CN115747242B - 消除质粒、质粒组合、基因编辑试剂盒、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及基因编辑技术领域，尤其涉及利用质粒进行基因编辑的技术领域，进一步涉及利用质粒对运动发酵单胞菌和大肠杆菌进行基因编辑的技术领域，更具体地，本申请涉及消除质粒、质粒组合、基因编辑试剂盒、制备方法及应用。该消除质粒具有分别来源于运动发酵单胞菌和大肠杆菌的两个复制起始区，两个复制起始区起始端之间的间隔区，以及在两个复制起始区末端之间的编码基因区。该间隔区通过靶向作用于同一或不同该类型的消除质粒的编码基因区实现该类型消除质粒之间的相互消除，可以广泛用做基因编辑的载体工具，可以应用快速多轮基因编辑过程。
Description
技术领域
本申请涉及基因编辑技术领域，尤其涉及利用质粒进行基因编辑的技术领域，进一步涉及利用质粒对运动发酵单胞菌和大肠杆菌进行基因编辑的技术领域，更具体地，本申请涉及消除质粒、质粒组合、基因编辑试剂盒、制备方法及应用。
背景技术
现如今，基因编辑方法构建重组菌株或者进行基因改造已越来越广泛，比如，通过噬菌体的重组酶进行同源重组、通过CRISPR/Cas进行基因编辑。然而，这些方法在携带外源基因的载体进行编辑时，相关质粒在宿主中无法有效消除，需要开发能够有效消除的无痕编辑质粒或者基于质粒的编辑试剂或试剂盒。
运动发酵单胞菌基因组遗传操作的常用方法是同源重组，这一方法通常需要自杀型质粒或不稳定的复制载体。使用同源重组的方法在Z.mobilis的基因组上进行基因敲除和插入后，使用自杀质粒(如SacB反筛系统)消除筛选标记，从而在特定位点实现靶基因“无痕”敲除或插入。现有的多种运动发酵单胞菌的基因失活菌株，如ndh失活菌株、SacC失活菌株和限制修饰系统失活菌株，均通过同源重组方法获得，用FLP重组酶或SacB筛选的方法消除引入的抗性标记。再如，现有技术还通过同源重组的方法在ZM4菌株中实现了ED途径两个关键酶基因的敲除：丙酮酸脱羧酶基因和乙醇脱氢酶基因，获得了生产丁二酸的重组工程菌株。然而，通过同源重组对运动发酵单胞菌进行基因编辑的效率往往偏低，另外一些常见的基因编辑方法也只能对目的基因单个逐一进行，存在耗时长、效率低等问题。并且，每一次遗传操作均需要引入特定的筛选标记，会存在可用选择标记有限、引入抗生素标记而产生生物安全隐患等问题。
发明内容
本申请发明人创造性地发现了一类可在运动发酵单胞菌株和大肠杆菌中穿梭的消除质粒。该消除质粒包含具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有如SEQ ID NO.2～4任一所示的核苷酸序列的第二复制起始区；编码基因区；以及CRISPR簇，所述CRISPR簇具有至少一个间隔区，所述间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以对所述编码基因或者对进行目的基因编辑的基因编辑质粒进行靶向切割。通过对这类消除质粒中的编码基因区进行选择，并使得该间隔区具有靶向同类型消除质粒的同类型抗性基因的作用，或者作用于具有不同类型的编码基因区的不同消除质粒，或与其他基因编辑质粒进行组合，如此形成的质粒组合，依次转入运动发酵单胞菌株ZM4中，进行培养，结果发现携带有间隔区的消除质粒，能够对应消除具有携带对应抗性基因的消除质粒，效率为100％。
为此，本申请至少公开了如下技术方案：
第一方面，本申请实施例公开了一种消除质粒，包含：
具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；
具有如SEQ ID NO.2～4任一所示的核苷酸序列的第二复制起始区；
编码基因区；以及
CRISPR簇，所述CRISPR簇具有至少一个间隔区，所述间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以对所述编码基因、或者对进行目的基因编辑的基因编辑质粒进行靶向切割。
第二方面，本申请实施例公开了一种质粒组合，包括第一消除质粒和第二消除质粒。所述第一消除质粒包括具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区、具有如SEQ ID NO.2～4任一所示的核苷酸序列的第二复制起始区、第一编码基因区；以及CRISPR簇，所述CRISPR簇具有第一间隔区。所述第二消除质粒包括具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区、具有如SEQ ID NO.2～4任一所示的核苷酸序列的第二复制起始区、第二编码基因区；以及CRISPR簇，所述CRISPR簇具有第二间隔区。其中，所述第一间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以靶向切割所述第二编码基因区，所述第二间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以靶向切割所述第一编码基因区。
第三方面，本申请实施例公开了一种质粒组合，包括至少三种第一方面所述的消除质粒，其中任一种所述消除质粒携带的编码基因区具有至少一个位于另一种所述消除质粒中具有靶向作用的间隔区。
第四方面，本申请实施例公开了一种基因编辑试剂盒，包含第一方面的消除质粒、或第二方面至第四方面任一所述的质粒组合。
第五方面，本申请实施例公开了第一方面所述的消除质粒的制备方法，包括：
获得基础质粒，所述基础质粒具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区、如SEQ ID NO.2～4任一所示的核苷酸序列的第二复制起始区、位于所述第一复制起始区的复制终端与所述第二复制起始区的复制终端之间的编码基因区、以及位于所述第一复制起始区的复制起始端与所述第二复制起始区的复制起始端之间的初始CRISPR簇；
获得用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以对所述编码基因、或者对进行目的基因编辑的基因编辑质粒进行靶向切割的间隔区的寡聚核酸片段；
将所述寡聚核酸片段插入至所述初始CRISPR簇中，以得到第一方面所述的消除质粒。
第六方面，本申请实施例公开了第一方面所述的质粒组合在基因编辑中的应用。
附图说明
图1为本申请实施例提供可选的一种消除质粒的结构示意图。
图2为本申请实施例提供可选的包含第一消除质粒和第二消除质粒的质粒组合的结构示意图。
图3为本申请实施例提供可选的第一消除质粒、第二消除质粒和第三消除质粒的结构示意图。
图4为本申请实施例提供可选的第一消除质粒、第二消除质粒和第三消除质粒两两之间的消除效果PCR电泳结果图；(A)第一消除质粒对第二消除质粒的消除PCR验证结果：左侧泳道是第一消除质粒和第一消除质粒(763bp)作为对照的菌落PCR结果，右侧泳道是第二消除质粒和第二消除质粒(813bp)作为对照的菌落PCR结果；(B)第三消除质粒对第一消除质粒的消除PCR验证结果：左侧泳道是第三消除质粒和第三消除质粒(389bp)作为对照的菌落PCR结果，右侧泳道是第一消除质粒和第一消除质粒(763bp)作为对照的菌落PCR结果；(C)第二消除质粒对第三消除质粒的消除PCR验证结果：左侧泳道是第二消除质粒和第二消除质粒(813bp)作为对照的菌落PCR结果；右侧泳道是第三消除质粒和第三消除质粒(389bp)作为对照的菌落PCR结果。
图5为本申请实施例提供可选的第一消除质粒、第二消除质粒和第三消除质粒两两之间消除效果的转化子液体培养物结果；(A)第一消除质粒对第二消除质粒的消除液体培养验证结果：左侧是添加氯霉素抗性的RMG2，而右侧添加壮观霉素抗性的RMG2；(B)第三消除质粒对第一消除质粒的消除液体培养验证结果：左侧添加卡那霉素抗性的RMG2，而右侧添加氯霉素抗性的RMG2；(C)第二消除质粒对第三消除质粒的消除液体培养验证结果：左侧添加壮观霉素抗性的RMG2，而右侧添加卡那霉素抗性的RMG2。
图6为本申请实施例提供可选的第一消除质粒、第二消除质粒和第三消除质粒两两之间消除效果的转化子消除固体平板结果；(A)第一消除质粒对第二消除质粒的稀释涂平板验证结果：左侧是添加氯霉素抗性的RMG2平板，而右侧添加壮观霉素抗性的RMG2平板；(B)第三消除质粒对第一消除质粒的稀释涂平板验证结果：左侧添加卡那霉素抗性的RMG2平板，而右侧添加氯霉素抗性的RMG2平板；(C)第二消除质粒对第三消除质粒的稀释涂平板验证结果：左侧添加壮观霉素抗性的RMG2平板，而右侧添加卡那霉素抗性的RMG2平板。
图7为本申请实施例提供可选的消除质粒的制备流程示意图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
术语
本申请中，“基因编辑”是对目的基因及其转录产物进行编辑(定向改造)，实现特定核酸片段或特定DNA碱基的敲入、敲除、替换和修饰，以得到改变目的基因或调控元件的序列、表达量或功能的菌株、菌株系或生物体，例如使得该目的基因或调控元件的功能改变、丧失或部分丧失、功能屏蔽，功能重组或功能突变等等。“基因编辑质粒”是指携带有用于改变目的基因或调控元件的序列的质粒，将其转入菌株、菌株系或生物体，能够使得该目的基因或调控元件的功能改变、丧失或部分丧失、功能屏蔽，功能重组或功能突变等等。
本申请中，“消除质粒”是相对于“基因编辑质粒”而言的，当“基因编辑质粒”转入菌株、菌株系或生物体后，其完成基因敲除后往往宿主体内长时间存在而不能自行消除，不仅影响宿主的基因表达和功能实现，也存在对宿主的生物安全影响，及时对其进行此类“基因编辑质粒”消除是十分必要的。本申请中的“消除质粒”正是基于此开发而言，其能够与“基因编辑质粒”同时转入宿主体内实现对“基因编辑质粒”的消除，或者本申请中的“消除质粒”自行亦携带基因编辑功能，并在实现“基因编辑质粒”的同时通过不同种类的“消除质粒”的多个组合实现相互之间的消除。在本申请中，“消除质粒”的种类根据其具有“第二复制起始区”、“先导区”、“重复区”、“间隔区”和“编码基因区”的种类决定，当“第二复制起始区”、“先导区”、“重复区”、“间隔区”和“编码基因区”均相同时，则两个“消除质粒”为“同种”；否则，两个“消除质粒”为“不同种”。下方实施例将对本申请提供的“消除质粒”进行详细阐述。
本申请中，“CRISPR核酸酶”是指可对特异性核酸序列进行靶向切割的酶，是指来源于包括CRISPR-Cas(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，成簇的规律间隔的短回文重复序列)系统的酶，例如来源于I-F型CRISPR-Cas系统的Cas3，来源于II型CRISPR-Cas系统的Cas9，来源于II型CRISPR-Cas系统的Cas12。以Cas9/CRISPR系统为例，其利用RNA指导的DNA结合对靶DNA进行序列特异性切割，由crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的靶序列上的特定位置处剪切双链DNA。与crRNA配对的靶序列通常是位于基因组PAM(原间隔区邻近基序)位点(NNG)上游的约20个核苷酸的序列。
在本申请中，“CRISPR簇”一般由“先导区”、“重复区”和“间隔区”组成。“先导区”能够发挥其启动功能转录出一段前体CRISPR RNA(pre-crRNA)，经“CRISPR核酸酶”催化加工并剪接成成熟的crRNA，最后“CRISPR簇”转录成为pre-crRNA并加工成成熟的crRNA，crRNA和“CRISPR核酸酶”形成一个蛋白核酸复合物(RNP)，crRNA中的间隔序列可与外源DNA中相应序列互补配对，随后引导Cas蛋白对靶序列的特定位点进行切割。每一类型的CRISPR簇以及其“CRISPR核酸酶”能够特异性地识别目的基因的不同PAM序列(原间隔序列临近基序，protospacer adjacent motif)，例如I-F型CRISPR-Cas系统识别的PAM序列为5’-NCC-3’，来源于II型CRISPR-Cas系统识别的PAM序列为5’-NTTN-3’。PAM序列向两端延伸的几个碱基都十分保守，其为目的基因身份识别序列，与目的基因对应。
