FI120741B - DNA:n vahvistaminen - Google Patents

Description

:¾

DNA:n vahvistaminen - Förstärkning av DNA

Esillä oleva keksintö kohdistuu menetelmään 5 prokaryoottisen bakteerisolun genomissa olevan DNA- sekvenssin vahvistamiseksi in vivo, menetelmässä käytettävään DNA-rakenteeseen, ja vektoriin, jossa on menetelmässä käytettävä DNA-rakenne.

10 Lukuisten luontaisesti esiintyvien organismien on havaittu tuottavan käyttökelpoisia tuotteita, joiden tuottaminen suuressa mittakaavassa on toivottua tutkimuksellisiin ja kaupallisiin tarkoituksiin. Kun tällainen tuote on identifioitu, on ponnisteltu 15 sellaisten tuotantomenetelmien kehittämiseksi, jotka johtavat tuotteen suureen tuotantoon. Eräs laajalti käytetty menetelmä, joka perustuu yhdistelmä-DNA-tekniikkoihin, on kloonata geeni, joka koodaa tuotetta, liittämällä geeni sopivaan ilmennysjärjestelmään, joka 20 sallii tuotteen ilmentymisen, ja ilmennysjärjestelmän käsittävän sopivan isäntäsolun viljelemisen joko kromosomiin integroituna tai kromosomin ulkopuolisena kokonaisuutena olosuhteissa, jotka johtavat tuotteen ilmentymiseen. Kuitenkin tällaisen menetelmän käyt-25 tamisen ehtona on se, että kyseinen geeni voidaan identifioida ja kloonata, ja se, että tuotantoon sopiva ilmennysjärjestelmä ja isäntäsolu ovat saatavissa.

f · · • · · •

Toinen lähestymistapa, jota voidaan käyttää tällaisten ,···. 30 tuotteiden tuotantoon, on viljellä solua, joka tuottaa • · .1*1 luonnossa tuotteen, tai tällaisen solun johdannaista • · · ! ·' sopivissa olosuhteissa. Tällaisen menetelmän usein ha- • · •J ϊ väittävänä haittana on kuitenkin se, että solu ei ole .*j*. sopiva tuotanto-organismi erään syyn ollessa se, että 35 tällaisen solun tuottaman tuotteen määrä on liian pieni ollakseen kaupallisesti houkuttava.

I · I • · ·

Huolimatta siitä mitä tuotantomenetelmää käytetään, on ··· ^ tavallisesti toivottavaa kyetä nostamaan kyseisen prote- *.* * 40 iinin tuotantotasoa. Näin ollen tuotantoa on pyritty : **: lisäämään esimerkiksi liittämällä tuotetta koodaava • •f .* , geeni voimakkaan ilmennyssignaalin ohjauksen alaisena • · · • · · • · «·· • · • · • · · 2 tai lisäämällä geenin kopioiden lukumäärää kyseisen organismin tuotannossa. Tämä viimeksi mainittu lähestymistapa voidaan suorittaa liittämällä geeni monikopioiseen plasmidiin, jolla on yleensä kuitenkin 5 taipumus olla epävakaa isäntäsolussa, tai itegroimalla geenin moninkertaisia kopioita tuotanto-organismin kromosomiin, joka on lähestymistapa, jota pidetään yleensä houkuttelevampana, koska rakenteen stabiiliudella on taipumus olla suurempi, mikä sallii 10 geenin pitämisen vakaana tuotanto-organismissa.

EP-0 282 126:ssa ja EP-166 628:ssa selostetaan menetelmiä geenin yhden tai useamman kopion integroimiseksi prokaryoottisolun kromosomiin, jossa 15 solussa on jo vähintään kyseisen geenin yksi kopio kromosomissa. EP-0 284 126:n mukaisesti mainitun geenin sisältävä isäntäsolu transformoidaan DNA-rakenteella, joka käsittää geenin toisen kopion, jolloin sopivan valintamenetelmän jälkeen saadaan solu, jonka kromosomi 20 sisältää geenin kaksi kopiota, joita erottaa endo- geeninen kromosomisekvenssi, joka on isäntäsolulle elintärkeä ja varmistaa siten integroidun geenin vakaan ylläpitämisen. Tämä menettely voidaan toistaa solujen valmistamiseksi, joissa on geenin moninkertaisia 25 kopioita kromosomissaan.

5 ft V (j EP-166 628 kohdistuu menetelmään spesifisen geenin vah--- vistamiseksi Bacillus-kannan kromosomissa saaden siten aikaan solu, jossa on niin kutsuttu "vahvistettavissa 30 oleva yksikkö", joka käsittää geenin, geenin J ; ilmennyselementit ja valikointimarkkeria koodaavan T: geenin liitettynä "kahdentuneiksi sekvensseiksi" nimitettyjen kahden suoraan toistuvan sekvenssin väliin. Geeni viedään soluun plasmidi-integrointivektorilla, 35 joka on integroitu Bacillus-kromosomiin ja jossa on markkerigeeni, vahvistettava geeni ja toinen kahdentuneista sekvensseistä toisen ollessa Bacillus-solun kromosomissa.

40 Kumpikin edellä kuvattu menetelmä edellyttää sitä, että kokonainen vahvistettava geeni voidaan liittää vahvennusmenetelmässä käytettävään vektoriin ja siten niitä voidaan käyttää vain silloin, kun vahvistettava 3 geeni on eristetty ja menetelmässä käytettävään vektoriin soveltuva.

Esillä oleva keksintö kohdistuu yleisesti uuteen 5 menetelmään prokaryoottisen bakteerisolun genomissa olevan DNA-sekvenssin vahvistamiseksi, jonka etuna on verrattaessa edellä kuvattuihin menetelmiin se, ettei vahvistettavan DNA-sekvenssin tarvitse olla saatavissa kokonaisuudessaan.

10

Erityisemmin esillä oleva keksintö kohdistuu ensimmäisessä kohteessaan menetelmään prokaryoottisen bakteeriemosolun genomissa olevan DNA-sekvenssin B vahvistamiseksi in vivo, joka menetelmä käsittää: 15 a) että mainitun solun genomiin integroidaan DNA- rakenne, joka käsittää rakenteen C-M-A-D, jossa A tarkoittaa DNA-sekvenssiä, joka on homologinen genomi-sen DNA-fragmentin kanssa, joka joko sivuaa vahvistettavaa DNA-sekvenssiä B tai limittyy sen kanssa tai on DNA-20 sekvenssin B alasekvenssi, joka muodostaa mainitun sekvenssin B toisen pään, C tarkoittaa DNA-sekvenssiä, joka on homologinen genomi-sen DNA-fragmentin kanssa, joka joko sivuaa vahvistettavaa DNA-sekvenssiä B tai limittyy sen kanssa tai on DNA-25 sekvenssin B alasekvenssi, joka muodostaa mainitun sek- »T; venssin B toisen pään, sekvenssin C sijaitessa »h sekvenssin B vastakkaisessa päässä verrattuna A:han, D tarkoittaa DNA-sekvenssiä, joka on homologinen genomi-.y sen DNA-fragmentin kanssa, joka sijaitsee distaalisesti > 30 C:n suhteen verrattuna B:hen, i y : M tarkoittaa valikointimarkkeria koodaavaa DNA-sekvens- ;'T; siä, b) että valitaan soluja, joissa DNA-sekvenssi M on integroituna genomiin joko ylävirtaan tai alavirtaan DNA- ’ 35 sekvenssistä B yhdessä sekvenssin A kanssa, jotka solut käsittävät rakenteen A-B-C-M-A-D missä tahansa orientaatiossa, ja c) että vaiheessa b) valittuja soluja lisäännytetään ·' nousevassa DNA-sekvenssin M koodaamaan valikointimarkke- y. 40 rin valikointipaineessa saaden siten solu, jossa on DNA-sekvenssien B ja M genomisesti integroituneiden kopioiden luku lisääntynyt verrattuna emosoluun.

<3

Rakenteen C-M-A-D käsittävän DNA-rakenteen integroiminen emosolun genomiin saa aikaan genomisen rakenteen, jossa DNA-sekvenssi B sijaitsee yhdessä sopivan valikoitavan markkerin kanssa kahden suoraan toistuneen DNA-5 sekvenssin välissä, joista toinen on peräisin kyseisestä genomista ja toinen on peräisin DNA-rakenteesta. Kun tällaisen rakenteen käsittävä kanta lisäännytetaän markkerin nousevassa valikointipaineessa, viljelmässä rikastuvat solut, jotka sisältävät geenien 10 duplikaatioita, triplikaatioita ja suurempia vahven- noksia kahden suoraan toistuneen sekvenssin välissä. Täten tarkoitetaan, että mielenkiinnon kohteena olevan DNA-sekvenssin kopioiden lukumäärä voi käsittää 20, 50, 100 tai enemmän ylärajan ollessa kopioiden lukumäärä, 15 joka tulee liian raskaaksi taakaksi solulle. Käyttämällä keksinnön mukaista menetelmää on havaittu, että vahvennettu DNA on täysin vakaa markkerin M valinnan puuttuessa.

