子在含有氯霉素和L-阿拉伯糖的培养基中培养后，如有需要再按体积比例1/1000转接培养液至新鲜的含有氯霉素和L-阿拉伯糖的培养基中再培养，以提高消除效率。
优选地，所述检测MGE的消除情况为通过多套引物进行PCR扩增检测MGE的消除情况。
优选地，所述细菌为弧菌，所述MGE为内源质粒、原噬菌体、毒力岛或抗性岛。
优选地，所述细菌为溶珊瑚弧菌SCSIO 43001，所述MGE为内源质粒pMBL43001；或所述细菌为施罗氏弧菌SCSIO 43133，所述MGE为原噬菌体Pvs1；或所述细菌为霍乱弧菌N16961，所述MGE为中毒力岛VPI-2。
优选地，当所述细菌为溶珊瑚弧菌SCSIO 43001，所述MGE为内源质粒pMBL43001时，具体步骤为：
(1)设计特异性靶向质粒pMBL43001的parA基因的20-nt碱基互补配对的sgRNA；
(2)在Ec-parA-F/Ec-parA-R引物对上引入这20-nt碱基序列，用该引物对以pgRNA-bacteria质粒为模板，扩增获得2584bp的PCR片段，然后以该PCR产物为模板，用sg-F/sg-R引物对扩增获得581bp的PCR片段，将该片段用连接至pMBLcas9质粒，构建含有parA-sgRNA和表达Cas9的质粒pMBLcas9-parA；
(3)利用接合转移实验将质粒pMBLcas9-parA转入溶珊瑚弧菌SCSIO 43001，产生重组菌株43001/pMBLcas9-parA，利用PCR扩增和测序筛选获得正确的接合子；
(4)将接合子在含有氯霉素和L-阿拉伯糖的2216E液体培养基中培养12小时，再体积比1/1000转接培养液至新鲜的含有氯霉素和L-阿拉伯糖的2216E液体培养基中再培养12小时，培养结束后，将细菌培养物划线在无抗2216E琼脂平板上；
(5)挑选单菌落，使用4对pBML43001的特异引物1F/1R、2F/2R、3F/3R、4F/4R进行菌落PCR，并以染色体的一对引物cF/cR作为对照，获得pMBL43001敲除菌株；
所述Ec-parA-F/Ec-parA-R引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示，所述sg-F/sg-R引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述引物1F/1R、2F/2R、3F/3R、4F/4R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-12所示，所述引物cF/cR的核苷酸序列如SEQ ID NO.13-14所示。
优选地，当所述细菌为施罗氏弧菌SCSIO 43133，所述MGE为原噬菌体Pvs1时，具体步骤为：
(1)设计特异性靶向原噬菌体Pvs1的repressor基因cI的20-nt碱基互补配对的sgRNA；
(2)在Ec-Pvs1cI-F/Ec-Pvs1cI-R引物上引入这20-nt碱基序列，用该引物对以pgRNA-bacteria质粒为模板，扩增获得2584bp的PCR片段，然后以该PCR产物为模板，用sg-F/sg-R引物对扩增获得581bp的PCR片段，将该片段用连接至pMBLcas9质粒，构建含有cI-sgRNA和表达Cas9的质粒pMBLcas9-cI；
(3)利用接合转移实验将pMBLcas9-cI转入SCSIO 43133，产生重组菌株43133/pMBLcas9-cI，利用PCR扩增和测序筛选获得正确的接合子；
(4)将接合子在含有氯霉素和L-阿拉伯糖的2216E液体培养基中培养12小时，再按体积比例1/1000转接培养液至新鲜的含有氯霉素和L-阿拉伯糖的2216E液体培养基中再培养12小时，培养结束后，将细菌培养物划线在无抗2216E琼脂平板上；
(5)挑选单菌落，使用Pvs1特异的整合酶引物int-F/int-R及检测Pvs1切离的引物Pvs1-bF、Pvs1-bR进行筛选，并利用整合位点两侧的四组交叉引物Pvs1-bF/Pvs1-bR、Pvs1-cF/Pvs1-cR、Pvs1-cF/Pvs1-bR和Pvs1-bF/Pvs1-cR进行PCR验证，获得Pvs1敲除菌株；
所述Ec-Pvs1cI-F/Ec-Pvs1cI-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.23-24所示，所述sg-F/sg-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述int-F/int-R的核苷酸序列如SEQ IDNO.29-30所示，所述Pvs1-bF的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，所述Pvs1-bR的核苷酸序列如SEQ ID NO.26所示，所述Pvs1-cF的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示，所述Pvs1-cR的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示。
