KR20210137928A - CRISPR/Cpf1 시스템을 기반으로 한 유전체 단일 염기 편집 방법 및 이의 용도 - Google Patents

CRISPR/Cpf1 시스템을 기반으로 한 유전체 단일 염기 편집 방법 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 CRISPR/Cpf1 시스템을 기반으로 한 유전체 편집 방법 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이 및 불일치 crRNA를 이용한 CRISPR 시스템은 표적 DNA에 유의적인 유전체 편집 효과를 달성하는 바, 본 발명의 CRISPR 시스템은 유전자 가위를 이용한 유전자 교정용 조성물, 유전체 수준의 스크리닝, 암을 비롯한 다양한 질병의 치료제, 질병 진단 또는 이미징용 조성물 개발, 형질전환동식물 개발 등의 폭넓은 분야에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

CRISPR/Cpf1 시스템을 기반으로 한 유전체 단일 염기 편집 방법 및 이의 용도{Method for Single Base Editing Based on CRISPR/Cpf1 System and Uses Thereof}
본 발명은 CRISPR/Cpf1 시스템을 기반으로 한 유전체 편집 방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
미생물의 유전체 돌연변이 도입은 일반적으로 상동성 재조합(homologous recombination)을 이용한 재조합(recombineering) 기술을 이용한다. 이 기술은 대장균으로 phage lambda의 RED 재조합 시스템(recombination system)을 이용한 방법과 Rac prophage의 RecET 시스템을 이용한 방법에서 처음으로 보고되었다. 재조합 기술은 DNA 기질(substrate)에 따라서 ssDNA (single-strand DNA, oligonucleotides), dsDNA (double-strand DNA, PCR fragments)로 나눌 수 있으며 이때 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)는 오카자키 단편(Okazaki fragment)으로 작동하여 DNA 복제 시 재조합 DNA를 만들면서 돌연변이가 도입되고 dsDNA는 5’→ 3’ 엑소뉴클레아제(exonuclease)의 효소적 과정을 거쳐서 작동하게 된다고 알려져 있다. 그러나, 재조합 과정 후 원하는 돌연변이가 도입된 세포를 선별할 때 항생제 저항성 마커를 사용하게 되면 추후 항생제 저항성 마커를 제거해야 하는 문제가 있고 항생제 저항성 마커가 없다면 많은 수의 후보들을 PCR하여 염기서열을 확인해야 하는 복잡한 과정을 거쳐야 한다.
이를 해결하기 위해서 CRISPR 유전자 가위 기술을 이용하여 재조합되지 않은 세포의 유전체에 이중 가닥 절단(DSB, Double strand breakage)를 유발하여 세포 사멸에 이르게 하는 음성 선택(negative selection)을 하게 되면 항생제 저항성 마커를 사용하지 않으면서, PCR 등을 통해서 변이 여부를 확인해야 하는 양성 후보(positive candidate)의 수를 획기적으로 줄일 수 있다.
CRISPR 기술은 미생물의 적응 면역계로 확인되었으며, 최근 대장균, Corynebacterium glutamicum을 포함한 다양한 미생물 균주에서 효율적인 유전체 돌연변이 유발 방법으로 활용되고 있다. Cas 단백질과 표적 상보적인 guide RNA 는 특정 PAM 서열을 인식하고 절단할 수 있다. Guide RNA와 상보적인 표적 DNA 서열에 불일치가 존재하면 표적 서열을 인식하지 못하기 때문에 이를 이용한 음성 선택(negative selection) 방법을 이용하여 미생물 유전체에 도입된 돌연변이의 선별 효율을 높여줄 수 있다. 즉, 표적 부위에 돌연변이가 도입되지 않은 세포는 CRISPR/Cas 시스템에 의해 타겟으로 인식되어 유전체 이중가닥 절단이 일어나게 되어 세포는 사멸하게 되고, 돌연변이가 도입된 세포는 타겟으로 인식되지 않아 살아남게 되어 돌연변이가 도입된 세포를 보다 쉽게 선별할 수 있다.
CRISPR/Cas 시스템 중에서도 Class 2, Cas type II 에 속하는 Cas9 endonuclease 시스템의 경우는 Streptococcus pyogenes로부터 유래하였으며, 가장 먼저 유전체편집 도구로 개발되어 대장균, 젖산균 등과 같은 미생물뿐 아니라 진핵 세포까지 광범위하게 활용되고 있다. Cas9의 경우 5’-NGG를 PAM 서열로 인식하며 3’- 평활 말단(blunt end)로 표적 DNA를 절단하는 특징이 있다. CRISPR/Cas9 시스템을 더욱 더 광범위하게 적용하기 위해서 Cas9 단백질에서 7개의 아미노산 서열을 변경하여 5’-NG를 PAM 서열로 인식하는 Cas9-NG도 개발되었다.
또한, Francisella novidica로부터 유래한 Class 2, Cas type V에 속하는 CRISPR/Cpf1은 5’-TTN을 PAM 서열로 인식하며 5’-오버행(overhang)을 갖도록 표적 DNA를 절단하는 특징이 있으며, Cas9 시스템에 비해서 더 작은 crRNA를 갖고 있어, 일부 연구에서 CRISPR/Cas9 시스템에 비해서 표적 부위가 아닌 서열을 인식해서 절단하는 오프타겟(off-target) 효과가 더 낮다고 보고되었다.
다양한 유용 대사산물을 생산하는 숙주로 사용되고 있는 Corynebacterium glutamicum 에서 CRISPR 기술을 이용할 때 cas9 유전자의 발현이 유전자 산물의 독성으로 인하여 세포의 성장을 지연시킨다는 보고가 있어 cas9 을 유전체에 도입시켜 Cas9 의 발현율을 낮추거나 Ptuf와 같은 약한 프로모터를 사용하기도 하였다.
CRISPR 시스템을 이용한 유전체 편집의 경우 CRISPR가 갖는 불일치 허용으로 인하여 진핵생물과 같이 대체로 크기가 크고 복잡한 유전체를 갖는 경우에는 오프타겟 효과로 인하여 표적이 아닌 곳에도 절단이 일어났다가 DNA 수선 기작에 의해 복구되면서 원치 않는 변이들이 발생하는 문제가 생기기도 하며, 미생물에서는 불일치 허용으로 인해서 1~2개의 염기 치환이 일어난 타겟도 돌연변이가 일어나지 않은 타겟과 동일하게 인식하여 DNA 절단이 일어나게 되어 원하는 돌연변이를 갖는 세포를 선별하기 힘든 문제가 있다.
따라서, 이러한 문제를 극복하고 단일 염기 결실을 미생물의 유전체에 도입하기 위한 기술에 대한 연구가 필요하다.
한국공개특허 제 10-2019-0058358호 (2019.05.29 공개)
Benjamin P. Kleinstiver, Shengdar Q. Tsai, Michelle S. Prew, Nhu T. Nguyen, Moira M. Welch, Jose M. Lopez, Zachary R. McCaw, Martin J. Aryee, J. Keith Joung, Genome-wide specificities of CRISPR-Cas Cpf1 nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 2016 August ; 34(8): 869-874.
