DE69334006T2

DE69334006T2 - Dna - amplifikation

Info

Publication number: DE69334006T2
Application number: DE69334006T
Authority: DE
Inventors: Troels Steen JOERGENSEN
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1992-12-22
Filing date: 1993-12-22
Publication date: 2006-11-23
Anticipated expiration: 2013-12-23
Also published as: JP3983798B2; EP0675959B1; NO952496L; CA2152371C; WO1994014968A1; ATE323167T1; DE69334006D1; JPH08504585A; AU5694494A; FI953079A; FI953079A0; CA2152371A1; FI120741B; AU679707B2; EP0675959A1; CN1114355A; DK0675959T3; CN1063488C; NO952496D0; DK153992D0

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Amplifizieren einer DNA-Sequenz in vivo, welche in einem Genom einer Zelle vorhanden ist, eine Zelle, welche mehrere Kopien der amplifizierten DNA-Sequenz in einem Genom beherbergt und einen Vektor, welcher ein in dem Verfahren zu verwendendes DNA-Konstrukt beherbergt. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids durch Kultivieren einer, wie oben beschriebenen, Zelle.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Von einer großen Anzahl natürlich vorkommender Organismen ist festgestellt worden, dass sie verwendbare Produkte produzieren, von denen eine Produktion in großem Maßstab für Forschungs- und Handelszwecke wünschenswert ist. Sobald ein solches Produkt identifiziert worden ist, sind Anstrengungen unternommen worden, um Herstellungsverfahren zu entwickeln, die zu einer hohen Produktion des Produktes führen. Ein weit verbreitetes Verfahren, das auf rekombinanten DNA-Techniken basiert, ist, ein Gen zu klonieren, welches das Produkt kodiert, das Gen in ein geeignetes Expressionssystem einzubringen, welches die Expression des Produktes erlaubt, und eine geeignete Wirtszelle, welche das Expressionssystem, entweder integriert in das Chromosom oder als eine extrachromosomale Einheit, umfasst, unter Bedingungen, die für die Expression des Produkts geeignet („conductive") sind, zu kultivieren. Eine Voraussetzung zum Verwenden eines solchen Verfahrens ist jedoch, dass das in Frage stehende Gen identifiziert und kloniert werden kann und weiterhin, dass ein geeignetes Expressionssystem und eine geeignete Wirtszelle für die Herstellung verfügbar sind.
Ein anderer Ansatz, der für die Produktion eines solchen Produktes verwendet werden kann, ist es, die Zelle, welche das Produkt in der Natur produziert oder ein Derivat einer solchen Zelle unter geeigneten Bedingungen zu kultivieren. Ein häufig erkannter Nachteil eines solchen Verfahrens ist jedoch, dass die Zelle kein geeigneter Produktionsorganismus ist, wobei ein Grund ist, dass die Menge an durch eine solche Zelle produzierten Produktes zu gering ist, um kommerziell attraktiv zu sein.
Unabhängig davon, welches Herstellungsverfahren verwendet wird, ist es normalerweise wünschenswert, den Produktionslevel eines gegebenen Proteins zu erhöhen. Daher werden Anstrengungen unternommen, um die Produktion zu erhöhen, z.B. durch Einbringen des Gens, welches das Protein kodiert, unter der Kontrolle eines starken Expressionssignals oder durch Erhöhen der Kopienanzahl des Gens in dem in Frage stehenden Produktionsorganismus. Dieser letztgenannte Ansatz kann erreicht werden durch Einbringen des Gens in ein Plasmid mit hoher Kopienzahl, welches jedoch im Allgemeinen dazu tendiert, in der in Frage stehenden Wirtszelle nicht stabil zu sein, oder durch Integrieren von mehreren Kopien des Gens in das Chromosom des Produktionsorganismus, ein Ansatz, welcher im Allgemeinen als attraktiver angesehen wird, da die Stabilität des Konstruktes tendentiell höher ist, was es dem Gen ermöglicht, stabil in dem Produktionsorganismus zu verbleiben.