在本申请中，“间隔区”为位于“消除质粒”中的双链DNA序列，其能够转录形成其又称为向导RNA(单链RNA或双链RNA)，向导RNA由crRNA和trancrRNA融合而成；向导RNA能够引导“CRISPR核酸酶”对靶位点进行切割，其通常包括crRNA上与靶序列互补的核苷酸和由crRNA与tracrRNA碱基配对形成的RNA支架(Scaffold)，能够识别与crRNA配对的靶序列。向导RNA可以与CRISPR核酸酶(例如Cas9蛋白)形成复合体并将CRISPR核酸酶带至靶序列并切割其中的靶位点。
消除质粒
本申请实施例公开了一种消除质粒，其具有两个复制起始区，以保证其能够在运动发酵单胞菌和大肠杆菌中穿梭，为基于相关目的基因构建重组或基因编辑的运动发酵单胞菌或大肠杆菌提供基础。该消除质粒还具有一个编码基因区，该编码基因可以是标记基因(例如抗生素抗性基因)也可以是目的基因(例如ED途径的丙酮酸脱羧酶基因)等。该消除质粒还具有一个CRISPR簇，该CRISPR簇具有至少一个间隔区，该间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以对该编码基因、或者对进行目的基因编辑的基因编辑质粒进行靶向切割。具有如此结构的消除质粒，利用其CRISPR簇能够引导CRISPR核酸酶靶向结合在编码基因区或者进行目的基因编辑的基因编辑质粒的目的基因区，实现同种或不同种消除质粒的消除，或者实现对基因编辑质粒的消除，此种消除方式，消除效率高达100％，对宿主的基因组影响小，能够实现在连接基因编辑中有效做到“无痕编辑”。
在一些实施方式中，如图1所示，该消除质粒包含：具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有如SEQ ID NO.2～4任一所示的核苷酸序列的第二复制起始区；编码基因区；以及CRISPR簇，所述CRISPR簇具有至少一个间隔区，所述间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以对所述编码基因、或者对进行目的基因编辑的基因编辑质粒进行靶向切割。
在一些实施方式中，如图1所示，编码基因区位于第一复制起始区的复制起始端与第二复制起始区的复制终端之间，且编码基因区的转录方向与第一复制起始区的复制方向相反(图中，箭头方向表示复制方向)。在一些实施例中，该第一复制起始区的复制方向与该第二复制起始区的复制方向相同。相对于将编码基因区在第一复制起始区的复制起始端与第二复制起始区的复制终端之间的结构，如图1所示的该消除质粒在第一复制起始区被复制启动后或第二复制起始区被复制启动后，能够更快转录和翻译编码基因，从而也能更快被向导RNA识别和靶向切割。
在一些实施方式中，如图1所示，所述CRISPR簇位于所述第一复制起始区的复制终端与所述第二复制起始区的复制起始端之间，其所述CRISPR簇的转录方向与所述第一复制起始区的复制方向相反(图中，先导区的箭头方向表示CRISPR簇的转录方向)。相对于CRISPR簇在第一复制起始区的复制起始端与第二复制起始区的复制终端之间的结构，具有如此结构的消除质粒能够减少CRISPR簇完成CRISPR-Cas系统的“适应”和“表达”功能动作与第一复制起始区、第二复制起始区的复制启动以及与编码基因区的转录翻译的相互影响，其CRISPR簇更易被CRISPR核酸酶启动而形成向导RNA。
在一些实施方式中，如图1所示，该CRISPR簇包括：至少一个间隔区，所述间隔区靶向同一种所述消除质粒的编辑基因、或靶向不同种所述消除质粒的编辑基因、或者靶向所述基因编辑质粒用于改变目的基因或调控元件的序列；重复区，所述重复区的核苷酸序列如SEQ ID NO.5或6所示，用于分隔所述间隔区；先导区，所述先导区的核苷酸序列如SEQ IDNO.7或8所示。
在该实施方式的一些实施例中，该CRISPR簇具有一个间隔区，两个位于间隔区两端的重复区，以及位于该CRISPR簇复制或转录上游的向导区，该重复区的核苷酸序列如SEQID NO.5所示，该先导区的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
在该实施例方式的一些实施例中，该CRISPR簇具有一个间隔区，位于该间隔区上游的重复区，以及位于该CRISPR簇转录上游的向导区。该重复区的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示，该先导区的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
在该实施例方式的一些实施例中，该CRISPR簇具有多个间隔区，多个间隔区之间被重复区分隔，以及位于该CRISPR簇复制或转录上游的向导区。该重复区的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，该先导区的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
在该实施例方式的一些实施例中，该CRISPR簇具有多个间隔区，多个间隔区之间被重复区分隔，以及位于该CRISPR簇复制或转录上游的向导区。该重复区的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，该先导区的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
在上述实施方式及实施例中，本领域技术人员应当理解的是，本申请实施例提供的消除质粒中的编码基因选自标记物基因或目的基因(该目的基因是对运动发酵单胞菌而言为内源基因或外源基因，或对大肠杆菌而言为内源基因或外源基因)。
在一些实施例中，该“目的基因”选自2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸途径相关代谢酶基因、固氮相关基因或异丁醇代谢途径相关酶基因中的一种。例如，2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸途径相关代谢酶基因选自2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶编码基因、葡萄糖激酶编码基因或6-磷酸葡萄糖酸脱水酶基因；固氮相关基因选自nifL、nifA或固氮酶编码基因；异丁醇代谢途径相关酶基因选自Als、IlvC和IlvD。
在一些实施例中，该“标记物基因”是指其表达可以被选择或富集的任何标记物基因，即当该标记物基因在宿主中表达时，可以通过一定方式选择和富集表达该标记物基因的宿主菌株或细菌。可用于本申请的标记物基因包括在表达后可以用于分选或筛选的报告基因，或者可以利用抗生素进行筛选的抗性基因，或者表达后可以被对应抗体识别并通过免疫染色或磁珠吸附进行筛选的蛋白基因。可用于本申请的抗性基因包括但不限于针对氨苄青霉素、四环素、氯霉素、链霉素、潮霉素、壮观霉素、卡那霉素、杀稻瘟菌素(Blasticidin)、遗传霉素(Geneticin，G-418)、潮霉素(Hygromycin B)、霉酚酸(Mycophenolic Acid)、嘌呤霉素(Puromycin)、博莱霉素(Zeocin)或新霉素(Neomycin)的抗性基因中的一种。可用于本申请的报告基因包括但不限于氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)、萤火虫荧光素酶基因、海洋腔肠荧光素酶基因、分泌型碱性磷酸酶基因(SEAP)、人生长激素基因(hGH)、绿色荧光蛋白的编码基因(GFP)、蓝色荧光蛋白(Cyan Fluorescent Protein)的编码基因、黄色荧光蛋白(Yellow Fluorescent Protein)的编码基因、橙色荧光蛋白(Orange Fluorescent Protein)的编码基因、红色荧光蛋白(Red Fluorescent Protein)的编码基因、远红色荧光蛋白(Far-Red FluorescentProtein)的编码基因或可切换荧光蛋白(Switchable Fluorescent Proteins)的编码基因中的一种。
在一些实施方式中，该“间隔区”的核苷酸序列与该“编码基因区”一一对应，以便于与CRISPR核酸酶结合实现对其靶向切割的作用。例如，分别靶向作氯霉素、壮观霉素和卡那霉素的编码基因的间隔区的核苷酸序列依次如如SEQ ID NO.9～11。
为此，该消除质粒的间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以对目的基因进行靶向切割。该目的基因可以位于宿主基因组或内源性质粒上，利用该消除质粒能够靶向消除目的基因，不仅能够实现基因编辑还能够实现靶向消除一下内源性基因，例如一些具有产生耐药性或某种抗性基因的内源性质粒。
在此实施方式的一些实施例中，该消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；编码基因区；间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区和具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区。
在此实施方式的一些实施例中，该消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；编码基因区；间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区和具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区。
在此实施方式的一些实施例中，该消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；编码基因区；间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区和具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区。
在此实施方式的一些实施例中，该消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；编码基因区；间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区和具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区。
在此实施方式的一些实施例中，该消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；编码基因区；间隔区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的重复区和具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区。
在此实施方式的一些实施例中，该消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；编码基因区；间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区和具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区。
基于此，本领域技术人员应当理解的是，本申请实施例提供的上述消除质粒可用任何分子生物学的技术手段合成得到或者基于化学合成得到。
在一些实施方式中，本申请提供的消除质粒的制备方法包括：获得基础质粒，所述基础质粒具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区、如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区、位于所述第一复制起始区的复制起始端与所述第二复制起始区的复制终端之间的编码基因区、以及位于所述第一复制起始区的复制终端与所述第二复制起始区的复制起始端之间的初始CRISPR簇；获得用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以对所述编码基因、或者对进行目的基因编辑的基因编辑质粒进行靶向切割的间隔区的寡聚核酸片段；将所述寡聚核酸片段插入至所述初始CRISPR簇中，使得其变成包含具有上述靶向作用的间隔区的CRISPR簇，以得到消除质粒。