20 On ymmärrettävä, että keksinnön mukaisesta vahvennusmenetelmästä ort tärkeää etua verrattuna tekniikan tason mukaisiin menetelmiin siinä, että suoritettavaan menetelmään ei tarvitse olla saatavissa kokonaista vahvistettavaa DNA-sekvenssiä. Tarvitsee 25 tietää vain DNA-sekvenssin osa tai sitä sivuavat alueet, kh; Tästä on etua siinä, että vaikka DNA:n eristys- ja sekvennointimenetelmät ovat parantuneet oleellisesti viime vuosikymmenen aikana, mielenkiinnon kohteena V-: olevan DNA-sekvenssin eristäminen ja sekvennointi on yhä j V 30 vaivalloista ja tosiasiassa se ei ole aina mahdollista.

% > i

St '4 \ Tässä yhteydessä termin "genomi" on tarkoitettu tarkoittavan normaalisti emosolun kromosomia. Kuitenkin termin ,, on myös tarkoitettu tarkoittavan mitä tahansa muuta emo- > > * ' 35 solussa olevaa genomia, josta esimerkki on plasmidi, v,esimerkiksi solussa oleva suuri vakaa plasmidi.

Termin "homologinen", kun sitä käytetään DNA- ’ sekvensseistä A, C ja D, on aiottu tarkoittavan minkä V; 40 tahansa näistä sekvensseistä ja genomin vastaavien osien välistä identtisyystasoa, joka riittää homologisen rekombinaation tapahtumiseen. DNA-sekvenssit ovat edullisesti identtisiä tai oleellisesti identtisiä 5 vähintään 8 peräkkäisen emäsparin osalta genomin vastaavien osien kanssa. Kuitenkin DNA-sekvenssit voivat olla pidempiä, esim. käsittää jopa useita tuhansia nukleotideja.

5

Termin "sivuava" on tarkoitettu tarkoittavan sitä, että DNA-sekvenssi A tai C on homologinen genomisen sekvenssin kanssa, joka sijaitsee DNA-sekvenssiin B saakka, mutta ei ulotu siihen. Termin "limittyvä" on 10 aiottu tarkoittavan sitä, että DNA-sekvenssi A tai C on homologinen genomisen osan sekvenssin osan kanssa, joka muodostuu DNA-sekvenssin B toisesta päästä ja välittömästi tämän sekvenssin ulkopuolella olevasta sekvenssistä.

15

Termi "distaalisesti C:hen nähden sijaitseva", kun sitä käytetään sekvenssistä D, on aiottu ymmärrettäväksi konventionaalisessa merkityksessään, so. että DNA-sekvenssi D on homologinen genomisen sekvenssin kanssa, joka si-20 jaitsee genomisen sekvenssin sivulla, joka on homologinen DNA-sekvenssin C kanssa, joka on vastapäätä vahvistettavan DNA-sekvenssin sijaintia. DNA-sekvenssien C ja D kanssa homologisten genomisten sekvenssien välinen etäisyys voi vaihdella tilanteesta, jossa C ja D 25 ovat identtiset tai osittain limittyvät, useiden ;: tuhansien emäspärien eroon. Kuitenkin C:n ja D:n väliset f'* DNA-sekvenssit deletoituvat lopulta genomista, kun keksinnön mukaista menetelmää suoritetaan.

’ * 30 Esitetään myös solu, joka sisältää moninkertaisia

; kopioita DNA-sekvenssistä, jossa on rakenne M-B

i T"’; genomissaan, jossa M tarkoittaa valikointimarkkeria koodaavaa DNA-sekvenssiä ja B tarkoittaa haluttua polypeptidiä koodaavaa DNA-sekvenssiä, rakenteen M-B ’ 35 moninkertaisten kopioiden sijaitessa kahden suoraan toistuneen sekvenssin välissä.

Lisäkohteissaan keksintö kohdistuu DNA-rakenteeseen, joka käsittää rakenteen C-M-A-D ja joka on tarkoitettu 40 käytettäväksi genomisen DNA-sekvenssin B

vahvistamisessa, jolloin A:n, C:n, M:n, D:n merkitys on edellä osoitettu, sekä vektoriin, jossa on DNA-rakenne.

6

Esitetään myös menetelmä DNA-sekvenssin B koodaaman polypeptidin valmistamiseksi, joka käsittää edellä määritetyn solun, jossa on DNA-sekvenssin B moninkertaisia kopioita integroituna, viljelemisen olosuhteissa, 5 jotka johtavat polypeptidin tuotantoon, ja saadun polypeptidin talteenottamisen viljelmästä.

Keksinnön mukainen integrointivaihe a) voidaan suorittaa millä tahansa sopivalla menetelmällä, jonka luonne riip-10 puu kyseisestä organismista ja DNA-rakenteesta. Ensiksikin DNA-rakenne on vietävä soluun. DNA-rakenne voidaan viedä sisään sellaisenaan käyttämällä alalla tunnettuja tekniikoita, jotka on tarkoitettu DNA:n suoraan sisällyttämisen, esim. käyttämällä elektroporaatiota, 15 kompetenttien solujen transformointia, protoplastitransformointia tai ballistista transformointia, mutta se suoritetaan sopivasti vektorissa, joka kykenee saamaan aikaan DNA-rakenteen integraation solun genomiin.

20

Vektori on edullisesti plasmidi tai bakteriofagi, joka voidaan viedä emosoluun millä tahansa tekniikalla, joka sopii kyseiselle vektorille ja emosolulle, mukaan lukien edellä mainittu transformointi, protoplastifuusio, 25 transfektio, transduktio ja konjugointi.

; 3 s >’> Emosoluun viemisen jälkeen DNA-rakenne integroidaan op- . » tionaalisesti yhdessä vektorista johdetun DNAn kanssa h; genomiin homologisella rekombinaatiolla, joka tapahtuu - ’ 30 homologisten sekvenssien välissä. Oheisessa kuviossa 1 > esitetään, kuinka genomin ja DNA-rakenteen välinen kak- : soisrekombinaatiotapahtuma synnyttää keksinnön mukaisen solun, joka sisältää rakenteen A-B-C-M-A-D genomissaan.

35 Kun DNA-rakenteen integrointiin käytetään vektoria, , solujen, jotka ovat vastaanottaneet vektorin, valinta voidaan suorittaa ennen keksinnön mukaisen menetelmän valikointivaihetta b) parantaen siten tehoa, jolla DNA-rakenteen integroituminen tapahtuu. Tähän tarkoitukseen 40 voidaan käyttää vektoria, joka kykenee replikoituinaan ,,,tietyissä (ehdollisissa) olosuhteissa ja joka on kykenemätön replikoituinaan toisissa (ei~ehdollisissa) olosuhteissa. Vektori voi olla esimerkiksi sellainen, 7 joka on lämpötilalle herkkä replikaatiossa. Täten vektori voi olla sellainen, joka ei kykene replikoituinaan nostetuissa lämpötiloissa, jotka sallivat yhä emosolun kasvun. Aluksi soluja viljellään 5 lämpötilassa, joka sallii plasmidin repiikoitumisen ja sen jälkeen voi tapahtua bakteerigenomiin integroituminen viljeltynä lämpötilassa, joka ei salli plasmidin replikoitumista siten, että vektori katoaa soluista, jollei integroidu genomiin.

10

Vektori voi sisältää valikoitavan markkerin. Tässä tapauksessa viljeleminen ei-ehdollisessa lämpötilassa voidaan suorittaa valikoivissa olosuhteissa sen varmistamiseksi, että pelkästään solut, jotka sisältävät 15 pelkästään integroituneen vektorin, joka sisältää DNA-rakenteen ja valikoitavan markkerin, säilyvät hengissä.

Valikoitava markkeri voi olla mikä tahansa alalla tunnettu markkeri, esimerkiksi tuotetta koodaava geeni, 20 joka antaa solulle antibioottiresistenssin, joka antaa prototrofian auksotrofiselle kannalle, tai joka täydentää isännän puutetta (esim. dal-kantaan viedyt dal-geenit, katso B. Diderichsen (1986)). Näissä olosuhteissa elävät solut ovat soluja, jotka sisältävät 25 vektorin, tai soluja, joihin keksinnön mukaisen DNA- ; Γ; rakenteen sisältävä vektori on integroitu. Valikoitava :% markkeri voidaan esim. leikata tunnetusta lähteestä tai se voi olla läsnä vektorissa, esim. plasmidi, jota käy-tetään esillä olevan keksinnön mukaisessa menetelmässä i 30 käytetyn DNA-rakenteen konstruointiin.