EP 0 284 126 und EP 166 628 offenbaren Verfahren zum stabilen Integrieren von einer oder mehreren Kopie(n) eines Gens in das Chromosom einer prokaryotischen Zelle, welche bereits mindestens eine Kopie des in Frage stehenden Gens in ihrem Chromosom beherbergt. Gemäß EP 0 284 126 wird eine Wirtszelle, die das Gen umfasst, mit einem DNA-Konstrukt, das eine weitere Kopie des Gens umfasst, transformiert, wodurch nach einer geeigneten Selektionsvorgehensweise eine Zelle erhalten wird, die in ihrem Chromosom zwei Kopien des Gens umfasst, die durch eine endogene chromosomale Sequenz separiert sind, welche lebensnotwendig für die Wirtszelle ist und dadurch einen stabilen Verbleib des integrierten Gens sicherstellt. Diese Vorgehensweise kann wiederholt werden, um eine Zelle herzustellen, die mehrere Kopien des Gens in ihrem Chromosom beherbergt.
EP 166 628 betrifft ein Verfahren zum Amplifizieren eines spezifischen Gens in dem Chromosom eines Bacillus-Stamms, wodurch eine Zelle erhalten wird, die eine sogenannte „amplifizierbare Einheit" beherbergt, welche das Gen, die Expressionselemente des Gens und ein Gen, das einen Selektionsmarker kodiert, das zwischen zwei direkt repetitiven Sequenzen, bezeichnet als „duplizierte Sequenzen", umfasst. Das Gen wird in die Zelle durch einen Plasmid-Integrationsvektor eingeführt, welcher in das Chromosom von Bacillus integriert wird, und welcher ein Markergen, das zu amplifizierende Gen und eine der duplizierten vorhandenen Sequenzen, von denen die andere auf dem Chromosom der Bacillus-Zelle vorhanden ist, beherbergt.
Beide oben beschriebenen Verfahren erfordern es, dass das vollständige zu amplifizierende Gen in den Vektor, der in dem Amplifikationsverfahren zu verwenden ist, eingebracht werden kann und sind daher lediglich anwendbar, wenn das zu amplifizierende Gen isoliert ist und in einem in dem Verfahren zu verwendenden Vektor verfügbar ist.
KURZE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein generell neues Verfahren zum Amplifizieren einer DNA-Sequenz, welche in einem Genom von einer prokaryotischen Eltern-Bakterienzelle vorhanden ist, welches im Vergleich zu den oben beschriebenen Verfahren den Vorteil aufweist, dass es nicht erforderlich ist, dass die zu amplifizierende DNA-Sequenz in ihrer Gesamtheit verfügbar ist.
Spezieller betrifft die vorliegende Erfindung in einem ersten Aspekt ein Verfahren zum Amplifizieren einer DNA-Sequenz B in vivo, welche in einem Genom von einer prokaryotischen Eltern-Bakterienzelle vorhanden ist, welches Verfahren umfasst

a) Integrieren eines DNA-Konstruktes, welches die Struktur C-M-A-D umfasst, in ein Genom der Elternzelle, wobei A eine DNA-Sequenz bezeichnet, welche homolog mit einem genomischen DNA-Fragment ist, welches die zu amplifizierende DNA-Sequenz B entweder flankiert oder überlappt, oder welche eine Untersequenz der DNA-Sequenz B ist, die eines der Enden der Sequenz B darstellt, C eine DNA-Sequenz bezeichnet, welche homolog mit einem genomischen DNA-Fragment ist, welches die zu amplifizierende DNA-Sequenz B entweder flankiert oder überlappt, oder welche eine Untersequenz der DNA-Sequenz B ist, die eines der Enden der Sequenz B darstellt, wobei die Sequenz C, verglichen mit A, an dem gegenüberliegenden Ende der Sequenz B lokalisiert ist, D eine DNA-Sequenz bezeichnet, welche homolog mit einem genomischen DNA-Fragment ist, welches distal zu C, verglichen mit B, lokalisiert ist, und M eine DNA-Sequenz bezeichnet, welche einen Selektionsmarker kodiert,
b) Selektieren von Zellen, in denen die DNA-Sequenz M entweder stromaufwärts oder stromabwärts von der DNA-Sequenz B zusammen mit der Sequenz A in das Genom integriert worden ist, welche Zellen die Struktur A-B-C-M-A-D in beliebiger Orientierung umfassen, und
c) Vermehren der in Schritt b) selektierten Zellen unter ansteigendem Selektionsdruck für den Selektionsmarker, der durch die DNA-Sequenz M kodiert wird, um eine Zelle zu erhalten, die verglichen mit der Elternzelle, eine erhöhte Anzahl an genomisch integrierten Kopien der DNA-Sequenzen B und M erhalten hat.

