JP6153180B2 - 脱塩基反応により標的化したdna配列に特異的に変異を導入する、ゲノム配列の改変方法、並びにそれに用いる分子複合体 - Google Patents
脱塩基反応により標的化したdna配列に特異的に変異を導入する、ゲノム配列の改変方法、並びにそれに用いる分子複合体 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6153180B2 JP6153180B2 JP2016516997A JP2016516997A JP6153180B2 JP 6153180 B2 JP6153180 B2 JP 6153180B2 JP 2016516997 A JP2016516997 A JP 2016516997A JP 2016516997 A JP2016516997 A JP 2016516997A JP 6153180 B2 JP6153180 B2 JP 6153180B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- double
- mutant
- nucleic acid
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title claims description 147
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 116
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims description 110
- 208000035657 Abasia Diseases 0.000 title claims description 21
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 title description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 268
- 102100037111 Uracil-DNA glycosylase Human genes 0.000 claims description 141
- 108020001738 DNA Glycosylase Proteins 0.000 claims description 136
- 102000028381 DNA glycosylase Human genes 0.000 claims description 136
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 129
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 122
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 99
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 92
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 92
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 87
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 70
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 64
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 64
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 60
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 claims description 52
- 108010029834 cytosine-DNA glycosidase Proteins 0.000 claims description 43
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 37
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 37
- 102100026406 G/T mismatch-specific thymine DNA glycosylase Human genes 0.000 claims description 36
- 108010035344 Thymine DNA Glycosylase Proteins 0.000 claims description 36
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 34
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 34
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 34
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 34
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 32
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 31
- 101710160987 Uracil-DNA glycosylase Proteins 0.000 claims description 28
- 101000807668 Homo sapiens Uracil-DNA glycosylase Proteins 0.000 claims description 21
- 102000010719 DNA-(Apurinic or Apyrimidinic Site) Lyase Human genes 0.000 claims description 17
- 108010063362 DNA-(Apurinic or Apyrimidinic Site) Lyase Proteins 0.000 claims description 17
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 17
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 claims description 15
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 claims description 11
- 241000700625 Poxviridae Species 0.000 claims description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 11
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 9
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 9
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 8
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 8
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 8
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 7
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 6
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 6
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 5
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 4
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 claims description 4
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 claims description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- 208000020584 Polyploidy Diseases 0.000 claims description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 3
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 claims description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000001850 polyploid cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 claims description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims 1
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 claims 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims 1
- 108010072685 Uracil-DNA Glycosidase Proteins 0.000 description 93
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 59
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 58
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 32
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 24
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 23
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 22
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 22
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 19
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 19
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 18
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 18
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 18
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 16
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 16
- 230000033590 base-excision repair Effects 0.000 description 16
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 16
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 16
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 16
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 15
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 15
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 15
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 14
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 14
- 108010073062 Transcription Activator-Like Effectors Proteins 0.000 description 13
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 13
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 12
- FSBIGDSBMBYOPN-VKHMYHEASA-N L-canavanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCONC(N)=N FSBIGDSBMBYOPN-VKHMYHEASA-N 0.000 description 12
- FSBIGDSBMBYOPN-UHFFFAOYSA-N O-guanidino-DL-homoserine Natural products OC(=O)C(N)CCON=C(N)N FSBIGDSBMBYOPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 description 11
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 11
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 10
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 10
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 9
- 230000006870 function Effects 0.000 description 9
- 241000235343 Saccharomycetales Species 0.000 description 8
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- 101150032615 ung gene Proteins 0.000 description 8
- 101150008604 CAN1 gene Proteins 0.000 description 7
- 101000897441 Homo sapiens Cyclin-O Proteins 0.000 description 7
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 7
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 108010034927 3-methyladenine-DNA glycosylase Proteins 0.000 description 6