在该实施方式的一些实施例中，该初始CRISPR簇包括一个先导区、两个重复区、以及位于两个重复区之间的一段间隔区，该间隔区具有两段反向排列的限制性内切酶识别序列及位于限制性内切酶识别序列之间的保护序列。在一些实施例中，该限制性内切酶选自Bsa I、Bsmb I或Bbs I。具有如此结构的初始CRISPR簇，能够被限制性内切酶从切开后，与具有靶向作用的间隔区的寡聚核酸片段进行酶连接(例如T4 DNA连接酶)。
在该实施方式的一些实施例中，该基础质粒是在pEZ15Asp上插入一个初始CRISPR簇，并且将其具有的第二复制起始区进行替换得到的。其中，pEZ15Asp参照“Yang S,Mohagheghi A,Franden M A,et al.Metabolic engineering of Zymomonas mobilis for2,3-butanediol production from lignocellulosic biomass sugars[J].BiotechnolBiofuels,2016,9(1):189.”方法获得，pEZ15Asp具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区、如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区和位于第一复制起始区的复制起始端与第二复制起始区的复制终端之间的编码基因区，pEZ15Asp的结构如图7所示，第一复制起始区为156-1069bp之间，第二复制起始区位于2142～3015bp之间(SEQID NO.2所示)。
为获得不同编码基因(例如抗性基因)的基础质粒pEZ15Asp，可以参照“质粒pUC19-CM-D的构建及应用[J]安徽农业科学，2010年，公开的方法，第19期”在其中插入不同标记基因。
在一个具体的基础质粒的制备实施例中，如图7所示，由GenScript(南京中国)合成一个初始CRISPR簇的核酸片段，该初始CRISPR簇包括一个先导区(如SEQ ID NO.7所示)、两个重复(如SEQ ID NO.5所示)，两个重复区之间包含两个反向的Bsa I酶切位点(5’.....GGTCTCN^NNNNN.....3’；3’.....CCAGAGNNNNN^N......5’)。例如一个初始CRISPR簇的序列如SEQ ID NO.12所示，利用如SEQ ID NO.13～14所示的上下游引物对其进行PCR扩增，回收扩增产物；将扩增产物用Xba I和EcoR I酶切，插入pEZ15Asp载体中，生成基础质粒。进而，利用Bsa I酶切基础质粒得到一个线性化的基础质粒，其两端均具有一个4bp的突出的重复序列；将具有靶向作用的间隔区的寡核苷酸退火到95℃加热5min，然后逐渐冷却到室温，制备了与该间隔区杂交配合的双链DNA，将该双链DNA与线性化的基础质粒在T4DNA连接酶作用下与其4bp的突出端互补，从而得到消除质粒。
质粒组合
通过对这类消除质粒中的编码基因区进行选择，并使得该间隔区具有靶向同类型消除质粒的同类型抗性基因的作用，或者作用于具有不同类型的编码基因区的不同消除质粒。如此形成的质粒组合，依次转入运动发酵单胞菌或大肠杆菌中，携带有间隔区的消除质粒，能够对应消除具有携带对应编码基因的消除质粒，消除率为100％。
为此，如图2所示，本申请实施例还公开了一种质粒组合，配置两种本申请实施例提供的消除质粒，第一消除质粒和第二消除质粒。该质粒组合包括第一消除质粒和第二质粒。该第一消除质粒包括具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区、具有如SEQ ID NO.2～4任一所示的核苷酸序列的第二复制起始区、第一编码基因区；以及具有第一间隔区的第一CRISPR簇。该第二消除质粒包括具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区、具有如SEQ ID NO.2～4任一所示的核苷酸序列的第二复制起始区、第二编码基因区；以及具有第二间隔区的第二CRISPR簇。其中，该第一间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以靶向切割该第二编码基因区，该第二间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以靶向切割该第一编码基因区。
在此实施方式中，可在第一消除质粒中的第一编码基因区配置成为一个能够实现编码的目的基因，将其转入宿主中，待完成相关编辑或重组后，再将第二消除质粒转入宿主中。由于第一间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以靶向切割第二编码基因区，第二间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以靶向切割所述第一编码基因区，可将第二编码基因区配置成标记基因，而不对宿主进行基因编辑或重组，如此得到的转化子，不仅能够实现目的基因编码，还能有效地实现第一消除质粒和第二消除质粒的相互消除，实现“无痕”编辑。例如，将第一消除质粒和第二消除质粒，依次转入运动发酵单胞菌株ZM4或其基因工程改造菌株中，进行培养，第一消除质粒和第二消除质粒能够相互消除，如此可将第一消除质粒和第二消除质粒分别作为两个基因的编辑载体，进行编辑，如此在转入宿主细胞中后能够在传代培养中相互消除，消除效率达到100％，而无需对转入的基因编辑载体进行额外的消除工作，极大地简化了基因编辑程序，缩短了基因编辑周期。
在此实施方式的一些实施例中，第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区。第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区。第一间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以靶向切割所述第二编码基因区，第二间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以靶向切割所述第一编码基因区。
在此实施方式的一些实施例中，该第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ IDNO.7所示核苷酸序列的先导区。该第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区。第一间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以靶向切割所述第二编码基因区，所述第二间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以靶向切割所述第一编码基因区。
在此实施方式的一些实施例中，第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区。第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区。第一间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以靶向切割所述第二编码基因区，所述第二间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以靶向切割所述第一编码基因区。
在此实施方式的一些实施例中，第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区。第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区。第一间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以靶向切割所述第二编码基因区，所述第二间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以靶向切割所述第一编码基因区。
在此实施方式的一些实施例中，第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区。第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区。第一间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以靶向切割所述第二编码基因区，所述第二间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以靶向切割所述第一编码基因区。
在此实施方式的一些实施例中，第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区。第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区。第一间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以靶向切割所述第二编码基因区，所述第二间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以靶向切割所述第一编码基因区。
在此实施方式的一些实施例中，第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区。第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区。
在此实施方式的一些实施例中，第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区。第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区。第一间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以靶向切割所述第二编码基因区，所述第二间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以靶向切割所述第一编码基因区。
在此实施方式的一些实施例中，第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区。第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区。第一间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以靶向切割所述第二编码基因区，所述第二间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以靶向切割所述第一编码基因区。
在此实施方式的一些实施例中，第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区。第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区。第一间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以靶向切割所述第二编码基因区，所述第二间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以靶向切割所述第一编码基因区。
在此实施方式的一些实施例中，第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区。第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区。第一间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以靶向切割所述第二编码基因区，所述第二间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以靶向切割所述第一编码基因区。