» j i } j il: Esillä olevan keksinnön mukaisen menetelmän valikointi- vaiheessa b) tehdään rakenteen A-B-C-M-A-D missä tahansa orientaatiossa sisältävien solujen valikointi. Tällaiset >’ 35 solut voivat olla yksittäisen rekombinointitapahtuman , tulostammissa tapauksessa vektori on yhä läsnä genomis- sa, tai ne voivat olla edullisesti tulosta kaksoisrekom-binointitapahtumasta, missä tapauksessa vektori ei ole läsnä genomissa. Kaksoisrekombinaatiotapahtuma voi olla 40 tulosta kahdesta peräkkäisestä rekombinaatiotapahtumasta, joista ensimmäinen koostuu integroimisesta rakenteen C-M-A-D sisältävän vektorin genomiin, toinen koostuu vektorin leikkaamisesta ge- 8 nomista. Menetelmää valaistaan kaaviomaisesti kuviossa 2, josta ilmenee, että integroiminen fragmentin C kautta, mitä seuraa leikkaaminen fragmentin D kautta, tai päinvastoin, tuottaa keksinnön mukaisen rakenteen A-5 B-C-M-A-D sisältävän genomin.

Tämä valikointi voidaan suorittaa kasvattamalla soluja DNA-sekvenssin M koodaamaan valikointimarkkerin valikointipaineessa ja analysoimalla siten soluista 10 rakenteen A-B-C-M-A-D läsnäolo esim. käyttämällä konventionaalisia . DNA-analyysitekniikoita mukaan lukien restriktioentsyymihajotus ja geelianalyysi yhdistettynä

Southern-blottaukseen tai käyttämällä PCR:ää käyttäen sopivia aloittajia, jotka vastaavat rakenteen A-B-C-M-A- 15 D karakteristisia osia.

Eräässä keksinnön erityisessä suoritusmuodossa käytetään lämpötilaherkkää vektoria, jossa on rakenteen C-M-A-D lisäksi toinen valikoitava markkeri Y. Vektori viedään 20 emosoluun ehdollisessa lämpötilassa valikoiden joko M

tai Y tai molemmat. Lisäännyttäminen suoritetaan sitten ei-ehdollisessa lämpötilassa ja M: n tai Y:n tai kummankin valikointia pidetään yllä. Näissä olosuhteissa viljellyissä soluissa on vektori integroituneena

25 genomiin (jommallakummalla kolmella fragmentilla C, A

;T; tai D). Lisäksi soluja viljellään ehdollisessa lämpötilassa valikointipaineen puuttuessa. Tämä sallii 'w, plasmidin replikoitumisen, integroituneen plasmidin leikkaamisen genomista (jälleen millä tahansa kolmesta I 3 J r 30 fragmentista C, A tai D) ja lopuksi plasmidin katoamisen i soluista. Nyt valitaan solut, jotka sisältävät .> valikointimarkkerin M ja tällaisista soluista seulotaan valikointimarkkerin Y läsnäolo esim.

replikapäällystämällä. Tällaiset solut voivat syntyä 35 pelkästään integroitumalla fragmentin C kautta, mitä seuraa leikkautuminen fragmentin D kautta, tai päinvas-; toin, ja ne sisältävät rakenteen A-B-C-M-A-D genomissa.

' ^ DNA-rakenteessa oleva DNA-sekvenssi M, joka integroidaan 40 esillä olevalla menetelmällä, voi koodata mitä tahansa valikoitavaa markkeria, esim. minkä tahansa tyyppistä, joka on kuvattu edellä keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetyssä vektorissa optionaalisesti olevan markkerin 9 yhteydessä. Täten DNA-sekvenssi M voi koodata antibioottiresistenssiä, kuten kanamysiini-, tetrasykliini-, am-pisilliini-, erytromysiini-, kloramfenikoliresistenssiä tai resistenssiä erilaisiin raskaisiin metalleihin, 5 kuten selenaatti, antimoni tai arsenaatti.

On ymmärrettävä, että keksinnön mukaisen menetelmän li-säännyttämisvaiheessa c) saatujen DNA-sekvenssien genomisesti integroitujen kopioiden lisääntynyt 10 lukumäärä on tulosta alunperin DNA-sekvenssejä B ja M

ympäröivän DNA-sekvenssin A kahden kopion (suoraan toistuneet) välisistä peräkkäisistä rekombinaatiotapahtumista. DNA-sekvenssin vahventumisen säätäminen voi olla mahdollista ja siten ennalta 15 määrätyn kopiolukumäärän saavuttaminen käytetyn valikoitavan markkerin ja lisäännyttämisvaiheessa c) käytetyn valikointipaineen voiman suhteen. Tässä vaiheessa saatavien DNA-sekvenssien B ja M kopioiden lukumäärälle ei ole mitään teoreettista ylärajaa mutta 20 käytännössä kopioiden lukumäärää rajoittaa isäntäsolulle pantu kuormitus.

On huomattava, että kun DNA-rakenne on konstruoitu emo- solun genomiin, sitä voidaan viljellä ilman valikointi- 5ij 25 painetta ilman, että solusta katoaa oleellisesti DNA- -ϊ > > rakennetta tai sen osia. Tämän uskotaan olevan seurausta > 3 l ’>.> siitä tosiasiasta, että integroitunut DNA-kykenee repli- koitumaan itsenäisesti ja se replikoituu yhdessä isäntä-rv. genomin kanssa, johon se on integroitunut.

; : 30 ^1“ On ymmärrettävä, että keksinnön mukainen uusi menetelmä V ’ soveltuu yleisesti genomissa olevan DNA-sekvenssin vah- ventamiseen solun tai genomin tyypistä riippumatta.

. ’": Ainoa solun luonteen rajoitus on se, että solu on 35 sellainen, joka voidaan transformoida tai joka sallii muutoin vieraan DNA:n sisällyttämisen. Solu voi sisältää | yhden tai useampia genomeja, esim. plasmidien tai “ : kromosomien muodossa.

40 Emosolu voi olla esimerkiksi mikrobisolu, hyönteissolu, ·' kasvisolu, selkärankaissolu tai nisäkässolu. Kun emosolu on mikrobisolu, se voi. olla prokaryoottinen tai eukary- 10 oottinen solu, kuten bakteeri- tai sieni- (mukaan lukien hiiva-) solu.

Kun solu on bakteerisolu, se voi olla solu, joka on 5 gram-positiivisesta bakteerista, kuten Bacillus,

Streptomyces ja Pseudomonas, esim. Bacillus subtilis-, Bacillus licheniformis-, Bacillus lentus-, Bacillus brevis-, Bacillus stearothermophilus-, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens-, Bacillus 10 coagulans-, Bacillus circulans-, Bacillus lautus-,

Bacillus thuriengiesis-, Streptomyce lividans- tai Streptomyces murinus -solu, tai gram-negatiivisen bakteerin, kuten Esherichia ja Pseudomonas, solu. Muut esimerkit bakteerisoluista käsittävät arkkibakteerien, 15 kuten Pyrococcus, solut.

Kun solu on sienisolu, se voi olla hiivasolu, kuten Sac-charomyces- tai Schizosaccharomyces-solu, tai rih-masienisolu, kuten Aspergillus-, esim. A. niger-, A. 20 nidulans- tai A. oryzae -solu.

Vahvistettava DNA-sekvenssi B voi olla luontainen emo-solulle tai se voi olla vaihtoehtoisesti sellainen, joka ei ole emolle luontainen vaan on kloonattu toisesta or-25 ganismista (esim. edellä kuvatun tyyppinene) tai joka on T;; syntetoitu ja viety sen jälkeen isäntäkromosomiin tai % toiseen isännän kantamaan genomiin millä tahansa sopivalla menetelmällä, esim. risteyttämällä, ennen keksinnön mukaiseen DNA-rakenteeseen integroimista. DNA-30 sekvenssi voidaan sisällyttää kokonaisuudessaan tai se ;; voidaan kokoonpanna kyseiseen isäntägenomiin esim.

h’, sisällyttämällä peräkkäin sekvenssin B osasekvenssit.

Tämä viimeksi mainittu lähestymistapa on erityisen käyttökelpoinen, kun DNA-sekvenssiä B ei voida kloonata 35 kokonaisuudessaan.

DNA-sekvenssi voi olla sellainen, jossa on jotain funktiota tai se koodaa jotain funktiota. DNA-sekvenssi B voi käsittää esimerkiksi avoimen lukujärjestyksen, esim. 40 joka koodaa rakenteellista tai säätävää proteiinia tai polypeptidiä, ja se voi olla yksittäinen geeni, geenien ryhmä tai operoni. DNA-sekvenssi B voi käsittää lisäksi yhden tai useamman säätösignaalin, joka osallistuu n ilmentymiseen avoimesta lukujärjestyksestä, kuten transkription tai translaation lopetus- tai aloitussekvenssit.

5 DNA-sekvenssi B käsittää edullisesti ilmennettävissä olevan geenin, joka voi sisältää kaikki tarpeelliset säätösekvenssit, kuten promoottorin, terminaattorin, ribosominsitoutumiskohdan jne.