Die Integration des DNA-Konstruktes, welches die Struktur C-M-A-D umfasst, in ein Genom der Elternzelle resultiert in einer genomischen Struktur, in welcher die DNA-Sequenz B zusammen mit einem geeigneten, selektierbaren Marker zwischen zwei direkt repetitiven DNA-Sequenzen A lokalisiert ist, von denen eine aus dem in Frage stehenden Genom und die andere aus dem DNA-Konstrukt stammt. Wenn ein Stamm, der eine solche Struktur umfasst, unter ansteigendem Selektionsdruck für den Marker vermehrt wird, wird die Kultur hinsichtlich Zellen angereichert, welche Verdoppelungen, Verdreifachungen und höhere Amplifikationen der Gene zwischen den direkt repetitiven Sequenzen enthalten. Demnach wird in Erwägung gezogen, dass die Kopienanzahl der interessierenden DNA-Sequenz 20, 50, 100 oder mehr betragen kann, wobei die Obergrenze die Kopienanzahl ist, die eine zu starke Belastung für die Zelle wird. Bei Verwenden des Verfahrens der Erfindung ist festgestellt worden, dass die amplifizierte DNA bei Ausbleiben der Selektion für den Marker M ziehmlich stabil ist.
Es ist zu verstehen, dass das Amplifikationsverfahren der Erfindung den wichtigen Vorteil gegenüber Verfahren aus dem Stand der Technik hat, dass die gesamte zu amplifizierende DNA-Sequenz für das Durchführen des Verfahrens nicht verfügbar sein muss. Lediglich ein Abschnitt der DNA-Sequenz oder ihrer flankierenden Regionen muss bekannt sein. Dies ist daher ein Vorteil, da es, obwohl DNA-Isolierungs- und Sequenzierungsverfahren während der letzten zehn Jahre wesentlich verbessert worden sind, nach wie vor mühsam ist, eine interessierende DNA-Sequenz zu isolieren und zu sequenzieren, und dass dies tatsächlich nicht immer möglich ist.
In dem vorliegenden Zusammenhang ist der Begriff „Genom" normalerweise dazu gedacht, ein Chromosom der Elternzelle anzuzeigen. Jedoch ist dieser Begriff ebenfalls dazu gedacht, jedes beliebige andere Genom, das in der Elternzelle vorhanden ist, anzuzeigen, ein Beispiel hiervon ist ein Plasmid, zum Beispiel ein in der Zelle vorhandenes großes stabiles Plasmid.
Der Begriff „homolog", wie er bezüglich der Sequenzen A, C und D verwendet wird, ist dazu gedacht, einen Identitätsgrad zwischen beliebigen dieser Sequenzen und den entsprechenden Abschnittes des Genoms anzuzeigen, welcher ausreichend dafür ist, dass eine homologe Rekombination erfolgt. Bevorzugt zeigen die DNA-Sequenzen eine Identität oder wesentliche Identität für mindestens acht aufeinanderfolgende Basenpaare mit den entsprechenden Abschnitten des Genoms. Die DNA-Sequenz kann jedoch länger sein, zum Beispiel kann sie bis zu einige Tausend Nukleotide umfassen.
