ES2938623T3 - Método para convertir una secuencia del genoma de una bacteria gram-positiva mediante una conversión específica de una base de ácido nucleico de una secuencia de ADN seleccionada como diana y el complejo molecular utilizado en el mismo - Google Patents
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Abstract
La presente invención proporciona un método para modificar un sitio objetivo de ADN de doble cadena que posee una bacteria grampositiva, el método comprende un paso para formar un complejo, en el que una enzima de conversión de base de ácido nucleico se une a una secuencia de reconocimiento de ácido nucleico. módulo que se une específicamente a una secuencia de nucleótidos objetivo en el ADN de doble cadena seleccionado, en contacto con el ADN de doble cadena, para eliminar o convertir al menos un nucleótido en el sitio objetivo en otro al menos un nucleótido, o insertar al menos un nucleótido en el sitio objetivo, sin escindir al menos una cadena del ADN de doble cadena en el sitio objetivo, donde el contacto del ADN de doble cadena con el complejo se realiza mediante la introducción de un ácido nucleico que codifica el complejo en la bacteria grampositiva .La presente invención también proporciona un complejo que se utilizará en el método y en el que una enzima de conversión de base de ácido nucleico se une a un módulo de reconocimiento de secuencia de ácido nucleico que se une específicamente a una secuencia de nucleótidos diana en el ADN de doble cadena que posee un gram- bacteria positiva. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Método para convertir una secuencia del genoma de una bacteria gram-positiva mediante una conversión específica de una base de ácido nucleico de una secuencia de ADN seleccionada como diana y el complejo molecular utilizado en el mismo
Campo técnico
La presente invención se refiere a un método de modificación de una secuencia genómica, que permite la modificación de una base de ácido nucleico en una región particular de un genoma de una bacteria gram-positiva perteneciente al género Clostridium, el género Brevibacillus o el género Corynebacterium, sin escindir el ADN de cadena doble (sin escisión o con escisión de una sola cadena), ni insertar un fragmento de ADN extraño, utilizando un complejo de un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico, que es un sistema CRISPR-Cas que comprende una Cas mutante en la que ambas capacidades de escisión de ADN de Cas están inactivadas, y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico, que es la citidina desaminasa 1 de Petromyzon marinus (PmCDA1).
Técnica anterior
Una bacteria gram-positiva es un nombre genérico para bacterias que se tiñen de color azul hierro o púrpura mediante una tinción Gram e incluye muchas bacterias útiles, tales como lactobacillus, actinomycetes y similares, utilizadas en la producción mediante fermentación tradicional y en la nueva biotecnología. A diferencia de las bacterias gram-negativas tales como Escherichia coli y similares, no tienen una membrana externa. Por lo tanto, tienen una alta capacidad de secreción de proteínas y similares. Además, dado que no producen endotoxinas, también son adecuadas para la producción de proteínas heterólogas. Por esta razón, se han realizado muchos intentos para mejorar aún más las propiedades de las bacterias útiles, mediante una modificación de los genes de las bacterias gram-positivas.
Por ejemplo, ciertos tipos de bacterias del género Clostridium (por ejemplo, Clostridium saccharoperbutylacetonicum, etc.) se han utilizado durante mucho tiempo como bacterias fermentadoras industriales de butanol. Para mejorar el rendimiento en butanol, se están realizando estudios con el objetivo de reducir los subproductos (acetona, etanol, ácido orgánico y similares) mediante recombinación génica.
Corynebacterium glutamicum se ha utilizado durante más de 50 años como bacteria para la producción industrial de aminoácidos, incluidos el ácido glutámico y la lisina, para alimentos, piensos o medicamentos. La producción de ácido glutámico puede aumentar por la deficiencia del gen pknG que controla la actividad de ODHC que cataliza la conver sión de ácido 2-oxoglutárico en succinil-CoA, en el ciclo de TCA.
Además, Brevibacillus choshinensis tiene una actividad proteolítica extracelular reducida y se utiliza como un sistema de producción de secreción elevada de proteínas heterólogas. La actividad proteolítica extracelular puede reducirse aún más eliminando el gen emp que codifica la proteasa extracelular.
Sin embargo, la modificación genética en los métodos convencionales, dado que el gen objeto se degrada mediante la inserción de un gen extraño por recombinación homóloga y delecionando el gen del genoma, el microorganismo obtenido se incluye dentro de los microorganismos con genes recombinantes. Por ello, para garantizar la seguridad, los costes de las instalaciones y los costes de eliminación de residuos se vuelven elevados, y los costes de producción se vuelven problemáticamente altos.
En los últimos años, la edición del genoma está llamando la atención como una técnica para modificar el gen objeto y la región del genoma en diversas especies. Convencionalmente, como método de edición del genoma, se ha propuesto un método que utiliza una nucleasa artificial que comprende una combinación de una molécula que tiene una capaci dad de escindir el ADN independientemente de la secuencia y una molécula que tiene una capacidad de reconocer una secuencia (documento no de patente 1).
Por ejemplo, se ha descrito un método para realizar la recombinación en un locus de un gen diana en el ADN de una célula vegetal o una célula de insecto como hospedador, mediante el uso de una nucleasa con dedos de zinc (ZFN), en donde un dominio de unión al ADN con dedos de zinc y un dominio de escisión del ADN no específico están unidos (documento de patente 1), un método para escindir o modificar un gen diana en una secuencia de nucleótidos parti cular o un sitio adyacente al mismo, mediante el uso de TALEN, en donde un efector similar al activador de la trans cripción (TAL) que es un módulo de unión al ADN que tiene la bacteria patógena vegetal Xanthomonas y una endonucleasa de ADN están ligados (documento de patente 2), un método que utiliza el sistema CRISPR-Cas9 en donde se combinan la secuencia de ADN de CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespa ciadas) que funciona en un sistema inmune adquirido que poseen las eubacterias y las arqueobacterias, y la familia de proteínas Cas nucleasas (asociadas a CRISPR) que tienen una función importante junto con CRISPR (documento de patente 3), y similares. Además, también se ha descrito un método para escindir un gen diana en las proximidades de una secuencia particular, mediante el uso de una nucleasa artificial, en donde una proteína PPR constituida para reconocer una secuencia de nucleótidos particular mediante una serie de motivos PPR, en donde cada uno de los cuales consiste en 35 aminoácidos y reconoce una base de ácido nucleico, se une con la nucleasa (documento de patente 4).
Las técnicas de edición del genoma propuestas hasta ahora, básicamente presuponen roturas del ADN de cadena doble (DSB, por sus siglas en inglés) a través de una nucleasa. Esto se debe a que la técnica de edición del genoma se basa en la idea de que un gen extraño se puede insertar más fácilmente en la región deseada, si se puede escindir una región particular del genoma, lo que se deriva del hallazgo de que una DSB favorece la recombinación homóloga. Sin embargo, dado que la DSB incluye modificaciones genómicas inesperadas, se producen efectos secundarios tales como fuerte citotoxicidad, reordenamiento cromosómico y similares, y tienen el problema de un número extremada mente bajo de células supervivientes y la dificultad de la propia modificación genética en microorganismos unicelula res.
El documento WO 2015/089406 A1 describe una variante de Cas para la edición de genes.
El documento WO 2015/035136 A2 describe sistemas para la entrega mediada por proteínas sobrecargadas, de pro teínas efectoras funcionales en células in vivo, ex vivo o in vitro.
Zeng Hu et al. (Applied Microbiology and Biotechnology, vol. 99, n° 24, 29 de agosto de 2015, páginas 10575-10585) describen la edición altamente eficiente del gen del factor de longitud de cadena de policétido de actinorrodina en Streptomyces coelicolor M145 utilizando el sistema combinado CRISPR/Cas9-CodA(sm).
Tao Xu et al. (Applied and Environmental Microbiology, American Society for Microbiology, vol. 81, n° 13, 1 de julio de 2015, páginas 3324-4431) describen la edición eficiente del genoma en Clostridium cellulolyticum a través de CRISPR-Cas9 nickasa.
El documento EP 3115457 A1 describe un método de modificación de una secuencia genómica para convertir espe cíficamente bases de ácido nucleico de la secuencia de ADN seleccionada como diana y un complejo molecular para uso en el mismo.
Shawn P. Finney-Manchester et al. (Nucleic Acids Research 7 de marzo de 2013, páginas e99-e99) describen el aprovechamiento de la recombinación homóloga mutagénica para la mutagénesis dirigida a una diana in vivo mediante TaGTEAM.
A. G. Lada et al. (Biochemistry, vol. 76, n° 1, 1 de enero de 2011, páginas 131-146) informan sobre los efectos mutantes y las firmas de mutación de la edición con desaminasas producidas en bacterias y levaduras.
A. G. Lada et al. (Biology Direct, Biomed Central, vol. 7, n° 1, 18 de diciembre de 2012, páginas 47) informa de que la citosina desaminasa AlD/APOBEC induce kataegis en todo el genoma.
Lista de documentos
Documentos de patente
documento de patente 1: JP-B-4968498
documento de patente 2: Publicación Nacional de la Solicitud de Patente Internacional n° 2013-513389 documento de patente 3: Publicación Nacional de la Solicitud de Patente Internacional n° 2010-519929 documento de patente 4: JP-A-2013-128413
Documento no de patente
documento no de patente 1: Kelvin M Esvelt, Harris H Wang (2013) Genome-scale engineering for systems and synthetic biology, Molecular Systems Biology 9: 641
Compendio de la invención
Problemas que la invención tiene que resolver
Un objeto de la presente invención es proporcionar un nuevo método de edición del genoma para modificar una base de ácido nucleico de una secuencia particular de un gen del genoma de una bacteria gram-positiva sin DSB ni inserción de un fragmento de ADN extraño, es decir, sin escisión de un ADN de cadena doble o escisión de una cadena sencilla, y sin depender de la inserción de un fragmento de ADN extraño o la eliminación de un fragmento de ADN del genoma. Medios para resolver los problemas
Los presentes inventores han realizado estudios intensos en un intento de resolver los problemas mencionados ante riormente y se han centrado en emplear la conversión de bases mediante una reacción de conversión de bases de ADN, sin DSB acompañante, ni inserción y/o eliminación de un fragmento de ADN. La reacción de conversión de bases mediante una reacción de desaminación de una base de ADN ya es conocida; sin embargo, aún no se ha realizado el direccionamiento hacia cualquier sitio mediante el reconocimiento de una secuencia particular de ADN y
la modificación específica del ADN seleccionado como diana mediante una conversión de bases del ADN.
Por lo tanto, la desaminasa que cataliza una reacción de desaminación se usó como enzima para esa conversión de las bases de ácido nucleico, y se modificó una secuencia genómica mediante una conversión de bases del ácido nucleico en una región que contenía una secuencia de ADN particular de tres tipos de bacterias gram-positivas, me diante la formación de un complejo de la enzima y una molécula que tiene una capacidad de reconocimiento de se cuencias de ADN (módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico).