상술한 상황 하에서, 본 발명자들은 CRISPR/Cpf1 시스템을 이용하여 목적 대상의 유전체 상의 단일 염기를 정확하게 치환하는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 이에, 본 발명자들은, 표적 DNA와 상보적이지 않은 염기 서열을 도입한 불일치 crRNA(mismatched crRNA)를 포함하는 CRISPR/Cpf1 시스템에, 표적 DNA와 상보적이지 않은 염기 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드를 이용한 위치 유도 돌연변이를 도입하였고, 그 결과, 상기 표적 DNA와 상기 crRNA 서열 간에 2 개 이상의 불일치(mismatch)가 부여(발생)되어 CRISPR/Cpf1 시스템의 불일치 허용을 극복하고, C. glutamicum에 단일 염기 치환 돌연변이가 도입되어, 유전체를 단일 염기 수준까지 정확하게 편집(교정)할 수 있을 뿐만 아니라, 점 돌연변이 도입 효율을 향상시켰음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 일 목적은 CRISPR/Cpf1 시스템 기반 유전체 편집 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 CRISPR/Cpf1 시스템 기반 유전체 편집용 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 CRISPR/Cpf1 시스템 기반의 유전체 편집 효율 증가 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 CRISPR/Cpf1 시스템 기반의 표적 DNA가 편집된 대상체의 제조 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 CRISPR/Cpf1 시스템 기반의 표적 DNA가 편집된 대상체의 제조 방법에 의해 제조된, 표적 DNA가 편집된 대상체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 설명을 목적으로 사용된 것으로, 한정하려는 의도로 해석되어서는 안된다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "핵산 서열", “염기 서열", "뉴클레오타이드 서열" 및 "폴리뉴클레오타이드 서열"은, 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, 유전체, 플라스미드 서열 및 이의 단편 또는 일부, 및 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있는 게놈 또는 합성 기원의 DNA 또는 RNA를 의미하고, 센스 또는 안티센스 가닥을 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 CRISPR/Cpf1 시스템 기반 유전체 편집 방법을 제공하며, 상기 방법은 표적 DNA에 상보적으로 결합하는 공여 핵산 분자 및 표적 DNA와 상보적으로 결합하는 crRNA에 의해, 상기 표적 DNA와 상기 crRNA 서열 간에 1 개 이상의 불일치(mismatch) 뉴클레오타이드가 부여되는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 표적 DNA 상에 변형, 예컨대, 점 돌연변이를 유발하는 공여 핵산 분자로서 올리고뉴클레오티드(mutagenic oligonucleotide); 및 표적 DNA에 대해 상보적으로 결합하고, 상기 표적 DNA에 대해 1 개 이상의 불일치(mismatch) 뉴클레오타이드가 부여된 crRNA;를 각각 제작하였고, 상기 올리고뉴클레오티드 및 상기 crRNA를, 대상체에 주입시키는 경우, 상기 점돌연변이가 포함된 올리고뉴클레오티드에 의해 표적 DNA 상에 불일치(mismatched) 염기 1 개가 존재하고, 또한, crRNA 상 부여한 불일치(mismatched) 염기 1 개가 존재하므로, 이로 인해 상기 표적 DNA와 상기 crRNA 서열 간에 2 개 이상의 미스매치(mismatch)가 발생함으로써 불일치 허용에 따른 음성 선택 결과로 대상체의 표적 DNA가 정확하게 편집된다.
본 명세서에서 용어 "유전체 교정(genome editing)"은, 특별한 언급이 없는 한, 표적 DNA의 표적 부위에서의 Cpf1 절단에 의한 핵산 분자의 결실, 삽입, 치환 등에 의하여 유전자 기능을 편집, 회복, 수정, 상실 및/또는 변경시키는 것을 의미한다.
바람직하게는, 본 발명에서 crRNA와 표적 DNA 간의 2 개 이상의 불일치 뉴클레오타이드가 오히려 CRISPR 시스템의 편집 효과를 향상시키는 것을 특징으로 한다.
상기 crRNA와 표적 DNA 간의 2 개 이상의 미스매치는 공여 핵산 분자의 도입 및 인위적인 crRNA 상의 불일치 도입에 의해 달성된다.
본 발명에서 CRISPR/Cpf1 시스템 기반 유전체 편집을 언급하면서 사용되는 용어 "공여 핵산 분자" 또는 “공여체 핵산 서열"은 표적 DNA에 삽입하고자 하는 목적의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 천연의 또는 변형된 폴리뉴클레오티드, RNA-DNA 키메라, 또는 DNA 단편, 또는 PCR 증폭된 ssDNA 또는 dsDNA 단편 또는 이의 유사체를 지칭한다.
이러한 공여 핵산 분자는 표적 DNA 상에 변형을 유발하여 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 임의의 형태, 예컨대, 단일-가닥 및 2중-가닥 형태를 포함할 수 있다.
상기 표적 DNA 상의 변형은 임의의 목적 위치에서의 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 녹아웃(knockout), 녹인(knockin), 내인성 핵산 서열의 상동, 이종상동성(endogenous) 또는 이종 핵산 서열로의 치환, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 바람직하게는, 상기 표적 DNA 상의 변형은 야생형 DNA 서열에서 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환에 의해 점 돌연변이가 도입(유도)된 것이고, 이러한 점 돌연변이의 도입은 예컨대, 올리고뉴클레오타이드에 의한 것이다.
상술한 점 돌연변이의 도입은 표적 DNA와의 미스매치를 유발한다.
본 발명에서 사용하는 용어 "돌연변이"는 단일 가닥 합성 DNA로 이루어진 올리고뉴클레오타이드에 의해서 유전체에 도입되는 돌연변이를 의미한다.
본 명세서에서 돌연변이 유도(유발)를 언급하면서 사용되는 용어 "올리고뉴클레오타이드"의 길이는, 10개의 내지 90개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 15개 내지 85개의 뉴클레오타이드(mer), 더욱 바람직하게는 25개 내지 75개의 뉴클레오타이드(프로브 또는 암플리머(amplimer)로서 사용될 수 있음)의 핵산 서열을 의미한다.
본 발명의 일시예에서, 상기 돌연변이 유발을 위한 올리고뉴클레오타이드(mutagenic oligonucleotide)는 59 mer 길이의 염기로 이루어진 단일 가닥 합성 DNA를 사용하였으나, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 사용하는 용어 "불일치" 또는 "미스매치(mismatch)"는 DNA 간 또는 DNA와 RNA 염기 간에 상보적인 결합에서 비상보적인 서열이 존재하는, 부적정 염기쌍이 발생한 상태를 의미하며 이들은 혼용된다. 본 발명자는 올리고뉴클레오타이드 및 CRISPR/Cpf1에 이용되는 crRNA를 이용하여, 야생형 DNA 서열에서 1 개 이상의 뉴클레오타이드가 점 돌연변이됨으로써 존재하는 미스매치와, 표적 DNA에 상보적인 crRNA 간에 의도적인 불일치 염기를 부여하여 발생한 미스매치로 인해 CRISPR가 표적 DNA를 인식하지 못함을 확인하였다.
따라서, 본 명세서에서 사용되는 용어 "불일치 뉴클레오타이드", "불일치 염기"또는 "미스매치 뉴클레오타이드"는 비-상보적인 뉴클레오타이드를 의미하며 혼용된다.
또한, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 불일치 뉴클레오타이드는 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, crRNA 상의 다양한 위치(site)에 위치시킬 수 있다.