10 Tavallisesti vahvennettava DNA-sekvenssi on sellainen, joka koodaa toivottua tuotetta, kuten entsyymiä, hormonia, antigeenistä komponenttia, immunoaktiivista proteiinia tai peptidiä, kasvutekijää, allergeeniä, kasvaimeen liittyvää antigeeniä, veren proteiinia ja 15 niiden kaltaisia, toisin sanoen mitä tahansa teollisesti käyttökelpoista tuotetta, jota halutaan valmistaa.

Esimerkit mielenkiinnon kohteena olevista entsyymeistä käsittävät emylolyyttiset, lipolyyttiset ja 20 proteolyyttiset entsyymit, transferaasit, isomeraasit, peroksidaasit, oksidaasit jne. Erityisesti on edullista, että DNA-sekvenssi B koodaa proteaasia, lipaasia, amylaasia, galaktosidaasia, pullulanaasia, sellulaasia, glukoosi-isomeraasia, proteiinidisulfidi-isomeraasia, 25 CGT'aasia (syklodekstriiniglukonotransferaasia), glukoosioksidaasia, glukosyylitransferaasia tai ksylanaasia.

. Esimerkit muista käyttökelpoisista tuotteista käsittävät ! ! 30 insuliinin kaltaiset kasvutekijät, insuliinin, ihmisen ;'· · tai naudan kasvuhormonin, ihmisverenhyydyttämistekijät, v ' interleukiinin, tPA:n jne.

Vaihtoehtoisesti DNA-sekvenssi B voi käsittää yhden tai 35 useamman geenin, joka koodaa biosynteettistä reittiä, yhden tai useamman geenin, joka koodaa solujen transkriptio-, translaatio- tai prote- iinierityslaitteistoa (esim. prokaryoottisten solujen sigmatekijät tai sec-geenit), solussa vaikuttavaa 40 säätötekijää tai metalliresistenssiä, tai DNA-sekvenssi 1 · B voi täydentää emosolun auksotrooppista mutaatiota.

12

Edellä olevasta selostuksesta on huomattava, että DNA-sekvenssit A ja C voivat olla homologisia minkä tahansa DNA-sekvenssin B kanssa limittyvän tai sitä sivuavan genomisen sekvenssin kanssa. Kun DNA-sekvenssi B on gee-5 ni, DNA-sekvenssi A tai C voi olla edullisesti homologinen DNA-sekvenssin B koodaavasta osasta ylävirtaan sijaitsevan kokonaisen tai osittaisen promoottorisekvenssin kanssa. Tällaisen rakenteen esimerkki on esitetty taulukossa 1.

10

Keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetty DNA-rakenne voidaan syntetoida lukuisilla geneettisillä manipulaatioilla, joissa käytetään alalla tunnettuja menetelmiä ja entsyymeitä. Tyypillisesti jokainen genominen sekvenssi, 15 jonka kanssa DNA-sekvenssien A, C ja D on oltava homologisia, identifioidaan konventionaalisilla DNA-ana-lyysimenetelmillä.

Esimerkiksi cDNA- tai genominen kirjasto voidaan valmis- 20 taa kyseisestä organismista ja siihen vahvistettava DNA-sekvenssi B identifoida. Kun vähintään osa DNA-sekvenssistä B tunnetaan, DNA-sekvenssi voidaan identifioida seulomalla positiiviset kloonit konventionaalisilla hydridointimenetelmillä esim.

25 käyttämällä oligonukleotidikoettimia, jotka on " syntetoitu osalle DNA-sekvenssiä B standarditekniikoiden i : mukaisesti (katso Sambrook et ai., 1989) tai ' erityisemmin käyttämällä polymeraasiketjureaktiota (PCR) ’V; käyttäen rappeutuneita oligonukleotidikoettimia, jotka ’ - 30 on valmistettu perustuen DNA-sekvenssin B tunnettuun y, osaan. Esimerkiksi PCR voidaan suorittaa käyttämällä US- patentissa nro 4 683 202 tai R.K. Saikin et ai. (1988) kuvaamia tekniikoita.

35 Kun DNA-sekvenssin B nukleotidisekvenssi on tuntematon ja sen ilmentymiä tuote tunnetaan, voidaan cDNA- tai : genomisista klooneista seuloa tuotteen aktiivisuus ja identifioida siten klooni, josta aktiivisuus ilmentyy, Seuraavaksi kloonin DNA:n osa eristetään ja .· 40 sekvennoidaan ja DNA-sekvenssin B tai sen osan sijainti identifioidaan.

13

Vahvistettava DNA-sekvenssi B voidaan identifioida mutaation keinoin, esim. transposonin insertioilla, jotka tuhoavat solun kyvyn tuottaa B:n tuotetta ja DNA-sekvenssin B osat voidaan määrittää esim. käänteis-5 PCR:llä käyttämällä aloittajia, jotka vastaavat transposonisekvenssejä. Tällä tavalla voidaan määrittää DNA-sekvenssit, jotka käsittävät B:n päät ja sivuavat alueet, jopa silloin, kun B ei ole kloonattavissa osittain tai kokonaisuudessaan.

10

Jotta DNA-sekvenssit A, C ja D voidaan valmistaa, on tunnettava vähintään B:n 5'- ja 3'-päät (mukaan lukien vähintään riittävät sekvenssitiedot koettimen tai PCR- aloittajan spesifisen sitoutumisen mahdollistamiseksi, 15 esim. 12 nukleotidiä). Kun näiden päiden sekvenssit on identifioitu, DNA-sekvenssin kumpaakin päätä sivuava tai niiden kanssa limittyvä DNA voidaan identifioida esim. hydridisaatiolla tai PCR-analyysillä ja sekvennoida sen jälkeen. Näihin sekvensseihin perustuen valmistetaan 20 DNA-sekvenssit A, C ja D.

DNA A, C, D ja M voidaan valmistaa synteettisesti tai ne voivat olla cDNA- tai genomista alkuperää, esim. genomi-sesta tai cDNA-kirjastosta edellä kuvattuja menetelmiä 25 käyttämällä eristettyjä.

I " Vaihtoehtoisesti keksinnön mukaisen DNA-rakenteen DNA- c v 1 ; ’ sekvenssi voidaan valmistaa synteettisesti -V; vakiintuneilla menetelmillä, esim. Beaucagen ja j , , 30 Caruthersin (1981) kuvaamalla fosfoamidiittimenetelmällä * > h!, tai Matthess et ai: n (1984) kuvaamalla menetelmällä.

’ Oligonukleotidit syntetoidaan fosfoamidiittimenetelmän mukaisesti esim. automaattisessa DNA-syntetisaattorissa, :V: puhdistetaan, lämpöliitetään, ligatoidaan ja kloonataan . 35 sopivissa vektoreissa.

[ Lisäksi DNA-rakenne voi olla sekoitettua genomista tai synteettistä, sekoitettua synteettistä ja cDNA- tai sekoitettua genomista ja cDNA-alkuperää, joka on 5 40 valmistettu ligatoimalla synteettisen, genomisen tai cDNA-alkuperan fragmentit (kuten on tarkoituksenmukaista), fragmentit, jotka vastaavat 14 kokonaisen yhdistelmä-DNA-molekyylin erilaisia osia, standarditekniikoiden mukaisesti.

Kuten edellä osoitettiin, DNA-sekvenssi B on edullisesti 5 sellainen, joka koodaa mielenkiinnon kohteena olevaa polypeptidiä, ja esillä oleva keksintö kohdistuu lisäksi menetelmään mielenkiinnon kohteena olevan polypeptidin valmistamiseksi, joka käsittää keksinnön mukaisen, geno-missa rakenteen M-B käsittävän DNA-sekvenssin moninker-10 täisiä kopioita sisältävän solun viljelemisen, jossa B koodaa mielenkiinnon kohteena olevaa polypeptidiä, olosuhteissa, jotka johtavat polypeptidin tuotantoon, ja saadun polypeptidin talteenottamisen viljelmästä. Esillä olevalla menetelmällä valmistettu polypeptidi voi olla 15 mikä tahansa edellä luetelluista tuotteista, kuten entsyymi, esim. proteaasi, amylaasi tai lipaasi.

Esillä olevaa keksintöä valaistaan lisäksi oheisissa piirustuksissa, joissa: 20

Kuvio 1 esittää genomin ja keksinnön mukaisen DNA-raken-teen kaksoisrekombinaatiotapahtumaa, joka saa aikaan genomissaan rakenteen A-B-C-M-A-D sisältävän solun.

25 Kuvio 2 esittää kaksoisrekombinaatiotapahtuman, joka on :Ί tulosta kahdesta peräkkäisestä yksittäisestä rekombinaa- tiotapahtumasta, joista ensimmäinen koostuu rakenteen 1< = C-M-A-D sisältävän vektorin integroimisesta vektoriin ;ij toisen koostuessa vektorin leikkaamisesta genomista,

30 mikä saa aikaan keksinnön mukaisen rakenteen A-B-C-M-A-D

, j ; sisältävän genomin. Esitetään erilaisia integrointi- ja '11 leikkausmahdollisuuksia.