在此实施方式的一些实施例中，第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区。第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区。第一间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以靶向切割所述第二编码基因区，所述第二间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以靶向切割所述第一编码基因区。
在此实施方式的一个实施例中，将第一消除质粒电转入ZM4感受态细胞，由于该ZM4基因改造株中含有CRISPR核酸酶的编码基因，因此无需额外向其转入CRISPR核酸酶，例如内源性I-F型CRISPR核酸酶(例如cas1,cas3,csy1,csy2,csy3,and csy4(or cas6f))，参见“Functional Characterization of CRISPR-Cas System in the EthanologenicBacterium Zymomonas mobilis ZM4[J]Advances in Microbiology，Vol.6No.3,March2016,published 15March 2016”)中并涂布添加有四环素的RMG2固体平板上，培养48小时后，筛选得到阳性转化子；再将第二消除质粒电转入该阳性转化子中，筛选得到同时转入第一消除质粒和第二消除质粒的阳性转化子，将其转接于同时添加四环素和链霉素的RMG2固体平板上培养发现8h发现，第一消除质粒和第二穿质粒消失，由此说明第一消除质粒和第二穿质粒能够在宿主体内相互消除。
为此，配置三种及以使得本申请实施例提供的消除质粒，本申请实施例还公开了一种质粒组合，包括三种及以上上述实施例提供的消除质粒，其中任一种消除质粒携带的编码基因区具有至少一个位于另一种消除质粒中靶向作用的间隔区。
在一些实施方式中，如图3所示，该质粒组合包括包括第一消除质粒、第二消除质粒和第三消除质粒，该第一消除质粒、第二消除质粒和第三消除质粒可依次在宿主体内实现循环消除。
在上述实施方式的一些实施例中，第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ IDNO.7所示核苷酸序列的先导区。第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区。第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区，用于分隔所述第三间隔区；具有如SEQID NO.7所示核苷酸序列的先导区。第一间隔区靶向作用所述第二编码基因区，所述第二间隔区靶向作用所述第三编码基因区，所述第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
在上述实施方式的一些实施例中，第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ IDNO.8所示核苷酸序列的先导区。第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区。第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区，用于分隔所述第三间隔区；具有如SEQID NO.8所示核苷酸序列的先导区。第一间隔区靶向作用所述第二编码基因区，所述第二间隔区靶向作用所述第三编码基因区，所述第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
在上述实施方式的一些实施例中，第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ IDNO.7所示核苷酸序列的先导区。第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区。第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区，用于分隔所述第三间隔区；具有如SEQID NO.7所示核苷酸序列的先导区。第一间隔区靶向作用所述第二编码基因区，所述第二间隔区靶向作用所述第三编码基因区，所述第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
在上述实施方式的一些实施例中，第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ IDNO.8所示核苷酸序列的先导区。第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区。第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区，用于分隔所述第三间隔区；具有如SEQID NO.8所示核苷酸序列的先导区。第一间隔区靶向作用所述第二编码基因区，第二间隔区靶向作用第三编码基因区，第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
在上述实施方式的一些实施例中，第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ IDNO.7所示核苷酸序列的先导区。第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区。第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区，用于分隔所述第三间隔区；具有如SEQID NO.7所示核苷酸序列的先导区。第一间隔区靶向作用所述第二编码基因区，所述第二间隔区靶向作用所述第三编码基因区，所述第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
在上述实施方式的一些实施例中，第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ IDNO.8所示核苷酸序列的先导区。第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区。第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区，用于分隔所述第三间隔区；具有如SEQID NO.8所示核苷酸序列的先导区。第一间隔区靶向作用所述第二编码基因区，所述第二间隔区靶向作用所述第三编码基因区，所述第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
在上述实施方式的一些实施例中，第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ IDNO.7所示核苷酸序列的先导区。第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区。第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区，用于分隔所述第三间隔区；具有如SEQID NO.7所示核苷酸序列的先导区。第一间隔区靶向作用第二编码基因区，第二间隔区靶向作用第三编码基因区，第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
在上述实施方式的一些实施例中，第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ IDNO.8所示核苷酸序列的先导区。第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区。第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区，用于分隔所述第三间隔区；具有如SEQID NO.8所示核苷酸序列的先导区。第一间隔区靶向作用第二编码基因区，第二间隔区靶向作用所述第三编码基因区，第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
在上述实施方式的一些实施例中，第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ IDNO.7所示核苷酸序列的先导区。第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区。第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区，用于分隔所述第三间隔区；具有如SEQID NO.7所示核苷酸序列的先导区。第一间隔区靶向作用所述第二编码基因区，所述第二间隔区靶向作用所述第三编码基因区，所述第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
在上述实施方式的一些实施例中，第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ IDNO.8所示核苷酸序列的先导区。第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区。第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区，用于分隔所述第三间隔区；具有如SEQID NO.8所示核苷酸序列的先导区。第一间隔区靶向作用所述第二编码基因区，所述第二间隔区靶向作用所述第三编码基因区，所述第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
在上述实施方式的一些实施例中，第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQIDNO.7所示核苷酸序列的先导区。第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区。第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区，用于分隔所述第三间隔区；具有如SEQID NO.7所示核苷酸序列的先导区。第一间隔区靶向作用第二编码基因区，所述第二间隔区靶向作用第三编码基因区，第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
在上述实施方式的一些实施例中，第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ IDNO.8所示核苷酸序列的先导区。第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区。第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区，用于分隔所述第三间隔区；具有如SEQID NO.8所示核苷酸序列的先导区。第一间隔区靶向作用第二编码基因区，第二间隔区靶向作用所述第三编码基因区，第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
在上述实施方式的一些实施例中，第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ IDNO.7所示核苷酸序列的先导区。第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区。第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区，用于分隔所述第三间隔区；具有如SEQID NO.7所示核苷酸序列的先导区。第一间隔区靶向作用第二编码基因区，第二间隔区靶向作用第三编码基因区，第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