즉, 상기 crRNA 상의 불일치 뉴클레오타이드의 위치는, 표적 DNA와 이에 상보적인 crRNA 간에 인위적 불일치 염기를 부여함으로써, CRISPR가 표적 DNA를 인식하지 못하도록 하는 한, 임의의 위치에 존재할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 공여 DNA 상의 점 돌연변이가 존재하는 위치에 상응하는, crRNA 상의 위치로부터 1 개의 뉴클레오타이드가 이격된 바로 근접한 부위에 위치하거나, 또는 10 개 이상 원격된 부위에 위치할 수 있다.
본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 불일치 뉴클레오타이드의 수는 제한되지 않으나, 바람직하게는, 불일치 뉴클레오타이드의 수는 1 내지 10개, 보다 바람직하게는 1 내지 5개, 보다 더 바람직하게는 1 내지 2 개일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면 불일치 염기의 수는 1 내지 2 개, 가장 바람직하게는 1개이다.
또한, crRNA에 최소 2 개의 불일치 뉴클레오타이드가 있는 경우, 불일치 뉴클레오타이드는 연속적 또는 불연속적으로 위치할 수 있다.
본 명세서에서 불일치 뉴클레오타이드 위치를 언급하면서 사용되는 용어"바로 근접한(immediately adjacent)"은, 표적 DNA 상에 변형을 유발하는 공여 핵산 분자(예컨대, 올리고뉴클레오타이드) 상에, 점 돌연변이가 존재하는 위치에 상응하는 위치로부터 5'- 또는 3'-말단 방향으로 인접(juxtaposition)한, 즉, 1 개 뉴클레오타이드만큼 이격된 부위에 위치하는 것을 의미한다.
본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 돌연변이 유도를 위한 올리고뉴클레오타이드에는 표적 서열과 1개 내지 4개의 불일치가 존재할 수 있으며, 표적 불일치 crRNA에는 1 개 내지 3 개의 불일치가 존재할 수 있다. 표적 불일치 crRNA에는 상기 돌연변이 유도를 위한 올리고뉴클레오타이드가 갖는 점 돌연변이에 상응하는 위치로부터 1-2 염기가 이격된 부위에 위치하는 것이 바람직하며, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 불일치 염기는 올리고뉴클레오타이드 상의 점 돌연변이 위치로부터 1개의 염기가 이격된 바로 근접한 부위에 위치한다.
용어 "crRNA"는 표적 DNA에 특이적인 RNA로, Cpf1 단백질과 복합체를 형성할 수 있고, Cpf1 단백질을 표적 DNA에 가져오는 RNA를 말한다. 상기 crRNA가 표적과 상보적인 부분을 포함한다면, 어떠한 crRNA라도 본 발명에 사용될 수 있다. 상기 crRNA는 표적 DNA와 혼성화될 수 있다.
crRNA는 RNA의 형태 또는 crRNA를 암호화하는 DNA의 형태로 세포 또는 유기체에 전달될 수 있다. 또한, crRNA는 분리된 RNA의 형태, 바이러스 벡터에 포함되어 있는 RNA, 또는 벡터에 암호화되어있는 형태일 수도 있다. 바람직하게, 상기 벡터는 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 또는 아그로박테리움 (agrobacterium) 벡터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 crRNA는, 표적 DNA의 서열과 완벽하게 상보적인 표적 일치 crRNA뿐만 아니라, 올리고뉴클레오타이드 상의 점 돌연변이가 존재하는 위치에 상응하는 위치로부터 5'- 또는 3'-말단 방향으로 1 개의 염기가 이격된 불일치 서열이 존재하는 표적 불일치 crRNA 를 모두 포함한다.
본 발명에서 CRISPR/Cpf1 시스템 기반 유전체 편집을 언급하면서 사용되는 용어 "불일치(mismatched) crRNA"는 표적 DNA와 crRNA 서열 간에 불일치 뉴클레오타이드가 1 개 이상 존재하는 crRNA를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "혼성화(hybridization)"는 상보적인 단일 가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2 개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 미스매치(mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다.
Cpf1 단백질은 상기 CRISPR/Cas 시스템과는 구별되는 새로운 CRISPR 시스템의 엔도뉴클레아제로서, Cas9에 비해 상대적으로 크기가 작고, tracrRNA가 필요 없으며, 단일 가이드 RNA에 의해 작용할 수 있다.
또한, Cpf1 단백질은, PAM (protospacer-adjacent motif) 서열로서, 5' 말단에 위치하는, 5'-TTN-3' 또는 5'-TTTN-3' (N은 임의의 뉴클레오타이드로서, A, T, G, 또는 C의 염기를 갖는 뉴클레오타이드임)와 같은 티민 (thymine)이 풍부한 DNA 서열을 인식하고 DNA의 이중 사슬을 잘라 점착종단 (cohesive end; cohesive double-strand break)을 생성한다. 이와 같이 생성된 점착 종단은 표적 위치 (또는 절단 위치)에서의 NHEJ-mediated transgene knock-in을 용이하게 할 수 있다.
본 발명의 CRISPR/Cpf1 시스템에서 상기 PAM은 5'-TTN-3' 염기이다.
예컨대, 상기 Cpf1 단백질은 캔디다투스 (Candidatus) 속, 라치노스피라 (Lachnospira) 속, 뷰티리비브리오 (Butyrivibrio) 속, 페레그리니박테리아 (Peregrinibacteria), 액시도미노코쿠스 (Acidominococcus) 속, 포르파이로모나스 (Porphyromonas) 속, 프레보텔라 (Prevotella) 속, 프란시셀라 (Francisella) 속, 캔디다투스 메타노플라스마 (Candidatus Methanoplasma), 또는 유박테리움 (Eubacterium) 속 유래의 것일 수 있고, 예컨대, Parcubacteria bacterium, Lachnospiraceae bacterium, Butyrivibrio proteoclasiicus, Peregrinibacteria bacterium, Acidaminococcus sp., Porphyromonas macacae, Lachnospiraceae bacterium, Porphyromonas crevioricanis, Prevotella disiens, Moraxella bovoculi, Smiihella sp., Leptospira inadai, Lachnospiraceae bacterium, Francisella novicida, Candidatus Methanoplasma termitum, Candidatus Paceibacter, Eubacterium eligens 등의 미생물 유래의 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 표적 DNA는 상기 crRNA 또는 sgRNA와 상보적인 서열의 뉴클레오타이드 및 프로토스페이서-인접 모티프(protospacer-adjacent motif, PAM)를 포함한다.
종래 기술인 돌연변이 유발 올리고뉴클레오타이드를 세포에 삽입하면, DNA를 복제하는 과정에서 낮은 수율로 돌연변이가 도입될 뿐이었다. 종래 CRISPR/Cpf1 시스템을 이용하는 경우에도 CRISPR/Cpf1의 불일치 허용으로 인해 단일 염기 점 돌연변이를 도입하는데 어려움이 있었다.
이에, 상술한 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 CRISPR/Cpf1의 불일치 허용을 극복하면서 표적 유전자의 목표 염기에 점 돌연변이를 도입시켜 효과적으로 편집 효과를 달성하는 데 영향을 미치는, 불일치 crRNA를 설계하고 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이와 함께 CRISPR/Cpf1 시스템에 적용하였다.