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 6
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 6
- 102220511664 Heme oxygenase 1_Y70G_mutation Human genes 0.000 description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 6
- 102100038661 Single-strand selective monofunctional uracil DNA glycosylase Human genes 0.000 description 6
- 101710147388 Single-strand selective monofunctional uracil-DNA glycosylase Proteins 0.000 description 6
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 6
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 6
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 6
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 5
- 241000193996 Streptococcus pyogenes Species 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 230000017730 intein-mediated protein splicing Effects 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 101100452003 Caenorhabditis elegans ape-1 gene Proteins 0.000 description 4
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 4
- 102220605874 Cytosolic arginine sensor for mTORC1 subunit 2_D10A_mutation Human genes 0.000 description 4
- 102000000395 SH3 domains Human genes 0.000 description 4
- 108050008861 SH3 domains Proteins 0.000 description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 230000005937 nuclear translocation Effects 0.000 description 4
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 3
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 3
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 3
- 102220545976 Dihydropyrimidinase_Y70A_mutation Human genes 0.000 description 3
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101100262801 Homo sapiens UNG gene Proteins 0.000 description 3
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 3
- 102220548254 Tafazzin_E96Q_mutation Human genes 0.000 description 3
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 3
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 3
- 238000006481 deamination reaction Methods 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 230000004049 epigenetic modification Effects 0.000 description 3
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 3
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 3
- 230000016314 protein import into mitochondrial matrix Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 1-beta-D-Xylofuranosyl-NH-Cytosine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FSASIHFSFGAIJM-UHFFFAOYSA-N 3-methyladenine Chemical compound CN1C=NC(N)=C2N=CN=C12 FSASIHFSFGAIJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 2
- 241000409811 Bombyx mori nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 2
- 108091092236 Chimeric RNA Proteins 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N Cytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 2
- 102100026846 Cytidine deaminase Human genes 0.000 description 2
- 108010031325 Cytidine deaminase Proteins 0.000 description 2
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 2
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 2
- 241000700662 Fowlpox virus Species 0.000 description 2
- 108010001498 Galectin 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100021736 Galectin-1 Human genes 0.000 description 2
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 241000700627 Monkeypox virus Species 0.000 description 2
- 229930182474 N-glycoside Natural products 0.000 description 2
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 2
- 241000251745 Petromyzon marinus Species 0.000 description 2
- 241000700564 Rabbit fibroma virus Species 0.000 description 2
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 2
- 241000700565 Swinepox virus Species 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 241000255993 Trichoplusia ni Species 0.000 description 2
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N cytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O1 UHDGCWIWMRVCDJ-ZAKLUEHWSA-N 0.000 description 2
- 230000009615 deamination Effects 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 2
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 2
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 2
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N (4r,7s,10s,13s,16r)-16-acetamido-13-(1h-imidazol-5-ylmethyl)-10-methyl-6,9,12,15-tetraoxo-7-propan-2-yl-1,2-dithia-5,8,11,14-tetrazacycloheptadecane-4-carboxamide Chemical compound N1C(=O)[C@@H](NC(C)=O)CSSC[C@@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CC1=CN=CN1 FQVLRGLGWNWPSS-BXBUPLCLSA-N 0.000 description 1
- ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 5-Methylcytidine Natural products O=C1N=C(N)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 5-methylcytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 ZAYHVCMSTBRABG-JXOAFFINSA-N 0.000 description 1
- 108010029988 AICDA (activation-induced cytidine deaminase) Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 1
- 102100034035 Alcohol dehydrogenase 1A Human genes 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- 101100365087 Arabidopsis thaliana SCRA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100365680 Arabidopsis thaliana SGT1B gene Proteins 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108091079001 CRISPR RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 1
- 101100351811 Caenorhabditis elegans pgal-1 gene Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020004998 Chloroplast DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000037088 Chromosome Breakage Diseases 0.000 description 1
- 101100417900 Clostridium acetobutylicum (strain ATCC 824 / DSM 792 / JCM 1419 / LMG 5710 / VKM B-1787) rbr3A gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 102000000311 Cytosine Deaminase Human genes 0.000 description 1
- 108010080611 Cytosine Deaminase Proteins 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008836 DNA modification Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 231100001074 DNA strand break Toxicity 0.000 description 1
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 240000006497 Dianthus caryophyllus Species 0.000 description 1
- 235000009355 Dianthus caryophyllus Nutrition 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 101100379225 Drosophila melanogaster cass gene Proteins 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241001452028 Escherichia coli DH1 Species 0.000 description 1
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000511010 Eustoma Species 0.000 description 1
- 208000034951 Genetic Translocation Diseases 0.000 description 1
- 101000892220 Geobacillus thermodenitrificans (strain NG80-2) Long-chain-alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 description 1
- 241000700586 Herpesviridae Species 0.000 description 1
- 101000780443 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1A Proteins 0.000 description 1
- 101000806846 Homo sapiens DNA-(apurinic or apyrimidinic site) endonuclease Proteins 0.000 description 1
- 101000664956 Homo sapiens Single-strand selective monofunctional uracil DNA glycosylase Proteins 0.000 description 1