En concreto, se utilizó el sistema CRISPR-Cas (CRISPR-Cas mutante). Es decir, se produjo un ADN que codificaba una molécula de ARN quimérico (ARN guía), en donde CRISPR-ARN:ARNcr (ARNg) específico del genoma que con tiene una secuencia (secuencia de direccionamiento) complementaria a una secuencia de nucleótidos diana de un gen que se va a modificar, se une a un ARN (transactivación de ARNcr: ARNtracr) para reclutar la proteína Cas, se produjo un ADN en donde un ADN que codificaba una proteína Cas mutante (dCas) en la que se había inactivado la capacidad de escisión de ambas cadenas de un ADN de cadena doble y se unía un gen de desaminasa, y esos ADNs se introdujeron en bacterias gram-positivas utilizando un vector de expresión funcional en cada célula hospedadora. Como resultado, la base deseada en la secuencia de nucleótidos diana podía sustituirse con éxito por otra base.
El presente inventor ha realizado estudios adicionales basándose en estos descubrimientos y ha completado la pre sente invención.
En consecuencia, la presente invención es como se describe a continuación.
[1] Un método para modificar un sitio seleccionado como diana en un ADN de cadena doble de una bacteria grampositiva, que comprende una etapa de poner en contacto un complejo, en el que se une un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico que se une específicamente a una secuencia de nucleótidos diana en un ADN de cadena doble dado y la citidina desaminasa 1 de Petromyzon marinus (PmCDA1), con dicho ADN de cadena doble, para convertir uno o varios nucleótidos en el sitio seleccionado como diana en otro u otros varios nucleótidos, sin escindir al menos una cadena de dicho ADN de cadena doble en el sitio seleccionado como diana, en donde el ADN de cadena doble se pone en contacto con el complejo introduciendo el ácido nucleico que codifica el complejo en la bacteria gram-positiva,
en donde la bacteria gram-positiva es un microorganismo perteneciente al género Clostridium, al género Brevibacillus o al género Corynebacterium, y
en donde el módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico es un sistema CRISPR-Cas y en donde Cas es una Cas mutante en la que ambas capacidades de escisión del ADN de Cas están inactivadas.
[2] El método del apartado [1 ] mencionado anteriormente, que utiliza dos o más tipos de módulos de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico, que se unen respectivamente de forma específica a diferentes secuencias de nucleótidos diana.
[3] El método del apartado [2] mencionado anteriormente, en el que la secuencia de nucleótidos diana diferente mencionada anteriormente está presente en un gen diferente.
[4] El método de cualquiera de los apartados [1] a [3] mencionados anteriormente, en el que el microorganismo que pertenece al género Clostridium es Clostridium saccharoperbutylacetonicum.
[5] El método de cualquiera de los apartados [1] a [3] mencionados anteriormente, en el que el microorganismo que pertenece al género Brevibacillus es Brevibacillus chosinensis.
[6] El método de cualquiera de los apartados [1] a [3] mencionados anteriormente, en el que el microorganismo que pertenece al género Corynebacterium es Corynebacterium glutamicum.
[7] El método de cualquiera de los apartados [1] a [6] mencionados anteriormente, que comprende una etapa de introducir un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica el complejo mencionado anterior mente en una forma que permite el control de un período de expresión en la bacteria gram-positiva mencionada anteriormente, y una etapa de inducir la expresión del ácido nucleico durante un período necesario para fijar la modificación del sitio seleccionado como diana en el ADN de cadena doble.
[8] El método de cualquiera de los apartados [1] a [7] mencionados anteriormente, en el que el módulo de reconoci miento de secuencias de ácido nucleico se fusiona con PmCDA1.
Efecto de la invención
De acuerdo con la técnica de edición del genoma de la presente invención, dado que no está acompañada de una inserción de un ADN extraño o roturas del ADN de cadena doble, la técnica es superior en cuanto a seguridad y tiene no pocas posibilidades de ofrecer una solución a los casos que causan disputas biológicas o legales en los métodos convencionales, en relación con microorganismos con recombinación génica. Por ejemplo, se puede esperar una re ducción de los costes de las instalaciones y de los costes de eliminación de residuos en la producción fermentativa
industrial utilizando bacterias gram-positivas y, por lo tanto, la técnica es económicamente ventajosa.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 muestra esquemáticamente la estructura de un vector plasmídico para la interrupción.
Descripción de las realizaciones
La presente invención proporciona un método para modificar un sitio seleccionado como diana en un ADN de cadena doble de una bacteria gram-positiva, que comprende una etapa de poner en contacto un complejo en el que se une un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico que se une específicamente a una secuencia de nucleótidos diana en un ADN de cadena doble dado y la citidina desaminasa 1 de Petromyzon marinus (PmCDA1), con dicho ADN de cadena doble, para convertir uno o varios nucleótidos en el sitio seleccionado como diana en otro u otros varios nucleótidos, sin escindir al menos una cadena de dicho ADN de cadena doble en el sitio diana, en donde el ADN de cadena doble se pone en contacto con el complejo introduciendo el ácido nucleico que codifica el complejo en la bacteria gram-positiva, en donde la bacteria gram-positiva es un microorganismo que pertenece al género Clostridium, al género Brevibacillus o al género Corynebacterium, y en donde el módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico es un sistema CRISPR-Cas y en donde Cas es una Cas mutante en la que ambas capacidades de escisión de ADN de Cas están inactivadas (en lo sucesivo, a veces también se denominará "el método de la presente invención"). El método contiene característicamente una etapa de poner en contacto un complejo, en donde un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico que se une específicamente a la secuencia de nucleótidos diana en el ADN de cadena doble y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico que es PmCDA1, se unen con el ADN de cadena doble en la bacteria gram-positiva hospedadora para convertir el sitio seleccionado como diana, es decir, la secuencia de nucleótidos diana y los nucleótidos en las proximidades de la misma, en otros nucleótidos, o similares.
La bacteria gram-positiva utilizable para el método de la presente invención es una bacteria que pertenece al género Clostridium, al género Brevibacillus o al género Corynebacterium. Ejemplos de bacterias que pertenecen al género Clostridium incluyen Clostridium saccharoperbutylacetonicum y similares, ejemplos de bacterias que pertenecen al género Brevibacillus incluyen Brevibacillus choshinensis y similares, y ejemplos de bacterias que pertenecen al género Corynebacterium incluyen Corynebacterium glutamicum y similares.
En la presente invención, una "modificación" de un ADN de cadena doble significa que un nucleótido (p. ej., dC) en una cadena de ADN se convierte en otro nucleótido (p. ej., dT, dA o dG). Aunque el ADN de cadena doble que se va a modificar no está particularmente limitado siempre que sea un ADN de cadena doble presente en la célula hospedadora, preferiblemente es un ADN genómico. El "sitio seleccionado como diana" de un ADN de cadena doble significa la "secuencia de nucleótidos diana" total o parcial, que un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico reconoce específicamente y se une a la misma, o las proximidades de la secuencia de nucleótidos diana (una o ambas en dirección 5' aguas arriba y 3' aguas abajo). Además, la "secuencia de nucleótidos diana" significa una secuencia a la que se une un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico en el ADN de cadena doble.
En la presente invención, el "módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico" es un sistema CRISPR-Cas. La unión del módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico a una secuencia de nucleótidos diana permite que una enzima convertidora de bases de ácido nucleico, es decir, PmCDA1, unida al módulo actúe específicamente sobre un sitio seleccionado como diana de un ADN de cadena doble.
En la presente invención, el "complejo enzimático modificador de ácido nucleico" significa un complejo molecular que comprende un complejo que comprende el módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico mencionado anteriormente y la enzima convertidora de bases de ácido nucleico (PmCDA1) conectados, y que tiene una actividad enzimática convertidora de bases de ácido nucleico y posee una capacidad particular de reconocimiento de secuencias de nucleótidos. El "complejo" en esta memoria incluye no solo uno constituido por múltiples moléculas, sino también uno que tiene un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico en una sola molécula, como una proteína de fusión.
La enzima convertidora de bases de ácido nucleico que se va a emplear en el método de la presente invención es PmCDA1 obtenida a partir de Petromyzon marinus (citidina desaminasa 1 de Petromyzon marinus).
Una secuencia de nucleótidos diana en un ADN de cadena doble que va a ser reconocida por el módulo de reconoci miento de secuencias de ácido nucleico en el complejo enzimático modificador de ácido nucleico de la presente in vención, no está particularmente limitada siempre que el módulo se una específicamente a la misma, y puede ser cualquier secuencia en el ADN de cadena doble. La longitud de la secuencia de nucleótidos diana solo tiene que ser suficiente para una unión específica del módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico. Tiene, por ejem plo, no menos de 12 nucleótidos, preferiblemente no menos de 15 nucleótidos, más preferiblemente no menos de 18 nucleótidos, según el tamaño del genoma de la bacteria gram-positiva. Si bien el límite superior de la longitud no está particularmente limitado, es preferiblemente no superior a 25 nucleótidos, más preferiblemente no superior a 22 nucleótidos.
Como módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico en el complejo enzimático modificador de ácido
nucleico, en el método de la presente invención se usa el sistema CRISPR-Cas en el que ambas capacidades de escisión de ADN de Cas están inactivadas (CRISPR-Cas mutante).
En un aspecto de la descripción, pero que no forma parte de la invención, un motivo de dedos de zinc está constituido por la unión de 3 - 6 unidades de dedos de zinc de tipo Cys2His2 diferentes (1 dedo reconoce aproximadamente 3 bases) y puede reconocer una secuencia de nucleótidos diana de 9 - 18 bases. En un aspecto de la descripción, pero que no forma parte de la invención, se puede producir un motivo de dedos de zinc mediante un método conocido, como el método de ensamblaje modular (Nat Biotechnol (2002) 20: 135-141), el método OPEN (Mol Cell (2008) 31: 294-301), el método CoDA (Nat Methods (2011) 8: 67-69), el método de híbrido único de Escherichia coli (Nat Bio technol (2008) 26:695-701) y similares. El documento de patente 1 mencionado anteriormente se puede consultar para los detalles de la producción del motivo de dedos de zinc.
En un aspecto de la descripción, pero que no forma parte de la invención, un efector TAL tiene una estructura de repetición de módulo con aproximadamente 34 aminoácidos como una unidad, y los residuos de aminoácidos 12 y 13 (llamados RVD) de un módulo determinan la estabilidad de la unión y la especificidad de bases. En un aspecto de la descripción, pero que no forma parte de la invención, dado que cada módulo es muy independiente, el efector TAL específico de una secuencia de nucleótidos diana, se puede producir simplemente conectando el módulo. Para el efector TAL se ha establecido un método de producción que utiliza un recurso abierto (método REAL (Curr Protoc Mol Biol (2012) capítulo 12: unidad 12.15), el método FLASH (Nat Biotechnol (2012) 30: 460-465) y el método Golden Gate (Nucleic Acids Res (2011) 39: e82) etc.), y un efector TAL para una secuencia de nucleótidos diana se puede diseñar de forma comparativamente conveniente. Se puede consultar el documento de patente 2 mencionado anteriormente para conocer los detalles de la producción del efector TAL.