그 결과, 점 돌연변이에 의한 불일치 염기 수 및 상기 불일치 crRNA (target-mismatched sgRNA)에 의해 증가한 불일치 염기 수로 인해 유전자 가위가 표적으로 인식하지 않아 표적 DNA가 절단되지 않고 살아남음으로써, 효과적인 유전체 편집 효과를 달성함을 규명하였다.
따라서, 본 발명에서 제공하는 방법은 미스매치가 없는 종래 crRNA에 비하여 유전체 편집 효과가 증가하는 것일 수 있다.
즉, 돌연변이가 도입되지 않은 세포들은 표적 유전자에 이중 가닥 절단이 일어나 죽게 되고, 돌연변이가 도입된 세포들은 표적으로 인식되지 않아 살아남게 되며, 이를 음성 선택이라고 한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상술한 방식으로 돌연변이 도입 후 선별된 변이 균주 유전체의 일부를 염기서열 분석 후 모균주의 유전체 서열과 비교분석한 결과, 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이와 함께 표적 서열-일치 crRNA를 이용한 경우, 점 돌연변이가 도입된 것으로 선별된 분홍색 콜로니가 0.6%의 낮은 비율로 나타났을 뿐만 아니라, 분홍색 콜로니 중 소수만이 정확하게 A에서 G로 치환되었으며, 나머지는 A에서 G로의 치환이 유발되었으나 주변의 염기에도 의도하지 않은 변이가 발생하였다.
반면, 본 발명의 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이와 함께 단일 염기 불일치 crRNA를 이용한 경우와, 이중 염기 불일치 crRNA를 이용한 경우에는 90% 이상의 높은 분홍색 콜로니 비율을 보였을 뿐만 아니라, 분홍색 콜로니 모두 정확하게 A에서 G로 치환되었고, 주변 부위에도 다른 변이가 발생하지 않았다.
이는, 목표 염기에 정확하게 단일 염기 점 돌연변이가 도입되었음을 의미한다.
결론적으로, 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이 도입과 불일치 crRNA를 이용한 CRISPR/Cpf1 음성 선택으로 균주의 유전체에서 목표 염기에만 정확하게 돌연변이를 도입할 수 있었다.
따라서, 본 발명의 방법은 단일 염기 점 돌연변이를 도입하여 목적 대상체의 유전체를 효과적으로 단일 염기 단위로 정교하게 편집할 수 있음을 입증한다.
또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 표적 DNA에 상보적으로 결합하는 공여 핵산 분자 및 crRNA를 포함하는 CRISPR/Cpf1 시스템 기반 유전체 편집용 조성물을 제공하며, 상기 표적 DNA와 상기 crRNA 서열 간에 1 개 이상의 불일치(mismatch) 뉴클레오타이드가 부여된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 조성물은 CRISPR-Cpf1 시스템에서 표적 유전자를 인식하나 표적 DNA와 1개 이상의 불일치 서열이 존재하는 crRNA를 발현할 수 있는 구조물을 포함하며, crRNA 및 공여 DNA(예컨대, 올리고뉴클레오타이드)가 동시에 세포 내로 전달되고, Cpf1 단백질에 의한 표적 DNA의 절단 시 공여 DNA를 통해 표적 DNA 대신 점 돌연변이 서열을 포함하는 공여 DNA가 유전체 내에 포함되어 표적 DNA의 치환 돌연변이 효율을 높일 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 방법을 이용하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 CRISPR/Cpf1 시스템 기반의 유전체 편집 효율 증가 방법을 제공하며, 표적 DNA에 상보적으로 결합하는, 공여 핵산 분자 및 crRNA에 의해 상기 표적 DNA와 상기 crRNA 서열 간에 1 개 이상의 불일치(mismatch) 뉴클레오타이드가 부여되는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법은 상술한 방법을 이용하므로, 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, CRISPR/Cpf1 시스템 기반의 표적 DNA가 편집된 대상체의 제조 방법을 제공한다:
(a) 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 표적 DNA 상에 변형을 유발하는 공여 핵산 분자를 제작하는 단계;
(b) 표적 DNA에 대해 상보적으로 결합하고, 상기 표적 DNA에 대해 1 개 이상의 불일치(mismatch) 뉴클레오타이드가 부여된 crRNA를 제작하는 단계; 및
(c) 상기 (a) 단계의 공여 핵산 분자 및 상기 (b) 단계의 crRNA를, 편집시키고자 하는 대상체에 주입시켜 상기 표적 DNA와 상기 crRNA 서열 간에 2 개 이상의 불일치(mismatch)가 발생함으로써 대상체의 표적 DNA가 편집되는 단계.
또한, 본 발명의 상기 CRISPR/Cpf1 시스템은 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 당업계에 공지된 임의의 선별마커를 이용할 수 있다.
본 발명의 대상체는, 본 발명의 방법을 적용할 수 있는 한, 제한되지 않으나, 바람직하게는 플라스미드, 바이러스, 원핵 세포, 분리된 진핵 세포 또는 인간을 제외한 진핵 유기체일 수 있다.
상기 진핵 세포는 효모, 곰팡이, 식물, 곤충, 양서류, 포유동물 등의 세포일 수 있고, 예를 들어, 당업계에서 일반적으로 사용되는 인 비트로에서 배양된 세포, 이식된 세포, 일차 세포 배양, 인 비보 세포, 인간을 포함하는 포유 동물의 세포일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 실시예에서, Cpf1 유전자가 유전체에 통합된 균주를 사용하기 때문에 Cpf1 플라스미드를 삽입하는 과정이 불필요하고, Cpf1 단백질의 안정적인 과발현을 유도할 수 있다. dsDNA를 사용하여 증폭, 정제 과정을 추가로 필요로 하지 않고, 단일 점 돌연변이를 포함하는 올리고뉴클레오타이드(mutagenic oligonucleotide)와 crRNA 플라스미드의 삽입 과정만이 필요하므로, 유전체의 교정까지 전체적인 시간을 단축시켰다.
본 발명의 일 실시예에 사용된 crRNA 플라스미드의 경우 37℃에서 배양함에 따라 소실되기 때문에 연속적인 유전체의 편집이 가능하고, 유전체에 통합된 Cpf1 유전자의 경우 손쉽게 제거되기 때문에 아무런 흔적 없이 유전체를 편집하는 것이 가능하므로 유전자 변형 생물체와 관련된 문제로부터 큰 영향을 받지 않을 수 있다.
상기 Cpf1 단백질을 암호화하는 핵산 또는 Cpf1 단백질은 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한, 임의의 것도 이용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 표적 DNA가 편집된 대상체의 제조 방법에 의해 제조된, 표적 DNA가 편집된 대상체를 제공한다.