在上述实施方式的一些实施例中，第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ IDNO.8所示核苷酸序列的先导区。第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区。第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区，用于分隔所述第三间隔区；具有如SEQID NO.8所示核苷酸序列的先导区。第一间隔区靶向作用所述第二编码基因区，所述第二间隔区靶向作用所述第三编码基因区，所述第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
在上述实施方式的一些实施例中，第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ IDNO.7所示核苷酸序列的先导区。第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区。第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区，用于分隔所述第三间隔区；具有如SEQID NO.7所示核苷酸序列的先导区。第一间隔区靶向作用所述第二编码基因区，所述第二间隔区靶向作用所述第三编码基因区，所述第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
在上述实施方式的一些实施例中，第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ IDNO.8所示核苷酸序列的先导区。第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区。第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区，用于分隔所述第三间隔区；具有如SEQID NO.8所示核苷酸序列的先导区。第一间隔区靶向作用所述第二编码基因区，所述第二间隔区靶向作用所述第三编码基因区，所述第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
在上述实施方式的一些实施例中，第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ IDNO.7所示核苷酸序列的先导区。第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区。第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区，用于分隔所述第三间隔区；具有如SEQID NO.7所示核苷酸序列的先导区。第一间隔区靶向作用所述第二编码基因区，所述第二间隔区靶向作用所述第三编码基因区，所述第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
在上述实施方式的一些实施例中，第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ IDNO.8所示核苷酸序列的先导区。第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区。第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区，用于分隔所述第三间隔区；具有如SEQID NO.8所示核苷酸序列的先导区。第一间隔区靶向作用第二编码基因区，第二间隔区靶向作用第三编码基因区，第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
在上述实施方式的一些实施例中，第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ IDNO.7所示核苷酸序列的先导区。第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区。第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区，用于分隔所述第三间隔区；具有如SEQID NO.7所示核苷酸序列的先导区。第一间隔区靶向作用第二编码基因区，第二间隔区靶向作用第三编码基因区，第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
在上述实施方式的一些实施例中，第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ IDNO.8所示核苷酸序列的先导区。第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区。第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区，用于分隔所述第三间隔区；具有如SEQID NO.8所示核苷酸序列的先导区。第一间隔区靶向作用第二编码基因区，所第二间隔区靶向作用第三编码基因区，第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
在上述这些实施例中，编码基因、第一编码基因、第二编码基因或第三编码基因均选自标记物基因或目的基因(该目的基因是对运动发酵单胞菌而言为内源基因或外源基因，或对大肠杆菌而言为内源基因或外源基因)。
在一些实施例中，该“目的基因”选自2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸途径相关代谢酶基因、固氮相关基因或异丁醇代谢途径相关酶基因中的一种。例如，2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸途径相关代谢酶基因选自2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸醛缩酶编码基因、葡萄糖激酶编码基因或6-磷酸葡萄糖酸脱水酶基因；固氮相关基因选自nifL、nifA或固氮酶编码基因；异丁醇代谢途径相关酶基因选自Als、IlvC和IlvD。
在一些实施例中，该“标记物基因”是指其表达可以被选择或富集的任何标记物基因，即当该标记物基因在宿主中表达时，可以通过一定方式选择和富集表达该标记物基因的宿主菌株或细菌。可用于本申请的标记物基因包括在表达后可以用于分选或筛选的报告基因，或者可以利用抗生素进行筛选的抗性基因，或者表达后可以被对应抗体识别并通过免疫染色或磁珠吸附进行筛选的蛋白基因。可用于本申请的抗性基因包括但不限于针对氨苄青霉素、四环素、氯霉素、链霉素、潮霉素、壮观霉素、卡那霉素、杀稻瘟菌素(Blasticidin)、遗传霉素(Geneticin，G-418)、潮霉素(Hygromycin B)、霉酚酸(Mycophenolic Acid)、嘌呤霉素(Puromycin)、博莱霉素(Zeocin)或新霉素(Neomycin)的抗性基因中的一种。可用于本申请的报告基因包括但不限于氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)、萤火虫荧光素酶基因、海洋腔肠荧光素酶基因、分泌型碱性磷酸酶基因(SEAP)、人生长激素基因(hGH)、绿色荧光蛋白基因(GFP)、蓝色荧光蛋白(CyanFluorescent Protein)、黄色荧光蛋白(Yellow Fluorescent Protein)、橙色荧光蛋白(Orange Fluorescent Protein)、红色荧光蛋白(Red Fluorescent Protein)、远红色荧光蛋白(Far-Red Fluorescent Protein)或可切换荧光蛋白(Switchable FluorescentProteins)的基因中的一种。
应用
基于上述这些实施例提供的消除质粒或质粒组合，显然本申请实施例还提供了一种基因编辑试剂盒，其可包含上述实施例提供的消除质粒或上述实施例提供的质粒组合。在一些实施例中，该基因编辑试剂盒还包括CRISPR核酸酶或提供CRISPR核酸酶表达的载体。在一些实施例中，该CRISPR核酸酶为运动发酵单胞菌ZM4内源性的CRISPR核酸酶或者外源性的CRISPR核酸酶，或者内源性I-F型CRISPR核酸酶(例如Cas1、Cas2/3、Cas8、Cas5、Cas7和Cas6)，外源性II型CRISPR核酸酶，例如Cas12。在一些实施例中，利用ZM4内源性的CRISPR核酸酶，将上述实施例提供的消除质粒或者质粒组合转入宿主体内，即可实现对质粒的靶向消除。
在一些实施例中，该基因编辑试剂盒包含由第一消除质粒、第二消除质粒和第三消除质粒组成的质粒组合，第一消除质粒、第二消除质粒和第三消除质粒可以循环消除。下方将对由三种消除质粒组成的质粒组合的一个具体实施例进行描述。
1、质粒组合的制备
在本实施例中，以pEZ15Asp为基础，参照“质粒pUC19-CM-D的构建及应用[J]安徽农业科学，2010年，公开的方法，第19期”在其中插入不同的抗性基因作为编码基因，例如氯霉素(Cm)抗性基因(SEQ ID NO.28)、壮观霉素(Spe)抗性基因(SEQ ID NO.29)和卡那霉素(Kana)抗性基因(SEQ ID NO.30)。再采用如图7所示的方法，插入初始CRISPR簇得到基础质粒，其中的重复区的序列如SEQ ID NO.5所示，先导区的序列如SEQ ID NO.7。
在本实施例中，如图7所示，分别合成靶向壮观霉素(Spe)抗性基因、卡那霉素(Kana)抗性基因和氯霉素(Cm)抗性基因的第一间隔区、第二间隔区和第三间隔区的寡核酸片段，该寡核酸片段可以设计为壮观霉素、卡那霉素和氯霉素基因PAM序列5-CCC-3’下游的32bp作为间隔区的序列，依次命名为RNA-Spe(第一RNA，如SEQ ID NO.10所示)、RNA-Kana(第二RNA，如SEQ ID NO.11所示)和RNA-Cm(第三RNA，如SEQ ID NO.9所示)。通过BasI酶切后插入至依次具有氯霉素(Cm)抗性基因(SEQ ID NO.27)、壮观霉素(Spe)抗性基因(SEQ IDNO.28)和卡那霉素(Kana)抗性基因(SEQ ID NO.29)的基础质粒中，其中，具有第一RNA和Cm抗性基因(SEQ ID NO.28)的质粒命名为pE1-Cm-RNA-Spe，即为第一消除质粒。
其中，将具有靶向Kana的第二RNA和Spe抗性基因的质粒利用如SEQ ID NO.15～16所示的上下游引物进行反向PCR扩增得到的产物，与利用SEQ ID NO.17～18所示的上下游引物对对ZM4菌液进行PCR扩增得到的如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区通过T5核酸外切酶组装，以得到第二消除质粒，命名为pE2-Spe-RNA-Kana。
其中，将具有靶向Cm的第三RNA和Kana抗性基因的质粒利用如SEQ ID NO.15～16所示的上下游引物进行反向PCR扩增得到的产物，与利用SEQ ID NO.19～20所示的上下游引物对对ZM4菌液进行PCR扩增得到的如SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区通过T5核酸外切酶组装，以得到第三消除质粒，命名为pE3-Kana-RNA-Cm。
其中，基础质粒的PCR扩增反应体系可如：上下游引物各2.4μL、模板1.2μL、PrimeSTAR 30μL和Milli-Q超纯水24μL。
其中，T5核酸外切酶组装的反应体系可如：第二复制起始区片段0.12pM、质粒反扩产物0.04pM、10×Buffer 4 0.5μL、T5核酸外切酶0.5μL(New England Biolabs Inc.,USA)和Milli-Q超纯水5μL。反应程序包括：按照上述反应体系配制，冰上反应5min；加入E.coli感受态细胞，混匀；静置30min，42℃热激45s；冰上冷却3min，加入LB液体培养基，37℃，250rpm摇菌约1h；(5)LB平板(添加相应抗性)上涂布，37℃倒置培养。
为验证各消除质粒(pE1-Cm-RNA-Spe、pE2-Spe-RNA-Kana和pE3-Kana-RNA-Cm)转化是否获得了阳性转化子，需要将其转入E.coli感受态细胞，于LB平板上培养，收集菌落，进行菌落PCR，经过凝脂糖凝胶电泳鉴定。菌体PCR反应体系包括：上下游引物各0.4μL、模板1μL、T5mix 30μL(擎科生物(Tsingke Biotechnology Co.,Ltd.China))和Milli-Q超纯水3.2μL。