En un aspecto de la descripción, pero que no forma parte de la invención, un motivo PPR está constituido de tal manera que una secuencia de nucleótidos particular se reconoce mediante una serie de motivos PPR, en donde cada uno de los cuales consiste en 35 aminoácidos y reconoce una base de ácido nucleico, y reconoce una base diana solo por los aminoácidos 1,4 y ii(-2) de cada motivo. En un aspecto de la descripción, la constitución del motivo no tiene ninguna dependencia y está libre de interferencias de motivos en ambos lados. Por lo tanto, en un aspecto de la descripción, pero que no forma parte de la invención, como el efector TAL, se puede producir una proteína PPR específica para la secuencia de nucleótidos diana, simplemente conectando motivos PPR. Se puede consultar el do cumento de patente 4 mencionado anteriormente para los detalles de la producción del motivo PPR.
Cuando se usa un fragmento de enzima de restricción, un factor de transcripción, una ARN polimerasa y similares en algunos aspectos tal y como se describe en este documento, pero que no forman parte de la invención, dado que los dominios de unión al ADN de esas proteínas son bien conocidos, se puede diseñar y construir fácilmente un fragmento que contiene el dominio y no tiene capacidad de escisión de la cadena doble de ADN.
En otro aspecto de la descripción, pero que no forma parte de la invención, cualquiera de los módulos de reconoci miento de secuencias de ácido nucleico mencionados anteriormente puede proporcionarse como una proteína de fusión con la enzima convertidora de bases de ácido nucleico mencionada anteriormente, o un dominio de unión a proteínas, tal como el dominio SH3, el dominio PDZ, el dominio GK, el dominio GB y similares, y puede fusionarse un ligando del mismo con un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico, respectivamente, y proporcionarse como un complejo proteico a través de una interacción del dominio y un ligando del mismo. Alternativamente, un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico pueden fusionarse cada uno con inteína, y pueden unirse mediante ligación después de la síntesis de la proteína.
El complejo de enzimas modificadoras de ácido nucleico de la presente descripción, pero que no forma parte de la invención, que contiene un complejo (que incluye la proteína de fusión) en el que se unen un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico, puede ponerse en contacto con un ADN de cadena doble, introduciendo un ácido nucleico que codifica el complejo en una bacteria gram-positiva que tiene el ADN de cadena doble de interés (por ejemplo, ADN genómico).
Por lo tanto, el módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico y la enzima convertidora de bases de ácido nucleico se preparan como un ácido nucleico que codifica una proteína de fusión de este, o en una forma que es capaz de formar un complejo en una célula hospedadora después de la traducción para dar una proteína, utilizando un dominio de unión, inteína y similares, o como un ácido nucleico que codifica cada uno de ellos. El ácido nucleico en esta memoria puede ser un ADN o un ARN. Cuando se trata de un ADN, preferentemente es un ADN de cadena doble, y se proporciona en forma de un vector de expresión dispuesto bajo la regulación de un promotor funcional en una célula hospedadora. Cuando se trata de un ARN, preferentemente es un ARN monocatenario.
Dado que el complejo de la presente descripción, que no forma parte de la invención, en el que se unen un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico, no viene acompañado de roturas del ADN de cadena doble (DSB), es posible una edición del genoma con baja toxicidad, y el método de modificación genética de la presente descripción, que no forma parte de la invención, puede aplicarse a una amplia gama de bacterias gram-positivas en general.
Un ADN que codifica un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico para el método descrito en el presente documento, como un motivo de dedos de zinc, un efector TAL, un motivo PPR y similares, puede obtenerse mediante cualquier método mencionado anteriormente para cada módulo. Un ADN que codifica un módulo de reco nocimiento de secuencias de enzimas de restricción, factor de transcripción, ARN polimerasa y similares, como se describe en el presente documento, pero que no forma parte de la invención, se puede clonar, por ejemplo, sinteti zando un cebador de oligoADN que cubre una región que codifica una parte deseada de la proteína (parte que contiene el dominio de unión al ADN), basándose en la información de la secuencia de ADNc de la misma, y amplificando con el método RT-PCR usando como molde el ARN total o una fracción de ARNm preparada a partir de las células pro ductoras de la proteína.
Un ADN que codifica una enzima convertidora de bases de ácido nucleico también se puede clonar de manera similar, sintetizando un cebador de oligoADN, basándose en la información de la secuencia de ADNc del mismo, y amplifi cando mediante el método RT-PCR usando como molde el ARN total o una fracción de ARNm preparada a partir de las células productoras de enzimas. Por ejemplo, un ADN que codifica PmCDA1 de Petromyzon marinus se puede clonar mediante el diseño de cebadores adecuados de la CDS aguas arriba y aguas abajo, basándose en la secuencia de ADNc (número de orden EF094822) registrado en la base de datos del NCBI, y la clonación del ARNm obtenido a partir de Petromyzon marinus mediante el método RT-PCR.
El ADN clonado puede ligarse directamente, o después de la digestión con una enzima de restricción cuando se desee, o después de la adición de un enlazador adecuado, con un ADN que codifica un módulo de reconocimiento de se cuencias de ácido nucleico para preparar un ADN que codifica una proteína de fusión. Alternativamente, un ADN que codifica un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico y un ADN que codifica una enzima convertidora de bases de ácido nucleico pueden fusionarse cada uno con un ADN que codifica un dominio de unión o un ligando del mismo, o ambos ADNs pueden fusionarse con un ADN que codifica una inteína de separación, por lo que el módulo de conversión de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico y la enzima convertidora de bases de ácido nucleico se traducen en una célula hospedadora para formar un complejo. En esos casos, un enlazador se puede unir a una posición adecuada de uno o ambos ADNs, cuando se desee.
Se puede obtener un ADN que codifica un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico y un ADN que codifica una enzima convertidora de bases de ácido nucleico, sintetizando químicamente la cadena de ADN, o conec tando cadenas cortas de oligoADN sintetizadas parcialmente solapadas, utilizando el método PCR y el método de ensamblaje de Gibson para construir un ADN que codifica la longitud completa del mismo. La ventaja de construir un ADN de longitud completa mediante síntesis química o una combinación del método PCR o el método de ensamblaje de Gibson, es que el codón que se va a utilizar puede diseñarse en la CDS de longitud completa de acuerdo con el hospedador en el que se introduce el ADN. En la expresión de un ADN heterólogo, se espera que aumente el nivel de expresión de la proteína al convertir su secuencia de ADN en un codón utilizado en el organismo hospedador. Como datos de frecuencia de uso de codones en el hospedador que se va a usar, por ejemplo, se puede utilizar la base de datos de frecuencia de uso del código genético (http://www.kazusa.or.jp/codon/index.html) descrita en la página de inicio de Instituto de Investigación de ADN de Kazusa o se pueden consultar documentos que muestran la frecuencia de uso de codones en cada hospedador. Haciendo referencia a los datos obtenidos y a la secuencia de ADN que se va a introducir, los codones que muestran una baja frecuencia de uso en el hospedador entre los utilizados para la secuencia de ADN, pueden convertirse en un codón que codifica el mismo aminoácido y muestra una frecuencia de uso elevada.
Se puede producir un vector de expresión que contiene un ADN que codifica un módulo de reconocimiento de secuen cias de ácido nucleico y/o una enzima convertidora de bases de ácido nucleico, por ejemplo, uniendo el ADN aguas abajo de un promotor en un vector de expresión adecuado.
Por ejemplo, como vector replicable en el género Clostridium, es conveniente un vector lanzadera de Escherichia coli y el género Clostridium. Por ejemplo, se pueden mencionar pKNT19 obtenido a partir de pIM13 (Journal of General Microbiology, 138, 1371-1378 (1992)), pJIR756 y pNAK1. Además, como vector replicable en el género Brevibacillus se puede mencionar pUB110 obtenido a partir de Brevibacillus brevis y como vector replicable en el género Corynebacterium se puede mencionar el plásmido híbrido pCG100-pHSG398, obtenido a partir de Corynebacterium glutamicum. Además, como vector replicable en el género Lactobacillus, se puede mencionar pLAB1000 obtenido a partir de Lactobacillus lactis y similares.
Como promotor se puede utilizar cualquier promotor apropiado para un hospedador que se va a utilizar para la expre sión génica. En un método convencional que usa DSB, dado que la tasa de supervivencia de la célula hospedadora a veces disminuye notablemente debido a la toxicidad, es deseable aumentar el número de células al comienzo de la inducción usando un promotor inductivo. Sin embargo, dado que también se puede lograr una proliferación celular suficiente expresando el complejo enzimático modificador de ácido nucleico de la presente invención, también se puede usar un promotor constitutivo sin limitación.
El vector de expresión puede contener, cuando se desee, un agente terminador, un represor, un marcador de selección tal como un gen de resistencia a fármacos, un gen complementario auxotrófico y similares, un origen de replicación funcional en Escherichia coli, etc., y similares.
Un ARN que codifica un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico y/o una enzima convertidora de bases de ácido nucleico se puede preparar, por ejemplo, mediante una transcripción a ARNm en un sistema de trans cripción in vitro conocido, mediante el uso de un vector codificador de ADN que codifica el módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico antes mencionado y/o una enzima convertidora de bases de ácido nucleico como molde.
Un complejo de un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico puede expresarse intracelularmente, introduciendo un vector de expresión que contiene un ADN que codifica un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico y/o una enzima convertidora de bases de ácido nucleico en una célula hospedadora y cultivando la célula hospedadora.
Un vector de expresión se puede introducir mediante un método conocido (p. ej., método de lisozima, método compe tente, método PEG, método de coprecipitación con CaCl2, método de electroporación, método de microinyección, método de pistola de partículas, método de lipofección, método de Agrobacterium y similares) según el tipo de hospedador.
Una bacteria gram-positiva a la que se introduce un vector puede cultivarse de acuerdo con un método conocido según el tipo de bacteria. Es preferible un medio líquido como medio para utilizar en el cultivo. El medio contiene preferente mente una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una sustancia inorgánica y similares que sean necesarias para el crecimiento del transformante. Ejemplos de la fuente de carbono incluyen glucosa, dextrina, almidón soluble, saca rosa y similares; ejemplos de la fuente de nitrógeno incluyen sustancias inorgánicas u orgánicas tales como sales de amonio, sales de nitrato, licor de maíz fermentado, peptona, caseína, extracto de carne, torta de soja, extracto de patata y similares; y ejemplos de la sustancia inorgánica incluyen cloruro de calcio, dihidrogenofosfato de sodio, cloruro de magnesio y similares. El medio puede contener extracto de levadura, vitaminas, factor promotor del crecimiento y similares. El pH del medio es preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 8.