Der Begriff „flankieren" ist dazu gedacht, anzuzeigen, dass die DNA-Sequenz A oder C homolog mit der genomischen Sequenz ist, bis zu der sie lokalisiert ist, jedoch sich nicht in die DNA-Sequenz B ausdehnt. Der Begriff „überlappen" ist dazu gedacht, anzuzeigen, dass die DNA-Sequenz A oder C homolog ist mit einem Abschnitt der genomischen Sequenz ist, der durch eines der Enden der DNA-Sequenz B und der Sequenz, unmittelbar außerhalb dieser Sequenz, dargestellt wird.
Der Begriff „distal zu C lokalisiert", wie er bezüglich der DNA-Sequenz D verwendet wird, ist dazu gedacht, in seiner herkömmlichen Bedeutung verstanden zu werden, d.h., dass die DNA-Sequenz D homolog mit einer genomischen Sequenz ist, die auf der Seite der genomischen Sequenz lokalisiert ist, die homolog mit der DNA-Sequenz C ist, welche gegenüberliegend zu der Position der zu amplifizierenden DNA-Sequenz B ist. Der Abstand zwischen den genomischen Sequenzen, die homolog mit den DNA-Sequenzen C und D sind, kann von der Situation, in der C und D identisch oder teilweise überlappend sind, bis zu einer Separation von mehreren Tausend Basenpaaren schwanken. Die DNA-Sequenzen zwischen C und D werden jedoch schließlich aus dem Genom entfernt, wenn das Verfahren der Erfindung durchgeführt wird.
In einem anderen Aspekt offenbart die vorliegende Erfindung eine Zelle, die mehrere Kopien einer DNA-Sequenz, welche die Struktur M-B umfasst, in ihrem Genom umfasst, wobei M eine DNA-Sequenz bezeichnet, die einen Selektionsmarker kodiert, und B eine DNA-Sequenz bezeichnet, die ein gewünschtes Polypeptid kodiert, wobei die mehreren Kopien der Struktur M-B zwischen zwei direkt repetitiven Sequenzen lokalisiert sind.
In weiteren Aspekten betrifft die Erfindung ein DNA-Konstrukt, welches die Struktur C-M-A-D, wobei A, C, M, D die oben angezeigte Bedeutung haben, und einen Vektor, welcher das DNA-Konstrukt beherbergt, umfasst.
Schließlich offenbart die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines Polypeptids, das durch eine DNA-Sequenz B kodiert wird, welches das Kultivieren einer Zelle, wie oben definiert, welche mehrere Kopien der DNA-Sequenz B integriert hat, unter Bedingungen, die geeignet („conductive") für die Herstellung des Polypeptids sind und das Gewinnen des resultierenden Polypeptids aus der Kultur umfasst.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Der Integrationsschritt a) des Verfahrens der Erfindung kann durch jedes beliebige Verfahren erreicht werden, dessen Natur von dem in Frage stehenden Organismus und DNA-Konstrukt abhängig ist. Zunächst muss das DNA-Konstrukt in die Zelle eingeführt werden. Das DNA-Konstrukt kann als solches eingeführt werden, unter Verwenden von im Stand der Technik bekannter Techniken zur direkten Einführung von DNA, z.B. unter Verwenden von Elektroporation, Transformation von kompetenten Zellen, Protoplastentransformation oder ballistischer Transformation, jedoch wird es geeigneter Weise von einem Vektor getragen, der in der Lage ist, die Integration des DNA-Konstrukts in das Genom der Zelle zu bewirken.
Der Vektor ist vorteilhafterweise ein Plasmid oder eine Bakteriophage, welches/welcher in die Elternzelle durch jede beliebige Technik, die für den in Frage stehenden Vektor und die in Frage stehende Elternzelle geeignet ist, eingeführt werden kann, einschließlich Transformation, wie oben, Protoplastenfusion, Transfektion, Transduktion und Konjugation.