- 101000755690 Homo sapiens Single-stranded DNA cytosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 1
- 241000235789 Hyperoartia Species 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 241000555303 Mamestra brassicae Species 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108020005196 Mitochondrial DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 210000004460 N cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 241000238814 Orthoptera Species 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 101150034686 PDC gene Proteins 0.000 description 1
- 102000000470 PDZ domains Human genes 0.000 description 1
- 108050008994 PDZ domains Proteins 0.000 description 1
- 101150012394 PHO5 gene Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108091008103 RNA aptamers Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101150105073 SCR1 gene Proteins 0.000 description 1
- -1 SNR52 Proteins 0.000 description 1
- 229910003797 SPO1 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910003798 SPO2 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 101100134054 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) NTG1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100150136 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SPO1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000793189 Saccharomyces cerevisiae BY4741 Species 0.000 description 1
- 101100478210 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) spo2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 102100022433 Single-stranded DNA cytosine deaminase Human genes 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 description 1
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000194020 Streptococcus thermophilus Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 238000010459 TALEN Methods 0.000 description 1
- 101150117137 Tdg gene Proteins 0.000 description 1
- 208000035199 Tetraploidy Diseases 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 101150107801 Top2a gene Proteins 0.000 description 1
- 101710183280 Topoisomerase Proteins 0.000 description 1
- 108010043645 Transcription Activator-Like Effector Nucleases Proteins 0.000 description 1
- 208000026487 Triploidy Diseases 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 244000098338 Triticum aestivum Species 0.000 description 1
- 101150003481 UNG1 gene Proteins 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101900122744 Uracil-DNA glycosylase (isoform 1) Proteins 0.000 description 1
- 102300041059 Uracil-DNA glycosylase isoform 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 description 1
- 241000269370 Xenopus <genus> Species 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 230000001909 effect on DNA Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 238000012236 epigenome editing Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 238000003144 genetic modification method Methods 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 230000037442 genomic alteration Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006451 grace's insect medium Substances 0.000 description 1
- 230000009036 growth inhibition Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 102000050321 human APEX1 Human genes 0.000 description 1
- 102000055291 human SMUG1 Human genes 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 125000001909 leucine group Chemical group [H]N(*)C(C(*)=O)C([H])([H])C(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 230000025608 mitochondrion localization Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000006870 ms-medium Substances 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 description 1
- 230000009438 off-target cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000010397 one-hybrid screening Methods 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 101150019841 penP gene Proteins 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 244000000003 plant pathogen Species 0.000 description 1
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 101150079601 recA gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 230000003007 single stranded DNA break Effects 0.000 description 1
- 230000005783 single-strand break Effects 0.000 description 1
- 101150068906 snr-6 gene Proteins 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 108700020534 tetracycline resistance-encoding transposon repressor Proteins 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
- C12N15/1024—In vivo mutagenesis using high mutation rate "mutator" host strains by inserting genetic material, e.g. encoding an error prone polymerase, disrupting a gene for mismatch repair
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2497—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing N- glycosyl compounds (3.2.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/02—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2) hydrolysing N-glycosyl compounds (3.2.2)
- C12Y302/02027—Uracil-DNA glycosylase (3.2.2.27)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
例えば、ジンクフィンガーDNA結合ドメインと非特異的なDNA切断ドメインとを連結した、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)を用い、宿主の植物細胞または昆虫細胞にDNA中の標的遺伝子座において組換えを行う方法(特許文献1)、植物病原菌キサントモナス属が有するDNA結合モジュールである転写活性化因子様(TAL)エフェクターと、DNAエンドヌクレアーゼとを連結したTALENを用いて、特定のヌクレオチド配列内又はそれに隣接する部位で、標的遺伝子を切断・修飾する方法(特許文献2)、あるいは、真正細菌や古細菌が持つ獲得免疫システムで機能するDNA配列CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)と、CRISPRとともに重要な働きを持つヌクレアーゼCas(CRISPR-associated)タンパク質ファミリーとを組み合わせたCRISPR-Cas9システムを利用する方法(特許文献3)などが報告されている。さらには、35個のアミノ酸からなり1個の核酸塩基を認識するPPRモチーフの連続によって、特定のヌクレオチド配列を認識するように構成されたPPRタンパク質と、ヌクレアーゼとを連結した人工ヌクレアーゼを用い、該特定配列の近傍で標的遺伝子を切断する方法(特許文献4)も報告されている。
しかし、これらのゲノム編集技術は、基本的にDNA二重鎖切断(double-stranded DNA breaks : DSB)を前提としているが、想定外のゲノム改変を伴うため、強い細胞毒性や染色体の転位などの副作用があり、遺伝子治療における信頼性を損なったり、ヌクレオチド改変による生存細胞数が極めて少なかったり、霊長類卵細胞や単細胞微生物では遺伝子改変自体が困難であるといった共通の課題があった。
さらに、特許文献6及び非特許文献2には、酵母3-メチルアデニン-DNAグリコシラーゼ(MAG1)とTetリプレッサータンパク質(TetR)との融合タンパク質を用いることにより、TetRが特異的に認識するTetオペレーター(TetO)DNA配列を有するゲノム領域内への標的化されたヌクレオチド改変が可能であることが記載されている。しかしながら、MAG1は3-メチルアデニンを主とするアルキル化などの傷害を受けた特殊なDNA塩基を取り除くのが本来的な役割であり、正常な塩基、特にミスマッチのない塩基対から塩基を除去する能力は極めて低い。そのため、通常の細胞ではMAG1による変異導入効果を見ることは困難であり、塩基除去修復系の遺伝子を破壊した細胞でMAG1を過剰発現させることにより、ようやく検出できる程度の変異率しか得られていない。また、DNA修復系を弱めてしまうとゲノム全体の変異率も上がってしまうため、実用化には程遠かった。ところが、MAG1の代わりに、正常なシトシン塩基に作用するCDG活性を有する変異UDGをこの系に用いても、変異導入効率は増大しなかった(特許文献6、非特許文献2)。
本発明者らは、従来法(例えば、特許文献6及び非特許文献2を参照)がCDG活性を有する変異UDGを用いても変異導入効率を改善できなかった原因の1つは、当該酵素が二本鎖DNAの至る所で脱塩基を起こしてしまうために、細胞毒性が高く、当該酵素タンパク質を発現させること自体を困難にしていることにあると推測した。この仮説のもと、本発明者らは、CDG活性又はTDG活性を有する変異UDGに、さらにひずみのない二重らせん構造のDNA(unrelaxed (double-helical) DNA)への作用を低下させる変異を導入し、該変異酵素とDNA配列認識能のある分子とを連結させることにより、特定のDNA配列を含む領域における核酸塩基変換によるゲノム配列の改変を行った。
具体的には、CRISPR-Casシステム(CRISPR-変異Cas)を用いて行った。即ち、改変しようとする遺伝子の標的配列と相補的な配列を含むゲノム特異的CRISPR-RNA:crRNA(gRNA)に、Casタンパク質をリクルートするためのRNA(trans-activating crRNA: tracrRNA)を連結したRNA分子をコードするDNAを作製し、他方で二本鎖DNAの両方の鎖の切断能を失活した変異Casタンパク質をコードするDNA(dCas)と変異CDG又はTDG遺伝子を連結したDNAを作製し、これらのDNAを、改変しようとする遺伝子を含む宿主酵母細胞に導入した。その結果、標的配列を含む目的遺伝子の数百ヌクレオチドの範囲内で、ランダムに変異を導入することに成功した。さらに、目的遺伝子内の複数の領域を標的化することにより、きわめて効率よく変異を導入することに成功した。即ち、DNAを導入した宿主細胞を非選択培地に播種し、無作為に選んだコロニーについて目的遺伝子の配列を調べた結果、ほとんど全てのコロニーについて変異が導入されていることを確認した。塩基除去修復系酵素であるAPエンドヌクレアーゼの機能欠損変異体を共発現させて、無塩基部位(AP部位)の修復エラーの頻度を高めることにより、変異導入効率はさらに向上した。