其中，第二复制起始区的目的片段获得方法包括：运动发酵单胞菌ZM4菌株(ATCC31821，购自美国ATCC菌种保藏中心)，将其真空冻干管的菌株活化后的菌液转接至摇瓶中30℃静置培养，显微镜观察期菌体符合ZM4典型形态特征，并且液体生长过程产物气体，生物稳定其产生絮凝沉淀后(或者OD600达到1.0以上)，即可收获其液体培养液，对ZM4菌液进行PCR扩增，以分别得到如SEQ ID NO.3和4所示的第二复制起始区的目的片段。
在一个实施例中，第二复制起始区的扩增反应体系包括：上下游引物各2.4μL、模板1.2μL、PrimeSTAR(用于片段扩增的DNA聚合酶PrimerSTAR Max DNA Polymerase为Takara公司产品)30μL、Milli-Q超纯水24μL。
4、质粒组合消除效率测试
将第二消除质粒、第一消除质粒、第三消除质粒分别电转到ZM4感受态细胞，得到的转化子分别用SEQ ID NO.23～24所示、SEQ ID NO.21～22所示、SEQ ID NO.25～26所示的上下游引物依次进行菌落PCR验证，将正确的转化子制备为感受态细胞，命名为ΔZM2、ΔZM1、ΔZM3。然后将第一消除质粒、第三消除质粒、第二消除质粒分别对应电转到ΔZM2、ΔZM1、ΔZM3菌株，得到的转化子分别用SEQ ID NO.23～24所示和SEQ ID NO.21～22所示、SEQ ID NO.25～26所示和SEQ ID NO.23～24所示、SEQ ID NO.21～22所示和SEQ ID NO.21～22所示引物进行菌落PCR验证，来判断初始转入ZM4的第二消除质粒、第一消除质粒、第三消除质粒是否被消除及消除效率，同时以被消除的质粒作为对照。
为了进一步验证，将成功消除的转化子分别在添加有两种相应抗性的RMG2液体培养基进行培养，被消除的质粒所带抗性的培养基中是无法进行生长的。将在发挥消除作用的质粒所带抗性的培养基中的培养物进行稀释涂平板，分别涂布两种抗性的固体平板，通过是否得到转化子来进一步判断质粒是否被消除。例如：第一消除质粒电转ΔZM2菌株，通过菌落PCR验证第二消除质粒被消除的菌株在分别添加有氯霉素、壮观霉素抗性的RMG2液体培养基进行培养。对在添加有氯霉素的液体培养基培养液进行稀释后，分别涂布在添加有氯霉素抗性、壮观霉素抗性的RMG2固体平板上，通过是否得到转化子进一步确认质粒是否被成功消除。第三消除质粒电转ΔZM1菌株、第二消除质粒电转ΔZM3菌株，这两种情况采用同样的方法。
5、结果
测试了第一消除质粒对第二消除质粒的消除效率。将300ng第二消除质粒电转到ZM4感受态细胞中并涂布添加有壮观霉素的RMG2固体平板上；约48h后，经菌落PCR验证，将所得菌株命名为ΔZM2，并按所述方法制备感受态细胞；然后将质粒第一消除质粒电转化到ΔZM2中，取100μL培养物涂布在添加有氯霉素的RMG2固体平板上；挑取单菌落PCR验证第一消除质粒成功转化的数量及质粒第二消除质粒被消除的数量。结果显示，挑取的7颗单菌落中，质粒第一消除质粒全部转化成功，并且质粒第二消除质粒也全部被消除，第一消除质粒对质粒第二消除质粒的消除效率是100％(图4A)。
同样，为了测试第三消除质粒、第二消除质粒对第一消除质粒、第三消除质粒的消除效率，将300ng第三消除质粒转化ΔZM1菌株并涂布在含有卡那霉素的RMG2平板上，将300ng第二消除质粒转化ΔZM3菌株并涂布在含有壮观霉素的RMG2平板上；与第一消除质粒对第二消除质粒的消除一样的方法，两种情况都各挑取7颗单菌落，PCR验证结果显示，第三消除质粒转化成功并且完全消除第一消除质粒，第二消除质粒转化成功并完全消除第三消除质粒。由此可见，第三消除质粒对第一消除质粒(图4B)、第二消除质粒对第三消除质粒(图4C)的消除效率也均可达到100％。
为了进一步地验证，将三种情况下质粒成功转化并且将相应质粒成功消除的转化子进行培养。第一消除质粒对第二消除质粒消除中，转化子培养在分别添加有氯霉素、壮观霉素抗性的RMG2液体培养基，结果显示，添加有氯霉素抗性的RMG2液体培基变浑浊，菌株正常生长，说明质粒第一消除质粒转化成功，而添加有壮观霉素抗性的RMG2液体培养基没有变浑浊，菌株没有生长，进一步说明第二消除质粒被消除(图5A)。此外，将在添加有氯霉素抗性的RMG2液体培养基的培养物稀释涂布在分别添加有氯霉素、壮观霉素抗性的RMG2固体平板；同样，添加有氯霉素抗性的RMG2固体平板有菌落生长，而添加有壮观霉素抗性的RMG2固体平板没有菌落生长，更进一步说明第二消除质粒被消除(图6A)。第三消除质粒对第一消除质粒的消除(图5B、图6B)、第二消除质粒对第三消除质粒的消除(图5C、图6C)也用同样的方法进行验证，得到了相同的结果。
上述结果发现，如图3所示的第一消除质粒、第二消除质粒和第三消除质粒中，任意一个质粒可以消除其中一个，也可以被另一个质粒消除，且效率均可达到100％。
基于此，在某些实施方式中，所述质粒组合可以包括三种以上的如第一方面中所述的消除质粒，其中任一种所述消除质粒携带的编码基因区具有至少一个位于另一种所述消除质粒中靶向作用的间隔区。如此形成的质粒组合，可以组合形成多个质粒，每一质粒携带不同的抗性基因和用于靶向作用另一质粒的编码基因区的间隔区，将实现每一消除质粒携带一目的基因，而分别或者同时对同一宿主进行基因编辑或基因改造，而后又进行相互之间的质粒消除，而无需进行额外的基因消除步骤，不仅提高了基因编辑效率，还极大地简化了基因编辑程序，缩短了基因编辑周期。
进一步地，本申请实施例还公开了一种基因编辑试剂盒，包含上述实施例公开的质粒组合。在一些实施例中，本领域技术人员可以理解的是，可将上述的编码基因区设置成不同基因编码区，并将其对应的具有靶向作用的间隔区设置该基因编码区的RNA，如此，对宿主菌(如ZM4基因改造株感受态细胞(通过基因编辑去除了内源性质粒ZMO0028和CRISPR1-4序列的Z.mobilis subsp.mobilis ZM4(ATCC 31821))可以进行不同基因改造，提高改造效率，还能实现“无痕”编辑，使得转入的质粒自行消除。
因此，基于这些消除质粒形成的质粒组合，可以将其中的间隔区设置用于基因组编辑的gRNA，以进行基因编辑，基因编辑后在进行质粒消除，以提高基因编辑效率和避免质粒消除的困扰。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。
Claims (67)
1.一种消除质粒，包含：
具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；
具有如SEQ ID NO.2~4任一所示的核苷酸序列的第二复制起始区；
编码基因区；以及
CRISPR簇，所述CRISPR簇具有至少一个间隔区，所述间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以对不同种所述消除质粒的所述编码基因、或者对一基因编辑质粒进行靶向切割，所述不同种所述消除质粒的所述编码基因不同。
2.根据权利要求1所述的消除质粒，其中，所述编码基因区位于所述第一复制起始区的复制起始端与所述第二复制起始区的复制终端之间，且所述编码基因区的转录方向与所述第一复制起始区的复制方向相反。
3.根据权利要求1所述的消除质粒，其中，所述CRISPR簇位于所述第一复制起始区的复制终端与所述第二复制起始区的复制起始端之间，所述CRISPR簇的转录方向与所述第一复制起始区的复制方向相反。
4.根据权利要求3所述的消除质粒，其中，所述CRISPR簇包括：
至少一个间隔区，所述间隔区靶向不同种所述消除质粒的所述编码基因、或者靶向所述基因编辑质粒；
重复区，所述重复区的核苷酸序列如SEQ ID NO.5或6所示，用于分隔所述间隔区；
先导区，所述先导区的核苷酸序列如SEQ ID NO.7或8所示。
5.根据权利要求1所述的消除质粒，所述消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；编码基因区；间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区。
6.根据权利要求1所述的消除质粒，所述消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；编码基因区；间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区。
7.根据权利要求1所述的消除质粒，所述消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；编码基因区；间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区。
8.根据权利要求1所述的消除质粒，所述消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；编码基因区；间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区。
9.根据权利要求1所述的消除质粒，所述消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；编码基因区；间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区。
10.根据权利要求1所述的消除质粒，所述消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；编码基因区；间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区。
11.根据权利要求1所述的消除质粒，其中，所述编码基因为标记物基因。
12.根据权利要求11所述的消除质粒，其中，所述标记物基因选自在表达后可以用于分选或筛选的报告基因，或者可以利用抗生素进行筛选的抗性基因，或者表达后可以被对应抗体识别并通过免疫染色或磁珠吸附进行筛选的蛋白基因。
13.根据权利要求12所述的消除质粒，其中，所述报告基因选自氯霉素乙酰转移酶的编码基因、β-葡萄糖苷酸酶的编码基因、萤火虫荧光素酶的编码基因、海洋腔肠荧光素酶的编码基因、分泌型碱性磷酸酶的编码基因、人生长激素的编码基因、绿色荧光蛋白的编码基因、蓝色荧光蛋白的编码基因、黄色荧光蛋白的编码基因、橙色荧光蛋白的编码基因、红色荧光蛋白的编码基因、远红色荧光蛋白的编码基因或可切换荧光蛋白的编码基因中的一种。
14.根据权利要求13所述的消除质粒，其中，所述报告基因选自氯霉素乙酰转移酶的编码基因、β-葡萄糖苷酸酶的编码基因或绿色荧光蛋白的编码基因中的一种。
15.根据权利要求12所述的消除质粒，其中，所述抗性基因选自针对氨苄青霉素、四环素、氯霉素、链霉素、潮霉素、壮观霉素、卡那霉素、杀稻瘟菌素、遗传霉素、霉酚酸、嘌呤霉素、博莱霉素或新霉素的抗性基因中的一种。
16.根据权利要求15所述的消除质粒，其中，所述抗性基因选自氯霉素抗性基因、壮观霉素抗性或卡那霉素抗性基因中的一种。
17.根据权利要求1所述的消除质粒，其中，所述间隔区选自具有如SEQ ID NO.9~11任一所示的序列。
18.一种质粒组合，包括：
第一消除质粒，所述第一消除质粒包括具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区、具有如SEQ ID NO.2~4任一所示的核苷酸序列的第二复制起始区、第一编码基因区；以及第一CRISPR簇，所述第一CRISPR簇具有第一间隔区；和
第二消除质粒，所述第二消除质粒包括具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区、具有如SEQ ID NO.2~4任一所示的核苷酸序列的第二复制起始区、第二编码基因区；以及第二CRISPR簇，所述第二CRISPR簇具有第二间隔区；
其中，所述第一间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以靶向切割所述第二编码基因区，所述第二间隔区用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以靶向切割所述第一编码基因区。