Nach der Einführung in die Elternzelle wird das DNA-Konstrukt, optional in Kombination mit DNA, die von dem Vektor stammt, durch homologe Rekombination, die zwischen den homologen Sequenzen erfolgt, in ein Genom integriert. In der beigefügten 1 wird dargestellt, wie ein Doppelrekombinationsereignis zwischen einem Genom und dem DNA-Konstrukt zu. einer Zelle gemäß der Erfindung führen kann, welche die Struktur A-B-C-M-A-D in ihrem Genom enthält.
Wenn ein Vektor für die Integration des DNA-Konstrukts verwendet wird, kann eine Selektion von Zellen, welche den Vektor erhalten haben, vor dem Selektionsschritt b) des Verfahrens der Erfindung durchgeführt werden, wodurch die Effizienz, mit der die Integration des DNA-Konstruktes erfolgt, verbessert wird. Für diesen Zweck kann ein Vektor verwendet werden, der in der Lage ist, unter bestimmten (permissiven) Bedingungen zu replizieren, und der nicht in der Lage ist, unter anderen (nicht-permissiven) Bedingungen zu replizieren. Der Vektor kann zum Beispiel einer sein, der Temperatur-sensitiv für die Replikation ist. Demnach kann der Vektor einer sein, der nicht in der Lage ist, bei erhöhten Temperaturen, die dennoch ein Wachstum der Elternzelle erlauben, zu replizieren. Die Zellen werden anfangs bei einer Temperatur kultiviert, welche die Plasmidreplikation erlaubt, und nachfolgend, nachdem die Integration in das bakterielle Genom erfolgt sein könnte, bei einer Temperatur kultiviert, welche die Plasmidreplikation nicht erlaubt, so dass der Vektor aus den Zellen verloren geht, sofern er nicht in das Genom integriert ist.
Der Vektor kann weiterhin einen selektierbaren Marker umfassen. In diesem Fall kann die Kultivierung bei der nicht-permissiven Temperatur unter selektiven Bedingungen erfolgen, um sicherzustellen, dass lediglich Zellen, welche den integrierten Vektor, welcher das DNA-Konstrukt und den selektierbaren Marker einschließt, enthalten, überleben.
Der selektierbare Marker kann jeder beliebige im Stand der Technik bekannte Marker sein, zum Beispiel ein Gen, das für ein Produkt kodiert, welches eine Antibiotikaresistenz auf die Zelle überträgt, welches Prototrophie auf einen auxotrophen Stamm überträgt, oder welches einen Defekt des Wirts ausgleicht (z.B. dal-Gene, die in einen dal-Stamm eingeführt werden; vgl. B. Diderichsen (1986)). Zellen, die unter diesen Bedingungen überleben, sind Zellen, welche den Vektor enthalten, oder Zellen, in denen der Vektor, der das DNA-Konstrukt der Erfindung umfasst, integriert worden ist. Der selektierbare Marker kann zum Beispiel aus einer bekannten Quelle ausgeschnitten werden oder kann in einem Vektor vorhanden sein, zum Beispiel einem Plasmid, der für die Konstruktion des in dem Verfahren der Erfindung zu verwendenden DNA-Konstrukts verwendet wird.
In dem Selektionsschritt b) des Verfahrens der Erfindung, wird eine Selektion von Zellen durchgeführt, die die Struktur A-B-C-M-A-D in jeder beliebigen Orientierung umfassen. Solche Zellen können das Resultat eines Einzelrekombinationsereignisses sein, in welchem Fall der Vektor noch in dem Genom vorhanden ist, oder können vorteilhafterweise das Resultat eines Doppelrekombinationsereignisses sein, in welchem Fall der Vektor nicht in dem Genom vorhanden ist. Das Doppelrekombinationsereignis kann das Resultat von zwei aufeinanderfolgenden Einzelrekombinationsereignissen sein, wobei das erste aus einer Integration des Vektors, der die Struktur C-M-A-D enthält, in das Genom besteht, und das zweite aus dem Ausschneiden des Vektors aus dem Genom besteht. Das Verfahren wird schematisch in 2 dargestellt, aus welcher ersichtlich ist, dass auf die Integration über das Fragment C das Ausschneiden über das Fragment D folgt, oder umgekehrt, was ein Genom ergibt, welches die Struktur A-B-C-M-A-D der Erfindung enthält.