Kuvio 3 on plasmidin pDN1981 restriktiokartta, : 35 :!J Kuvio 4 on plasmidin pSJ1985 restriktiokartta.

11 Kuvio 5 on plasmidin pSJ2024 restriktiokartta.

40 Kuvio 6 on plasmidin pSJ980 restriktiokartta.

Kuvio 7 on plasmidin pSJ1926 restriktiokartta.

15

Kuvio 8 on plasmidin pSJ2059 restriktiokartta, ja

Kuvio 9 esittää esimerkissä 1 mainittuja genomisia karttoja ja integraatiotapahtumia, joissa 5 A esittää B. licheniformis -kromosomissa olevaa amyL-geeniä, B esittää integraatiota promoottorifragmentin (ooooooo) kautta, C esittää integraatiota 'amyL-fragmentin (koodaavan sek-10 venssin 5'-osa **********) kautta, D esittää integraatiota alavirtaan axnyL-fragmentin (ala-virtaan koodaavasta sekvenssitä xxxx) kautta, E esittää plasmidin leikkaamista integranttityypistä C koodaavan sekvenssin homologian alavirtaan kautta (xxx), 15 F esittää P-amyL-kanB-alueen vahventamista (aluksi kahden promoottorialueen oooooo kautta)

Keksintöä selostetaan edelleen seuraavissa esimerkeissä, joiden ei ole tarkoitettu rajoittavan keksinnön piiriä 20 millään tavalla.

ft MATERIAALIT JA MENETELMÄT

;' ’ Kannat: VV Bacillus licheniformis SJ1904 on alfa-amylaasia tuottava ’ , 25 kanta, joka on johdettu kannasta SJ1707 integroimal- la/leikkaamalla WO 93/10249 :n esimerkissä 6 kuvattu V plasmidi pSJ1755, jonka julkaisun sisältö sisällytetään tähän viitteeksi.

vv 30 Bacillus subtilis DN1885: B. subtilisin 168 amyE, 7 amyR2, spo1, Pro+ -johdannainen (Diderichsen et ai., i v 1990).

16 Väliaine : TY: 20 Trypticase20 g/l

Hiivauute 5 g/l 5 FeCl2.4H20 6 mg/1

MnCl2.4H20 45 1 mg/1

MgS04.74H20 15 mg/1 2 5 pH 7,3 10 BPX: Perunatärkkelys 100 g/1

Ohrajauho 50 50 g/l BAN 5000 SKB 0,1 g/l 30 Natriumkaseinaatti 10 g/l

Soijajauho 20 g/l 15 Na2HP04, 12 H20 9 g/l

Plutonic 55 0,1 g/l LB-agar 35 Bacto-tryptoni 10 g/l

Bacto-hiivauute 5 g/l

NaCl 10 g/l

Bacto-agar 60 15 g/l Säädetty pH:hon 40 7,5 NaOH:11a

YLEISET MENETELMÄT

ij Plasmidien konstruoimiseen käytetyt koetekniikat olivat p. yhdistelmä-DNA-tekniikan alalla käytettyjä ,*»·, 65 standarditekniikoita, katso Sambrook et ai. (1989).

Restriktioendonukleaasit hankittiin New England ; Biolabsista ja Boehringer Mannheimilta ja niitä : ; käytettiin valmistajien ohjeiden mukaisesti. T4 DNA - 70 ligaasi hankittiin New England Biolabsista ja sitä käytettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Plasmidi-DNA:n valmistaminen kaikista kannoista suoritettiin Kieserin, 1984, kuvaamalla menetelmällä.

75 B. subtilisin transformointi

Kompetentit solut valmistettiin ja transformoitiin

Yashin et ai:n, 1975, kuvaamasta.

80 B, licheniformisin transformointi 17

Plasmidit vietiin B. licheniformisiin polyetyleeniglykolivälitteisellä protoplastitransformaatiolla, kuten Akamatzu, 1984, on kuvannut.

5

Amylaasxaktiivisuus määritettiin Pharmacia Diagnosticsin PhadebasR Amylase Test -valinesarjalla, kuten välittäjä kuvaa.

10 ESIMERKIT

Esimerkki 1

Amylaasia koodaavan geenin vahvistaminen Tämä esimerkki valaisee B. licheniformis -kannan SJ 1904 kromosomissa olevan amylaasia koodaavan geenin vahvista-15 mistä. Tämä esimerkin mukaisesti konstruoitu kanta on sellainen, joka sisältää kromosomissa seuraavassa järjestyksessä: 1) amylaasipromoottorin, 2) amylaasirakennegeenin, 3) kanamysiiniresistenssigeenin ja 4) amylaasipromoottorin 20 toisen kopion. Amylaasipromoottorin kaksi kopiota toimivat tässä tapauksessa, kuten suoraan toistuvat DNA-sekvenssit A.

Kasvun valikoinnin nousevissa kanamysiinitasoissa on 25 esitetty johtavan amylaasia koodaavan geenin (mukaan lukien promoottori) ja kanamysiiniresistenssigeenin vahvistumiseen.

> .3 m

Plasmidirakenteet V: 30 Kaikki plasmidit konstruoitiin B. subtilisissa DN1885 f: valikoiden kanamysiiniresistenssi (10 pg/ml).

> i n pDN1981 (kuvio 3) sisältää B. licheniformis alfa-amylaasi (amyli) geenin ja sen on kuvannut Jcprgensen et : 35 ai. , 1990.

pSJl985 (kuvio 4) sisältää amyL-promoottorin (PamyL)<-; mitä seuraa 210 emäsparin fragmentti, joka sijaitsi alunperin välittömästi alavirtaan amyL- 40 terminaattorisekvenssistä. Fragmentti PCR-vahvistettiin pDN1981:stä aloittajilla LWN3226 + LWN3223 (taulukko 1), hajotettiin Ndel:llä ja HindIII:lla ja iigatoitiin 4 18 kiloemäksen pDN1981:stä peräisin olevaan Ndel-Hindlll-fragmenttiin pSJ1985:n saamiseksi.

pSJ2024 (kuvio 5) sisältää tämän promoottorin ja 5 alavirtafragmentin yhdistelmän pE194:ään perustuvassa lämpötilaherkässä plasmidissa (Horinouchi ja Weisblum, 1982b). Se konstruoitiin ligatoimalla pSJ1985:stä peräisin oleva 1,7 emäsparin BglI-HindIII-fragmentti pSJ980:n 4,9 emäsparin BglII-HindIII~fragmenttiin (kuvio 10 6). pSJ980 on kuvattu WO 93/10249:ssä.

pSJl926 (kuvio 7) sisältää amyL-geenin mukaan lukien sen terminaattorisekvenssin mutta josta on deletoitu terminaattorista alavirtaan olevat sekvenssit (alavirran 15 210 emäsparin fragmenttia, joka sisältyi pSJ1985:een, ei ole täten pSJl926:ssa), pDN1981:stä peräisin oleva 0,5 kiloemäksen fragmentti PCR-vahvistettiin aloittajilla LWN3224 1 LWN3227 (taulukko 1), hajotettiin Sall:llä ja HindIII:lla ja ligatoitiin pDN1981:stä peräisin olevaan 20 5,2 kiloemäksen fragmenttiin, mikä tuotti pSJ1926:n.

PSH1926 Sall-Hindlll-fragmentti, joka on johdettu PCR-vahvistamisella, on DNA-sekvennoitu eikä sisällä mitään indusoituja mutaatioita.

25 pSJ2059 (kuvio 8) sisältää amyL-geenin .1 kiloemäksen fragmentin, joka juuri sisältää terminaattorisekvenssin, kanamysiiniresistenttigeenin, amyL-promoottorin ja ,lopuksi amyL-terminaattorista alavirtaan olevan ’»* fragmentin, jotka ovat kaikki lämpötilaherkkää V 30 alkuperää. pSJ1926 hajotettiin EcoRI:llä ja Kpnl:llä ja 1 kiloemäksen fragmentti liitettiin EcoRIrn ja Kpnltn väliin pSJ2024:ään pSJ2059:n saamiseksi.