19.根据权利要求18所述的质粒组合，所述质粒组合包括第一消除质粒和第二消除质粒：
所述第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区。
20.根据权利要求18所述的质粒组合，所述质粒组合包括第一消除质粒和第二消除质粒：
所述第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区。
21.根据权利要求18所述的质粒组合，所述质粒组合包括第一消除质粒和第二消除质粒：
所述第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区。
22.根据权利要求18所述的质粒组合，所述质粒组合包括第一消除质粒和第二消除质粒：
所述第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第一间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第二间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区。
23.根据权利要求18所述的质粒组合，所述质粒组合包括第一消除质粒和第二消除质粒：
所述第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第一间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第二间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区。
24.根据权利要求18所述的质粒组合，所述质粒组合包括第一消除质粒和第二消除质粒：
所述第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第一间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第二间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区。
25.根据权利要求18所述的质粒组合，所述质粒组合包括第一消除质粒和第二消除质粒：
所述第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区。
26.根据权利要求18所述的质粒组合，所述质粒组合包括第一消除质粒和第二消除质粒：
所述第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第一间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第二间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区。
27.根据权利要求18所述的质粒组合，所述质粒组合包括第一消除质粒和第二消除质粒：
所述第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区。
28.根据权利要求18所述的质粒组合，所述质粒组合包括第一消除质粒和第二消除质粒：
所述第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第一间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第二间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区。
29.根据权利要求18所述的质粒组合，所述质粒组合包括第一消除质粒和第二消除质粒：
所述第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区。
30.根据权利要求18所述的质粒组合，所述质粒组合包括第一消除质粒和第二消除质粒：
所述第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第一间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第二间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区。
31.根据权利要求18~30任一所述的质粒组合，其中，所述第一编码基因、所述第二编码基因均选自标记物基因。
32.根据权利要求31所述的质粒组合，其中，所述标记物基因选自在表达后可以用于分选或筛选的报告基因，或者可以利用抗生素进行筛选的抗性基因，或者表达后可以被对应抗体识别并通过免疫染色或磁珠吸附进行筛选的蛋白基因。
33.根据权利要求32所述的质粒组合，其中，所述报告基因选自氯霉素乙酰转移酶的编码基因、β-葡萄糖苷酸酶的编码基因、萤火虫荧光素酶的编码基因、海洋腔肠荧光素酶的编码基因、分泌型碱性磷酸酶的编码基因、人生长激素的编码基因、绿色荧光蛋白的编码基因、蓝色荧光蛋白的编码基因、黄色荧光蛋白的编码基因、橙色荧光蛋白的编码基因、红色荧光蛋白的编码基因、远红色荧光蛋白的编码基因或可切换荧光蛋白的编码基因中的一种。
34.根据权利要求33所述的质粒组合，其中，所述报告基因选自氯霉素乙酰转移酶的编码基因、β-葡萄糖苷酸酶的编码基因或绿色荧光蛋白的编码基因中的一种。
35.根据权利要求32所述的质粒组合，其中，所述抗性基因选自针对氨苄青霉素、四环素、氯霉素、链霉素、潮霉素、壮观霉素、卡那霉素、杀稻瘟菌素、遗传霉素、霉酚酸、嘌呤霉素、博莱霉素或新霉素的抗性基因中的一种。
36.一种质粒组合，包括至少三种如权利要求1~17任一所述的消除质粒，其中任一种所述消除质粒携带的编码基因区具有至少一个位于另一种所述消除质粒中具有靶向作用的间隔区。
37.根据权利要求36所述的质粒组合，所述质粒组合包括第一消除质粒、第二消除质粒和第三消除质粒：
所述第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区，用于分隔所述第三间隔区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第一间隔区靶向作用所述第二编码基因区，所述第二间隔区靶向作用所述第三编码基因区，所述第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
38.根据权利要求36所述的质粒组合，所述质粒组合包括第一消除质粒、第二消除质粒和第三消除质粒：
所述第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第一间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第二间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第三间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第一间隔区靶向作用所述第二编码基因区，所述第二间隔区靶向作用所述第三编码基因区，所述第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
39.根据权利要求36所述的质粒组合，所述质粒组合包括第一消除质粒、第二消除质粒和第三消除质粒：
所述第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区，用于分隔所述第三间隔区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第一间隔区靶向作用所述第二编码基因区，所述第二间隔区靶向作用所述第三编码基因区，所述第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
40.根据权利要求36所述的质粒组合，所述质粒组合包括第一消除质粒、第二消除质粒和第三消除质粒：
所述第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第一间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第二间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第三间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第一间隔区靶向作用所述第二编码基因区，所述第二间隔区靶向作用所述第三编码基因区，所述第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
41.根据权利要求36所述的质粒组合，所述质粒组合包括第一消除质粒、第二消除质粒和第三消除质粒：
所述第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区，用于分隔所述第三间隔区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第一间隔区靶向作用所述第二编码基因区，所述第二间隔区靶向作用所述第三编码基因区，所述第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
42.根据权利要求36所述的质粒组合，所述质粒组合包括第一消除质粒、第二消除质粒和第三消除质粒：
所述第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第一间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第二间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第三间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第一间隔区靶向作用所述第二编码基因区，所述第二间隔区靶向作用所述第三编码基因区，所述第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
43.根据权利要求36所述的质粒组合，所述质粒组合包括第一消除质粒、第二消除质粒和第三消除质粒：
所述第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区，用于分隔所述第三间隔区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第一间隔区靶向作用所述第二编码基因区，所述第二间隔区靶向作用所述第三编码基因区，所述第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
44.根据权利要求36所述的质粒组合，所述质粒组合包括第一消除质粒、第二消除质粒和第三消除质粒：
所述第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第一间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第二间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第三间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第一间隔区靶向作用所述第二编码基因区，所述第二间隔区靶向作用所述第三编码基因区，所述第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
45.根据权利要求36所述的质粒组合，所述质粒组合包括第一消除质粒、第二消除质粒和第三消除质粒：
所述第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区，用于分隔所述第三间隔区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第一间隔区靶向作用所述第二编码基因区，所述第二间隔区靶向作用所述第三编码基因区，所述第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