본 발명은 목적 대상의 유전체를 단일 염기 단위로 편집, 수선하는 방법에 관한 것으로서, 목표 유전자에 변이가 일어난 목적 대상, 예컨대, 미생물 균주들의 유전체를 올바르게 수선하거나, 코돈의 변화 등을 유발함으로써 유용 물질 등의 생산능을 최적화시킨 균주를 제작하는 방법을 제공하는 효과가 있다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이 및 불일치 crRNA를 이용한 CRISPR/ Cpf1 시스템은 표적 DNA에 정확한 유전체 편집 효과를 달성할 뿐만 아니라, off-targeting 효과가 매우 적으므로, 본 발명의 CRISPR 시스템은 유전자 가위를 이용한 유전자 교정용 조성물, 유전체 수준의 스크리닝, 암을 비롯한 다양한 질병의 치료제, 질병 진단 또는 이미징용 조성물 개발, 형질전환동식물 개발 등의 폭넓은 분야에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1a 내지 1c은 본 발명의 유전체 돌연변이 도입 및 CRISPR/Cpf1을 이용한 유전체 편집 과정에 대한 개념도를 나타낸 것이다.
도 2a 및 2b는 각각 코리네박테리움 글루타미쿰 균주에서 카로티노이드 생합성 경로 및 이를 촉매하는 유전자군을 도식화한 것이다.
도 3a는 다양한 개수의 점 돌연변이가 존재하는 올리고뉴클레오타이드와 표적 일치 crRNA(Perfect-matched crRNA)를 이용하였을 때, 표적 서열과 crRNA의 결합을 도식화한 것이다. 도 3b는 crRNA의 세포 내 도입 및 음성선택에 따른 형질전환 효율과 이때의 돌연변이 도입에 의한 crtEb 유전자의 불활성화로 인해 나타난 분홍색 콜로니의 비율을 그래프화한 것이다. 도 3c는 올리고뉴클레오타이드에 의한 돌연변이가 1 개일 때 불일치 내성에 의해서 정확한 이중 가닥 절단이 발생하지 못하고 돌연변이가 2개 이상일 때 정확한 이중 가닥 절단이 발생함을 도식화한 것이다.
도 4a는 1 개의 점 돌연변이가 존재하는 올리고뉴클레오타이드와 표적 불일치 crRNA(Single-mismatched, Double-mismatched, Triple-mismatched)를 이용하였을 때 표적 서열과 crRNA의 결합을 도식화한 것이다. 도 4b는 crRNA의 세포 내 도입 및 음성선택에 따른 형질전환 효율과 이때의 돌연변이 도입에 의한 crtEb 유전자의 불활성화로 인해 나타난 분홍색 콜로니의 비율을 그래프화한 것이다.
도 5는 1 개의 점 돌연변이가 존재하는 올리고뉴클레오타이드와 표적 일치 crRNA 및 표적 불일치 crRNA를 이용했을 때, 음성 선택으로 인해 발생한 분홍색 콜로니의 crtEb 유전자 부위를 PCR하여 염기서열을 분석한 결과이다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. Cpf1 의 안정적인 발현과 scar-less editing을 위한 cpf1 유전자의 C. glutamicum 유전체 도입
본 발멸자들은 Cpf1의 안정적인 발현과 scar-less editing을 위해서 Francisella novicida 유래 cpf1을 C. glutamicum 유전체에 도입하였다.
간략하게는, C. glutamicum 유전자 번호(locus tag no.) Cg1121의 500 bp 상동성 서열, Fncpf1 유전자와 조절부위를 pKmobSacB 플라스미드에 삽입시켜 만든 pHK487을, C. glutamicum 13869에 전기천공하여 형질전환시킨 후, 카나마이신(kanamycin)이 25 ug/mL로 포함된 BHI 배지에서 자란 형질전환체를 PCR 을 통해서 확인하함으로써 Fncfp1 유전자와 조절부위가 유전체에 도입된 HK1220 균주를 제작하였다(도 1a).
상기 균주에 RecT 발현 플라스미드인 pHK489를 전기천공하여 도입하였다. 상기 균주에 올리고뉴클레오타이드를 이용한 위치 유도 돌연변이(site-directed mutation)를 도입하기 위하여, 25 μg/mL 클로람페니콜(chloramphenicol), 0.5 mM IPTG 가 포함된 BHISG (50 mM sorbitol, 10 g/L glucose가 포함된 BHI) 배지에서 OD600nm 값이 1이 될 때까지 배양한 후, crRNA와 올리고뉴클레오타이드를 전기천공으로 세포 내로 도입하였다(도 1b).
돌연변이 도입과 선별이 완료되면 플라스미드는 37℃에서 배양하여 소실(curing)시키고, 유전체에 도입되어 있는 Fncpf1 유전자는 상동성 서열과 SacB 를 이용해서 제거하여 scar-less genome editing이 가능한 시스템을 구축하였다(도 1c).
실시예 2. 올리고뉴클레오타이드와 CRISPR/Cpf1 시스템을 이용한 카로티노이드계 색소 생합성 유전자 crtEb의 편집
본 발명자들은, 올리고뉴클레오타이드가 갖는 염기 돌연변이 개수에 따른 유전체 편집 효율을 확인하기 위하여, 올리고뉴클레오타이드와 CRISPR/Cpf1 시스템을 이용하여 카로티노이드계 색소 생합성 유전자 crtEb를 편집하였다.
간략하게는 다음과 같다.
올리고뉴클레오타이드를 이용한 위치 유도 돌연변이를 확인하기 위한 타겟으로서 카로티노이드(carotenoid) 생합성 오페론의 crtEb 유전자를 이용하였다.
이 유전자는 라이코펜(lycopene)을 플라부크산틴(flavuxanthin)으로 전환하는 효소이다(도 2). 이 유전자가 발현되지 않으면 플라부크산틴 (flavuxanthin), 데카프레녹산틴(decaprenoxanthin)이 생합성되지 않고 라이코펜이 축적되면서 콜로니의 색상이 분홍색을 띠게 된다. 따라서, 이 유전자를 타겟으로 하여 올리고뉴클레오타이드를 이용하여 돌연변이를 유발(점 돌연변이의 도입)한 후, 형질전환체를 얻고 형질전환체의 색깔 변화를 이용해서 돌연변이 도입 여부를 확인 및 선별할 수 있다.
형질전환 효율이 ug DNA 당 106 인 competent cell을 이용하였고 표적 부위를 정확하게 인식하여 절단하는 표적 일치 crRNA만 형질전환하였을 때 ug DNA 당 102의 생존 세포(survival cells)이 나타났다(도 3b).
또한, crtEb 유전자의 150 번째 염기인인 T를 G로 치환하여, 티로신(tyrosine)이 종결 코돈이 되는 넌센스 돌연변이 (nonsense mutation)를 유발하도록 하였으며 올리고뉴클레오타이드가 갖는 돌연변이 개수를 1개에서 4개까지 설계하고 표적 일치 crRNA를 이용하였다.
그 결과, 4 가지 올리고를 사용한 경우 모두 생존 세포는 102 내지 103으로 나타났다. 즉, 올리고뉴클레오타이드에 돌연변이가 1개 존재하는 경우 분홍색 콜로니의 비율이 0.58%로 매우 낮은 것으로 나타났고, 이는 CRISPR/Cpf1 시스템에 의해서 음성 선택이 작동하지 않았음을 제시한다.
반면, 올리고뉴클레오타이드에 돌연변이가 2개, 3개, 4개 존재하는 경우 90% 이상의 콜로니가 분홍색으로 나타났고, 각각 95.31%, 91.52%, 92.0%로 나타났다(도 3b).