优选地，当所述细菌为霍乱弧菌N16961，所述MGE为中毒力岛VPI-2时，具体步骤为：
(1)设计特异性靶向毒力岛VPI-2的整合酶基因intV2的20-nt碱基互补配对的sgRNA；
(2)在Ec-intV2-F/Ec-intV2-R引物上引入这20-nt碱基序列，用该引物对以pgRNA-bacteria质粒为模板，扩增获得2584bp的PCR片段，然后以该PCR产物为模板，用sg-F/sg-R引物对扩增获得581bp的PCR片段，将该片段用连接至pMBLcas9质粒，构建含有intV2-sgRNA和表达Cas9的质粒pMBLcas9-intV2；
(3)利用接合转移实验将pMBLcas9-intV2转入霍乱弧菌N16961，产生重组菌株N16961/pMBLcas9-intV2，利用PCR扩增和测序筛选获得正确的接合子；
(4)将接合子在含有氯霉素和L-阿拉伯糖的LB培养基中培养12小时，再按体积比例1/1000转接培养液至新鲜的含有氯霉素和L-阿拉伯糖的LB液体培养基中再培养12小时，培养结束后，将细菌培养物划线在无抗LB琼脂平板上；
(5)挑选单菌落，使用VPI-2特异的整合酶引物VPI2-inF/VPI2-inR进行筛选突变株，并利用整合位点两侧的三组交叉引物VPI2-bF/VPI2-bR、VPI2-cF/VPI2-dR和VPI2-dF/VPI2-cR进行PCR验证，获得Pvs1敲除菌株；
所述Ec-intV2-F/Ec-intV2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.15-16所示，所述sg-F/sg-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述VPI2-inF/VPI2-inR的核苷酸序列如SEQ IDNO.21-22所示，所述VPI2-bF的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述VPI2-bR的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，所述VPI2-cF的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，所述VPI2-cR的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
本发明的优点：
开发了一种全新的Cas9-NE方法，该方法依赖于CRISPR/Cas9系统的双链切割活性和MGE的自然切除，无论是整合形式还是环状多拷贝形式的MGE都可以完整去除，而且不会对整合位点侧翼序列造成人为影响。Cas9-NE方法不仅推动细菌中MGEs的研究，而且对于快速生成工业生产等商业用途菌株具有重要意义。
附图说明
图1是Cas9-NE方法去除可移动遗传元件的工作流程。
图2是Cas9-NE方法有效消除菌株V.coralliilyticus SCSIO 43001中的天然质粒pMBL43001。(a)在菌株SCSIO 43001中消除pMBL43001的示意图，以及用于PCR验证的引物。(b)使用四对pMBL43001上的特异引物对(1F/1R,2F/2R,3F/3R和4F/4R)和染色体上引物对(cF/cR)进行PCR验证pMBL43001的消除。(c)氯霉素(Cm)敏感菌落的筛选。图(b)和(c)中的10个单菌落是相同的，图(b)和(c)中的蓝色数字表示成功消除pMBL43001的单菌落。数字1、6、8和9是成功消除pMBL43001且丢失pMBLcas9-parA的单菌落。
图3是Cas9-NE方法可有效用于消除菌株V.shilonii SCSIO 43133中的原噬菌体Pvs1。(a)Pvs1原噬菌体的基因图谱及检测引物位置。(b)使用所示引物对Pvs1敲除菌株进行PCR筛选。(c)利用附着位点两侧的四对引物组进行PCR验证Pvs1敲除突变株。图b-c中通道的数字相同表示同一菌落，蓝色数字表示Pvs1敲除的单菌落。(d)PCR检测SCSIO 43133野生型和ΔPvs1细胞中Pvs1的切除率和染色体外环状拷贝数。"ND"代表"未检测到"，表明在ΔPvs1中检测attP量的Ct值大于36。
图4是Cas9-NE方法可有效用于去除菌株V.cholerae N16961中的毒力岛VPI-2。(a)毒力岛VPI-2基因图谱和检测引物位置。(b)使用int-F/int-R引物对已去除VPI-2突变体进行PCR筛选。(c)使用a中所示的引物组对VPI-2敲除株进行PCR验证。图b-c中通道的数字相同表示同一菌落，的蓝色数字突出显示了已去除VPI-2的菌落。(d)VPI-2敲除前后，宿主菌N16961运动性检测，左侧为代表性图像和右侧为定量分析结果。数据显示为均值±标准偏差。两组数据使用无配对t检验进行比较(n＝5)。
具体实施方式