Las bacterias gram-positivas se cultivan generalmente a aproximadamente 30 hasta aproximadamente 40°C. Cuando es necesario, también se puede realizar aireación y agitación.
Como se ha mencionado anteriormente, un complejo de un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico, es decir, un complejo enzimático modificador de ácido nucleico, puede expresarse intracelularmente.
Un ARN que codifica el módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico y/o la enzima convertidora de bases de ácido nucleico puede introducirse en una bacteria gram-positiva mediante un método ya conocido. La intro ducción de ARN puede realizarse una vez o repetirse varias veces (por ejemplo, 2 - 5 veces) a intervalos adecuados.
Cuando un complejo de un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico se expresa mediante un vector de expresión o una molécula de ARN introducida en la célula, el módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico reconoce específicamente y se une a una secuencia de nucleótidos diana en el ADN de cadena doble (p. ej., ADN genómico) de interés y, debido a la acción de la enzima convertidora de bases de ácido nucleico unida al módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico, la con versión de bases se produce en la cadena codificante o no codificante del sitio seleccionado como diana (secuencia de nucleótidos diana total o parcial, o en las proximidades de la misma) y se produce un emparejamiento erróneo en el ADN de cadena doble (por ejemplo, cuando se usa una citidina desaminasa tal como PmCDA1, AID y similares como enzima convertidora de bases de ácido nucleico, la citosina en la cadena codificante o no codificante en el sitio seleccionado como diana se convierte en uracilo para causar un emparejamiento erróneo U:G o G:U). Cuando el emparejamiento erróneo no se repara correctamente, y cuando se repara de manera que una base de la cadena opuesta forma una pareja con una base de la cadena convertida (T-A o A-T en el ejemplo mencionado anteriormente), o cuando se sustituye por otro nucleótido (p. ej., U ^A , G) o cuando se eliminan o se insertan de una a varias docenas de bases durante la reparación, se introducen diversas mutaciones.
En cuanto al motivo de dedos de zinc, la producción de muchos motivos de dedos de zinc realmente funcionales no es fácil, ya que la eficacia de la producción de un dedo de zinc que se une específicamente a una secuencia de nucleótidos diana no es alta y la selección de un dedo de zinc que tiene una alta especificidad de unión es complicada. Aunque el efector TAL y el motivo PPR tienen un alto grado de libertad de reconocimiento de la secuencia de ácido nucleico diana, en comparación con el motivo de dedos de zinc, sigue existiendo un problema en la eficacia, ya que es necesario diseñar y construir una proteína grande cada vez según la secuencia de nucleótidos diana.
Por el contrario, dado que el sistema CRISPR-Cas reconoce la secuencia de ADN de cadena doble objeto mediante un ARN guía complementario a la secuencia de nucleótidos diana, cualquier secuencia puede identificarse como diana, simplemente sintetizando un oligoADN capaz de formar específicamente un híbrido con la secuencia de nucleótidos diana.
Por lo tanto, en la presente invención se usa un sistema CRISPR-Cas en el que ambas capacidades de escisión del ADN de Cas están inactivadas (CRISPR-Cas mutante) como módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nu cleico.
El módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico de la presente descripción, que no forma parte de la invención, que utiliza CRISPR-Cas mutante, se proporciona como un complejo de un ARN quimérico (ARN guía) que consiste en un CRISPR-ARN (ARNcr) que comprende una secuencia complementaria a la secuencia de nucleótidos diana y un ARN transactivador (ARNtracr) necesario para reclutar la proteína Cas mutante y una proteína Cas mutante.
La proteína Cas de la presente descripción, que no forma parte de la invención, no está particularmente limitada siempre que forme un complejo con el ARN guía y pueda reconocer y unirse a la secuencia de nucleótidos diana en el gen objeto y un motivo adyacente protoespaciador (PAM) adyacente al mismo. Como Cas mutante para uso en la presente descripción, que no forma parte de la invención, se emplea cualquier Cas en la que se inactiva la capacidad de escindir ambas cadenas del ADN de cadena doble. Preferiblemente es Cas9. Ejemplos de Cas9 incluyen, pero no se limitan a, Cas9 (SpCas9) obtenida a partir de Streptococcus pyogenes; secuencia NGG de PAM (N es A, G, T o C, en lo sucesivo en el presente documento), Cas9 (StCas9; secuencia NNAGAAW de PAM) obtenida a partir de Strep tococcus thermophilus, Cas9 (MmCas9; secuencia NNNNGATT de PAM) obtenida a partir de Neisseria meningitidis y similares. Se prefiere SpCas9 con menos restricción por parte de PAM (sustancialmente 2 bases, y puede dirigirse teóricamente a cualquier sitio del genoma). Por ejemplo, en el caso de SpCas9, un mutante D10A en el que el 10° residuo Asp se convierte en un residuo Ala y carece de la capacidad de escisión de una cadena opuesta a la cadena que forma una cadena complementaria con un ARN guía, o un mutante H840A en el que el 840° residuo His se convierte en un residuo Ala y carece de la capacidad de escisión de la cadena complementaria al ARN guía, o se puede usar un mutante doble de la misma, y se puede usar otro mutante de Cas de manera similar.
La enzima convertidora de bases de ácido nucleico se proporciona como un complejo con Cas mutante mediante un método similar al esquema de acoplamiento con los dedos de zinc mencionados anteriormente y similares. Alternati vamente, una enzima convertidora de bases de ácido nucleico y una Cas mutante también pueden unirse utilizando aptámeros de ARN MS2F6, PP7 y similares y un armazón de ARN mediante la unión de proteínas al mismo. La secuencia de direccionamiento en el ARN guía forma una cadena complementaria con la secuencia de nucleótidos diana, el mutante Cas es reclutado por el ARNtracr fijado y la Cas mutante reconoce PAM. Uno o ambos ADNs no se pueden escindir y, debido a la acción de la enzima convertidora de bases de ácido nucleico unida a la Cas mutante, se produce una conversión de bases en el sitio seleccionado como diana (ajustado apropiadamente dentro de un entorno de varios cientos de bases, incluyendo la secuencia de nucleótidos diana total o parcial) y se produce un emparejamiento erróneo en el ADN de cadena doble. Cuando el emparejamiento erróneo no se repara correctamente, y cuando se repara de manera que una base de la cadena opuesta forma una pareja con una base de la cadena convertida, o cuando otro nucleótido se convierte adicionalmente o cuando se eliminan o insertan de una a varias docenas de bases durante la reparación, se introducen diversas mutaciones.
Incluso cuando CRISPR-Cas mutante se utiliza como módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico, se introduce de forma deseable un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico, en forma de un ácido nucleico que los codifica, en una bacteria gram-positiva que tiene un ADN de cadena doble de interés, de forma parecida a cuando se usan dedos de zinc y similares como módulos de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico.
Un ADN que codifica Cas puede clonarse mediante un método similar al método mencionado anteriormente para un ADN que codifica una enzima convertidora de bases de ácido nucleico, a partir de una célula que produce la enzima. Se puede obtener una Cas mutante mediante la introducción de una mutación para convertir un residuo de aminoácido de la parte importante para la actividad de escisión del ADN (p. ej., el residuo 10° Asp y el residuo 840° His para Cas9, aunque sin limitarse a los mismos) en otro aminoácido, en un ADN que codifica Cas clonada, mediante un método de inducción de una mutación específica del sitio conocido de por sí.
Alternativamente, un ADN que codifica una Cas mutante también se puede construir como un ADN que muestra el uso de codones adecuados para la expresión en una célula hospedadora que se va a utilizar, mediante un método similar a los mencionados anteriormente para un ADN que codifica un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico y un ADN que codifica una enzima convertidora de bases de ácido nucleico, y mediante una combina ción de una síntesis química o un método PCR o un método de ensamblaje de Gibson.
Un ADN que codifica una Cas mutante y un ADN que codifica una enzima convertidora de bases de ácido nucleico se pueden unir para permitir la expresión como una proteína de fusión, o diseñar para una expresión por separado usando un dominio de unión, inteína y similares, y formar un complejo en una célula hospedadora a través de una interacción proteína-proteína y ligación de proteínas.
El ADN obtenido que codifica una Cas mutante y/o una enzima convertidora de bases de ácido nucleico puede inser tarse aguas abajo de un promotor de un vector de expresión similar al mencionado anteriormente, según el hospedador.
Por otro lado, un ADN que codifica un ARN guía se puede sintetizar químicamente diseñando una secuencia de oligoADN en la que se une una secuencia de ARNcr que contiene una secuencia de nucleótidos (también denominada "secuencia de direccionamiento") complementaria a una "cadena seleccionada como diana" de la secuencia de nu cleótidos diana y una secuencia de ARNtracr conocida (p. ej., gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggc accgagtcggtggtgctttt; SEQ ID NO: 1) y utilizando un sintetizador de ADN/ARN.
La "cadena seleccionada como diana" en esta memoria significa una cadena que forma un híbrido con el ARNcr de la secuencia de nucleótidos diana, y una cadena opuesta a la misma que se vuelve monocatenaria mediante una hibri dación con la cadena seleccionada como diana y el ARNcr se denomina "cadena no seleccionada como diana". Dado que generalmente se supone que la reacción de conversión de bases de ácido nucleico ocurre con frecuencia en una cadena no seleccionada como diana monocatenaria, cuando la secuencia de nucleótidos diana se va a expresar a través de una de las cadenas (p. ej., cuando se indica la secuencia PAM, cuando se muestra la relación posicional de la secuencia de nucleótidos diana y PAM, etc.), se representa por una secuencia de la cadena no seleccionada como diana.
Si bien la longitud de la secuencia de direccionamiento no está particularmente limitada, siempre que pueda unirse específicamente a una secuencia de nucleótidos diana, por ejemplo, tiene de 15 a 30 nucleótidos, preferiblemente de 18 a 25 nucleótidos. La selección de la secuencia de nucleótidos diana está restringida por la presencia de un PAM adyacente en el lado 3' de la secuencia. Según el sistema de la presente invención en el que se combinan PmCDA1 y CRISPR-Cas mutada, la mutación se introduce fácilmente en C en una posición ubicada dentro de los 7 nucleótidos desde el extremo 5' de la misma, independientemente de la longitud de la secuencia de nucleótidos diana. Por lo tanto, mediante una determinación adecuada de la longitud de la secuencia de nucleótidos diana (secuencia de direcciona miento como cadena complementaria de la misma), se puede desplazar el sitio de una base en el que se puede introducir una mutación. Como resultado, la restricción a través de PAM (NGG en SpCas9) puede eliminarse al menos parcialmente, y el grado de libertad para la introducción de mutaciones aumenta.