本発明者らは、これらの知見に基づいてさらに研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。
[1]細胞内の二本鎖DNAの標的化された部位を改変する方法であって、選択された二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、ひずみのない二重らせん構造のDNA(unrelaxed DNA)への反応性が十分に低いDNAグリコシラーゼとが結合した複合体を、該二本鎖DNAと接触させ、該標的化された部位において該二本鎖DNAの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の1以上のヌクレオチドを他の1以上のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に1以上のヌクレオチドを挿入する工程を含む、方法。
[2]前記核酸配列認識モジュールが、Casの少なくとも1つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステム、ジンクフィンガーモチーフ、TALエフェクター及びPPRモチーフからなる群より選択される、上記[1]記載の方法。
[3]前記核酸配列認識モジュールが、Casの少なくとも1つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステムである、上記[1]記載の方法。
[4]DNA二本鎖構造を変化させる因子を、さらに該二本鎖DNAと接触させることを特徴とする、上記[1]又は[2]記載の方法。
[5]異なる標的ヌクレオチド配列とそれぞれ特異的に結合する、2種以上の核酸配列認識モジュールを用いることを特徴とする、上記[1]〜[4]のいずれかに記載の方法。
[6]前記異なる標的ヌクレオチド配列が、異なる遺伝子内に存在する、上記[5]記載の方法。
[7]前記DNAグリコシラーゼがシトシン-DNAグリコシラーゼ(CDG)活性又はチミン-DNAグリコシラーゼ(TDG)活性を有するものである、上記[1]〜[6]のいずれかに記載の方法。
[8]前記CDG活性又はTDG活性を有するDNAグリコシラーゼが、ウラシル-DNAグリコシラーゼ(UDG)の変異体である、上記[7]記載の方法。
[9]さらに、無塩基部位への結合能を有するが、ヌクレアーゼ活性を欠損するAPエンドヌクレアーゼを、二本鎖DNAと接触させることを特徴とする、上記[1]〜[8]のいずれかに記載の方法。
[10]前記DNAグリコシラーゼが、生来的にひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が低いものである、上記[1]〜[9]のいずれかに記載の方法。
[11]前記DNAグリコシラーゼが、CDG活性又はTDG活性を有する、ポックスウイルス科に属するウイルス由来のウラシル-DNAグリコシラーゼ(UDG)の変異体である、上記[10]記載の方法。
[12]さらに、A20タンパク質を二本鎖DNAと接触させることを特徴とする、上記[11]記載の方法。
[13]前記DNAグリコシラーゼが、野生型に比べて、ひずみのない二重らせん構造のDNA(unrelaxed DNA)への反応性が減弱された変異体である、上記[1]〜[9]のいずれかに記載の方法。
[14]前記DNAグリコシラーゼと、該DNAグリコシラーゼと直接的に結合する前記核酸配列認識モジュールの要素とが、それぞれ2つの断片に分断され、一方の断片同士と他方の断片同士とがそれぞれ結合して2つの部分的複合体を形成し、該部分的複合体同士がリフォールディングした場合に、該核酸配列認識モジュールは標的ヌクレオチド配列と特異的に結合することができ、かつ該特異的な結合により該DNAグリコシラーゼが酵素活性を発揮し得るようになることを特徴とする、上記[1]〜[9]のいずれかに記載の方法。
[15]前記DNAグリコシラーゼと直接的に結合する核酸配列認識モジュールの要素が、少なくとも1つのDNA切断能が失活したCasタンパク質である、上記[14]記載の方法。
[16]前記2つの部分的複合体が、別個の分子複合体として提供され、細胞内で両者が会合することによりリフォールディングされる、上記[14]又は[15]記載の方法。
[17]二本鎖DNAと複合体との接触が、該二本鎖DNAを有する細胞への、該複合体をコードする核酸の導入により行われる、上記[1]〜[16]のいずれかに記載の方法。
[18]前記細胞が原核生物細胞である、上記[17]記載の方法。
[19]前記細胞が真核生物細胞である、上記[17]記載の方法。
[20]前記細胞が微生物細胞である、上記[17]記載の方法。
[21]前記細胞が植物細胞である、上記[17]記載の方法。
[22]前記細胞が昆虫細胞である、上記[17]記載の方法。
[23]前記細胞が動物細胞である、上記[17]記載の方法。
[24]前記細胞が脊椎動物細胞である、上記[17]記載の方法。
[25]前記細胞が哺乳類動物細胞である、上記[17]記載の方法。
[26]前記細胞が倍数体細胞であり、相同染色体上のすべての標的化された対立遺伝子内の部位を改変することを特徴とする、上記[18]〜[25]のいずれかに記載の方法。
[27]二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、ひずみのない二重らせん構造のDNA(unrelaxed DNA)への反応性が十分に低いDNAグリコシラーゼとが結合した複合体であって、標的化された部位において該二本鎖DNAの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の1以上のヌクレオチドを他の1以上のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に1以上のヌクレオチドを挿入する、核酸改変酵素複合体。
[28]上記[27]記載の核酸改変酵素複合体をコードする核酸。
また、「ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が十分に低い」とは、細胞の生存に影響を与えない程度に細胞毒性が抑えられる頻度でしか、ひずみのない二重らせん構造のDNAを形成する領域内での脱塩基反応を起こさないことを意味する。ここで「ひずみのない二重らせん構造のDNA」とは、強固な二重らせん構造を形成した状態にあること(即ち、unrelaxed double-helical DNA(又は単にunrelaxed DNAともいう))を意味し、対形成する塩基同士が完全に解離した一本鎖DNAの状態のみならず、塩基対は形成しているものの二重らせん構造がほどけた緩んだ二本鎖(relaxed double-stranded DNA)の状態のものも含まれない。ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が十分に低いDNAグリコシラーゼとしては、生来的にひずみのない二重らせん構造のDNAに対する反応性が十分に低いDNAグリコシラーゼや、野生型に比べてひずみのない二重らせん構造のDNAに対する反応性を低下させる変異が導入された変異DNAグリコシラーゼ等が挙げられる。さらに、2つの断片に分断されたDNAグリコシラーゼであって、それぞれの断片が2つに分断された核酸配列認識モジュールのいずれか一方と結合して2つの複合体を形成し、両複合体がリフォールディングすると該核酸配列認識モジュールは標的ヌクレオチド配列と特異的に結合することができ、該特異的な結合によって該DNAグリコシラーゼが脱塩基反応を触媒することが可能となるようにデザインされたスプリット酵素であるDNAグリコシラーゼも、本発明における「ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が十分に低いDNAグリコシラーゼ」に包含される。
尚、UNG2を用いる場合も、上記変異部位に対応するアミノ酸残基に同様の変異を導入することにより、CDG活性、TDG活性又は5-mCDG活性を有する変異UNGを得ることができる。
また、変異UNGは、正常な塩基に作用し得る限り、上記の部位が上記以外のアミノ酸で置換されたものであっても、あるいは上記以外の部位に変異が導入されたものであってもよい。変異UNGが正常な塩基に作用し得るか否かは、例えば、Kavli B. et al., EMBO J. (1996) 15(13): 3442-7に記載の方法によって確認することができる。
上記の条件を充足するDNAグリコシラーゼとして、例えば、酵母由来のUNG1(配列番号2)の場合、N末端から304番目のロイシンをアラニンに置換した変異体が挙げられる(該変異体をL304Aともいう)(Slupphaug, G. et al. Nature (1996) 384(6604): 87-92)。あるいは、308番目のアルギニンをグルタミン酸又はシステインに置換した変異体(該変異体をそれぞれR308E、R308Cともいう)も、ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が顕著に低下している(Chen, C.Y. et al. DNA Repair (Amst) (2005) 4(7): 793-805)。別の生物種由来のUNGを用いる場合、所望の生物由来のUNG1又はUNG2のアミノ酸配列を、上記の酵母UNG1のアミノ酸配列とアラインすることにより、対応する変異部位を同定することができる。例えば、ヒトUNG1の場合、酵母UNG1のL304に対応するアミノ酸は272番目のロイシン(L272)であり、R308に対応するアミノ酸は276番目のアルギニン(R276)である。また、大腸菌ungの場合、酵母UNG1のL304に対応するアミノ酸は191番目のロイシン(L191)であり、R308に対応するアミノ酸は195番目のアルギニン(R195)である。ワクシニアウイルスUDGの場合、酵母UNG1のR308に対応するアミノ酸は187番目のアルギニン(R187)である。
従って、核酸配列認識モジュールと、DNAグリコシラーゼとは、それらの融合タンパク質をコードする核酸として、あるいは、結合ドメインやインテイン等を利用してタンパク質に翻訳後、宿主細胞内で複合体形成し得るような形態で、それらをそれぞれコードする核酸として調製することが好ましい。ここで核酸は、DNAであってもRNAであってもよい。DNAの場合は、好ましくは二本鎖DNAであり、宿主細胞内で機能的なプロモーターの制御下に配置した発現ベクターの形態で提供される。RNAの場合は、好ましくは一本鎖RNAである。
DNAグリコシラーゼをコードするDNAも、同様に、使用する酵素のcDNA配列情報をもとにオリゴDNAプライマーを合成し、当該酵素を産生する細胞より調製した全RNAもしくはmRNA画分を鋳型として用い、RT-PCR法によって増幅することにより、クローニングすることができる。例えば、酵母のUNG1をコードするDNAは、NCBIデータベースに登録されているcDNA配列(accession No. NM_001182379)をもとに、CDSの上流及び下流に対して適当なプライマーを設計し、酵母由来mRNAからRT-PCR法によりクローニングできる。
得られたcDNAを鋳型にして、自体公知の部位特異的変異誘発法を用いて、CDG活性、TDG活性又は5-mCDG活性を付与する変異と、ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性を低下させる変異とを導入することにより、ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が十分に低いDNAグリコシラーゼをコードする核酸を取得することができる。vvUDG等のように、生来的にひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が十分に低いDNAグリコシラーゼの場合、CDG活性、TDG活性又は5-mCDG活性を付与する変異のみを導入することができる。
クローン化されたDNAは、そのまま、または所望により制限酵素で消化するか、適当なリンカー(例、GSリンカー、GGGARリンカー等)、スペーサー(例、FLAG配列等)及び/又は核移行シグナル(NLS)(目的の二本鎖DNAがミトコンドリアや葉緑体DNAの場合は、各オルガネラ移行シグナル)を付加した後に、核酸配列認識モジュールをコードするDNAとライゲーションして、融合タンパク質をコードするDNAを調製することができる。UNG1及びUNG2はそれぞれN末端にミトコンドリア移行シグナル及び核移行シグナルを有するので、それらをそのまま利用することもできる。あるいは、例えばUNG1を核ゲノムDNAを標的化したヌクレオチド改変に用いる場合、ミトコンドリア移行シグナルを除去して、別途核移行シグナルを連結することができる。
あるいは、核酸配列認識モジュールをコードするDNAと、DNAグリコシラーゼをコードするDNAに、それぞれ結合ドメインもしくはその結合パートナーをコードするDNAを融合させるか、両DNAに分離インテインをコードするDNAを融合させることにより、核酸配列認識変換モジュールとDNAグリコシラーゼとが宿主細胞内で翻訳された後に複合体を形成できるようにしてもよい。これらの場合も、所望により一方もしくは両方のDNAの適当な位置に、リンカー及び/又は核移行シグナルを連結することができる。
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド(例、pBR322,pBR325,pUC12,pUC13);枯草菌由来のプラスミド(例、pUB110,pTP5,pC194);酵母由来プラスミド(例、pSH19,pSH15);昆虫細胞発現プラスミド(例:pFast-Bac);動物細胞発現プラスミド(例:pA1-11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNAI/Neo);λファージなどのバクテリオファージ;バキュロウイルスなどの昆虫ウイルスベクター(例:BmNPV、AcNPV);レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなどの動物ウイルスベクターなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。DSBを伴う従来法では毒性のために宿主細胞の生存率が著しく低下する場合があるので、誘導プロモーターを使用して誘導開始までに細胞数を増やしておくことが望ましいが、本発明の核酸改変酵素複合体を発現させても十分な細胞増殖が得られるので、構成プロモーターも制限なく使用することができる。
例えば、宿主が動物細胞である場合、SRαプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、CMV(サイトメガロウイルス)プロモーター、RSV(ラウス肉腫ウイルス)プロモーター、MoMuLV(モロニーマウス白血病ウイルス)LTR、HSV-TK(単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ)プロモーターなどが用いられる。なかでも、CMVプロモーター、SRαプロモーターなどが好ましい。
宿主が大腸菌である場合、trpプロモーター、lacプロモーター、recAプロモーター、λPLプロモーター、lppプロモーター、T7プロモーターなどが好ましい。
宿主がバチルス属菌である場合、SPO1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロモーターなどが好ましい。