在Cas9-NE方法中，需要设计一个针对MGE序列的20-nt的碱基互补配对区域的特异sgRNA(small guide RNA)，并利用质粒同时表达sgRNA组分和Cas9蛋白。sgRNA中的20-nt序列可以位于MGE的基因编码区或间隔区，需要高度特异，以避免脱靶效应。不建议将其定位于转座子或其侧翼序列，因为这可能增加转座子介导的重组风险。可以通过上传目标细菌的全基因组序列，并使用在线工具(例如CRISPy-web：https://crispy.secondarymetabolites.org/#/input)进行设计，来确定sgRNA中的20个核苷酸碱基配对区域。
MGE消除的一般实验过程如图1所示，包括四个步骤：首先，通过接合转移实验将表达sgRNA和Cas9的pMBLcas9-sgRNA质粒转移到目标细菌中，并使用添加氯霉素的培养基筛选含有pMBLcas9-sgRNA的转接子，用PCR扩增和测序进行验证。其次，将正确的转接子在含有氯霉素(Cm)和L-阿拉伯糖的培养基中培养8-12小时，形成用于MGE消除的Cas9/sgRNA复合物。如果需要，可以通过将细菌培养物的1/1000转移至新鲜培养基来增加MGE清除效率。第三，将细菌培养物划线在不含抗生素的琼脂平板上，以获得单个菌落。第四，挑选单个菌落，并通过多套引物进行PCR扩增检测MGE的消除情况。质粒pMBLcas9-sgRNA不稳定，可以在传代培养过程中丢失。因此可以通过丢失氯霉素抗性来确认菌落中质粒pMBLcas9-sgRNA的缺失，最终获得去除MGE并丢失pMBLcas9-sgRNA的菌落。Cas9-NE方法不仅可以进行各种MGE的研究，还对于快速生成无原噬菌体和毒力岛和抗性岛的工业生产菌株具有重要意义。
本发明聚焦于细菌中可移动遗传元件的完全去除，以敲除弧菌中质粒、原噬菌体和毒力岛为例。以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
本发明实施例所使用的引物如表1所示。
实施例1：对溶珊瑚弧菌SCSIO 43001中内源质粒pMBL43001进行完整消除，获得不含pMBL43001的溶珊瑚弧菌SCSIO 43001
(1)上传SCSIO 43001的全基因组序列(CP024627-CP024629)至CRISPy-web：https://crispy.secondarymetabolites.org/#/input，设计特异性靶向质粒pMBL43001的parA基因的20-nt碱基互补配对的sgRNA(AAGGACGTGAATATCTAGCG)。
(2)在Ec-parA-F/Ec-parA-R引物对上引入这20-nt碱基序列，用该引物对以商业化的pgRNA-bacteria(2584bp)质粒为模板，扩增获得2584bp的PCR片段(条件为95℃ 5min；95℃30s，58℃ 30s，72℃ 120s，32循环)，然后以该PCR产物为模板，用sg-F/sg-R引物对扩增获得581bp的PCR片段(条件为95℃—5min；95℃—30s，58℃—30s，72℃—30s，32循环)，将该片段用连接至pMBLcas9(MK637405，构建过程见PMID：31203365)质粒的AhdI位点，构建含有parA-sgRNA和表达Cas9的质粒pMBLcas9-parA。
(3)通过化学转化pMBLcas9-parA转化入大肠杆菌WM3064，以WM3064/pMBLcas9-parA为供体，以SCSIO 43001为受体，各1mL过夜培养液按1:1体积比混合，点至含0.3mM的二氨基庚二酸(Diaminopimelic acid，DAP)LB固体平板上，30℃培养过夜进行接合转移实验将质粒pMBLcas9-parA转入SCSIO 43001，产生重组菌株43001/pMBLcas9-parA，利用sg-F/sg-R引物进行PCR扩增(条件为95℃ 10min；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，32循环)和测序筛选获得正确的接合子。
(4)将接合子在含有15μg/mL氯霉素和体积比0.3％L-阿拉伯糖的2216E液体培养基中培养重组菌株12小时，再体积比1/1000转接培养液至新鲜的含有15μg/mL氯霉素和体积比0.3％L-阿拉伯糖的2216E液体培养基中再培养12小时，以增加质粒的去除效率。培养结束后，将细菌培养物划线在无抗2216E琼脂平板上。
(5)随机挑选10个单菌落，以野生型(wt)为对照，使用4对pBML43001的特异引物(1F/1R、2F/2R、3F/3R、4F/4R)进行菌落PCR(条件为95℃ 10min；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃60s，32循环)，并以染色体的一对引物(cF/cR)作为对照(图2a)。PCR分析证实，在10个单菌落中有9个成功消除了质粒pMBL43001，表明pMBL43001的消除效率为90％(图2b)。