Se puede diseñar una secuencia de direccionamiento, por ejemplo, utilizando un sitio web público para el diseño de ARN guía (herramienta de diseño CRISPR, CRISPRdirect, etc.) haciendo una lista de secuencias de 20 meros que tienen PAM (p. ej., NGG) adyacentes al lado 3' de las secuencias CDS del gen objeto, y seleccionando una secuencia que provoca un cambio de aminoácidos en la proteína codificada por el gen diana, cuando C ubicada dentro de los 7 nucleótidos desde el extremo 5', se convierte en T. Además, cuando la longitud de la secuencia de direccionamiento cambia dentro de un intervalo de, por ejemplo, 18 a 25 nucleótidos, se selecciona de manera similar una secuencia que contiene C que provoca un cambio de aminoácidos mediante la conversión de bases dentro de los 7 nucleótidos desde el extremo 5' de la misma. Una secuencia candidata que tiene un número bajo de sitios fuera de la diana, en el genoma de la bacteria gram-positiva objeto, puede usarse como secuencia de direccionamiento. La herramienta de diseño CRISPR y CRISPRdirect actualmente no tienen una función para buscar sitios fuera de la diana en bacterias gram-positivas. Los sitios fuera de la diana se pueden buscar aplicando una búsqueda Blast al genoma de la bacteria gram-positiva que actúa como hospedadora, por ejemplo, 8 - 12 nucleótidos en el lado 3' de la secuencia candidata (secuencia semilla con capacidad elevada de discriminación de la secuencia de nucleótidos diana).
Por otro lado, un ADN que codifica un ARN guía también se puede insertar en un vector de expresión similar al men cionado anteriormente, según el hospedador. Como promotor, se utiliza preferentemente el promotor del sistema pol III (p. ej., SNR6, SNR52, SCR1, RPR1, U6, promotor H1, etc.) y un terminador (p. ej., la secuencia T6). Cuando se usa un promotor del sistema pol III, una secuencia de nucleótidos que tiene cuatro o más T consecutivas no debe selec cionarse como secuencia de direccionamiento.
Un ARN que codifica una Cas mutante y/o una enzima convertidora de bases de ácido nucleico puede prepararse, por ejemplo, mediante la transcripción a ARNm en un sistema de transcripción in vitro conocido de por sí, mediante el uso de un vector que codifica la Cas mutante mencionada anteriormente y/o el ADN que codifica una enzima convertidora de bases de ácido nucleico como molde.
El ARN guía (ARNcr-ARNtracr) se puede obtener mediante el diseño de una secuencia de oligoADN que une una secuencia complementaria a la cadena seleccionada como diana de la secuencia de nucleótidos diana y una secuen cia de ARNtracr conocida y mediante síntesis química empleando un sintetizador de ADN/ARN.
Un ADN o ARN que codifica una Cas mutante y/o una enzima convertidora de bases de ácido nucleico, un ARN guía (ARNcr-ARNtracr) o un ADN que lo codifica, puede introducirse en una bacteria gram-positiva mediante un método similar al anterior, según el hospedador.
Ya que una nucleasa artificial convencional acompaña a las roturas del ADN de cadena doble (DSB), la inhibición del crecimiento y la muerte celular supuestamente causadas por una escisión desordenada del cromosoma (escisión fuera de la diana) se producen al dirigirse como diana a una secuencia en el genoma. Su efecto es particularmente fatal para muchos microorganismos y procariotas, e impide su aplicabilidad. En la presente invención, la mutación no se introduce mediante una escisión del ADN sino por una reacción de conversión del sustituyente en la base del ADN (particularmente una reacción de desaminación) y, por lo tanto, se puede lograr una reducción drástica de la toxicidad.
La modificación del ADN de cadena doble en la presente invención no evita que se produzca la escisión del ADN de cadena doble en un sitio distinto del sitio seleccionado como diana (adecuadamente ajustado dentro de varios cientos de bases que incluyen la secuencia de nucleótidos diana total o parcial). Sin embargo, una de las mayores ventajas de la presente invención es evitar la toxicidad debida a una escisión fuera de la diana, que generalmente es aplicable a cualquier especie. En una realización preferible, por lo tanto, la modificación del ADN de cadena doble en la presente invención no está acompañada de una escisión de la cadena de ADN, no solo en un sitio seleccionado como diana de un ADN de cadena doble dado, sino en un sitio distinto del mismo.
En los Ejemplos mencionados a continuación, se usa el doble muíante de Cas9, y los presentes inventores han des cubierto que cuando se usa como hospedador otro microorganismo como la levadura de gemación, Escherichia coli y similares y Cas que tiene actividad nickasa capaz de escindir solo una de las cadenas del ADN de cadena doble como Cas mutante, la eficacia de la introducción de una mutación aumenta en comparación con la Cas mutante incapaz de escindir ambas cadenas. Por lo tanto, por ejemplo, cuando una proteína que tiene actividad nickasa se une además a un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico y solo se escinde una sola cadena del ADN en las proximidades de la secuencia de nucleótidos diana, la eficacia de la introducción de mutaciones se puede mejorar evitando la fuerte toxicidad de DSB. Además, una comparación de los efectos de la Cas mutante que tiene dos tipos de actividad nickasa para escindir diferentes cadenas, confirmaba que los sitios mutados se agrupaban principalmente cerca del centro de la secuencia de nucleótidos diana en una de ellas y se introdujeron aleatoriamente diversas mutaciones en la región de varios cientos de bases desde la secuencia de nucleótidos diana en la otra. Por lo tanto, tal y como se describe en esta memoria, pero que no forma parte de la invención, al seleccionar una cadena para que la nickasa la escinda, se puede introducir una mutación en un nucleótido o en una región de nucleótidos particular del ADN de doble cadena de una bacteria gram-positiva en un punto preciso, o se pueden introducir aleatoriamente diversas mutaciones en un intervalo comparativamente amplio, que se pueden adoptar de acuerdo con el objeto.
Los presentes inventores también confirmaron usando una levadura de gemación que cuando los módulos de reco nocimiento de secuencias se producen de forma que se corresponden con las múltiples secuencias de nucleótidos diana adyacentes y se usan simultáneamente, la eficacia de la introducción de mutaciones aumenta drásticamente en comparación con el uso de una sola secuencia de nucleótidos como diana. Como efecto de ello, se realiza de forma similar una inducción de la mutación incluso cuando ambas secuencias de nucleótidos diana se solapan parcialmente o cuando ambas están separadas por aproximadamente 600 pb. Puede ocurrir tanto cuando las secuencias de nu cleótidos diana están en la misma dirección (la cadena seleccionada como diana es la misma cadena), como cuando son opuestas (ambas cadenas de ADN de cadena doble son cadenas seleccionadas como diana).
Los presentes inventores también han confirmado utilizando una levadura de gemación, que el método de modificación de secuencias del genoma de la presente invención puede introducir una mutación en casi todas las células en las que se ha expresado el complejo enzimático modificador de ácido nucleico de la descripción, que no forma parte de la invención, seleccionando una secuencia de nucleótidos diana adecuada. Por lo tanto, la inserción y la selección de un gen marcador de selección, que son esenciales en la edición convencional del genoma, no son necesarias. Esto facilita y simplifica drásticamente la manipulación génica y aumenta la aplicabilidad para el cultivo de moléculas de microorganismos útiles y similares, ya que no se produce un microorganismo recombinante con ADN extraño.
Dado que el método de modificación de secuencias del genoma de la presente invención muestra una eficacia para introducir mutaciones extremadamente alta y no requiere una selección con marcadores, se puede realizar una modi ficación de múltiples regiones del ADN en posiciones completamente diferentes como dianas. Por lo tanto, en una realización preferible de la descripción, que no forma parte de la invención, se pueden usar dos o más tipos de módulos de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico que se unen específicamente a diferentes secuencias de nucleótidos diana (que pueden estar presentes en un gen objeto, o en dos o más genes objeto diferentes). En ese caso, cada uno de esos módulos de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico y la enzima convertidora de bases de ácido nucleico forman un complejo enzimático modificador del ácido nucleico. En ese caso, se puede utilizar una enzima convertidora de bases de ácido nucleico común. Por ejemplo, cuando el sistema CRISPR-Cas se utiliza como módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico, se utiliza un complejo común (incluida una proteína de fusión) de una proteína Cas y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico, y dos o más tipos de ARNs quiméricos de ARNtracr y se producen cada uno de dos o más ARNcr que respectivamente forman una cadena com plementaria con una secuencia de nucleótidos diana diferente y se utilizan como ARN guía (ARNcr-ARNtracr). Por otro lado, cuando se emplea el motivo de dedos de zinc, el efector TAL y similares como módulos de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico de la descripción, que no forma parte de la invención, por ejemplo, una enzima convertidora de bases de ácido nucleico de la descripción, que no forma parte de la invención, se puede fusionar con un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico que se une específicamente a un nucleótido diana diferente.
Para expresar el complejo enzimático modificador de ácido nucleico de la presente descripción en una célula hospedadora, como se ha mencionado anteriormente, se introduce un vector de expresión que contiene un ADN que codifica el complejo enzimático modificador de ácido nucleico, o un ARN que codifica el complejo enzimático modificador de ácido nucleico en una bacteria gram-positiva. Para introducir de forma eficaz la mutación, es deseable mantener una expresión del complejo enzimático modificador de ácido nucleico a un nivel dado o superior, durante no menos de un período dado. Debido a ese aspecto, es seguro introducir un vector de expresión (plásmido, etc.) replicable de forma autónoma en una célula hospedadora. Sin embargo, dado que el plásmido, etc., es un ADN extraño, preferiblemente se elimina rápidamente después de una introducción exitosa de la mutación. Alternativamente, cuando se van a mo dificar sucesivamente múltiples genes diana y cuando uno o más plásmidos utilizables son incompatibles, el plásmido introducido previamente debe eliminarse antes de la introducción del plásmido en una etapa posterior. Por lo tanto, aunque está sujeto a cambios dependiendo del tipo de célula hospedadora y similares, por ejemplo, el plásmido intro ducido se elimina deseablemente de la célula hospedadora después de un lapso de 6 horas a 2 días desde la intro ducción de un vector de expresión, usando diversos métodos de eliminación de plásmidos bien conocidos en la téc nica.
Alternativamente, siempre que se obtenga una expresión de un complejo enzimático modificador de ácido nucleico, que sea suficiente para la introducción de una mutación, es preferible introducir la mutación en el ADN de cadena doble objeto mediante una expresión transitoria, usando un vector de expresión que no se replique de forma autónoma. en una célula hospedadora (p. ej., un vector, etc., que carece de un origen de replicación que funcione en la célula hospedadora y/o un gen que codifique la proteína necesaria para la replicación) o ARN.