宿主が酵母である場合、Gal1/10プロモーター、PHO5プロモーター、PGKプロモーター、GAPプロモーター、ADHプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、P10プロモーターなどが好ましい。
宿主が植物細胞である場合、CaMV35Sプロモーター、CaMV19Sプロモーター、NOSプロモーターなどが好ましい。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)K12・DH1〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,60,160 (1968)〕,エシェリヒア・コリJM103〔Nucleic Acids Research,9,309 (1981)〕,エシェリヒア・コリJA221〔Journal of Molecular Biology,120,517 (1978)〕,エシェリヒア・コリHB101〔Journal of Molecular Biology,41,459 (1969)〕,エシェリヒア・コリC600〔Genetics,39,440 (1954)〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス(Bacillus subtilis)MI114〔Gene,24,255 (1983)〕,バチルス・サブチルス207-21〔Journal of Biochemistry,95,87 (1984)〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)AH22,AH22R-,NA87-11A,DKD-5D,20B-12、シゾサッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)NCYC1913,NCYC2036,ピキア・パストリス(Pichia pastoris)KM71などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫、ショウジョウバエ、コオロギなどが用いられる〔Nature,315,592 (1985)〕。
大腸菌は、例えば、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,69,2110 (1972)やGene,17,107 (1982)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
バチルス属菌は、例えば、Molecular & General Genetics,168,111 (1979)などに記載の方法に従ってベクター導入することができる。
酵母は、例えば、Methods in Enzymology,194,182-187 (1991)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA,75,1929 (1978)などに記載の方法に従ってベクター導入することができる。
昆虫細胞および昆虫は、例えば、Bio/Technology,6,47-55 (1988)などに記載の方法に従ってベクター導入することができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊8 新細胞工学実験プロトコール,263-267 (1995)(秀潤社発行)、Virology,52,456 (1973)に記載の方法に従ってベクター導入することができる。
例えば、大腸菌またはバチルス属菌を培養する場合、培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。また、培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖などが;窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質が;無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のpHは、好ましくは約5〜約8である。
大腸菌を培養する場合の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むM9培地〔Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕が好ましい。必要により、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、3β-インドリルアクリル酸のような薬剤を培地に添加してもよい。大腸菌の培養は、通常約15〜約43℃で行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
バチルス属菌の培養は、通常約30〜約40℃で行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
酵母を培養する場合の培地としては、例えば、バークホールダー(Burkholder)最小培地〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77,4505 (1980)〕や0.5%カザミノ酸を含有するSD培地〔Proc. Natl. Acad. Sci. USA,81,5330 (1984)〕などが挙げられる。培地のpHは、好ましくは約5〜約8である。培養は、通常約20℃〜約35℃で行なわれる。必要に応じて、通気や撹拌を行ってもよい。
昆虫細胞または昆虫を培養する場合の培地としては、例えばGrace's Insect Medium〔Nature,195,788 (1962)〕に非働化した10%ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のpHは、好ましくは約6.2〜約6.4である。培養は、通常約27℃で行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
動物細胞を培養する場合の培地としては、例えば、約5〜約20%の胎児ウシ血清を含む最小必須培地(MEM)〔Science,122,501 (1952)〕,ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)〔Virology,8,396 (1959)〕,RPMI 1640培地〔The Journal of the American Medical Association,199,519 (1967)〕,199培地〔Proceeding of the Society for the Biological Medicine,73,1 (1950)〕などが用いられる。培地のpHは、好ましくは約6〜約8である。培養は、通常約30℃〜約40℃で行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
植物細胞を培養する培地としては、MS培地、LS培地、B5培地などが用いられる。培地のpHは好ましくは約5〜約8である。培養は、通常約20℃〜約30℃で行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
以上のようにして、核酸配列認識モジュールとDNAグリコシラーゼとの複合体、即ち核酸改変酵素複合体を細胞内で発現させることができる。
これに対し、CRISPR-Casシステムは、標的ヌクレオチド配列に対して相補的なガイドRNAにより目的の二本鎖DNAの配列を認識するので、標的ヌクレオチド配列と特異的にハイブリッド形成し得るオリゴDNAを合成するだけで、任意の配列を標的化することができ、しかも、標的化された部位において、二本鎖DNAをほどいて一本鎖構造の領域と、それに隣接する緩んだ二本鎖DNA構造をとる領域とを生成するため、二本鎖DNAの構造を変化させる因子を組み合わせることなく、標的化された部位特異的にDNAグリコシラーゼを効率よく作用させることができる。
従って、本発明のより好ましい実施態様においては、核酸配列認識モジュールとして、Casの少なくとも1つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステム(CRISPR-変異Cas)が用いられる。
CRISPR-変異Casを用いた本発明の核酸配列認識モジュールは、標的ヌクレオチド配列と相補的なガイドRNAと、変異Casタンパク質のリクルートに必要なtracrRNAとからなるRNA分子と変異Casタンパク質との複合体として提供される。
DNAグリコシラーゼは、上記ジンクフィンガー等との連結様式と同様の手法により、変異Casとの複合体として提供される。あるいは、DNAグリコシラーゼと変異Casとを、RNA aptamerであるMS2F6、PP7等とそれらとの結合タンパク質によるRNA scaffoldを利用して結合させることも出来る。ガイドRNAが標的ヌクレオチド配列と相補鎖を形成し、これに続くtracrRNAに変異CasがリクルートされてDNA切断部位認識配列PAM(プロトスペーサー アジェイセント モチーフ)(SpCas9を用いた場合、PAMはNGG(Nは任意の塩基)3塩基であり、理論上ゲノム上のどこでも標的化することができる)を認識するが、一方あるいは両方のDNAを切断することができず、変異Casに連結されたDNAグリコシラーゼの作用により、標的された部位(標的ヌクレオチド配列の全部もしくは一部を含む数百塩基の範囲内で適宜調節できる)で脱塩基が起こり、二本鎖DNA内にAP部位が生じる。これを修復しようとする細胞のBER系のエラーにより、種々の変異が導入される(例えば、図5参照)。
CasをコードするDNAは、DNAグリコシラーゼをコードするDNAについて上記したのと同様の方法により、該酵素を産生する細胞からクローニングすることができる。また、変異Casは、クローン化されたCasをコードするDNAに、自体公知の部位特異的変異誘発法を用いて、DNA切断活性に重要な部位のアミノ酸残基(例えば、Cas9の場合、10番目のAsp残基や840番目のHis残基が挙げられるが、これらに限定されない)を他のアミノ酸で変換するように変異を導入することにより、取得することができる。
あるいは変異CasをコードするDNAは、核酸配列認識モジュールをコードするDNAやDNAグリコシラーゼをコードするDNAについて上記したのと同様の方法により、化学合成又はPCR法もしくはGibson Assembly法との組み合わせで、用いる宿主細胞での発現に適したコドン使用を有するDNAとして構築することもできる。例えば、SpCas9を真核細胞で発現のために最適化したCDS配列及びアミノ酸配列を配列番号3及び4に示す。配列番号3に示された配列中塩基番号29の「A」を「C」に変換すれば、D10A変異体をコードするDNAを得ることができ、塩基番号2518-2519の「CA」を「GC」に変換すればH840A変異体をコードするDNAを得ることができる。
変異CasをコードするDNAと、DNAグリコシラーゼをコードするDNAとは、融合タンパク質として発現するように連結してもよいし、結合ドメインやインテイン等を用いて別々に発現させ、タンパク質間相互作用やタンパク質ライゲーションを介して宿主細胞内で複合体を形成するように設計してもよい。あるいは、変異CasをコードするDNAと、DNAグリコシラーゼをコードするDNAとを、それぞれ適当な箇所で2つの断片に分断し、それらの一方の断片同士を直接もしくは適当なリンカーを介して連結することにより、核酸改変酵素複合体を2つの部分的複合体として発現させ、それらが細胞内で会合し、リフォールディングすることによって、特定の核酸配列認識能を有する機能的な変異Casを再構成させ、該変異Casが標的ヌクレオチド配列と結合した場合に、脱塩基反応触媒活性を有する機能的なDNAグリコシラーゼが再構成されるように設計してもよい。例えば、変異CasのN末側断片をコードするDNAとC末側断片をコードするDNAとを、それぞれ適当なプライマーを用いてPCR法により調製し、他方、DNAグリコシラーゼのN末側断片をコードするDNAとC末側断片をコードするDNAとを同様にして調製し、例えばN末側断片をコードするDNA同士、並びにC末側断片をコードするDNA同士を、常法を用いて連結して、2つの部分的複合体をコードするDNAを作製することができる。あるいは、変異CasのN末側断片をコードするDNAとDNAグリコシラーゼのC末側断片をコードするDNAとを連結し、他方、DNAグリコシラーゼのN末側断片をコードするDNAと変異CasのC末側断片をコードするDNAとを連結することにより、2つの部分的複合体をコードするDNAを作製することもできる。各部分的複合体は融合タンパク質として発現するように連結してもよいし、結合ドメインやインテイン等を用いて別々に発現させ、タンパク質間相互作用やタンパク質ライゲーションを介して宿主細胞内で複合体を形成するように設計してもよい。また、2つの部分的複合体を1つの融合タンパク質として発現するように連結してもよい。。変異Casの分断箇所は、分断された2つの断片が標的ヌクレオチド配列を認識して結合するように再構成され得る限り特に制限はなく、1か所で分断されてN末側断片とC末側断片としてもよいし、2か所以上で分断して生じる3以上の断片を適宜連結して2つの断片とすることもできる。種々のCas9タンパク質の3次元構造は公知であり、当業者であれば、当該情報に基づいて適宜分断箇所を選択することができる。例えば、SpCas9の場合、N末から94番目から718番目のアミノ酸からなる領域が標的ヌクレオチド配列とガイドRNAの認識に関わるドメイン(REC)であり、1099番目からC末端のアミノ酸からなる領域がPAMとの相互作用に関わるドメイン(PI)であるので、RECドメイン内もしくはPIドメイン内の任意の部位、好ましくは構造を持たない領域内(例、N末から204番目と205番目のアミノ段の間(204..205)、N末から535番目と536番目のアミノ酸の間(535..536)など)で、N末側断片とC末側断片とに分断することができる(例えば、Nat Biotechnol. 33(2): 139-142 (2015)参照)。
一方、ガイドRNA及びtracrRNAをコードするDNAは、標的ヌクレオチド配列に対して相補的な配列と既知のtracrRNA配列(例えば、gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtggtgctttt; 配列番号5)とを連結したオリゴDNA配列を設計し、DNA/RNA合成機を用いて、化学的に合成することができる。ガイドRNA及びtracrRNAをコードするDNAも、宿主に応じて、上記と同様の発現ベクターに挿入することができるが、プロモーターとしては、pol III系のプロモーター(例、SNR6、SNR52、SCR1、RPR1、U6、H1プロモーター等)及びターミネーター(例、T6配列)を用いることが好ましい。
ガイドRNA-tracrRNAは、標的ヌクレオチド配列に対して相補的な配列と既知のtracrRNA配列とを連結したオリゴRNA配列を設計し、DNA/RNA合成機を用いて、化学的に合成することができる。
尚、本発明の二本鎖DNAの改変では、標的化された部位(標的ヌクレオチド配列の全部もしくは一部を含む数百塩基の範囲内で適宜調節できる)以外で、該二本鎖DNAの切断が生じることを妨げない。しかしながら、本発明の最大の利点の1つが、off-target切断による毒性を回避することであり、原則的にいかなる生物種においても適用可能であることを考慮すれば、好ましい一実施態様においては、本発明の二本鎖DNAの改変は、選択された二本鎖DNAの標的化された部位のみならず、それ以外の部位でのDNA鎖切断も伴わない。