(6)为了确定上述10个单菌落是否也失去了pMBLcas9-parA质粒，我们将它们划线在两个2216E琼脂平板上进行氯霉素敏感筛选：一个2216E琼脂平板含15μg/mL氯霉素，另一个2216E琼脂平板不含氯霉素。丢失了pMBLcas9-parA质粒的单菌落对氯霉素敏感，无法在氯霉素琼脂平板上生长。由于pMBLcas9质粒的不稳定性，9个pMBL43001清除的菌落中有4个也丢失了pMBLcas9-parA质粒(图2c)。以上结果表明ΔpMBL43001突变菌株成功获得。
(7)为了检测ΔpMBL43001是否发生了任何其他突变，随机选取一个ΔpMBL43001突变体，以野生型SCSIO 43001未对照进行了全基因组重测序。使用breseq(版本0.37.1)进行突变分析显示，在测序的ΔpMBL43001突变体中pMBL43001环状形式都完全去除，且没有发现额外的突变。
实施例2：对施罗氏弧菌SCSIO 43133中原噬菌体Pvs1进行完整消除，获得不含Pvs1的施罗氏弧菌SCSIO 43133
(1)上传SCSIO 43133的全基因组序列(CP068024-CP068025)至CRISPy-web：https://crispy.secondarymetabolites.org/#/input，设计特异性靶向原噬菌体Pvs1的repressor基因cI的20-nt碱基互补配对的sgRNA(AGTTACTTTTGGCACTTGAG)。
(2)在Ec-Pvs1cI-F/Ec-Pvs1cI-R引物上引入这20-nt碱基序列，用该引物以商业化的pgRNA-bacteria质粒为模板，扩增获得2584bp的PCR片段(条件为95℃ 5min；95℃30s，58℃ 30s，72℃ 120s，32循环)，然后以该PCR产物为模板，用sg-F/sg-R引物扩增获得581bp的PCR片段(条件为95℃—5min；95℃—30s，58℃—30s，72℃—30s，32循环)，将该片段用连接至pMBLcas9质粒的AhdI位点，构建含有cI-sgRNA和表达Cas9的质粒pMBLcas9-cI。
(3)通过化学转化pMBLcas9-cI转化入大肠杆菌WM3064，以WM3064/pMBLcas9-cI为供体，以SCSIO 43133为受体，各1mL过夜培养液按1:1体积比混合，点至含0.3mM的二氨基庚二酸(Diaminopimelic acid，DAP)LB固体平板上，30℃培养过夜进行接合转移实验将质粒pMBLcas9-cI转入SCSIO 43133，产生重组菌株43133/pMBLcas9-cI，利用sg-F/sg-R引物进行PCR扩增(条件为95℃ 10min；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，32循环)和测序筛选获得正确的接合子。
(4)将接合子在含有15μg/mL氯霉素和体积比0.3％L-阿拉伯糖的2216E培养基中培养重组菌株12小时，再按体积比例1/1000转接培养液至新鲜的含有15μg/mL氯霉素和体积比0.3％L-阿拉伯糖的2216E培养基中再培养12小时，以增加质粒的去除效率。培养结束后，将细菌培养物划线在无抗2216E琼脂平板上。
(5)随机挑选13个单菌落，以野生型(wt)为对照，使用Pvs1特异的整合酶引物int-F/int-R及检测Pvs1切离的引物Pvs1-bF/Pvs1-bR(图3为bF/bR)进行筛选(引物位置如图3a所示)。菌落PCR(条件为95℃ 10min；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，32循环)分析证实，在13个单菌落中有13个成功去除了原噬菌体Pvs1(图3b)。随机选取其中一个单克隆)，利用整合位点两侧的四组交叉引物(Pvs1-bF/Pvs1-bR、Pvs1-cF/Pvs1-cR、Pvs1-bF/Pvs1-cR、Pvs1-cF/Pvs1-bR)进行PCR验证(图3c)，结果表明该单菌落中Pvs1完全消除。
(6)实时定量PCR(qPCR)验证野生型和Pvs1敲除株中Pvs1的切除率和染色体外环状拷贝数。实时定量PCR(qPCR)实验中，我们使用引物组Pvs1-qF/Pvs1-qR和Pvs1-qcirF/Pvs1-qcirR分别定量SCSIO 43133中Pvs1的attB和attP。染色体上的gyrB基因被用作参考基因(引物组43133gyrB-qF/qR)。attB/gyrB表示Pvs1的切除率，attP/attB表示Pvs1的染色体外环状拷贝数。结果表明，Pvs1可以以10-3的频率从SCSIO 43133的细菌染色体中切除。野生菌中Pvs1染色体外平均拷贝数为37(图3d)，说明Pvs1可以整合形式和多拷贝环状形式存在于细胞中。而ΔPvs1中切除率约为1，且检测不到环状形式，进一步说明ΔPvs1中整合形式和多拷贝环状形式都已经完全去除。
(7)为了检测ΔPvs1是否发生了任何其他突变，随机选取一个ΔPvs1突变体进行了全基因组重测序。使用breseq(版本0.37.1)进行突变分析显示，在测序的ΔPvs1突变体中原噬菌体Pvs1的整合形式和环状形式都完全去除，且没有发现额外的突变。
实施例3：为对霍乱弧菌N16961中毒力岛VPI-2进行完整去除，获得不含VPI-2的突变株ΔVPI-2