La expresión del gen diana se suprime mientras el complejo enzimático modificador de ácido nucleico de la presente descripción, que no forma parte de la invención, se expresa en una bacteria gram-positiva para realizar una reacción de conversión de bases de ácido nucleico. Por lo tanto, era difícil editar directamente un gen esencial para la supervi vencia de la célula hospedadora como gen diana (debido a los efectos secundarios, tales como inhibición del creci miento del hospedador, eficacia inestable de la introducción de una mutación, mutación en un sitio diferente de la diana y similares). En la presente invención, la edición directa de un gen esencial se puede realizar de manera eficaz provocando una reacción de conversión de bases de ácido nucleico en una etapa deseada y expresando transitoria mente el complejo enzimático modificador de ácido nucleico de la presente descripción, que no forma parte de la invención, en una célula hospedadora durante un período necesario para fijar la modificación del sitio seleccionado como diana. Si bien el período necesario para una reacción de conversión de bases de ácido nucleico y la fijación de la modificación del sitio seleccionado como diana varía según el tipo de célula hospedadora, las condiciones de cultivo y similares, generalmente se considera que son necesarias de 2 a 20 generaciones. Los expertos en la técnica pueden determinar apropiadamente un período preferible para la inducción de la expresión, basándose en el tiempo requerido para una duplicación de la célula hospedadora en las condiciones de cultivo que se van a utilizar. El período de induc ción de la expresión de un ácido nucleico que codifica el complejo enzimático modificador de ácido nucleico de la presente invención puede extenderse más allá del "período necesario para fijar la modificación del sitio seleccionado como diana" mencionado anteriormente, siempre que la célula hospedadora esté exenta de efectos secundarios.
Como medio para expresar transitoriamente el complejo enzimático modificador de ácido nucleico de la presente des cripción, que no forma parte de la invención, en una etapa deseada durante un período deseado, se puede mencionar un método que incluye producir una estructura artificial (vector de expresión) que contiene un ácido nucleico (un ADN que codifica un ARN guía y un ADN que codifica una Cas mutante y una enzima convertidora de bases de ácido nucleico en el sistema CRISPR-Cas) que codifica el complejo enzimático modificador de ácido nucleico, en una forma que es capaz de controlar el período de expresión, introduciendo la estructura artificial en una bacteria gram-positiva. La "forma capaz de controlar el período de expresión" es específicamente, por ejemplo, un ácido nucleico que codifica el complejo enzimático modificador de ácido nucleico de la presente invención, dispuesto bajo la regulación de una región reguladora inducible. Aunque la "región reguladora inducible'' no está particularmente limitada, es, por ejemplo, un operón de un represor de la mutación sensible a la temperatura (ts) y un operador regulado por el mismo. Ejemplos del represor de la mutación ts incluyen, pero no se limitan a, la mutación ts del represor cI obtenido a partir del fago A . En el caso del represor cl (ts) del fago A , está unido a un operador para suprimir la expresión del gen aguas abajo a no más de 30°C (por ejemplo, 28°C). A una temperatura alta de no menos de 37°C (por ejemplo, 42°C), se disocia del operador para permitir la inducción de la expresión génica. Por lo tanto, el período en el que se suprime la expresión del gen diana puede minimizarse cultivando una célula hospedadora en la que se ha introducido un ácido nucleico que codifica un complejo enzimático modificador de ácido nucleico, generalmente a no más de 30°C, elevando la temperatura a no menos de 37°C en una etapa apropiada, realizando el cultivo durante un período determinado para llevar a cabo una reacción de conversión de bases de ácido nucleico y, después de la introducción de la mutación en el gen diana, disminuyendo rápidamente la temperatura a no más de 30°C. Por lo tanto, incluso cuando el direccionamiento es hacia un gen esencial para la célula hospedadora, se puede editar de manera eficiente a la vez que se suprimen los efectos secundarios.
Cuando se utiliza una mutación sensible a la temperatura, por ejemplo, un mutante sensible a la temperatura de una proteína necesaria para la replicación autónoma de un vector, se introduce en un vector que contiene un ADN que codifica el complejo enzimático modificador de ácido nucleico de la presente descripción, pero que no forma parte de la invención. Como resultado, la replicación autónoma no puede tener lugar rápidamente después de la expresión del complejo enzimático modificador de ácido nucleico, y el vector disminuye naturalmente junto con la división celular. Por lo tanto, un uso combinado con el represor cI (ts) del fago A mencionado anteriormente permite una expresión transitoria del complejo enzimático modificador de ácido nucleico de la presente descripción, que no forma parte de la invención, y la eliminación del plásmido de forma simultánea.
La presente invención se explica a continuación haciendo referencia a los Ejemplos, que no deben interpretarse como limitativos.
Ejemplos
Ejemplo 1 Modificación genética de Clostridium saccharoperbutylacetonicum
(1) Construcción del vector plasmídico para interrumpir - introducir una modificación con CRISPR en pKNT 19
Se construyó un vector plasmídico para interrumpir insertando la siguiente secuencia génica necesaria entre los sitios de corte de las enzimas de restricción BamHI y Kpnl del plásmido pKNT19, replicable en Escherichia coli y microor ganismos del género Clostridium.
La mutación de los aminoácidos D10A y H840A se introdujo en el gen Cas9 de Streptococcus pyogenes que contenía una región promotora bidireccional para proporcionar dCas9, y se construyó una estructura artificial para que se ex presara como una proteína de fusión con PmCDA1 a través de una secuencia enlazadora y, además, ARNg quimérico que codificaba una secuencia (secuencia de direccionamiento) complementaria a la secuencia de nucleótidos diana de los genes pta (SEQ ID NOs: 2 y 3) de C. saccharoperbutylacetonicum, se ensambló junto con la misma en un plásmido (la secuencia de nucleótidos de longitud completa se muestra en SEQ ID NO: 4 y cada secuencia de direc cionamiento se inserta en el sitio de n20 (nucleótidos n° 5560-5579) en la secuencia) (Fig. 1).
(2) Introducción del vector plasmídico para la interrupción en C. saccharoperbutylacetonicum
De los vectores plasmídicos para la interrupción producidos en el apartado (1) mencionado anteriormente, se utilizó 11757 o 1269+AatII para transformar la cepa ATCC27021 de C. saccharoperbutylacetonicum y la cepa ATCC27021 Aptb1 (véase el Ejemplo 1 del documento JP-A-2014-207885). Las secuencias de direccionamiento y si milares del vector plasmídico para la interrupción 11757, 1269+AatII se muestran en la Tabla 1.
Tabla 1
Método
Como precultivo, se inoculó una reserva en glicerol (0,5 mL) de la cepa ATCC 27021 de C. saccharoperbutylaceto nicum o la cepa ATCC 27021 Aptb1 en medio TYA (5 mL), y las células se cultivaron a 30°C durante 24 horas. La composición del medio TYA se muestra en la Tabla 2.
Tabla 2
El medio de precultivo se inoculó en medio TYA (10 mL) con una DO=0,1 y se incubó en un tubo Falcon de 15 mL a
37°C. Con una DO=0,6, la solución de fermentación se centrifugó, se eliminó el material sobrenadante, se añadió tampón MOPS 65 mM enfriado con hielo (pH 6,5) (10 mL) y la mezcla se resuspendió mediante pipeteo y se centrifugó. El lavado con tampón MOPS se repitió dos veces. El tampón MOPS se eliminó por centrifugación y los sedimentos de bacterias se resuspendieron en sacarosa 0,3 M enfriada con hielo (100 gL) para proporcionar una célula competente. La célula competente (50 gL) se cargó en un tubo Eppendorf y se mezcló con el plásmido (1 gg). Se colocó en una celda enfriada con hielo para electroporación y la celda se imprimió en modo de caída exponencial, 2,5 kV/cm, 25 gF, 350 ü. El aparato de electroporación utilizado era Gene pulser xcell (Bio-rad). Posteriormente, la cantidad total se inoculó en 5 mL de medio TYA y el medio recuperado se cultivó a 30°C durante aproximadamente 2 horas. Posterior mente, el medio de cultivo recuperado se aplicó sobre un medio sólido MASS que contenía eritromicina (10 ppm), se cultivó a 30°C durante varios días, se seleccionó el cultivo de las colonias surgidas y se obtuvo una cepa resistente a la eritromicina con el plásmido introducido. Luego, se confirmó que el plásmido se conservaba en la cepa obtenida. Se inocularon cuatro colonias en medio TYA que contenía eritromicina (10 ppm), una región particular del plásmido se amplificó por PCR utilizando un medio de cultivo obtenido a partir de la colonia transformante cultivada como molde, el producto amplificado se analizó por electroforesis y se confirmó la presencia o ausencia de retención del plásmido. Resultados
Se obtuvieron todos los productos amplificados de la región particular del plásmido. Por lo tanto, se esclareció que el vector plasmídico para la interrupción se conservaba en las bacterias de fermentación de butanol.
(3) Conversión de la secuencia del gen pta de C. saccharoperbutylacetonicum utilizando un vector plasmídico para la interrupción
Usando el vector plasmídico para la interrupción, se convirtió la secuencia de ADN del gen pta de bacterias de fer mentación de butanol. Dado que el vector plasmídico para la interrupción no tiene un mecanismo de control en la herramienta destructiva, funciona simplemente formando generaciones.
Método
La cepa 11757/ATCC 27021Aptb1 como cepa portadora de 11757, las cepas 1269+AatII/ATCC 27021Aptb1 y 1269+AatII/ATCC 27021 como cepa portadora de 1269+AatII, producidas en el apartado (2) mencionado anterior mente, se inocularon y se cultivaron en medio TYA que contenía eritromicina (10 ppm) y se aplicó una dilución sobre el medio sólido TYA que contenía eritromicina (10 ppm) para proporcionar una única colonia. Las colonias individuales (8 colonias) se seleccionaron de la cepa 11757/ATCC 27021 Aptb1 y la cepa 1269+AatII/ATCC 27021 y se tomaron 16 colonias de 1269+AatII/ATCC 27021 Aptb1 y, utilizándolas como moldes, se amplificó el gen pta de longitud completa en el genoma.
Composición para PCR (en una muestra)
2 x tampón KODFX 25 gL
dNTPS 2 mM 10 gL
cebador F 20 gM 0,75 gL (NS-150414-i02)
cebador R 20 gM 0,75 gL (NS-150304-i04)
D. W. 11,5 gL
KODFX 1 gL
secuencia de NS-150414-i025'-GCCCTTTATGAAAGGGATTATATTCAG-3' (SEQ ID NO: 7)
secuencia de NS-150304-i045'-GCTTGTACAGCAGTTAATGCAAC-3' (SEQ ID NO: 8)
Se administraron 49 gL de cada una, se añadió una suspensión de una sola colonia (1 gL) como molde y se realizó la PCR con las siguientes condiciones.
94°C 2 min
98°C 10 s ^ 50°C 30 s ^ 68°C 2 min x 30 ciclos
mantenimiento 10°C
A continuación, el producto de la PCR se purificó mediante Wizard (marca comercial registrada) SV Gel y PCR Clean-Up System, y se realizó una reacción de secuenciación usando el producto purificado como molde.