Diese Selektion kann erreicht werden, indem die Zellen unter Selektionsdruck für den Selektionsmarker, der durch die DNA-Sequenz M kodiert wird, wachsen gelassen werden und die dadurch selektierten Zellen auf die Gegenwart der Struktur A-B-C-M-A-D hin analysiert werden, z.B. durch die Verwendung von herkömmlichen DNA-Analysetechniken, einschließlich der Verdauung mit Restriktionsenzymen und Gelanalyse kombiniert mit Southern-Blotting oder durch die Verwendung von PCR unter Verwenden von geeigneten Primern, die charakteristischen Abschnitten der Struktur A-B-C-M-A-D entsprechen.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird ein Temperatur-sensitiver Vektor verwendet, welcher, zusätzlich zu der Struktur C-M-A-D, einen weiteren selektierbaren Marker, Y, trägt. Der Vektor wird in die Elternzelle bei permissiver Temperatur eingeführt, wodurch nach entweder M oder Y oder beiden selektiert wird. Die Vermehrung wird dann bei einer nicht-permissiven Temperatur fortgesetzt und die Selektion nach entweder M oder Y oder beiden wird beibehalten. Zellen, die unter diesen Bedingungen wachsen, besitzen den Vektor in ein Genom integriert (durch eines der drei Fragmente C, A oder D). Nachfolgend werden die Zellen bei einer permissiven Temperatur in Abwesenheit des Selektionsdrucks wachsen gelassen. Dies erlaubt die Plasmidreplikation, das Ausschneiden des integrierten Plasmids aus dem Genom (wiederum durch ein beliebiges der drei Fragmente C, A oder D) und schließlich den Verlust des Plasmids aus den Zellen. Es werden nun Zellen selektiert, welche noch den Selektionsmarker M enthalten, und solche Zellen werden nach der Gegenwart des Selektionsmarkers Y, z.B. durch Replika-Plattierung, gescreent. Solche Zellen können sich nur durch die Integration über das Fragment C, gefolgt von dem Ausschneiden über das Fragment D, oder umgekehrt, ergeben und enthalten die Struktur A-B-C-M-A-D in einem Genom.
Die DNA-Sequenz M, welche in dem durch das vorliegende Verfahren zu integrierenden DNA-Konstrukt vorhanden ist, kann jeden beliebigen selektierbaren Marker kodieren, z.B. von jedem beliebigen oben beschriebenen Typ, in Verbindung mit dem Marker, der optional von dem in dem Verfahren der Erfindung zu verwendenden Vektor getragen wird. Daher kann die DNA-Sequenz M eine Antibiotikaresistenz kodieren, wie eine Resistenz gegenüber Kanamycin, Tetracyclin, Ampicillin, Erythromycin, Chloramphenicol oder eine Resistenz gegenüber verschiedenen Schwermetallen, wie Selen-sauren Salz, Antimon oder Arsenat.
Es ist zu verstehen, dass die erhöhte Anzahl an genomisch integrierten Kopien der DNA-Sequenzen B und M, welche in dem Vermehrungsschritt c) des Verfahrens der Erfindung erhalten werden, das Resultat von aufeinanderfolgenden Rekombinationsereignissen zwischen anfänglich den zwei Kopien der DNA-Sequenz A (direkt repetitiv), welche die DNA-Sequenzen B und M umgeben, sind. Es kann möglich sein, die Amplifikation der DNA-Sequenz B zu regulieren und damit eine vorbestimmte Kopienanzahl zu bekommen, vermittelt durch den verwendeten selektierbaren Marker und die in dem Vermehrungsschritt c) verwendete Stärke des Selektionsdrucks. Es gibt keine theoretische Obergrenze für die Kopienanzahl der in diesem Schritt zu erhaltenden DNA-Sequenzen B und M, in der Praxis wird die Kopienanzahl jedoch durch die Belastung, die auf der Wirtszelle lastet, limitiert.