(1)上传霍乱弧菌N16961的全基因组序列(CP028827-CP028828)至CRISPy-web：https://crispy.secondarymetabolites.org/#/input，设计特异性靶向毒力岛VPI-2的整合酶基因intV2的20-nt碱基互补配对的sgRNA(CAATTCCGTTATAAACGACC)。
(2)在Ec-intV2-F/Ec-intV2-R引物上引入这20-nt碱基序列，用该引物以商业化的pgRNA-bacteria质粒为模板，扩增获得2584bp的PCR片段(条件为95℃ 5min；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 120s，32循环)，然后以该PCR产物为模板，用sg-F/sg-R引物扩增获得581bp的PCR片段(条件为95℃ 5min；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，32循环)，将该片段用连接至pMBLcas9质粒AhdI位点，构建含有intV2-sgRNA和表达Cas9的质粒pMBLcas9-intV2。
(3)通过化学转化pMBLcas9-intV2转化入大肠杆菌WM3064，以WM3064/pMBLcas9-intV2为供体，以N16961为受体，各1mL过夜培养液按1:1体积比混合，点至含0.3mM的二氨基庚二酸(Diaminopimelic acid，DAP)LB固体平板上，30℃培养过夜进行接合转移实验将质粒pMBLcas9-intV2转入N16961，产生重组菌株N16961/pMBLcas9-intV2，利用sg-F/sg-R引物进行PCR扩增(条件为95℃ 10min；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，32循环)和测序筛选获得正确的接合子。
(4)将接合子在含有15μg/mL氯霉素和体积比0.3％L-阿拉伯糖的LB培养基中培养重组菌株12小时，再按体积比例1/1000转接培养液至新鲜的含有15μg/mL氯霉素和0.3％L-阿拉伯糖的LB培养基中再培养12小时，以增加质粒的去除效率。培养结束后，将细菌培养物划线在无抗LB琼脂平板上。
(5)随机挑选13个单菌落，以野生型(wt)为对照，使用VPI-2特异的整合酶引物VPI2-inF/VPI2-inR(图4中inF/inR)筛选突变株(引物位置如图4a所示)。菌落PCR(条件为95℃ 10min；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，32循环)分析证实，在13个单菌落中有4个成功去除了VPI-2(图4b)。随机选取其中一个单克隆，利用整合位点两侧的三组交叉引物(VPI2-bF/VPI2-bR、VPI2-bF/VPI2-cR，VPI2-cF/VPI2-bR图4为bF、bR、cF、cR)进行PCR验证(图4c)，结果表明该单菌落中Pvs1完全消除。
(6)在25℃液体培养24小时后，使用含有0.25％琼脂(w/v)的LB培养基半固体琼脂平板测量野生型菌株霍乱弧菌N16961和突变菌株ΔVPI-2的运动性。为了量化运动性，测量游动直径，并通过GraphPad Prism(版本7.00)使用无配对t检验对两个样本进行分析。结果发现VPI-2敲除后N16961在含有0.25％琼脂的LB培养基半固体琼脂平板上的运动性显著降低(见图4d)。
表1本发明中使用的引物
下划线表示sgRNA中20-nt的序列
Claims (10)
1.一种联合Cas9和自然切离的细菌中可移动遗传元件的敲除方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)设计针对MGE序列的sgRNA，将表达sgRNA和Cas9的pMBLcas9-sgRNA质粒转移到目标细菌中，筛选阳性接合子；
(2)将阳性接合子在含有氯霉素和L-阿拉伯糖的培养基中培养，产生Cas9/sgRNA复合物，靶向消除MGE；
(3)将步骤(2)得到的细菌培养物划线在不含抗生素的固体培养基上，以获得单菌落；
(4)挑选单菌落，检测MGE的消除情况，获得MGE敲除菌株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述设计针对MGE序列的sgRNA为设计针对MGE序列的20-nt的碱基互补配对区域的特异sgRNA。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述表达sgRNA和Cas9的pMBLcas9-sgRNA质粒的构建方法包括如下步骤：设计引物引入与sgRNA互补配对的碱基序列，用该引物以pgRNA-bacteria质粒为模板，扩增获得2584bp的PCR片段，然后以该PCR产物为模板，用sg-F、sg-R引物扩增获得581bp的PCR片段，将该片段连接至pMBLcas9质粒，构建表达sgRNA和Cas9的质粒pMBLcas9-sgRNA，所述sg-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述sg-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将阳性接合子在含有氯霉素和L-阿拉伯糖的培养基中培养后，再按体积比例1/1000转接培养液至新鲜的含有氯霉素和L-阿拉伯糖的培养基中再培养，以扩大MGE的消除效率。