Taulukko 1 35 Aloittajaluettelo <EcsqRI> ΟΦΓ3223: 5'-GAA TTC TCA ICT TIG ACA GC -3' (SEQ ID #1) asemat 1-20 pDN1981v2-sekvenssissä : 40 19 <"XbaI-><· -Ndel~> IWN3226: 5'-GAC TIC TAG ACA TOT GTO AST TDC GIT GST TOC ATT -3' (SBQ ID #2) asemat 2221-2240 amyLv2-sekvenssissä

<HirdIII

5 IWN3227 : 5'-GAC Τ3Γ CCA GAA GCT TOA AST AAA AAA ACG GAT TIC -3' (SEQ ID #3) asemat 2210-2190 amyLv2-sekvenssissä LKN3224: 5'-ATG ΑΤΑ CAC AGC CGG GGC AA -3' (SB2 ID #4) 10 asemat 1690-1710 amyLv2-sekvenssissä EWN3554 : 5'-GIT GAC CAG ACA TEA 03 -3' (SEQ ID #5) asemat 1217-1201 kanB-sekvenssissa 15 IKN3208: S'-OGA GIC AGC TOG CAA CIG TCA IGA AAC AAC AAA AAC GGC ITT ACG CC -3' (SEX3 ID #6) asemat 622-650 amyLv2-sekvenssissä 20 B. licheniformisin transformointi pSj2059 vietiin B. licheniformisiin SJ1904 protoplast!-transformoinnilla valikoiden erytromysiiniresistenssi (5 ,,, pg/ml). Täten saatu transformantti oli kanta SJ2127.

• Λ ; '" 25 Integrointi ; · SJ2127:ää siveltiin LB-levyille 10 pg/ml:n kanamysiiniä :iv: kanssa ja inkuboitiin 50 °C:ssa. Koska pSJ2059 on > ’ lämpötilalle herkkä replikaatiossa, vain kromosomaalisesti integroituneen plasmidikopion V · 30 sisältävät solut synnyttävät kopioita.

7 ‘' pSJ2059 sisältää kolme erilaista SJ1904:ssä olevan kromosomaalisen amyL-alueen kanssa homologista aluetta 7 ja integroiminen on mahdollista vain rekornbinoimalla : i : 35 millä tahansa näistä alueista. Tämä tuottaa kantoja, ; · joissa kromosomi näyttää sellaiselta kuten kuviossa 9, B, C tai D esitetään.

Plasmi.d.i, joka on integroitu kuten kuviossa 9B, ei 40 kykene leikkautumaan tuottaen haluttua kantaa.

5 20

Plasmidi, joka on integroitu kuten kuviossa 9C, tuottaa halutun kannan, jos leikkaaminen tapahtuu rekombinaatiolla alavirtafragmentissa.

Plasmidi, joka on integroitu kuten kuviossa 9D, tuottaa halutun kannan, jos leikkaaminen tapahtuu rekombinaatiolla amyL-rakennegeenifragmentissa.

10 8 50 °C:n levystä olevaa pesäkettä testattiin CPR- vahvennuksella käyttämällä aloittajia LWN3208 + LWN3554 (taulukko I) . Reaktiot suoritettiin suoraan materiaalilla, joka saatiin suspendoimalla uudelleen ja keittämällä solut TY-väliaineessa. Aloittajien asema on 15 esitetty kuviossa 9, B, D ja E.

B-tyypin integrantista ei saatu mitäään PCR-vahvistettua fragmenttia, kun taas C-tyyppi tuottaa 2,7 kiloemäksen fragmentin ja D-tyyppi 7,5 kiloemäksen fragmentin.

20 ; i * * 9 t * f in * 3 .· i i s } 21 8 pesäkkeestä havaittiin 5:ssä 2,7 kb;n fragmentti, mikä osoittaa, että integroituminen on tapahtunut näissä tapauksissa amyL-rakennegeenifragmentin kautta tuottaen C-tyypin integrantteja. Nämä lisäännytettiin sitten TY-väliaineessa 5 30 °C:ssa plasmidin leikkautumisen ja kadon sallimiseksi.

Kolmen siirron jälkeen TY-väliaineessa havaittiin KanaR ErmS -pesäkkeitä replikapäällystämällä. Erytromysiiniherk-kyys osoittaa plasmidin kadon. 2,7 kb:n fragmentti voidaan tuottaa yhä näistä pesäkkeistä PCR-vahvennuksella odotetus-10 ti, jos leikkaaminen tapahtui rekombinaatiolla alavirta-fragmentissa tuottaen kuviossa 9E esitetyn tuloksen. Yksi kustakin 5 yksittäisestä 50 °C:n pesäkkeestä saatu kanta pidettiin SJ2147-2151:nä.

15 Vahventaminen

Kannoissa SJ2148 ja SJ2150 olevat alfa-amylaasi (amyL) + kanamysiiniresistenssigeenit vahvistettiin seuraavalla menetelmällä: 20 Kantoja inokuloitiin 10 ml:ssa TY-väliainetta +10 pg/ml:s-sa kanamysiiniä ja niitä ravistettiin 37 °C:ssa yön ajan. Uusia 10 ml:n viljelmiä, jotka sisältävät 20, 50, 100 ja 200 μg/ml kanamysiiniä, inokuloitiin 100 μΐιΐΐη 10 μg/ml:n ϊ t viljelmää ja ravistettiin 37 C:ssa yön ajan. 10 ml:n vil-,ί,Γ 25 j elmiä, jotka sisältävät 500, 1 000, 1 500, 2000 ja 2500 t ug/ml kanamysiiniä, inokuloitiin 100 ulilla 200 ug/ml:n 4 » viljelmää.

2000 ja 2500 ug/ml:n viljelmiä inokuloitiin 4 päivää, muut : 30 kerättiin yön ajan viljelyn jälkeen. Kaikkien viljelmien ; ; alikvootit pakastettiin 15-%:isessa glyserolissa ja solut \ kerättiin kromosomaalisen DNA:n valmistamista varten.

22

Eristetyt kannat

Emokanta: SJ2148 SJ2150 5 Kanamysiinikonsen-traatio yig/ml 10 SJ2172 SJ2182 20 SJ2173 SJ2183 50 SJ2174 SJ2184 10 100 SJ2175 SJ2185 200 SJ2176 SJ2186 500 SJ2177 SJ2187 1000 SJ2178 SJ2188 1500 SJ2179 SJ2189 15 2000 SJ2180 SJ2190 2500 SJ2181 SJ2191

Edellä olevista kannoista peräisin oleva kromosomaalinen DNA hajotettiin BGlII:lla, jonka tulisi tuottaa 4,1 kb:n 20 fragmentti, joka on johdettu vahvistetusta DNA:sta (katso kuvio 9F). Tämä fragmentti on nähtävissä EtBr-värjätyssä geelissä jopa 10 pg/ml:ssa kanamysiiniä valikoiduissa kannoissa, se tulee lisääntyvästi silmiinpistäväksi 20 ja 50 ·.· » pg/ml:ssa ja pysyy korkealla tasolla lopuissa kannoissa.

Ί* 25

Vahvennuksen tuottoteho i ’ Ravistuspulloja, joissa on BPX-väliainetta, inokuloitiin ; ’ suoraan glyseroli-pakastetuista viljelmistä ja ravistettiin 300 rpm:ssä 37 °C:ssa.

30

Alfa-amylaasituottoja, jotka saatiin vahvistetuilla kannoilla, verrattiin kannalla SJ1904 saatuun tuottoon.

23 __Koe A___Koe B____

Kanamysiiniä 7 päivää 4 päivää 6 päivää 5 rav.pullossa " ~ , £

Kanta 3uht. saanto Suht. saanto Suht. saanto __^g/ml___________ SJ2172 10 2.76 ___0__2^6___ SJ2173 20 3.44 0 3.04 1.92 2.72 10---—---- SJ2174 50 2.68 __0__2.72_____ SJ2175 100 3.24 __0__2.84__1.84__2.88 SJ2176 200 3.2 15 :__0__3.24__1.84__2.84 \ SJ2177 500 0.72 I 0 3.24 1.76 2.76 j — 1 ~ ! SJ2182 10 0.48 ; _______o___________ SJ2183 20 3.68 __0__3.68__2.04__2.6 SJ2184 50 2.96 __0__2jJ$_____ SJ2185 100 2.8 __0__3^2__1.44__2.32 25 SJ2186 200 2.96 __0__2.92___ SJ2187 500 0.6 __0__3.56__1.68__2j_6_ ,' SJ1904__0__1.00__0j_6__1.00 30

On ilmeistä, että vahvistetut kannat tuottavat jokainen enemmän alfa-amylaasia kuin emokanta.

35 Esimerkki 2 CGTaasia koodaavan geenin vahvistaminen Tämä esimerkki valaisee syklodekstriiniglykosyylitransfe-raasia (cgtA) koodaavan geenin vahvistamista. Geeni kloonattiin alunperin Thermoanaerobacter sp:stä ja insertoitiin 24 yhtenä kopiona Bacillus licheniformis -kannan kromosomiin korvaten tämän kannan endogeeninen alfa-amylaasigeeni (amyL). CGTaasigeeniin yhdistettiin tehokas alfa-amylaasi-promoottorin mutanttiversio ja tässä prosessissa käytetyssä 5 plasmidissa oleva alfa-amylaasisignaalipeptidi ja B. lic-heniformisin transformointi ilman rekombinanttirakennetta oli vain silloin menestyksekäs, kun spontaani rekombinaa-tiotapahtuma siirsi amyL-cgtA-geenin kromosomiin villin-tyyppisen amyL-promoottorin ohjauksen alaisena. Sitten käy-10 tettiin myöhempää rekombinaatyövaihetta mutanttipromootto-rin viemiseksi kromosomaalisen amyL-cgtA-geenin eteen. Tämä työ, josta syntyy muiden muassa esillä olevassa esimerkissä käytetty kanta SJ1708, on kuvattu WO 93/10249:ssä ja WO 93/10248:ssa.