Es sollte angemerkt werden, dass, wenn das DNA-Konstrukt einmal in ein Genom der Elternzelle integriert worden ist, diese in der Abwesenheit des Selektionsdrucks ohne wesentlichen Verlust des DNA-Konstrukts oder Abschnitten hiervon aus der Zelle kultiviert werden kann. Es wird angenommen, dass dies auf die Tatsache zurückzuführen ist, dass die integrierte DNA nicht in der Lage ist, sich autonom zu replizieren, und zusammen mit dem Wirtsgenom, in welches sie integriert ist, repliziert wird.
Es versteht sich, dass das neue Verfahren der Erfindung generell für die Amplifikation einer DNA-Sequenz, welche in einem Genom vorhanden ist, unabhängig von dem Zelltyp oder dem Genom, anwendbar ist. Die einzige Beschränkung hinsichtlich der Natur der Zelle ist diejenige, dass die Zelle eine ist, welche transformiert werden kann, oder welche auf andere Weise die Einführung fremder DNA erlaubt. Die Zelle kann ein oder mehrere Genome umfassen, z.B. in der Form von Plasmiden oder Chromosomen.
Zum Beispiel kann die Zelle eine mikrobielle Zelle sein, eine Insektenzelle, eine Pflanzenzelle, eine Wirbeltierzelle oder eine Säugertierzelle. Wenn die Elternzelle eine mikrobielle Zelle ist, kann sie eine prokaryotische oder eine eukaryotische Zelle sein, wie eine Bakterien- oder Pilz- (einschließlich Hefe-) Zelle.
Wenn die Zelle eine Bakterienzelle ist, kann sie eine Zelle eines grampositiven Bacteriums sein, wie die Bacillus, Streptomvces und Pseudomonas, z.B. eine Zelle von Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus thuringiensis, Streptomyces lividans oder Streptomyces murinus, oder eine Zelle von einem gramnegativen Bacterium sein, wie Escherichia und Pseudomonas. Andere Beispiele von Bakterienzellen schließen Zellen von Archaebakterien ein, wie Pyrococcus.
Wenn die Zelle eine Pilzzelle ist, kann sie eine Hefezelle sein, wie eine Zelle von Saccharomyces oder Schizosaccharomyces oder eine Zelle von einem filamentösen Pilz, wie eine Zelle von Aspergillus, z.B. A. niger, A. nidulans oder A. oryzae.
Die zu amplifizierende DNA-Sequenz B kann nativ zu der Elternzelle sein oder kann alternativ eine sein, die nicht nativ zu der Elternzelle ist, die jedoch aus einem anderen Organismus geklont worden ist (z.B. des oben beschriebenen Typs), oder welche synthetisiert und nachfolgend in das Wirtschromosom oder ein anderes von dem Wirt getragenes Chromosom durch jeden beliebigen geeigneten Prozess, z.B. Crossing-over, vor der Integration des DNA-Konstruktes der Erfindung eingeführt worden ist. Die DNA-Sequenz B kann in ihrer Gesamtheit eingeführt werden, oder kann in dem in Frage stehenden Wirtsgenom zusammengesetzt werden, z.B. durch aufeinanderfolgende Einführung von Sequenzbestandteilen der Sequenz B. Dieser letztgenannter Ansatz ist insbesondere verwendbar, wenn die DNA-Sequenz B in ihrer Gesamtheit nicht klonierbar ist.