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述检测MGE的消除情况为通过3-5套引物进行PCR扩增检测MGE的消除情况。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细菌为弧菌，所述MGE为内源质粒、原噬菌体、毒力岛或抗性岛。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述细菌为溶珊瑚弧菌SCSIO 43001，所述MGE为内源质粒pMBL43001；或所述细菌为施罗氏弧菌SCSIO 43133，所述MGE为原噬菌体Pvs1；或所述细菌为霍乱弧菌N16961，所述MGE为毒力岛VPI-2。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，当所述细菌为溶珊瑚弧菌SCSIO 43001，所述MGE为内源质粒pMBL43001时，具体步骤为：
(1)设计特异性靶向质粒pMBL43001的parA基因的20-nt碱基互补配对的sgRNA；
(2)在Ec-parA-F/Ec-parA-R引物对上引入这20-nt碱基序列，用该引物对以pgRNA-bacteria质粒为模板，扩增获得2584bp的PCR片段，然后以该PCR产物为模板，用sg-F/sg-R引物对扩增获得581bp的PCR片段，将该片段用连接至pMBLcas9质粒，构建含有parA-sgRNA和表达Cas9的质粒pMBLcas9-parA；
(3)利用接合转移实验将质粒pMBLcas9-parA转入溶珊瑚弧菌SCSIO 43001，产生重组菌株43001/pMBLcas9-parA，利用PCR扩增和测序筛选获得正确的接合子；
(4)将接合子在含有氯霉素和L-阿拉伯糖的2216E液体培养基中培养12小时，再体积比1/1000转接培养液至新鲜的含有氯霉素和L-阿拉伯糖的2216E液体培养基中再培养12小时，培养结束后，将细菌培养物划线在无抗2216E琼脂平板上；
(5)挑选单菌落，使用4对pBML43001的特异引物1F/1R、2F/2R、3F/3R、4F/4R进行菌落PCR，并以染色体的一对引物cF/cR作为对照，获得pMBL43001敲除菌株；
所述Ec-parA-F/Ec-parA-R引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.3-4所示，所述sg-F/sg-R引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述引物1F/1R、2F/2R、3F/3R、4F/4R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5-12所示，所述引物cF/cR的核苷酸序列如SEQ ID NO.13-14所示。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，当所述细菌为施罗氏弧菌SCSIO 43133，所述MGE为原噬菌体Pvs1时，具体步骤为：
(1)设计特异性靶向原噬菌体Pvs1的repressor基因cI的20-nt碱基互补配对的sgRNA；
(2)在Ec-Pvs1cI-F/Ec-Pvs1cI-R引物上引入这20-nt碱基序列，用该引物对以pgRNA-bacteria质粒为模板，扩增获得2584bp的PCR片段，然后以该PCR产物为模板，用sg-F/sg-R引物对扩增获得581bp的PCR片段，将该片段连接至pMBLcas9质粒，构建含有cI-sgRNA和表达Cas9的质粒pMBLcas9-cI；
(3)利用接合转移实验将pMBLcas9-cI转入SCSIO 43133，产生重组菌株43133/pMBLcas9-cI，利用PCR扩增和测序筛选获得正确的接合子；
(4)将接合子在含有氯霉素和L-阿拉伯糖的2216E液体培养基中培养12小时，再按体积比例1/1000转接培养液至新鲜的含有氯霉素和L-阿拉伯糖的2216E液体培养基中再培养12小时，培养结束后，将细菌培养物划线在无抗2216E琼脂平板上；
(5)挑选单菌落，使用Pvs1特异的整合酶引物int-F/int-R及检测Pvs1切离的引物Pvs1-bF、Pvs1-bR进行筛选，并利用整合位点两侧的四组交叉引物Pvs1-bF/Pvs1-bR、Pvs1-cF/Pvs1-cR、Pvs1-bF/Pvs1-cR、Pvs1-cF/Pvs1-dR进行PCR验证，获得Pvs1敲除菌株；