즉, 올리고뉴클레오타이드에 의해서 유발된 돌연변이가 1개일 때 효율이 낮은 것은 crRNA와 상보적인 20 개의 염기(표적 서열) 중에서 1개의 불일치(mismatch)가 있더라도 유전자 가위에 의해서 절단될 수 있는 불일치 내성(mismatch tolerance)를 나타낸다는 것을 제시한다.
반면, 돌연변이가 2 개 이상일 때는, CRISPR/Cpf1 시스템이 불일치 내성 없이 정확하게 돌연변이가 도입된 서열과 도입되지 않는 서열을 구분할 수 있다는 것을 보여준다(도 3c).
실시예 3. 불일치 crRNA(Mismatched crRNA)를 이용한 단일 염기 치환 효율 검증
본 발명자들은 불일치 crRNA(Mismatched crRNA)를 이용한 단일 염기 치환 효율을 확인하였다.
간략하게는 다음과 같다.
crRNA와 상보적인 20개의 염기(표적 서열) 중에서 2개 이상의 불일치가 있을 때 CRISPR/Cpf1에 의한 정확한 선별이 가능한 것을 바탕으로 올리고뉴클레오타이드를 이용한 단일 염기 치환을 위해서 불일치 crRNA(mismatched crRNA)를 이용하였다.
즉, 표적 서열에 올리고뉴클레오타이드에 의해 도입되는 돌연변이 1개로 인하여 불일치 서열이 발생하고, 이와 별개로 crRNA 서열에 또 다른 불일치 서열이 존재하도록 설계하여, crRNA와 상보적으로 결합하는 20개의 염기(표적 서열)에 2개 이상의 불일치가 발생하도록 유도하였다. 또한, 돌연변이가 도입된 서열과 아닌 서열을 비교하여, 이 둘을 정확하게 구별할 수 있도록 하였다.
crRNA에 불일치를 1 내지 3 개까지 갖도록 하여 전체 불일치 개수가 2개 이상이 되도록 crRNA 발현 벡터를 제작하여 비교하였다(도 4a).
그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이, crRNA에 존재하는 불일치가 1 개, 즉, 전체 불일치 개수가 2 개일 때, PAM에서 가까운 쪽에 crRNA 불일치가 위치하는 경우(pHK494) 분홍색 콜로니의 비율이 14.9%로 나타난 반면, PAM에서 먼 쪽에 crRNA 불일치가 위치하는 경우(pHK497)에는 분홍색 콜로니의 비율이 99.7%로 확인되었다.
또한, crRNA에 존재하는 불일치가 2 개, 즉, 전체 불일치 개수가 3 개일 때, PAM에서 가까운 쪽에 crRNA 불일치가 위치하는 경우(pHK495) 분홍색 콜로니의 비율이 91.5%로 나타난 반면, PAM에서 먼 쪽에 crRNA 불일치가 위치하는 경우(pHK498) 분홍색 콜로니가 전혀 관찰되지 않았으며, 생존 세포 또한 ~106으로 나타나 CRISPR/Cfp1에 의한 음성선택이 작동하지 않는 것으로 확인되었다.
또한, crRNA에 존재하는 불일치가 3 개일 때(pHK496 및 pHK499)는 불일치가 어느 쪽에 위치하던지 분홍색 콜로니가 관찰되지 않았으며, 이는 CRISPR/Cpf1에 의한 음성선택이 작동하지 않는 것으로 확인되었다.
또한, 본 발명자들은 분홍색 콜로니의 crtEb 부분을 시퀀싱하여 불일치 crRNA에 의해서 정확하게 단일 염기 치환이 되었는지 확인하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 일치 crRNA를 이용했던 세포들(pHK493)은 0.6%의 비율로 분홍색 콜로니가 나타났고, 분홍색 콜로니 9 개 중 2 개만이 정확하게 A에서 G로 치환되었으며, 나머지는 A에서 G로의 치환이 유발되었으나 주변의 염기에도 변이가 생긴 것을 확인할 수 있다. 또한, PAM에서 가까운 쪽에 존재하는 단일 염기 불일치 crRNA를 이용했던 세포들(pHK494)은 14.9%의 비율로 분홍색 콜로니가 나타났고, 분홍색 콜로니 9개 중 3개만이 정확하게 A에서 G로 치환된 것으로 나타났다.
반면, PAM에서 먼 쪽에 존재하는 단일 염기 불일치 crRNA를 이용했던 세포들(pHK497)과, PAM에서 가까운 쪽에 존재하는 이중 염기 불일치 crRNA를 이용했던 세포들(pHK495)은 90% 이상의 높은 분홍색 콜로니 비율을 보였을 뿐만 아니라, 분홍색 콜로니 9개가 모두 정확하게 A에서 G로 치환되었고 주변 부위에도 다른 변이가 없는 것으로 확인되었다.
본 실시예에 이용된 올리고뉴클레오타이드는 하기 표 1에 나타내었다.
서열번호 올리고뉴클레오타이드 명 올리고뉴클레오타이드 염기 서열(5'→3') 특징
1 59mer-S GTAGGCATAGTATTTTTTCTTATCCCGTAGAACATCGCCATGTATGGCATCAACGATGT Single-mutagenic (150T to G)
2 59mer-D GTAGGCATAGTATTTTTTCTTATCCCGTAGCACATCGCCATGTATGGCATCAACGATGT Double-mutagenic (150TA to GC)
3 59mer-T GTAGGCATAGTATTTTTTCTTATCCCGTAGCCCATCGCCATGTATGGCATCAACGATGT Triple-mutagenic (150TAA to GCC)
4 59mer-Q GTAGGCATAGTATTTTTTCTTATCCCGTAGCCAATCGCCATGTATGGCATCAACGATGT Quadruple-mutagenic (150TAAC to GCCA)
5 P1 CAATAACTAAGTCCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCG Construction of the Cpf1 integrated vector
6 P2 CAAGAACCAGGACCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGG Construction of the Cpf1 integrated vector
7 P3 AACCGTATTACCGGTCCTGGTTCTTGTCCTGGGCAACGTTG Construction of the Cpf1 integrated vector
8 P4 GATTCCGCGAACCCCAGAGTCCCGCAGGAGCCTCAAAAATCGAGCTCGCTTTGGTC Construction of the Cpf1 integrated vector
9 P5 CAAAGCGAGCTCGATTTTTGAGGCTCCT GCGGGACTCTGGGGTTCGCGGAATCATG Construction of the Cpf1 integrated vector
10 P6 GCTCACTCAAAGGGACTTAGTTATTGCGGTTCTGGACAAAT Construction of the Cpf1 integrated vector
11 P7 [5’-Phosphorylated] CACACATGGTACCACACGATGATTAATTG Construction of the RecT expression vector
12 P8 [5’-Phosphorylated] GAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTC Construction of the RecT expression vector
13 P9 TTTTTTTCTCCATGCGAAACGATCCTCATCCTGTCTCTTGA Construction of the RecT expression vector
14 P10 GCAGGGCGGGGCGGCGGGACTCTGGGGTTCGCGGAATCATG Construction of the RecT expression vector
15 P11 AGGATCGTTTCGCATGGAGAAAAAAATCACTGGATATACCA Construction of the RecT expression vector
16 P12 CCCAGAGTCCCGCCGCCCCGCCCTGCCACTCATCGCAGTAC Construction of the RecT expression vector
Construction of the crRNA expression vector
17 P13 GAAAGCACTCAAGACGTGCGAGCTACCAACTCATATGCACGGG Construction of pHK473 (crRNA expression vector)