Composición de la reacción de secuenciación (para una muestra)
Mezcla de reacción Terminator Ready 1 gL
5 x tampón de secuenciación 3,5 pL
cebador 3,2 pmol 1 pL
cebador de ADN 0,35 pL
D.W. 14,15 pL
El ADN molde y el cebador se combinaron como sigue.
Cepa portadora de 1269+AatII
Lado F NS-150414-i02/Lado R NS-150304-i04
cepa portadora de 11753
Lado F NS-150525-i01 /Lado R NS-150304-i04
secuencia de NS-150525-i01 5'-GGTGTTACAGGAAATGTTGCAG-3' (SEQ ID NO: 9)
La PCR de la composición mencionada anteriormente se realizó con las siguientes condiciones.
96°C 1 minuto
96°C 10 s ^ 50°C 5 s ^ 60°C 4 min x 25 ciclos mantenimiento 10°C
Una vez completada la reacción, la secuencia del producto de reacción se analizó mediante un secuenciador de ADN ABI PRISM3101.
Resultados
En los resultados del análisis de la secuencia de una colonia obtenida a partir de 11757/ATCC27021 Aptb1, se muestra la secuencia de ADN 916 - 935 del gen pta en la Tabla 3.
Tabla 3
Como resultado, se introdujo alguna mutación en las 8 cepas cuyas secuencias pudieron analizarse. A partir de esos
resultados, se confirmó que el vector plasmídico 11757 actúa como un plásmido de herramienta destructiva para Clostridium saccharoperbutylacetonicum. Como posición de introducción de la mutación, 6 cepas eran las cepas con la mutación c.932G>A (la base G en la posición 932 del gen pta se modificó a A), 1 cepa era c.934G>A y 1 cepa era la cepa con la mutación c.932G>A, la cepa con la mutación c.934G>A y la cepa con la mutación c.935G>A. Mediante la introducción de la mutación c.932G>A, el aminoácido arginina en la posición 311 (codificada con AGA) de la proteína PTA se convierte en lisina (codificada con AAA) y de manera similar se convierte en G312K por la mutación c.934G>A y c.935G>A. En particular, se supone que R311 es el centro de actividad de PTA, y se esperaba una disminución drástica de la actividad enzimática por la mutación c.932G>A.
En los resultados del análisis de secuencias de las colonias obtenidas a partir de 1269+AatII/ATCC27021 y 1269+AatII/ATCC27021 Aptb1, los resultados de la secuencia de ADN en las posiciones 6 - 30 del gen pta se muestran respectivamente en las Tablas 4 y 5.
Tabla 4
Tabla 5
Se introdujo alguna mutación en las 21 cepas de las 22 cepas cuyas secuencias pudieron analizarse. A partir de esos resultados, se confirmó que 1269+AatII actúa como un plásmido de herramienta destructiva para Clostridium saccharoperbutylacetonicum. Como posición de introducción de la mutación, la G en la posición 25 del gen pta se cambió a A en todas las cepas con la introducción de la mutación, y múltiples cepas tenían la mutación c.24G>A o c.28G>A. Mediante la introducción de la mutación c.24G>A, el aminoácido triptófano en la posición 8 (codificado por UGG) de la proteína PTA cambió a un codón de parada (codificado por UGA), y se esperaba que la función se perdiera ahí ya que la síntesis de proteínas estaba interrumpida.
Ejemplo 2 Modificación genética de Corynebacterium glutamicum (1) Producción del vector lanzadera
Se obtuvo un plásmido pCG100 obtenido a partir de la cepa ATCC13058 de C. glutamicum según el método descrito en el Ejemplo 1 del documento WO 2007/013695.
Para la ligación con pHSG398, se digirió pCG100 con la enzima de restricción Bg111 y se digirió pHSG398 con BamHI y se desfosforiló para evitar una autoligación. pCG100 (digerido con BglII) y pHSG398 (digerido con BamHI) se ligaron y se introdujeron en Escherichia coli.
(2) Producción del plásmido de modificación génica pknG
Se añadió un sitio PstI a ambos extremos terminales del fragmento de ADN (fragmento HindIII-XhoI de aproximada mente 6 kpb de SEQ ID NO: 18) de la modificación CRISPR y se insertó en el plásmido pCG100-pHSG398 en el sitio de escisión de PstI para producir un plásmido de modificación CRISPR que actuaba en C. glutamicum. Se diseñaron las secuencias de direccionamiento (Tabla 6) para la modificación del gen pknG (SEQ ID NO: 19 y 20) de C. glutamicum, y los números 6, 7, 8 y 10 de las mismas se insertaron en el sitio de inserción de la secuencia de direcciona miento (n20) (nucleótidos 8773-8492 de SEQ ID NO: 18) del plásmido de modificación CRISPR para proporcionar plásmidos de modificación del gen pknG.
Tabla 6
(3) introducción del plásmido de modificación del gen pknG en C. glutamicum y confirmación de la modificación gené tica
El plásmido de modificación del gen pknG producido en (2) se introdujo en la cepa ATCC 13032 de C. glutamicum de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 2 del documento WO 2007/013695. Después de la transformación, se formaron colonias en medio agar LBCm 60 ppm. Las colonias se inocularon en medio líquido LBCm 60 ppm y se subcultivaron dos veces, se diluyeron y se formaron colonias en medio agar LB.
Las colonias que crecieron se cultivaron en medio LB, los segmentos del gen pknG se amplificaron mediante PCR utilizando los siguientes cebadores y se analizaron las secuencias de los mismos. Como resultado, se pudo confirmar que se había introducido un codón de parada en los sitios pretendidos.
cebador F de PCR atgaaggataatgaagatttcgatccagattcac (SEQ ID NO: 41)
cebador R de PCR gaaccaactcagtggccgc (SEQ ID NO: 42)
(4) Introducción de otro plásmido de modificación del gen pknG en C. glutamicum y confirmación de la modificación genética
Además, las otras secuencias de direccionamiento descritas en la Tabla 6 se insertaron en un sitio de inserción de la secuencia de direccionamiento del plásmido de modificación CRISPR del apartado (2) mencionado anteriormente, para proporcionar un plásmido de modificación del gen pknG, y la cepa ATCC 13032 de C. glutamicum se transformó mediante un método similar al del apartado (3) mencionado anteriormente, para formar una colonia.
Las colonias que crecieron se cultivaron en el medio LB, los segmentos del gen pknG se amplificaron por PCR utili zando los siguientes cebadores y se analizaron las secuencias de los mismos. Cuando se usaba la secuencia de direccionamiento n° 2, se podía obtener una cepa en la que la C en la posición 203 cambiaba a T y el aminoácido codificante cambiaba de treonina a isoleucina, aunque no se formaba un codón de terminación.
cebador F de PCR cagcaaccgaagctgttgcc (SEQ ID NO: 72)
cebador R de PCR gccatcagcaactgggcg (SEQ ID NO: 73)
Ejemplo 3 Modificación genética de Brevibacillus choshinensis (1) Producción de un plásmido de modificación del gen emp
Se escindió el plásmido pBIC1 utilizable en B. choshinensis con las enzimas de restricción XhoI y HindIII, entre cuyos sitios de escisión se insertó un fragmento de ADN necesario (un fragmento HindIII-XhoI de aproximadamente 6 kpb de la SEQ ID NO: 18 mencionada anteriormente) de modificación CRISPR para transformar B. choshinensis y propor cionar un plásmido de modificación CRISPR funcional. Se diseñaron las secuencias de direccionamiento (Tabla 7) para la modificación del gen emp (SEQ ID NO: 43 y 44) de B. choshinensis, y los n° 5, 6 y 7 de las mismas se insertaron en el sitio de inserción de la secuencia de direccionamiento (n2o) (nucleótidos 8773-8792 de SEQ ID NO: 18) del plásmido de modificación CRISPR para proporcionar el plásmido de modificación del gen emp.
Tabla 7
(2) Introducción del plásmido de modificación del gen emp en B. choshinensis y confirmación de la modificación ge nética
B. choshinensis se transformó basándose en el sistema TAKARA Brevibacillus Expression HB300. Después de la transformación, se formaron colonias en una placa MTNm 50 ppm. Las colonias se inocularon en medio líquido MTNm 50 ppm y se subcultivaron dos veces, se diluyeron y se formaron colonias en la placa MT.
Medio
placa MTNm
medio MT con neomicina añadida (50 ppm)
medio MT
glucosa 10 g/L
peptona fitona 10 g/L
extracto de bonito Erlich 5 g/L
extracto de levadura en polvo S 2 g/L
FeSO4 ■ 7H2O 10 mg/L
MnSO4 ■ 4 H2 O 10 mg/L
ZnSO4 ■ 7 H2 O 1 mg/L
ajustado a pH 7.0
Las colonias que crecieron se cultivaron en medio líquido MT, los segmentos del gen emp se amplificaron por PCR utilizando los siguientes cebadores y se analizaron las secuencias de los mismos. Como resultado, se pudo confirmar una modificación correspondiente a la introducción del codón de parada.
cebador F de PCR gggacatgattcgccggttg (SEQ ID NO: 59)
cebador R de PCR gcgtccatcgtagtaccagatc (SEQ ID NO: 60)
(3) Introducción de otro plásmido de modificación del gen rmp en B. choshinensis y confirmación de la modificación genética
Además, las otras secuencias de direccionamiento descritas en la Tabla 7 se insertaron en un sitio de inserción de la secuencia de direccionamiento del plásmido de modificación CRISPR del apartado (1) mencionado anteriormente, para proporcionar un plásmido de modificación del gen emp, y B. choshinensis se transformó mediante un método similar al del apartado (2) mencionado anteriormente, para formar una colonia.
Las colonias que crecieron se cultivaron en medio líquido MT, los segmentos del gen emp se amplificaron por PCR utilizando los siguientes cebadores y se analizaron las secuencias de los mismos. Cuando se usaba la secuencia de direccionamiento n° 3, se podía obtener una cepa en la que la C en la posición 454 cambiaba a T y la glutamina cambiaba al codón de terminación.
cebador F de PCR ccggaagccatacaggtaagatc (SEQ ID NO: 74)
cebador R de PCR cctgagtcgacatcaatcacgttc (SEQ ID NO: 75)
A partir de los resultados anteriores, se mostraba que el método de la presente invención permite una amplia modifi cación genética de bacterias gram-positivas sin estar acompañada de inserción, deleción o DSB del gen.
Ejemplo 4 Modificación genética de Clostridium saccharoperbutylacetonicum (2)
(1) Producción del hospedador para la destrucción de múltiples genes.
Utilizando 11757/ATCC27021, que es la cepa portadora de 11757 producida en el Ejemplo 1(2), se convirtió la se cuencia de ADN del gen pta de la cepa ATCC27021. A continuación, para la producción de una cepa que tuviera múltiples genes destruidos, se eliminó el plásmido 11757 de la cepa mutada obtenida, R311K (la base G en la posición 932 del gen pta se modificó a A) y G312R (la base G en la posición 934 del gen pta se modificó a A).