所述Ec-Pvs1cI-F/Ec-Pvs1cI-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.23-24所示，所述sg-F/sg-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述int-F/int-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.29-30所示，所述Pvs1-bF的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示，所述Pvs1-bR的核苷酸序列如SEQID NO.26所示，所述Pvs1-cF的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示，所述Pvs1-cR的核苷酸序列如SEQ ID NO.28所示。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，当所述细菌为霍乱弧菌N16961，所述MGE为毒力岛VPI-2时，具体步骤为：
(1)设计特异性靶向毒力岛VPI-2的整合酶基因intV2的20-nt碱基互补配对的sgRNA；
(2)在Ec-intV2-F/Ec-intV2-R引物上引入这20-nt碱基序列，用该引物对以pgRNA-bacteria质粒为模板，扩增获得2584bp的PCR片段，然后以该PCR产物为模板，用sg-F/sg-R引物对扩增获得581bp的PCR片段，将该片段用连接至pMBLcas9质粒，构建含有intV2-sgRNA和表达Cas9的质粒pMBLcas9-intV2；
(3)利用接合转移实验将pMBLcas9-intV2转入霍乱弧菌N16961，产生重组菌株N16961/pMBLcas9-intV2，利用PCR扩增和测序筛选获得正确的接合子；
(4)将接合子在含有氯霉素和L-阿拉伯糖的LB培养基中培养12小时，再按体积比例1/1000转接培养液至新鲜的含有氯霉素和L-阿拉伯糖的LB液体培养基中再培养12小时，培养结束后，将细菌培养物划线在无抗LB琼脂平板上；
(5)挑选单菌落，使用VPI-2特异的整合酶引物VPI2-inF/VPI2-inR进行筛选突变株，并利用整合位点两侧的三组交叉引物VPI2-bF/VPI2-bR、VPI2-cF/VPI2-bR和VPI2-bF/VPI2-cR进行PCR验证，获得Pvs1敲除菌株；
所述Ec-intV2-F/Ec-intV2-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.15-16所示，所述sg-F/sg-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-2所示，所述VPI2-inF/VPI2-inR的核苷酸序列如SEQ IDNO.21-22所示，所述VPI2-bF的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，所述VPI2-bR的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示，所述VPI2-cF的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，所述VPI2-cR的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
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| CN202410208435.9A CN118086349A (zh) | 2024-02-26 | 2024-02-26 | 一种联合Cas9和自然切离的细菌中可移动遗传元件的敲除方法 |
Publications (1)
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|---|---|
| CN118086349A true CN118086349A (zh) | 2024-05-28 |
Family
ID=91162693
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202410208435.9A Pending CN118086349A (zh) | 2024-02-26 | 2024-02-26 | 一种联合Cas9和自然切离的细菌中可移动遗传元件的敲除方法 |
Country Status (1)
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| CN (1) | CN118086349A (zh) |
-
2024
- 2024-02-26 CN CN202410208435.9A patent/CN118086349A/zh active Pending
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