18 P14 CGGTGTTTCGTTTAGTGGGTGCGAAGAATAGTCTGCTCATTAC Construction of pHK473 (crRNA expression vector)
19 P15 ATTCTTCGCACCCACTAAACGAAACACCGTCAGCAGAAAACGG Construction of pHK473 (crRNA expression vector)
20 P16 GTTGGTAGCTCGCACGTCTTGAGTGCTTTCTCCCAGCTGATGAC Construction of pHK473 (crRNA expression vector)
21 P17 [5’-Phosphorylated] TTCGAGTCGAGGAAGAGCCAGAGCAGAAGGC Construction of pHK475 (crRNA expression vector)
22 P18 [5’-Phosphorylated] TTCGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAG Construction of pHK475 (crRNA expression vector)
23 P19 GATATTCCATTTTCTGATGTGAGAAGAGCCATTATGGATTC Construction of crRNA plasmids
24 P20 CTTCTCACATCAGAAAATGGAATATCAGGTAGTAATTCCTC Construction of crRNA plasmids
25 P21 TTATCCCGTATAACATCGCCAATTTAAATAAAACGAAAGGCTCAG Construction of pHK493 (crRNA expression vector)
26 P22 TGGCGATGTTATACGGGATAAATCTACAACAGTAGAAATTCGGAT Construction of pHK493 (crRNA expression vector)
27 P23 TTATCCCGTCTAACATCGCCAATTTAAATAAAACGAAAGGCTCAG Construction of pHK494 (crRNA expression vector)
28 P24 TGGCGATGTTAGACGGGATAAATCTACAACAGTAGAAATTCGGAT Construction of pHK494 (crRNA expression vector)
29 P25 TTATCCCGGCTAACATCGCCAATTTAAATAAAACGAAAGGCTCAG Construction of pHK495 (crRNA expression vector)
30 P26 TGGCGATGTTAGCCGGGATAAATCTACAACAGTAGAAATTCGGAT Construction of pHK495 (crRNA expression vector)
31 P27 TTATCCCCGCTAACATCGCCAATTTAAATAAAACGAAAGGCTCAG Construction of pHK496 (crRNA expression vector)
32 P28 TGGCGATGTTAGCGGGGATAAATCTACAACAGTAGAAATTCGGAT Construction of pHK496 (crRNA expression vector)
33 P29 TTATCCCGTATCACATCGCCAATTTAAATAAAACGAAAGGCTCAG Construction of pHK497 (crRNA expression vector)
34 P30 TGGCGATGTGATACGGGATAAATCTACAACAGTAGAAATTCGGAT Construction of pHK497 (crRNA expression vector)
35 P31 TTATCCCGTATCCCATCGCCAATTTAAATAAAACGAAAGGCTCAG Construction of pHK498 (crRNA expression vector)
36 P32 TGGCGATGGGATACGGGATAAATCTACAACAGTAGAAATTCGGAT Construction of pHK498 (crRNA expression vector)
37 P33 TTATCCCGTATCCAATCGCCAATTTAAATAAAACGAAAGGCTCAG Construction of pHK499 (crRNA expression vector)
38 P34 TGGCGATTGGATACGGGATAAATCTACAACAGTAGAAATTCGGAT Construction of pHK499 (crRNA expression vector)
39 P35 GAGCTTGCAGGCGAACTAGGTGTCAGTG Sequencing of crRNA plasmids
40 P36 CAGAACCCATACGGTGGTTACGACAAC Cpf1 integration in the C. glutamicum genome (Upstream of HR region)
41 P37 GTTGGCTCCGTTGTTCACGTCTACTACG Cpf1 integration in the C. glutamicum genome (Downstream of HR region)
42 P38 GAGCTCTTCGGCCAGGTCCTTCTTGATC Cpf1 integration in the C. glutamicum genome (Reverse primer of the cpf1 gene)
43 P39 CGAGACCTTCAAGAAGATGGGCAAGCAG Cpf1 integration in the C. glutamicum genome (Forward primer of the cpf1 gene)
44 P40 CTTCTGATTCCTGCCCTATGGTTGCCTG Sequencing of crtEb
45 P41 GTTGTGGAGCTTGAACGCATCGAGGTCG Sequencing of crtEb
종래 기술인 돌연변이 유발 올리고뉴클레오타이드를 세포에 삽입하면 DNA를 복제하는 과정에서 낮은 수율로 돌연변이가 도입되며, 도입 여부를 확인하기 위해서 많은 수의 후보들을 PCR 및 염기서열 분석등을 통해서 확인하여야 했다. CRISPR/Cpf1 시스템을 사용하게 되면 돌연변이가 도입되지 않은 서열은 CRSISPR/Cpf1 시스템에 의해 표적으로 인식되어 이중가닥 DNA 에 절단이 일어나고 세포 사멸에 이르게 되고, 돌연변이가 도입된 서열은 표적으로 인식되지 않아서 세포는 살아남아 콜로니를 형성하게 됨으로써 돌연변이 도입 여부를 확인하는 데 필요한 시간 및 비용 효율적인 선별이 가능하다.
그러나, 이러한 기술에도 CRISPR/Cpf1 시스템이 갖는 불일치 허용으로 인해서 단일 염기 치환 점 돌연변이를 도입하는데는 어려움이 있었다.
이에, 상술한 문제점을 해결하기 위하여 본 발명자들은 CRISPR/Cpf1 시스템의 불일치 허용을 극복하면서 표적 염기에 단일 염기 치환 점 돌연변이를 효과적으로 유발시킬 수 있도록 하는 표적 불일치 crRNA를 설계하여 올리고뉴클레오타이드-유도 돌연변이와 함께 CRISPR/Cpf1 시스템에 적용하였다.
그 결과, 상기의 표적 불일치 crRNA에 의해 증가한 불일치 염기수로 CRISPR/Cfp1가 표적으로 인식하기 않아 돌연변이가 도입된 서열을 갖는 세포는 살아남음으로써 효과적인 유전체 편집 효과를 보여주었다.
종합하자면, 본 발명에서 카로티노이드 생합성 효소를 암호화하는 일련의 유전자들 중에서 crtEb 유전자 부위에 1개 내지는 4개의 점 돌연변이를 일으키는 올리고뉴클레오타이드를 세포에 도입하여 위치 유도 돌연변이 도입 후, CRISPR/Cpf1 으로 음성 선택하여 BHI 고체배지에 도말하였을 때, 2개의 염기를 치환하는 돌연변이 올리고뉴클레오타이드를 사용한 경우 돌연변이가 도입되어 분홍색을 띠는 콜로니의 비율이 95.3%, 3 개의 염기를 치환하는 돌연변이 올리고뉴클레오타이드를 사용한 경우 분홍색 콜로니의 비율이 91.5%, 4개의 염기를 치환하는 돌연변이 올리고뉴클레오타이드를 사용한 경우 분홍색 콜로니의 비율이 92.0%로 나타났다. 그러나, 1 개의 단일 염기를 치환하는 돌연변이 올리고뉴클레오타이드를 사용한 경우에는 분홍색 콜로니가 0.58%의 낮은 비율로 나타났다.