46.根据权利要求36所述的质粒组合，所述质粒组合包括第一消除质粒、第二消除质粒和第三消除质粒：
所述第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第一间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第二间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第三间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第一间隔区靶向作用所述第二编码基因区，所述第二间隔区靶向作用所述第三编码基因区，所述第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
47.根据权利要求36所述的质粒组合，所述质粒组合包括第一消除质粒、第二消除质粒和第三消除质粒：
所述第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区，用于分隔所述第三间隔区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第一间隔区靶向作用所述第二编码基因区，所述第二间隔区靶向作用所述第三编码基因区，所述第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
48.根据权利要求36所述的质粒组合，所述质粒组合包括第一消除质粒、第二消除质粒和第三消除质粒：
所述第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第一间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第二间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第三间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第一间隔区靶向作用所述第二编码基因区，所述第二间隔区靶向作用所述第三编码基因区，所述第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
49.根据权利要求36所述的质粒组合，所述质粒组合包括第一消除质粒、第二消除质粒和第三消除质粒：
所述第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区，用于分隔所述第三间隔区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第一间隔区靶向作用所述第二编码基因区，所述第二间隔区靶向作用所述第三编码基因区，所述第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
50.根据权利要求36所述的质粒组合，所述质粒组合包括第一消除质粒、第二消除质粒和第三消除质粒：
所述第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第一间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第二间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第三间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第一间隔区靶向作用所述第二编码基因区，所述第二间隔区靶向作用所述第三编码基因区，所述第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
51.根据权利要求36所述的质粒组合，所述质粒组合包括第一消除质粒、第二消除质粒和第三消除质粒：
所述第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区，用于分隔所述第三间隔区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第一间隔区靶向作用所述第二编码基因区，所述第二间隔区靶向作用所述第三编码基因区，所述第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
52.根据权利要求36所述的质粒组合，所述质粒组合包括第一消除质粒、第二消除质粒和第三消除质粒：
所述第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第一间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第二间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第三间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第一间隔区靶向作用所述第二编码基因区，所述第二间隔区靶向作用所述第三编码基因区，所述第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
53.根据权利要求36所述的质粒组合，所述质粒组合包括第一消除质粒、第二消除质粒和第三消除质粒：
所述第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区，用于分隔所述第三间隔区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第一间隔区靶向作用所述第二编码基因区，所述第二间隔区靶向作用所述第三编码基因区，所述第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
54.根据权利要求36所述的质粒组合，所述质粒组合包括第一消除质粒、第二消除质粒和第三消除质粒：
所述第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第一间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第二间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第三间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第一间隔区靶向作用所述第二编码基因区，所述第二间隔区靶向作用所述第三编码基因区，所述第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
55.根据权利要求36所述的质粒组合，所述质粒组合包括第一消除质粒、第二消除质粒和第三消除质粒：
所述第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的重复区，用于分隔所述第三间隔区；具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的先导区；所述间隔区两侧分别配置一所述重复区；
所述第一间隔区靶向作用所述第二编码基因区，所述第二间隔区靶向作用所述第三编码基因区，所述第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
56.根据权利要求36所述的质粒组合，所述质粒组合包括第一消除质粒、第二消除质粒和第三消除质粒：
所述第一消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第一编码基因区；第一间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第一间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第二消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第二编码基因区；第二间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第二间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第三消除质粒包含：具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区；具有SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列的第二复制起始区；第三编码基因区；第三间隔区；具有如SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的重复区；具有如SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的先导区；其中，所述第三间隔区仅于远离所述第一复制起始区复制终端一侧配置一所述重复区；
所述第一间隔区靶向作用所述第二编码基因区，所述第二间隔区靶向作用所述第三编码基因区，所述第三间隔区靶向作用第一编码基因区。
57.根据权利要求37~56任一所述的质粒组合，所述第一编码基因、所述第二编码基因或所述第三编码基因中的任一项均选自标记物基因。
58.根据权利要求57所述的质粒组合，其中，所述标记物基因选自在表达后可以用于分选或筛选的报告基因，或者可以利用抗生素进行筛选的抗性基因，或者表达后可以被对应抗体识别并通过免疫染色或磁珠吸附进行筛选的蛋白基因。
59.根据权利要求58所述的质粒组合，其中，所述报告基因选自氯霉素乙酰转移酶的编码基因、β-葡萄糖苷酸酶的编码基因、萤火虫荧光素酶的编码基因、海洋腔肠荧光素酶的编码基因、分泌型碱性磷酸酶的编码基因、人生长激素的编码基因、绿色荧光蛋白的编码基因、蓝色荧光蛋白的编码基因、黄色荧光蛋白的编码基因、橙色荧光蛋白的编码基因、红色荧光蛋白的编码基因、远红色荧光蛋白的编码基因或可切换荧光蛋白的编码基因中的一种。
60.根据权利要求59所述的质粒组合，其中，所述报告基因选自氯霉素乙酰转移酶的编码基因、β-葡萄糖苷酸酶的编码基因或绿色荧光蛋白的编码基因中的一种。
61.根据权利要求58所述的质粒组合，其中，所述抗性基因选自针对氨苄青霉素、四环素、氯霉素、链霉素、潮霉素、壮观霉素、卡那霉素、杀稻瘟菌素、遗传霉素、霉酚酸、嘌呤霉素、博莱霉素或新霉素的抗性基因中的一种。
62.根据权利要求18~35、37~61任一所述的质粒组合，其中，所述第一间隔区选自具有如SEQ ID NO.9~11任一所示的序列。
63.根据权利要求18~35、37~61任一所述的质粒组合，其中，所述第二间隔区选自具有如SEQ ID NO.9~11任一所示的序列。
64.根据权利要求37~61所述的质粒组合，其中，所述第三间隔区选自具有如SEQ IDNO.9~11任一所示的序列。
65.一种基因编辑试剂盒，包含权利要求1~17任一所述的消除质粒、或权利要求18~64任一所述的质粒组合。
66.权利要求1~17任一所述的消除质粒的制备方法，包括：
获得基础质粒，所述基础质粒具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的第一复制起始区、如SEQ ID NO.2~4任一所示的核苷酸序列的第二复制起始区、位于所述第一复制起始区的复制起始端与所述第二复制起始区的复制终端之间的编码基因区、以及位于所述第一复制起始区的复制终端与所述第二复制起始区的复制起始端之间的初始CRISPR簇；
获得用于与CRISPR核酸酶结合形成复合物以对所述编码基因、或者对进行目的基因编辑的基因编辑质粒进行靶向切割的间隔区的寡聚核酸片段；
将所述寡聚核酸片段插入至所述初始CRISPR簇中，以得到如权利要求1~17任一所述的消除质粒。
67.权利要求1~17任一所述的消除质粒、或权利要求18~64任一所述的质粒组合在制备基因编辑试剂盒中的应用。
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| GR01 | Patent grant | ||
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