1 5

Koska keksijä ei kyennyt saamaan B. licheniformisin trans-formantteja, joissa on plasmideja, jotka sisältävät amyL-cgtA-geenin, joka on ilmentynyt mutanttipromoottorista, tämän ekspressiokasetin vahvistaminen kromosomissa ei ollut 20 mahdollista menetelmillä, joissa tarvitaan kokonaisen kasetin sisäänviemistä yhtenä vaiheena, mutta se oli mahdollis-ta esillä olevassa keksinnössä kuvatulla menetelmällä.

i ► Tämän esimerkin mukaan konstruoitu kanta on sellainen, joka 25 sisältää kromosomissa seuraavassa järjestyksessä: 1) mutantti-amyL-promoottorin, 2) amyL-cgtA-geenin, 3) : kanamysiiniresistenssigeenin ja 4) mutanttiamyL-promootto- / rin toisen kopion. amyL-promoottorin kaksi kopiota toimivat tässä tapauksessa, kuten suoraan toistuvat DNA-sekvenssit 30 A.

Kasvun valikointi nousevissa kanamysiinitasoissa näyttää > johtavan amyL-cgtA-geenin sekä mutanttipromoottorin että kanamysiiniresistenssigeenin vahvistumiseen.

35 SJl707:n kromosomi sisältää amyL-geenin fragmentin distaa-lisesti amyL-cgtA-rakenteeseen (katso Wo 90/10249). Plas-midia pSJ2059 voidaan siten käyttää työkaluna kannan SJ1707 vahvistettavissa olevan johdannaisen konstruoimiseen samal 25 la tavalla kuin sitä käytettiin esimerkissä 1 B. licheni-formisin amylaasigeenin vahvistamiseen.

Transformointi: 5 pSJ2059 vietiin B. licheniformisiin SJ1707 protoplasti- transformoinnilla valikoiden erytromysiiniresistenssi (5 pg/ml) 30 °C:ssa.

Yhtä saatua transformanttia pidettiin SJ2285:nä.

10

Integrointi: SJ2285:tä siveltiin LB-levyille 10 pg/ml:n kanamysiiniä kanssa ja inkuboitiin 50 °C:ssa yön ajan. 10 50 °C:ssa muodostunutta pesäkettä lisäännytettiin TY-väliaineessa 30 15 °C:ssa leikkautumisen ja integroituneen plasmidin katoamisen mahdollistamiseksi. TY-väliaineen yhden siirron jälkeen havaittiin Kana** erm^-pesäkkeitä replikapäällystämallä viljelmät, jotka on johdettu 7:stä 10:stä integranttipesäk-keestä.

20

Vahvistamista (kuten esimerkissä 1) yritettiin 4:llä näistä kannoista ja isolaatit, jotka kasvavat lopulta 2000 pg/ml:ssa kanamysiiniä, saatiin 3:sta näistä 4:stä.

25 Pidettiin yksi vahvistettu sarja: , ; : Kanamysiini- / konsentraatio pg/ml Kanta 30 10 SJ2322 20 SJ2323 50 SJ2324 100 SJ2325 200 SJ2326 35 500 SJ2327 1000 SJ2328 1500 SJ2329 2000 SJ2330 26 SJ2323-SJ2326:ta inokuloitiin SJ2322:sta (100 μΐ 10 ml:s-sa) ja SJ2327-SJ2330:tä inokuloitiin SJ2326:sta.

Kaikkien viljelmien alikvootit pakastettiin 15-£:isessa 5 glyserolissa ja solut kerättiin kromosomaalisen DNA:n valmistamiseksi .

EcoRIrllä hajotetun kannoista SJ2324 ja SJ2328 peräisin olevan kromosomaalisen DNA:n Southern-analyysi paljasti 5,5 10 kb:n fragmentin, kuten odotettiin amyL-cgtA + kanamysiini-resistenssigeenien vahvennuksesta. Kannasta SJ2328 peräisin oleva 5,5 kb:n fragmentti oli hyvin silmiinpistävä jo EtBr-värjätyllä agaroosigeelillä.

1 5 Vahvennuksen tuottoteho:

Ravistuspullot, joissa on BPX-väliainetta, inokuloitiin suoraan glyserolipakastetuista viljelmistä ja niitä ravistettiin 300 rpm:ssä 37 °C:ssa. Vahvistetuilla kannoilla saatuja CGTaasisaantoja verrattiin kannalla SJ1707 saatuun 20 saantoon.

25 ; 30 . ϊ 35 27

Koe A Koe B Koe C

. ' Kanamy- 7 PäivSä 7 Paivää 3 Päivää b _________________· S11f1 Rel. Yield Rel. Yield Rel. Yield Kanta Mg/ml SJ1707 0 1.0 1.1 SJ2322 0 2.1 1.4 10 10 2.2 1.7 SJ2323 0 1.9 20 2.0 SJ2324 0 2.2 1.5 1.5 15 50 2.4 1.7 1.8 I SJ2325 0 1.8 100 1.6 SJ2326 0 1.6 20 200 1.8 SJ2327 0 1.9 500 1.3 SJ2328 0 1.9 1.6 1.4 25 1000 2.4 2.0 2.1

On ilmeistä, että vahvistetut kannat tuottavat enemmän : i . 30 CGTaasia kuin emokanta.

Joiden ravistuspulloista peräisin olevien kantojen stabiilius tutkittiin päällystämällä LB-levyille, jotka sisältävät tärkkelystä ja määrittämällä halomuodostus. Geneettisen 35 epästabiiliuden perusvaikutus olisi CGTaasigeenin jopa vii-: meisen kopion katomainen, mikä saa aikaan CGTaasinegatiivi- sia segreganttej a, jotka eivät kykene tuottamaan haloja tärkkelyslevyille.

28 SJ2322: 100/100 positiivinen (koe A) 300/300 positiivinen (koe B) SJ2324: 200/200 positiivinen (koe A) 5 300/300 positiivinen (koe B) 120/120 positiivinen (koe C) SJ2328: 200/200 positiivinen (koe A) 500/500 positiivinen (koe B) 10 120/120 positiivinen (koe C)

Mistään kannasta ei tutkittu CGTaasigeenin viimeisen kopion katoa testatuissa olosuhteissa.

29

VIITTEET

Jorgensen et ai. (1990). In vivo genetic engineering: homologous recombination as a tool for plasmid construction. 5 Gene 96, 37-41.

Horinouchi, s. and Weisblura, B. (1982b). Nucleotide sequence and functional map of pE194, a plasmid that specifies inducible resistance to macrolide, lincosamide, and strepto-10 gramin type B antibiotics. J. Bacteriol., 150, 804-814.

B. Diderichsen, (1986), Bacillus: Molecular Genetics and Biotechnology Applications. A.T. Ganesan and J.A. Hoch, Eds., Academic Press, pp. 35-46.

15

Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd edition

Beaucage et al., Tetrahedron Letters 22. 1981, pp. 1859-1869, 20

Matthes et al., EMBO Journal 3. 1984, pp. 801-805 Saiki et al. (1988), Science 239. 1988, pp. 487-491.

*; » 25 Diderichsen et al. (1990). Cloning of aldB. which encodes a-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from Bacillus brevis. J. Bacteriol., 172, 4315-4321.

Kieser, T. (1984), Factors affecting the isolation of CCC DNA 30 from Streptomvces lividans and Escherichia coli. Plasmid 12, 19-36.

Akamatzu et al. (1984), An improved method of protoplast regeneration for Bacillus species and its application to proto-35 plast fusion and transformation. Agric. Biol. Chem. 48, 651-655.

Yasbin et al. (1975), J. Bacteriol. 121, 296-304.