이에, 본 발명자들은 올리고뉴클레오타이드에 의해 돌연변이가 도입되는 염기의 위치로부터 1개 혹은 2개의 염기가 이격된 위치에 crRNA에 불일치 서열을 위치시켜 표적 DNA 서열과 불일치 개수를 증가시킴으로써, CRISPR/Cpf1에 의한 음성 선택의 효율을 향상시키고자 하였다.
그 결과, 올리고뉴클레오타이드로 1개의 돌연변이를 도입시키고 crRNA에 불일치 서열이 1개 존재할 때, 즉, 전체 불일치 개수가 2개일 때, 5'-말단 위치에 crRNA 불일치가 존재하는 경우 14.9%, 3'-말단 위치에 crRNA 불일치가 존재하는 경우에는 99.7%가 분홍색 콜로니였다.
반면, crRNA에 불일치 서열이 2개 존재할 때, 즉, 전체 불일치 개수가 3개일 때, 5'-말단 위치에 crRNA 불일치가 존재하는 경우 91.5%가 분홍색 콜로니였으나 3’-말단 위치에 crRNA 불일치가 존재하는 경우에는 분홍색 콜로니가 전혀 관찰되지 않았다. 또한, crRNA에 불일치 서열이 3개 존재할 때, 즉, 전체 불일치 개수가 4개일 때, crRNA 불일치 위치가 5'-말단이거나 3'-말단인 경우 모두 전혀 분홍색 콜로니가 관찰되지 않았고 형질전환 효율도 ~106 CFU/ug crRNA로 나타나 음성 선택이 불가능하였다.
상술한 방식으로 돌연변이를 도입 후, 선별된 분홍색 콜로니의 crtEb 부위를 염기서열 분석하여 목표 염기인 150 번째 염기에 단일 염기 치환 점 돌연변이가 도입되었는지를 확인하였을 때, 표적 일치 crRNA를 사용하였을 때나 표적 불일치 crRNA 중에서 5'-말단 위치에 crRNA 불일치가 존재하는 경우에는 목표 염기 이외의 주변 염기서열 부분에서 염기의 변화가 있는 것으로 나타나 올리고뉴클레오타이드에 의한 도입의 정확성이 떨어지는 것으로 확인되었다.
그러나, 높은 비율로 분홍색 콜로니가 확인된 3'-말단에 1개의 불일치를 갖는 crRNA, 5'-말단에 2개의 불일치를 갖는 crRNA를 사용한 경우에는 주변 염기 서열에 돌연변이가 없고, 목표 염기 1개에만 정확하게 돌연변이가 도입된 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 불일치 crRNA를 이용한 방법은 미생물 유전체에 단일 염기 치환 점 돌연변이를 도입하여 목적 미생물의 유전체를 정확하고 효과적으로 단일 염기 단위로 편집할 수 있음을 입증한다.
결론적으로, 본 발명은 종래 CRISPR/Cpf1 시스템에 비해 점 돌연변이 도입 효율이 향상될 뿐만 아니라, 정확하게 실제 단일 염기 단위의 유전자 편집 효과를 달성한바, 목표 유전자에 변이(예컨대, 점 돌연변이)가 일어난 미생물 균주들의 유전체를 올바르게 수선하거나, 또는 코돈의 변화 등을 유발함으로써 물질 생산에 최적화된 코돈과 대사경로를 가지게 하여, 유용 물질의 생산능을 최적화시킨 균주의 제작 등에 다양하게 활용될 수 있어, 유용 산물 생산과 관련된 산업적 활용에 매우 유용하다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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Claims (10)

  1. 표적 DNA에 상보적으로 결합하는 공여 핵산 분자 및 crRNA(CRISPR RNA)를 포함하는 CRISPR/Cpf1 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/ CRISPR from Prevotella and Francisella 1) 시스템 기반 유전체 편집 방법으로서,
    상기 표적 DNA와 상기 crRNA 서열 간에 1 개 이상의 불일치(mismatch) 뉴클레오타이드가 부여되는 단계를 포함하는, CRISPR/Cpf1 시스템 기반 유전체 편집 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 표적 DNA는 프로토스페이서-인접 모티프(protospacer-adjacent motif, PAM)를 포함하는 것을 특징으로 하는,
    CRISPR/Cpf1 시스템 기반 유전체 편집 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 공여 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태인 것을 특징으로 하는,
    CRISPR/Cpf1 시스템 기반 유전체 편집 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 공여 핵산 분자는 표적 DNA 상에 변형을 유발하는 것을 특징으로 하는,
    CRISPR/Cpf1 시스템 기반 유전체 편집 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 변형은 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 하나 이상의 뉴클레오티드의 삽입, 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 녹아웃(knockout), 녹인(knockin), 내인성 핵산 서열의 상동, 이종상동성(endogenous) 또는 이종 핵산 서열로의 치환, 또는 이의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는,
    CRISPR/Cpf1 시스템 기반 유전체 편집 방법.
  6. 표적 DNA에 상보적으로 결합하는 공여 핵산 분자 및 crRNA(CRISPR RNA)를 포함하는 CRISPR/Cpf1 시스템 기반 유전체 편집용 조성물로서,
    상기 표적 DNA와 상기 crRNA 서열 간에 1 개 이상의 불일치(mismatch) 뉴클레오타이드가 포함되는 것을 특징으로 하는,
    CRISPR/Cpf1 시스템 기반 유전체 편집용 조성물.
  7. 표적 DNA에 상보적으로 결합하는 공여 핵산 분자 및 crRNA(CRISPR RNA)를 포함하는 CRISPR/Cpf1 시스템 기반의 유전체 편집 효율 증가 방법으로서,
    상기 표적 DNA와 상기 crRNA 서열 간에 1 개 이상의 불일치(mismatch) 뉴클레오타이드가 부여되는 단계를 포함하는, CRISPR/Cpf1 시스템 기반의 유전체 편집 효율 증가 방법.
  8. 다음 단계를 포함하는, CRISPR/Cpf1 시스템 기반의 표적 DNA가 편집된 대상체의 제조 방법:
    (a) 표적 DNA에 상보적으로 결합하고, 표적 DNA 상에 변형을 유발하는 공여 핵산 분자를 제작하는 단계;
    (b) 표적 DNA에 대해 상보적으로 결합하고, 상기 표적 DNA에 대해 1 개 이상의 불일치(mismatch) 뉴클레오타이드가 부여된 crRNA를 제작하는 단계; 및
    (c) 상기 (a) 단계의 공여 핵산 분자 및 상기 (b) 단계의 crRNA를, 편집시키고자 하는 대상체에 주입시켜, 상기 표적 DNA와 상기 crRNA 서열 간에 2 개 이상의 불일치(mismatch)가 발생함으로써 대상체의 표적 DNA가 편집되는 단계.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 CRISPR/Cpf1 시스템은 항생제 저항성 선별마커를 이용하는 것을 특징으로 하는, 표적 DNA가 편집된 대상체의 제조 방법.
  10. 제8항의 표적 DNA가 편집된 대상체의 제조 방법에 의해 제조된, 표적 DNA가 편집된 대상체.
KR1020210060798A 2020-05-11 2021-05-11 CRISPR/Cpf1 시스템을 기반으로 한 유전체 단일 염기 편집 방법 및 이의 용도 KR20210137928A (ko)

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