また、変異導入効率が極めて高く、かつマーカーによる選抜を必要としないことから、本発明のゲノム配列の改変方法においては、全く異なる位置の複数のDNA領域を標的として改変することが可能である。従って、本発明の好ましい一実施態様においては、異なる標的ヌクレオチド配列(1つの目的遺伝子内であってもよいし、異なる2以上の目的遺伝子内にあってもよい。これらの目的遺伝子は同一染色体上にあってもよいし、別個の染色体上に位置していてもよい。)とそれぞれ特異的に結合する、2種以上の核酸配列認識モジュールを用いることができる。この場合、これらの核酸配列認識モジュールの各々1つと、DNAグリコシラーゼとが、核酸改変酵素複合体を形成する。ここでDNAグリコシラーゼは共通のものを使用することができる。例えば、核酸配列認識モジュールとしてCRISPR-Casシステムを用いる場合、Casタンパク質とDNAグリコシラーゼとの複合体(融合タンパク質を含む)は共通のものを用い、ガイドRNA-tracrRNAとして、異なる標的ヌクレオチド配列とそれぞれ相補鎖を形成する2以上のガイドRNAの各々と、tracrRNAとのキメラRNAを2種以上作製して用いることができる。一方、核酸配列認識モジュールとしてジンクフィンガーモチーフやTALエフェクターなどを用いる場合には、例えば、異なる標的ヌクレオチドと特異的に結合する各核酸配列認識モジュールに、DNAグリコシラーゼを融合させることができる。
あるいは、変異導入に十分な核酸改変酵素複合体の発現が得られる限り、宿主細胞内での自律複製能を有しない発現ベクター(例えば、宿主細胞で機能する複製起点及び/又は複製に必要なタンパク質をコードする遺伝子を欠くベクター等)や、RNAを用いて、一過的発現により目的の二本鎖DNAに変異を導入することもまた好ましい。
<細胞株・培養・形質転換・発現誘導>
出芽酵母Saccharomyces cerevisiae BY4741株(ロイシン及びウラシル要求性)を用い、標準的なYPDA培地ないしSD培地の栄養要求性に合わせたDropout組成で培養した。培養は25℃から30℃の間で、寒天プレートでの静置培養または液体培地での振とう培養を行った。形質転換は酢酸リチウム法を用い、適切な栄養要求性に合わせたSD培地で選抜を行った。ガラクトースによる発現誘導には、適切なSD培地で一晩予備培養した後、炭素源を2%グルコースから2%ラフィノースに代えたSR培地に植え継いで一晩培養、さらに炭素源を0.2%ガラクトースに代えたSGal培地に植え継いで3時間から二晩程度培養して発現誘導を行った。
生存細胞数およびCan1変異率の測定には、細胞懸濁液をSDプレート培地およびSD-Arg+60mg/l Canavanineプレート培地あるいはSD+300mg/l Canavanineプレート培地に適宜希釈して塗布し、3日後に出現するコロニー数を生存細胞数としてカウントした。SDプレートでの生存コロニー数を全細胞数とし、Canavanineプレートでの生存コロニー数を耐性変異株数として、変異率を算出・評価した。変異導入箇所はコロニーPCR法によって各株のターゲット遺伝子領域を含むDNA断片を増幅した後DNAシーケンスを行い、Saccharomyces Genome Database (http://www.yeastgenome.org/)の配列をベースにアラインメント解析を行って同定した。
DNAは、PCR法、制限酵素処理、ライゲーション、Gibson Assembly法、人工化学合成のいずれかによって、加工・構築した。プラスミドは酵母・大腸菌シャトルベクターとしてロイシン選抜用のpRS315、およびウラシル選抜用のpRS426をバックボーンとして用いた。プラスミドは大腸菌株XL-10 goldないしDH5αで増幅し、酢酸リチウム法で酵母に導入した。
誘導発現には、ガラクトース誘導型で双方向性プロモーターである出芽酵母pGal1/10(配列番号6)を用いた。プロモーター下流にStreptococcus pyogenes由来のCas9遺伝子ORFを真核発現用にコドンを最適化されたもの(配列番号3)に核移行シグナル(ccc aag aag aag agg aag gtg; 配列番号7(PKKKRV; 配列番号8をコードする))を付加したものを繋ぎ、リンカー配列を介して野生型又は種々の変異ウラシル-DNAグリコシラーゼ遺伝子(酵母Saccharomyces cerevisiae由来UNG1)のORF(野生型遺伝子のORFを配列番号1に示す。Y164A変異は、塩基番号490〜491のtaがgcに置換されたもの(ta490gc);Y164G変異は、塩基番号490〜491のtaがggに置換されたもの(ta490gg);N222D変異は、塩基番号664のaがgに置換されたもの(a664g);L304A変異は、塩基番号910〜911のttがgcに置換されたもの(tt910gc);R308E変異は、塩基番号922〜923のagがgaに置換されたもの(ag922ga);R308C変異は、塩基番号922〜924のagaがtgtに置換されたもの(aga922tgt)である。)からミトコンドリア移行シグナルをコードする領域(塩基番号1〜60)を除いた配列を繋いで融合タンパク質として発現させた。比較のために、UNG1遺伝子の代わりにデアミナーゼ遺伝子(ヤツメウナギPetromyzon marinus由来PmCDA1)を繋いで融合タンパク質として発現させた。リンカー配列としては2xGSリンカー(ggt gga gga ggt tct; 配列番号9(GGGGS; 配列番号10をコードする)の2回繰り返し)を用いた。ターミネーターとして出芽酵母由来のADH1ターミネーター(配列番号11)およびTop2ターミネーター(配列番号12)を繋いだ。またドメイン結合方式においては、Cas9遺伝子ORFを2xGSリンカーを介してSH3ドメイン(配列番号13及び14)に繋いだものを一つのタンパク質とし、変異酵母UNG1にSH3 ligand配列(配列番号15及び16)を付加したものを別のタンパク質としてGal1/10プロモーターの両方向に繋いで同時に発現させた。これらはpRS315プラスミドに組み込んだ。
Cas9において、第10番目のアスパラギン酸をアラニンに変換する変異(D10A、対応DNA配列変異a29c)および840番目のヒスチジンをアラニンに変換する変異(H840A、対応DNA配列変異ca2518gc)をそれぞれ片側のDNA鎖の切断能を除去するために導入した。
gRNAはtracrRNA(Streptococcus pyogenes由来; 配列番号5)とのキメラ構造としてSNR52プロモーター(配列番号17)とSup4ターミネーター(配列番号18)の間に配置し、pRS426プラスミドに組み込んだ。gRNA標的塩基配列は、CAN1遺伝子ORFの793-812 (aacccaggtgcctggggtcc; 配列番号19) 及び767-786の相補鎖配列 (ataacggaatccaactgggc; 配列番号20)を用いた。複数のターゲットを同時に発現させる場合にはプロモーターからターミネーターまでの配列を1セットとして複数を同一のプラスミドに組み込んだ。細胞にCas9-UNG1発現用プラスミドと共に導入し、細胞内にて発現させ、gRNA-tracrRNAとCas9-UNG1との複合体を形成させた。
変異ウラシル-DNAグリコシラーゼとCRISPR-Casの核酸配列認識能とを利用した本発明のゲノム配列の改変技術の効果を試験すべく、遺伝子欠損によりカナバニン耐性を生じるカナバニントランスポーターをコードするCAN1遺伝子への変異導入を試みた。gRNAとしてCAN1遺伝子ORFの793-812に相補的な配列及び767-786の相補鎖配列に相補的な配列を用い、これらにStreptococcus pyogenes由来tracrRNAを連結したキメラRNAの発現ベクターと、Streptococcus pyogenes由来Cas9(SpCas9)に変異(D10AおよびH840A)を導入してヌクレアーゼ活性を喪失させたdCas9に野生型及び種々の変異(N222D単独変異及びN222DとL304A、R308E又はR308C変異との二重変異)を導入した酵母由来UNG1を融合させたタンパク質を発現するベクターとを構築し、酢酸リチウム法で出芽酵母内に導入し、共発現させた。結果を図3に示す。カナバニン含有SDプレート上で培養すると、gRNA-tracrRNAとdCas9-変異UNG1(CDG活性を付与するN222D変異とひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性を低下させるL304A、R308E又はR308C変異との二重変異体)とを導入発現させた細胞のみカナバニン耐性コロニーを形成した。N222D単独変異では細胞毒性が強く、細胞培養及び評価が困難であったため、結果は示していない。以上より、DNAグリコシラーゼのひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性を低下させることにより、標的特異的な変異導入が可能となることが示された。
ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性を低下させるR308C変異と、CDG活性を付与するN222D変異又はTDG活性を付与するY164AもしくはY164G変異との二重変異を導入した酵母UNG1を用いて、実施例1と同様の方法で、CAN1遺伝子への変異導入を試みた。結果を図4に示す。R308C N222Dは、デアミナーゼPmCDA1に匹敵する変異導入効率を達成でき、選抜無しでも変異株を所得できることが示された。R308C Y164Aでもカナバニン耐性コロニーが得られたことから、チミン塩基の編集が可能であることが示された。Y164G変異により変異導入効率が改善した。
次に、カナバニン耐性となった各クローンについてCan1遺伝子領域のシーケンス解析を行った。結果を図5に示す。2つの近接する標的部位(767-786、793-812)を中心として、ややランダムに変異が入っていた。これはデアミナーゼによるピンポイント変異導入(国際公開第2015-133554号)とは異なり、本発明のゲノム編集技術が、標的ヌクレオチド配列及びその周辺にランダムに変異を導入する用途に適していることを示唆している。想定通り、N222Dでは主にCないしGからの点変異であり、Y164A及びY164Gでは主にTないしAからの点変異であった。
Cas9とDNAグリコシラーゼを融合タンパク質としてではなく、結合ドメインとそのリガンドを介して核酸改変酵素複合体形成させることによっても、標的化した遺伝子への変異導入が可能かどうかを調べた。Cas9としては実施例1で用いたdCas9を、DNAグリコシラーゼとして酵母UNG1変異体(N222DもしくはY164A変異と、R308EもしくはR308C変異との二重変異体)を用い、前者にSH3ドメイン、後者にその結合リガンドを融合して、図6に示すコンストラクトを作製した。また、実施例1と同様、CAN1遺伝子内配列をgRNAターゲットとして用い、これらのコンストラクトを出芽酵母に導入した。その結果、結合ドメインを介してdCas9とDNAグリコシラーゼを結合させた場合でも、CAN1遺伝子の標的化された部位に効率よく変異が導入された(図6)。
ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性を低下させるR308C変異と、CDG活性を付与するN222D変異又はTDG活性を付与するY164G変異との二重変異を導入した酵母UNG1と、酵素活性を失っているがAP部位への結合を保持している変異ヒトAPE1(E96Q, D210N)とを用いて、実施例1と同様の方法で、CAN1遺伝子への変異導入を試みた。結果を図7に示す。変異APE1を共発現させると、単独では効率の低かったY164G, R308Cでもカナバニン耐性コロニー数が増加し、チミンを標的とする変異導入の効率が顕著に向上した。
UNG1におけるひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性を低下させる変異(L304A)の有無が宿主酵母の生存率に及ぼす影響を調べた。結果を図8に示す。CDG活性(N222D)又はTDG活性(Y164A)を付与する変異のみを有する変異UNG1を導入された宿主酵母では、野生型UNG1を導入された酵母に比べて生存率が著しく低下した。これは、野生型UNG1はDNA中に稀に出現する異常塩基であるウラシルを除去するのに対し、CDG活性もしくはTDG活性を有する変異UNG1は、ゲノムDNA上の至る所でシトシンもしくはチミンを除去し、細胞の生存に望ましくない変異を生じるためであると推察される。一方、L304変異を導入してひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性を低下させると、宿主酵母の生存率は顕著に回復し、細胞毒性を回避することができた。
酵母由来の変異UNG1に代えて、異種生物由来の変異UNG1を用いても、宿主酵母における標的化された変異導入が可能であるか否かを調べた。2種の大腸菌由来変異ung(EcUDG)(N123D/L191A二重変異体、Y66G/L191A二重変異体)と4種のワクシニアウイルス由来変異UDG(vvUDG)(N120D/R187C二重変異体、Y70G/R187C二重変異体、N120D変異体、Y70G変異体)を用いた。結果を図9に示す。EcUDG、vvUDGとも酵母で機能的であったが、変異導入効率は酵母UNG1に比べて低く、同種由来のDNAグリコシラーゼの使用が有利であることが示された。驚くべきことに、vvUDGでは、酵母UNG1のR308C変異に対応するR187C変異の有無に拘わらず、細胞毒性が生じないことが明らかとなった。シーケンス解析の結果、vvUDGによる変異は、R187C変異の有無に拘わらず、標的ヌクレオチド配列内の特定塩基に集中していたことから(図10参照)、vvUDGは生来的にひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が十分に低いDNAグリコシラーゼであることが示唆された。vvUDGによる変異導入効率は、ウイルスDNAポリメラーゼにおいて、vvUDGと相互作用してプロセッシビティ因子として働くA20を共発現させることにより顕著に上昇した(図9)。
ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性を低下させる変異、vvUDGのような生来的に二重らせん構造のDNAへの反応性が低いDNAグリコシラーゼの利用に加え、DNAグリコシラーゼによる非特異的変異を低減させる別の手段として、スプリット酵素技術の利用を試みた。図11に示される種々のスプリット酵素をコードするDNAを含むプラスミドを、ガイドRNA-tracrRNAをコードするDNAを含むプラスミドとともに、実施例1と同様の方法で宿主酵母に導入し、非選択培地上での細胞数、カナバニン耐性(標的化された部位における変異)コロニー数、チアリジン耐性(非特的変異)コロニー数を調べた。いずれのスプリット酵素を用いた場合でも、非選択培地上での宿主酵母の生存率が、ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性を低下させる変異(R308C)を導入した変異UNG1を導入した場合と同等であったことから、スプリット酵素の利用により、ひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性を低下させる変異を導入せずとも細胞毒性を十分に低減させ得ることが示され、非特異的変異を抑制できることが示唆された(図11)。実際に、チアリジン耐性を指標とした非特異的変異の頻度は、スプリット酵素の利用により低減されていた(図11)。
Claims (25)
- 細胞内の二本鎖DNAの標的化された部位を改変する方法であって、選択された二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、ひずみのない二重らせん構造のDNA(unrelaxed DNA)への反応性が十分に低いDNAグリコシラーゼとが結合した複合体を、該二本鎖DNAと接触させ、該標的化された部位において該二本鎖DNAの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の1以上のヌクレオチドを他の1以上のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に1以上のヌクレオチドを挿入する工程を含み、