Método
Utilizando 11757/ATCC27021, que es la cepa portadora de 11757 producida en el Ejemplo 1 (2), se realizó la conver sión de la secuencia de ADN y el análisis de la secuencia del gen pta mediante un método similar al del Ejemplo 1 (3). Las cepas mutadas R311K (la base G en la posición 932 del gen pta se modificó a A) y G312R (la base G en la posición 934 del gen pta se modificó a A) obtenidas como resultado del análisis de la secuencia, se cultivaron en medio TYA exento de antibióticos y se aplicó una dilución a un medio sólido. Utilizando la única colonia que crecía ahí como molde, se confirmó la presencia o ausencia de retención del plásmido, mediante el método mostrado en el Ejemplo 1 (2) y se seleccionaron colonias exentas de un producto de amplificación de la región particular del plásmido. Composición de la PCR (para una muestra)
2 x tampón KODFX 25 pL
dNTPS 2 mM 10 pL
cebador F 20 pM 0,75 pL (NS-150410-i01)
cebador R 20 pM 0,75 pL (NS-150410-i02)
D. W. 11,5 pL
KODFX 1 pL
secuencia de NS-150410-i01 5'-CCGATAGCTAAGCCTATTGAG-3' (SEQ ID NO: 61)
secuencia de NS-150410-i025'-TCATCCTGTGGAGCTTAGTAG-3' (SEQ ID NO: 62)
Se administraron 49 pL de cada una, se añadió una suspensión de una sola colonia (1 pL) como molde y se realizó la PCR con las siguientes condiciones.
94°C 2 min
98°C 10 s ^ 50°C 30 s ^ 68°C 2 min x 30 ciclos mantenimiento 10°C
Resultados
Los productos de la PCR obtenidos se sometieron a electroforesis y las colonias obtenidas a partir de la respectiva cepa mutada (R311K y G312R) y exentas de un producto de amplificación de la región particular del plásmido, se usaron respectivamente como cepas de disminución de 11757, ATCC 27021R311K y ATCC 27021G312R.
(2) Introducción del vector plasmídico para interrupción en C. saccharoperbutylacetonicum
Se construyeron cuatro tipos de plásmidos de vector ptb1 para la interrupción 64G>A, 655G>A, 442C>T y 745G>A, en donde la porción de la secuencia de direccionamiento [porción n20 (nucleótidos n° 5560-5579) de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 4; correspondiente a "Diana" en la Fig. 1] del vector plasmídico para la interrupción producida en el Ejemplo 1(1), se sustituyó por una secuencia complementaria a cada secuencia de nucleótidos diana en el gen ptb1 (SEQ ID NO: 63 y 64) de C. saccharoperbutylacetonicum. Las secuencias de direccionamiento y similares de esos vectores plasmídicos para interrupción se muestran en la Tabla 8.
Tabla 8
En 64G>A, la mutación 64G>A y/o 66G>A y/o 67G>A se introdujo en el gen diana ptb1, y la mutación V22I o V22 y/o A23T se introdujo a nivel de aminoácido. 442C>T es un vector de interrupción que muta P148 a L o S. Se sabe que la prolina es un iminoácido que disminuye localmente el grado de libertad de la proteína. Cuando se cambia a leucina, la conservación de la estructura se vuelve difícil y se espera una reducción o pérdida de actividad. 655G>A es un vector de interrupción que muta A219 a T, 745G>A muta A249 a T. La mutación de alanina no polar que tiene una cadena lateral pequeña a treonina polar que tiene una cadena lateral voluminosa, cambia la estructura de la proteína PTB1 y se espera que reduzca o elimine la actividad. 745G>A también puede introducir una mutación en 751G>A (V251 a I).
Método
La cepa ATCC 27021 de C. saccharoperbutylacetonicum, y las cepas ATCC 27021R311K y ATCC 27021G312 producidas en el apartado (1) mencionado anteriormente, se transformaron con el vector plasmídico ptb1 mencionado anteriormente para la interrupción 64G>A, 442C>T, 655G>A o 745G>A. La introducción del vector plasmídico para la interrupción y el mantenimiento del plásmido se confirmaron mediante el método que se muestra en el Ejemplo 1 (2). Resultados
Como resultado de la PCR de confirmación de conservación del plásmido utilizando la cepa obtenida como molde, se obtuvieron productos de amplificación en la región particular del plásmido en todos los hospedadores y se confirmó que eran transformantes.
(3) Conversión de la secuencia del gen ptb1 de C. saccharoperbutylacetonicum usando un vector plasmídico para interrupción
Usando el vector plasmídico para interrupción, se convirtió la secuencia de ADN del gen ptb1 de la bacteria de
fermentación de butanol. Dado que el vector plasmídico para la interrupción no tiene un mecanismo de control en la herramienta destructiva, actúa simplemente formando generaciones.
Método
La cepa 64G>A/ATCC 27021 como cepa portadora de 64G>A, la cepa 442C>T/ATCC 27021, la cepa 442C>T/ATCC 27021R311K y la cepa 442C>T/ATCC 27021G312 como cepa 64G>A/ATCC 27021R312K y la cepa 64G>A/ATCC 27021G312, la cepa portadora 442C>T, la cepa 655G>A/At CC 27021 como cepa portadora 655G>A y la cepa 745G>A/ATCC 27021, la cepa 745G>A/ATCC 27021R311K y la cepa 745G>A/ATCC 27021G312R como cepa 655G>A/ATCC 27021R311K y la cepa 655G>A/ATCC 27021G312R, la cepa portadora 745G>A, que se produjeron en el apartado (2) mencionado anteriormente, se inocularon y cultivaron en medio TYA que contenía eritromicina (10 ppm), y se aplicó una dilución al medio sólido TYA que contenía eritromicina (10 ppm) para proporcionar una única colonia. Se seleccionaron las colonias individuales y, utilizándolas como moldes, se amplificó el gen ptb1 de longitud completa en el genoma.
La composición y las condiciones de la PCR eran como las del Ejemplo 1(3), excepto que los cebadores utilizados eran NS-150819-i01 y NS-150819-i02 para ptb1.
secuencia de NS-150819-i01 5'-GCAAGAAATGAGCAAAAACTTTGACG-3' (SEQ ID NO: 69)
secuencia de NS-150819-i025'-GCTGCAACTAATGCTGCTAAAGC-3' (SEQ ID NO: 70)
A continuación, el producto de la PCR se purificó mediante Wizard (marca comercial registrada) SV Gel y PCR Clean-Up System, y se realizó una reacción de secuenciación usando el producto purificado como molde.
La composición y las condiciones de la PCR fueron como las del Ejemplo 1(3), excepto que el cebador utilizado era NS-150819-i01 (SEQ ID NO: 69) para la cepa portadora de 64G>A y nS-150324-i01 para las demás.
secuencia de NS-150324-i01 5'-CTCTGACTGTGCAGTTAACC-3' (SEQ ID NO: 71)
Resultados
Como resultado del análisis de las secuencias de las colonias obtenidas a partir de la cepa portadora de 64G>A, se obtuvo una cepa que mostraba la introducción de la mutación 64G>A y/o 67G>A en el gen ptb1. Se obtuvo una cepa que se convirtió en V22I y/o A23T como proteína PTB1 a través de la mutación 64G>A y/o 67G>A. En ese momento no se encontró en el análisis una cepa que mostrara la introducción de la mutación V22M. Como resultado del análisis de secuencias de las colonias obtenidas a partir de la cepa portadora de 442C>T, se obtuvo una cepa que mostraba la introducción de la mutación en 442C>T y/o 443C>T. Mediante la mutación 442C>T y/o 443C>T se obtuvo una cepa que tenía P148L o P148S como proteína PTB1. Como resultado del análisis de secuencias se obtuvieron las colonias obtenidas a partir de la cepa portadora de 655G>A. Mediante la mutación 655G>A se obtuvo una cepa que tenía A219T como proteína PTB1. Como resultado del análisis de secuencias de las colonias obtenidas a partir de la cepa portadora de 745G>A, se obtuvo una cepa que mostraba la introducción de la mutación en 745G>A y/o 751G>A. Mediante la mutación 745G>A y/o 751 G>A se obtuvo una cepa que tenía A249T y/o V2511 como proteína PTB1.
Aplicabilidad industrial
La presente invención hace posible poder introducir con seguridad una mutación específica de un sitio en cualquier bacteria gram-positiva sin la inserción concomitante de un ADN extraño o roturas del ADN de cadena doble. Dado que se considera que la cepa modificada genéticamente así obtenida no pertenece a los microorganismos con genes recombinantes, se puede esperar una reducción de los costes de las instalaciones y del coste para la eliminación de residuos en la producción fermentativa industrial, utilizando bacterias gram-positivas, y la cepa es extremadamente útil porque permite una reducción de los costes de producción.
Esta solicitud se basa en un documento de solicitud de patente n° 2015-178022 presentado en Japón (fecha de pre sentación: 9 de septiembre, 2015).
Claims (8)
1. Un método para modificar un sitio seleccionado como diana en un ADN de cadena doble de una bacteria grampositiva, que comprende una etapa de poner en contacto un complejo, en el que se une un módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico que se une específicamente a una secuencia de nucleótidos diana en un ADN de cadena doble dado y la citidina desaminasa 1 de Petromyzon marinus (PmCDA1), con dicho ADN de cadena doble, para convertir uno o varios nucleótidos en el sitio seleccionado como diana en otro u otros varios nucleótidos, sin escindir al menos una cadena de dicho ADN de cadena doble en el sitio diana, en donde el ADN de cadena doble se pone en contacto con el complejo introduciendo el ácido nucleico que codifica el complejo en la bacteria gram-positiva, en donde la bacteria gram-positiva es un microorganismo perteneciente al género Clostridium, al género Brevibacillus o al género Corynebacterium, y
en donde el módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico es un sistema CRISPR-Cas y en donde Cas es una Cas mutante en la que ambas capacidades de Cas para escindir el ADN están inactivadas.
2. El método según la reivindicación 1, que utiliza dos o más tipos de módulos de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico que se unen respectivamente de forma específica a diferentes secuencias de nucleótidos diana.
3. El método según la reivindicación 2, en el que dicha secuencia de nucleótidos diana diferente está presente en un gen diferente.
4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el microorganismo que pertenece al género Clostridium es Clostridium saccharoperbutylacetonicum.
5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el microorganismo que pertenece al género Brevibacillus es Brevibacillus choshinensis.
6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el microorganismo que pertenece al género Corynebacterium es Corynebacterium glutamicum.
7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende una etapa de introducir un vector de expresión que comprende un ácido nucleico que codifica dicho complejo en una forma que permite el control de un período de expresión en dicha bacteria gram-positiva, y una etapa de inducir la expresión del ácido nucleico durante un período necesario para fijar la modificación del sitio seleccionado como diana en el ADN de cadena doble.
8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el módulo de reconocimiento de secuencias de ácido nucleico se fusiona con PmCDA1.
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