30 (1) YLEISTÄ TIETOA: (i) HAKIJA: (A) NIMI: NOVO NORDISK A/S 5 (B) KATU: Novo Alle (C) KAUPUNKI: Baegsvaerd

(E) MAA: TANSKA

(F) POSTINUMERO: DK-2880 (G) PUHELIN: +45 44448888 10 (H) TELEFAX: +45 4449 3256 (1) TELEX: 37304 (ii) KEKSINNÖN NIMITYS: DNA:n vahvistaminen (lii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 6 15 (iv) TIETOKONEELLA LUETTAVISSA OLEVA MUOTO: (A) VÄLINEEN MUOTO: kalvolevy (B) TIETOKONE: IBM PC-yhteensopiva

(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS

(D) OHJELMISTO: Patentin Release #1.0, versio #1.25 20 (EPO) (2) SEKVENSSIN ID NO 1 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: 25 (A) PITUUS: 20 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 30 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (iv) ANTI-SENSE: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen 35 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NRO:1: GAATTCTCAT GTTTGACAGC 20 31 (2) SEKVENSSIN ID NO 2 TIEDOT: (1) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: (A) PITUUS: 36 emasparia 5 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) 10 (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (iv) ANTI-SENSE: Ei (V) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO 2:

15 GACTTCTAGA CATATGTAAA TTTCGTTGAT TACATT

36 (2) SEKVENSSIN ID NO 3 TIEDOT: 20 (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: (A) PITUUS: 36 emasparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen / 25 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) ΐ (iii) HYPOTEETTINEN: Ei : (iv) ANTI-SENSE: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen 30 (Xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO 3: GACTGTCCAG AAGCTTAAAA TAAAAAAACG GATTTC 36 35 (2) SEKVENSSIN ID NO 4 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: (A) PITUUS: 20 emäsparia 32 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS; yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 5 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (iv) ANTI-SENSE: Ei (V) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen 10 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO 4: ATGATACACA GCCGGGGCAA 20 (2) SEKVENSSIN ID NO 5 TIEDOT: 1 5 (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: (A) PITUUS: 17 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen 20 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) ’ ; (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (iv) ANTI-SENSE: Ei 25 (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO 5: S : ··

GTTGACCAGA CATTACG

17 30 ’ (2) SEKVENSSIN ID NO 6 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: (A). PITUUS: 47 emäsparia 35 (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 33 (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (iii) HYPOTEETTINEN: Ei (iv) ANTI-SENSE: Ei (v) FRAGMENTTITYYPPI: sisäinen 5 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO 6: TGAGTCAGCT AGCAACTGTC ATGAAACAAC AAAAACGGCT TTACGCC 47 10 a 0 s *

Claims (15)

1. Menetelmä prokaryoottisen bakteeriemosolun genomissa olevan DNA-sekvenssin B vahvistamiseksi in vivo, tunnettu 5 siitä, että se käsittää: a) että mainitun solun genomiin integroidaan DNA-rakenne, joka käsittää rakenteen C-M-A-D, jossa 10. tarkoittaa DNA-sekvenssiä, joka on homologinen genomi-sen DNA-fragmentin kanssa, joka joko sivuaa vahvistettavaa DNA-sekvenssia B tai limittyy sen kanssa tai on DNA-sekvenssin B alasekvenssi, joka muodostaa mainitun sekvenssin B toisen pään, 15 C tarkoittaa DNA-sekvenssiä, joka on homologinen genomi-sen DNA-fragmentin kanssa, joka joko sivuaa vahvistettavaa DNA-sekvenssiä B tai limittyy sen kanssa tai on DNA-sekvenssin B alasekvenssi, joka muodostaa mainitun sek-20 venssin B toisen pään, sekvenssin C sijaitessa sekvenssin B vastakkaisessa päässä verrattuna A:hän, Γ\ D tarkoittaa DNA-sekvenssiä, joka on homologinen genomi- i”'.· sen DNA-fragmentin kanssa, joka sijaitsee distaalisesti :v. 25 C:n suhteen verrattuna B:hen, ja i!,' M tarkoittaa valikointimarkkeria koodaavaa DNA-sekvens- ' siä, • 30 b) että valitaan soluja, joissa DNA-sekvenssi M on inte groituna genomiin joko ylävirtaan tai alavirtaan DNA-v, sekvenssistä B yhdessä sekvenssin A kanssa, jotka solut käsittävät rakenteen A-B-C-M-A-D missä tahansa orientaatiossa, ja 35 c) että vaiheessa b) valittuja soluja lisäännytetään nousevassa DNA-sekvenssin M koodaaman valikointimarkkerin valikointipaineessa saaden siten solu, jossa DNA-sek-venssien B ja M genomisesti integroituneiden kopioiden 5 luku on lisääntynyt verrattuna emosoluun.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA-rakenne on sopivassa vektorissa, edullisesti plasmidissa tai faagissa. 10

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vektori on lämpötilaherkkä replikaatiossa.

4. Jonkin patenttivaatimuksen 1-3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että solu on gram-positiivisen bakteerin, edullisesti Bacillus tai Streptomyces, solu tai gram-negatiivisen bakteerin, edullisesti Esherichia, solu.

5. Jonkin patenttivaatimuksen 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi B käsittää avoimen ij : lukukehyksen.

6. Jonkin patenttivaatimuksen 1-5 mukainen menetelmä, ;v:. 25 tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi B heterologinen ; /. emosolun kanssa ja johdettu mikro-organismista, kasvista, hyönteisestä, selkärankaisesta tai nisäkkäästä.

7. Jonkin patenttivaatimuksen 1-6 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi B koodaa entsyymiä, hormonia, antigeenistä komponenttia, immunoaktiivista proteiinia tai peptidiä, kasvutekijää, allergeeniä, j": kasvaimeen liittyvää antigeeniä, tai veren proteiinia.

8. Jonkin patenttivaatimuksen 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi B käsittää yhden tai useamman geenin, joka koodaa biosynteettistä reittiä, yhden tai useamman geenin, joka koodaa solun transkriptio-, translaatio- tai proteiininerityslaitteiston elementtejä, solussa vaikuttavaa säätötekijää, 5 metalliresistenssiä, tai B täydentää emosolun auk-sotrooppista mutaatiota.

9. Jonkin patenttivaatimuksen 1-8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi B on geeni ja DNA-sek- 10 venssi A on homologinen kokonaisen tai osittaisen promoottorisekvenssin kanssa, joka on ylävirtaan DNA-sekvenssin B koodaavasta osasta.

10. Minkä tahansa edellisen patenttivaatimuksen mukainen 15 menetelmä, tunnettu siitä, että DNA-sekvenssi M koodaa tuotetta, joka antaa emosolulle antibioottiresistenssin, joka antaa prototrofian auksotrofiselle solulle, tai joka täydentää emosolun puutetta.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että antibioottiresistenssi on kanamysiini-, V : tetrasykliini-, ampisilliini-, erytromysiini-, kloram- fenikoliresistenssi, tai että DNA-sekvenssi M koodaa tuotetta, joka antaa raskasmetalliresistenssin. * > \ SV; 25 il

12. Vektori, tunnettu siitä, että siinä on DNA-rakenne, joka käsittää rakenteen C-M-A-D, jossa i i , 30. tarkoittaa DNA-sekvenssiä, joka on homologinen genomi- sen DNA-fragmentin kanssa, joka joko sivuaa vahvistettani vaa DNA-sekvenssiä B tai limittyy sen kanssa tai on DNA- ”, sekvenssin B alasekvenssi, joka muodostaa mainitun sek venssin B toisen pään, 35 C tarkoittaa DNA-sekvenssiä, joka on homologinen genomi-sen DNA-fragmentin kanssa, joka joko sivuaa vahvistettavaa DNA-sekvenssiä B tai limittyy sen kanssa tai on DNA-sekvenssin B alasekvenssi, joka muodostaa mainitun sek-5 venssin B toisen pään, sekvenssin C sijaitessa sekvenssin B vastakkaisessa päässä verrattuna A:hän, D tarkoittaa DNA-sekvenssiä, joka on homologinen genomi-sen DNA-fragmentin kanssa, joka sijaitsee distaalisesti 10 C:n suhteen verrattuna B:hen, ja M tarkoittaa valikointimarkkeria koodaavaa DNA-sekvenssiä .

13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen vektori, tunnettu siitä, että vektori on plasmidi tai bakteriofagi.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen vektori, tunnettu siitä, että se käsittää lisäksi lämpötilaherkän 20 replikaation aloituskohdan. i15. DNA-rakenne, tunnettu siitä, että se käsittää ; ; rakenteen C-M-A-D, jossa li -J V, 25 A tarkoittaa DNA-sekvenssiä, joka on homologinen genomi- ; sen DNA-fragmentin kanssa, joka joko sivuaa vahvistettani vaa DNA-sekvenssiä B tai limittyy sen kanssa tai on DNA- ’ sekvenssin B alasekvenssi, joka muodostaa mainitun sek venssin B toisen pään, : : 30 C tarkoittaa DNA-sekvenssiä, joka on homologinen genomi-sen DNA-fragmentin kanssa, joka joko sivuaa vahvistettavaa DNA-sekvenssiä B tai limittyy sen kanssa tai on DNA-sekvenssin B alasekvenssi, joka muodostaa mainitun sek-35 venssin B toisen pään, sekvenssin C sijaitessa sekvenssin B vastakkaisessa päässä verrattuna A:han, D tarkoittaa DNA-sekvenssiä, joka on homologinen genomi-sen DN A-fragmentin kanssa, joka sijaitsee distaalisesti C:n suhteen verrattuna B:hen, ja 5 M tarkoittaa valikointimarkkeria koodaavaa DNA-sekvenssiä . > s