該核酸配列認識モジュールが、Casの少なくとも1つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステムであり、
該DNAグリコシラーゼが、シトシン-DNAグリコシラーゼ(CDG)活性又はチミン-DNAグリコシラーゼ(TDG)活性を有するUNGの変異体である、方法(但し、ヒト体内で行われる方法を除く)。 - 前記CDG活性が、
(a) 配列番号2で示される酵母由来のUNG1(野生型UNG1)において、N末端から222番目のアスパラギンをアスパラギン酸に置換すること、又は
(b) 酵母由来のUNG1以外のUNGにおいて、(a)に対応する変異を導入すること、
により付与され、前記TDG活性が、
(c) 配列番号2で示される酵母由来のUNG1において、N末端から164番目のチロシンをアラニン若しくはグリシンに置換すること、又は
(d) 酵母由来のUNG1以外のUNGにおいて、(c)に対応する変異を導入すること
により付与される、請求項1に記載の方法。 - DNA二本鎖構造を変化させる因子を、さらに該二本鎖DNAと接触させることを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
- 異なる標的ヌクレオチド配列とそれぞれ特異的に結合する、2種以上の核酸配列認識モジュールを用いることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記異なる標的ヌクレオチド配列が、異なる遺伝子内に存在する、請求項4記載の方法。
- さらに、無塩基部位への結合能を有するが、ヌクレアーゼ活性を欠損するAPエンドヌクレアーゼを、二本鎖DNAと接触させることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記DNAグリコシラーゼが、生来的にひずみのない二重らせん構造のDNAへの反応性が低い、ポックスウイルス科に属するウイルス由来のUDGの変異体である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ポックスウイルス科に属するウイルスがワクシニアウイルスである、請求項7記載の方法。
- さらに、A20タンパク質を二本鎖DNAと接触させることを特徴とする、請求項7又は8記載の方法。
- 前記DNAグリコシラーゼが、野生型に比べてひずみのない二重らせん構造のDNA(unrelaxed DNA)への反応性が減弱された変異体である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記DNAグリコシラーゼが、
(a) 酵母由来のUNG1の変異体であって、野生型UNG1のN末端から304番目のアミノ酸に対応するロイシンがアラニンに、又はN末端から308番目のアミノ酸に対応するアルギニンがグルタミン酸若しくはシステインに置換されている変異体、又は
(b) 酵母由来のUNG1以外のUNGの変異体であって、(a)に対応する変異を有する変異体
である、請求項10記載の方法。 - 前記DNAグリコシラーゼと、該DNAグリコシラーゼと直接的に結合する前記核酸配列認識モジュールの要素とが、それぞれ2つの断片に分断され、一方の断片同士と他方の断片同士とがそれぞれ結合して2つの部分的複合体を形成し、該部分的複合体同士がリフォールディングした場合に、該核酸配列認識モジュールは標的ヌクレオチド配列と特異的に結合することができ、かつ該特異的な結合により該DNAグリコシラーゼが酵素活性を発揮し得るようになることを特徴とし、該DNAグリコシラーゼと直接的に結合する核酸配列認識モジュールの要素が、少なくとも1つのDNA切断能が失活したCasタンパク質である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記2つの部分的複合体が、別個の分子複合体として提供され、細胞内で両者が会合することによりリフォールディングされる、請求項12記載の方法。
- 前記DNAグリコシラーゼが、
(a) 酵母由来のUNG1の変異体において、野生型UNG1のN末端から258番目と259番目のアミノ酸に対応するアミノ酸の間、又は
(b) 酵母由来のUNG1以外のUNGの変異体において、(a)に対応するアミノ酸の間
で2つに分断されていることを特徴とする、請求項12又は13記載の方法。 - 二本鎖DNAと複合体との接触が、該二本鎖DNAを有する細胞への、該複合体をコードする核酸の導入により行われる、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
- 前記細胞が原核生物細胞又は真核生物細胞である、請求項15記載の方法。
- 前記細胞が微生物細胞、植物細胞又は昆虫細胞である、請求項15記載の方法。
- 前記細胞が動物細胞である、請求項15記載の方法。
- 前記動物細胞が脊椎動物細胞である、請求項18記載の方法。
- 前記脊椎動物細胞が哺乳類動物細胞である、請求項19記載の方法。
- 前記細胞が倍数体細胞であり、相同染色体上のすべての標的化された対立遺伝子内の部位を改変することを特徴とする、請求項15〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 二本鎖DNA中の標的ヌクレオチド配列と特異的に結合する核酸配列認識モジュールと、ひずみのない二重らせん構造のDNA(unrelaxed DNA)への反応性が十分に低いDNAグリコシラーゼとが結合した複合体であって、該核酸配列認識モジュールが、Casの少なくとも1つのDNA切断能が失活したCRISPR-Casシステムであり、該DNAグリコシラーゼが、シトシン-DNAグリコシラーゼ(CDG)活性又はチミン-DNAグリコシラーゼ(TDG)活性を有するUNGの変異体であり、標的化された部位において該二本鎖DNAの少なくとも一方の鎖を切断することなく、該標的化された部位の1以上のヌクレオチドを他の1以上のヌクレオチドに変換する又は欠失させる、あるいは該標的化された部位に1以上のヌクレオチドを挿入する、核酸改変酵素複合体。
- 前記DNAグリコシラーゼが、ワクシニアウイルス由来のUDGの変異体であって、野生型UDGのN末端から120番目のアミノ酸に対応するアスパラギンがアスパラギン酸に、及び/又は70番目のアミノ酸に対応するチロシンがアラニン若しくはグリシンに置換されている変異体である、請求項22記載の核酸改変酵素複合体。
- 前記DNAグリコシラーゼが、
(a) 酵母由来のUNG1の変異体であって、配列番号2で示される野生型UNG1のN末端から222番目のアミノ酸に対応するアスパラギンがアスパラギン酸に、及び/又は164番目のアミノ酸に対応するチロシンがアラニン若しくはグリシンに置換されており、かつ304番目のアミノ酸に対応するロイシンがアラニンに、又は308番目のアミノ酸に対応するアルギニンがグルタミン酸若しくはシステインに置換されている変異体、あるいは
(b) 酵母由来のUNG1以外のUNGの変異体であって、(a)に対応する変異を有する変異体
である、請求項22記載の核酸改変酵素複合体。 - 請求項22〜24のいずれか1項に記載の核酸改変酵素複合体をコードする核酸。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2014224745 | 2014-11-04 | ||
JP2014224745 | 2014-11-04 | ||
PCT/JP2015/080958 WO2016072399A1 (ja) | 2014-11-04 | 2015-11-02 | 脱塩基反応により標的化したdna配列に特異的に変異を導入する、ゲノム配列の改変方法、並びにそれに用いる分子複合体 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2016072399A1 JPWO2016072399A1 (ja) | 2017-04-27 |
JP6153180B2 true JP6153180B2 (ja) | 2017-06-28 |
Family
ID=55909124
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016516997A Active JP6153180B2 (ja) | 2014-11-04 | 2015-11-02 | 脱塩基反応により標的化したdna配列に特異的に変異を導入する、ゲノム配列の改変方法、並びにそれに用いる分子複合体 |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10920215B2 (ja) |
EP (2) | EP3216867B1 (ja) |
JP (1) | JP6153180B2 (ja) |
DK (1) | DK3216867T3 (ja) |
ES (1) | ES2800168T3 (ja) |
PL (1) | PL3216867T3 (ja) |
PT (1) | PT3216867T (ja) |
WO (1) | WO2016072399A1 (ja) |
Families Citing this family (44)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2012333134B2 (en) | 2011-07-22 | 2017-05-25 | John Paul Guilinger | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
US20150044192A1 (en) | 2013-08-09 | 2015-02-12 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a cas9 nuclease |
US9359599B2 (en) | 2013-08-22 | 2016-06-07 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof |
US9340800B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-05-17 | President And Fellows Of Harvard College | Extended DNA-sensing GRNAS |
US9737604B2 (en) | 2013-09-06 | 2017-08-22 | President And Fellows Of Harvard College | Use of cationic lipids to deliver CAS9 |
US9322037B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-04-26 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof |
US20150166982A1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for correcting pi3k point mutations |
EP3115457B1 (en) | 2014-03-05 | 2019-10-02 | National University Corporation Kobe University | Genomic sequence modification method for specifically converting nucleic acid bases of targeted dna sequence, and molecular complex for use in same |
US10077453B2 (en) | 2014-07-30 | 2018-09-18 | President And Fellows Of Harvard College | CAS9 proteins including ligand-dependent inteins |
DK3348638T3 (da) | 2015-09-09 | 2023-02-13 | Univ Kobe Nat Univ Corp | Fremgangsmåde til at konvertere genomsekvens fra gram-positiv bakterie ved specifikt at konvertere nukleinsyrebase i tilsigtet dna-sekvens, og molekylkompleks anvendt dertil |
AU2016342380B2 (en) | 2015-10-23 | 2022-04-07 | President And Fellows Of Harvard College | Nucleobase editors and uses thereof |
DK3382019T3 (da) | 2015-11-27 | 2022-05-30 | Univ Kobe Nat Univ Corp | Fremgangsmåde til omdannelse af enkimet plantegenomsekvens, hvori nukleinsyrebase i målrettet DNA-sekvens specifikt omdannes, og molekylært kompleks anvendt deri |
BR112018071376A2 (pt) * | 2016-04-21 | 2019-04-24 | National University Corporation Kobe University | método para modificar um sítio alvejado de um dna de cadeia dupla, complexo enzimático modificador de ácido nucleico, e, ácido nucleico |
AU2017306676B2 (en) | 2016-08-03 | 2024-02-22 | President And Fellows Of Harvard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
CN109804066A (zh) | 2016-08-09 | 2019-05-24 | 哈佛大学的校长及成员们 | 可编程cas9-重组酶融合蛋白及其用途 |
AU2017313917B2 (en) * | 2016-08-18 | 2023-12-21 | The Regents Of The University Of California | CRISPR-Cas genome engineering via a modular AAV delivery system |
US11542509B2 (en) | 2016-08-24 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
KR20240007715A (ko) | 2016-10-14 | 2024-01-16 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 핵염기 에디터의 aav 전달 |
US10745677B2 (en) | 2016-12-23 | 2020-08-18 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of CCR5 receptor gene to protect against HIV infection |
US11898179B2 (en) | 2017-03-09 | 2024-02-13 | President And Fellows Of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
WO2018165629A1 (en) * | 2017-03-10 | 2018-09-13 | President And Fellows Of Harvard College | Cytosine to guanine base editor |
SG11201908782XA (en) | 2017-03-22 | 2019-10-30 | Univ Kobe Nat Univ Corp | Method for converting nucleic acid sequence of cell specifically converting nucleic acid base of targeted dna using cell endogenous dna modifying enzyme, and molecular complex used therein |
SG11201908658TA (en) | 2017-03-23 | 2019-10-30 | Harvard College | Nucleobase editors comprising nucleic acid programmable dna binding proteins |
WO2018209320A1 (en) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation |
JP2020534795A (ja) | 2017-07-28 | 2020-12-03 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | ファージによって支援される連続的進化(pace)を用いて塩基編集因子を進化させるための方法および組成物 |
EP3676376A2 (en) | 2017-08-30 | 2020-07-08 | President and Fellows of Harvard College | High efficiency base editors comprising gam |
CA3082251A1 (en) | 2017-10-16 | 2019-04-25 | The Broad Institute, Inc. | Uses of adenosine base editors |
WO2019103020A1 (ja) | 2017-11-22 | 2019-05-31 | 国立大学法人神戸大学 | 安定で副作用の少ないゲノム編集用複合体及びそれをコードする核酸 |
US11802311B2 (en) * | 2018-03-15 | 2023-10-31 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods of quantifying RNA and DNA variants through sequencing employing phosphorothioates |
EP3660152A4 (en) * | 2018-03-26 | 2020-07-15 | National University Corporation Kobe University | METHOD FOR MODIFYING THE DESTINATION IN DOUBLE-STRANDED DNA IN A CELL |
CA3108281A1 (en) * | 2018-08-03 | 2020-02-06 | Beam Therapeutics Inc. | Multi-effector nucleobase editors and methods of using same to modify a nucleic acid target sequence |
WO2020041079A1 (en) * | 2018-08-21 | 2020-02-27 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Compositions and methods for modifying maturity in rice plants |
CN114729365A (zh) | 2019-03-19 | 2022-07-08 | 布罗德研究所股份有限公司 | 用于编辑核苷酸序列的方法和组合物 |
CA3138329A1 (en) | 2019-05-10 | 2020-11-19 | Basf Se | Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants |
WO2021046155A1 (en) | 2019-09-03 | 2021-03-11 | Voyager Therapeutics, Inc. | Vectorized editing of nucleic acids to correct overt mutations |
US20230203515A1 (en) | 2019-09-12 | 2023-06-29 | Basf Se | Regulatory Nucleic Acid Molecules for Enhancing Gene Expression in Plants |
WO2021069387A1 (en) | 2019-10-07 | 2021-04-15 | Basf Se | Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants |
CN114787365A (zh) | 2019-12-03 | 2022-07-22 | 巴斯夫欧洲公司 | 用于在植物中增强基因表达的调节性核酸分子 |
EP4118199A4 (en) * | 2020-03-11 | 2024-03-06 | North Carolina State University | COMPOSITIONS, METHODS AND SYSTEMS FOR GENOMEDITING TECHNOLOGY |
EP4146804A1 (en) | 2020-05-08 | 2023-03-15 | The Broad Institute Inc. | Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence |
WO2022158561A1 (ja) * | 2021-01-22 | 2022-07-28 | 国立大学法人東京大学 | 植物ゲノムの編集方法 |
JPWO2022181796A1 (ja) | 2021-02-26 | 2022-09-01 | ||
WO2024048599A1 (ja) * | 2022-08-31 | 2024-03-07 | 国立大学法人東京農工大学 | タンパク質-核酸複合体、これを用いた物質の検出キット及び検出方法 |
WO2024083579A1 (en) | 2022-10-20 | 2024-04-25 | Basf Se | Regulatory nucleic acid molecules for enhancing gene expression in plants |
Family Cites Families (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9600384D0 (en) * | 1996-01-09 | 1996-03-13 | Nyfotek As | Dna glycosylases |
US6117680A (en) * | 1997-08-26 | 2000-09-12 | Ariad Gene Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for regulation of transcription |
AU2003251286B2 (en) | 2002-01-23 | 2007-08-16 | The University Of Utah Research Foundation | Targeted chromosomal mutagenesis using zinc finger nucleases |
AU2008223544B2 (en) | 2007-03-02 | 2014-06-05 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Cultures with improved phage resistance |
CN106834320B (zh) | 2009-12-10 | 2021-05-25 | 明尼苏达大学董事会 | Tal效应子介导的dna修饰 |
JP2013128413A (ja) | 2010-03-11 | 2013-07-04 | Kyushu Univ | Pprモチーフを利用したrna結合性蛋白質の改変方法 |
US9267117B2 (en) * | 2012-03-15 | 2016-02-23 | New England Biolabs, Inc. | Mapping cytosine modifications |
WO2014127287A1 (en) * | 2013-02-14 | 2014-08-21 | Massachusetts Institute Of Technology | Method for in vivo tergated mutagenesis |
EP3679785A3 (en) * | 2013-04-05 | 2020-09-16 | Dow AgroSciences LLC | Methods and compositions for integration of an exogenous sequence within the genome of plants |
JP2014224745A (ja) | 2013-05-16 | 2014-12-04 | 株式会社ミツトヨ | 原点信号発生装置及び原点信号発生システム |
US20150037790A1 (en) * | 2013-07-05 | 2015-02-05 | The University Of Southampton | Cytosine variant detection |
US20150166982A1 (en) * | 2013-12-12 | 2015-06-18 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for correcting pi3k point mutations |
EP3115457B1 (en) * | 2014-03-05 | 2019-10-02 | National University Corporation Kobe University | Genomic sequence modification method for specifically converting nucleic acid bases of targeted dna sequence, and molecular complex for use in same |
-
2015
- 2015-11-02 JP JP2016516997A patent/JP6153180B2/ja active Active
- 2015-11-02 PL PL15857325T patent/PL3216867T3/pl unknown
- 2015-11-02 DK DK15857325.3T patent/DK3216867T3/da active
- 2015-11-02 US US15/523,939 patent/US10920215B2/en active Active
- 2015-11-02 EP EP15857325.3A patent/EP3216867B1/en active Active
- 2015-11-02 ES ES15857325T patent/ES2800168T3/es active Active
- 2015-11-02 PT PT158573253T patent/PT3216867T/pt unknown
- 2015-11-02 EP EP20168727.4A patent/EP3739047A1/en active Pending
- 2015-11-02 WO PCT/JP2015/080958 patent/WO2016072399A1/ja active Application Filing
-
2021
- 2021-02-12 US US17/175,245 patent/US20210171935A1/en active Pending
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
DK3216867T3 (da) | 2020-06-22 |
US20210171935A1 (en) | 2021-06-10 |
US10920215B2 (en) | 2021-02-16 |
WO2016072399A1 (ja) | 2016-05-12 |
PT3216867T (pt) | 2020-07-16 |
EP3216867A1 (en) | 2017-09-13 |
ES2800168T3 (es) | 2020-12-28 |
EP3216867A4 (en) | 2018-04-04 |
EP3216867B1 (en) | 2020-04-15 |
PL3216867T3 (pl) | 2020-11-02 |
JPWO2016072399A1 (ja) | 2017-04-27 |
EP3739047A1 (en) | 2020-11-18 |
US20170321210A1 (en) | 2017-11-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6153180B2 (ja) | 脱塩基反応により標的化したdna配列に特異的に変異を導入する、ゲノム配列の改変方法、並びにそれに用いる分子複合体 | |
JP6462069B2 (ja) | 標的化したdna配列の核酸塩基を特異的に変換するゲノム配列の改変方法及びそれに用いる分子複合体 | |
JP6780860B2 (ja) | 標的化したdna配列の核酸塩基を特異的に変換するゲノム配列の改変方法及びそれに用いる分子複合体 | |
KR102116200B1 (ko) | 게놈 서열 변형 기법의 돌연변이 도입 효율을 증가시키는 방법 및 이에 사용되는 분자 복합체 | |
JP2023063448A (ja) | 細胞の有する二本鎖dnaの標的部位を改変する方法 | |
JP7133856B2 (ja) | 細胞内在性のdna修飾酵素を利用して標的化したdnaの核酸塩基を特異的に変換する、細胞の核酸配列の変換方法、及びそれに用いる分子複合体 | |
WO2022050413A1 (ja) | 小型化シチジンデアミナーゼを含む二本鎖dnaの改変用複合体 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20160927 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20161129 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20170113 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170316 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20170509 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20170524 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6153180 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R3D04 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R3D02 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R3D04 |