Die DNA-Sequenz B kann eine sein, die jede beliebige Funktion besitzt oder kodiert. Zum Beispiel kann die DNA-Sequenz B einen offenen Leserahmen umfassen, z.B. kodierend für ein strukturelles oder regulatorisches Protein oder Polypeptid, und kann ein einzelnes Gen, ein Gencluster oder ein Operon sein. Die DNA-Sequenz B kann weiterhin ein oder mehrere Regulationssignal(e) umfassen, das/die in die Expression des offenen Leserahmens involviert ist/sind, wie Transkriptions- oder Translationsterminationssequenzen oder Transkriptions- oder Translationsinitiationssequenzen.
Bevorzugt umfasst die DNA-Sequenz B ein exprimierbares Gen, welches alle erforderlichen Regulationssequenzen enthalten kann, wie einen Promotorer, einen Terminator, eine Ribosomenbindungsstelle usw.
Normalerweise ist die zu amplifizierende DNA-Sequenz B eine, die ein gewünschtes Produkt, wie ein Enzym, ein Hormon, eine antigene Komponente, ein immunwirksames Protein oder Peptid, einen Wachstumsfaktor, ein Allergen, ein Tumor-assoziiertes Antigen, ein Blutprotein und dergleichen kodiert, mit anderen Worten, jedes beliebige industriell verwendbare Produkt, dessen Produktion wünschenswert ist.
Beispiele von interessierenden Enzymen schließen amylolytische, lipolytische und proteolytische Enzyme, Transferasen, Isomerasen, Peroxidasen, Oxidasen usw. ein. Insbesondere ist es bevorzugt, dass die DNA-Sequenz B eine Protease, eine Lipase, eine Amylase, eine Galactosidase, eine Pullulanase, eine Cellulase, eine Glucoseisomerase, eine Protein-Disulfid-Isomerase, eine CGTase (Cyclodextringluconotransferase), eine Glucoseoxidase, eine Glucosyltransferase oder eine Xylanase kodiert.
Beispiele von anderen verwendbaren Produkten schließen Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren, Insulin, humanes Wachstumshormon oder Rinderwachstumshormon, humane Blutgerinnungsfaktoren, Interleukin, tPA usw. ein.
Alternativ kann die DNA-Sequenz B ein oder mehrere Gen(e) umfassen, die einen biosynthetischen Stoffwechselweg kodiert/kodieren, ein oder mehrere Gen(e), das/die Elemente des Zelltranskriptions-, Translations- oder Proteinsekretionsapparats kodieren (z.B. Sigmafaktoren oder sec-Gene von prokaryotischen Zellen), einen regulatorischen Faktor, der in der Zelle wirkt, oder eine Metallresistenz kodiert/kodieren, oder die DNA-Sequenz B kann eine auxotrophe Mutation der Elternzelle ausgleichen.
Aus der obigen Offenbarung ist zu verstehen, dass die DNA-Sequenzen A und C homolog mit jeder beliebigen genomischen Sequenz sein können, die die DNA-Sequenz B überlappt oder flankiert. Wenn die DNA-Sequenz B ein Gen ist, kann die DNA-Sequenz A oder C vorteilhafterweise homolog mit der vollständigen oder teilweisen Promotorsequenz sein, die stromaufwärts des kodierenden Abschnitts der DNA-Sequenz B liegt. Ein Beispiel eines solchen Konstruktes ist hierin nachfolgend in Beispiel 1 gezeigt.
Das in dem Verfahren der Erfindung verwendete DNA-Konstrukt kann durch eine Reihe von genetischen Manipulationen unter Anwenden von Verfahren und Enzymen, die im Stand der Technik bekannt sind, synthetisiert werden. Typischerweise wird jede der genomischen Sequenzen, mit denen die DNA-Sequenzen A, C und D homolog sein müssen, durch herkömmliche DNA-Analyseverfahren identifiziert.
Zum Beispiel kann eine cDNA- oder genomische Bibliothek aus dem in Frage stehenden Organismus hergestellt werden und die zu amplifizierende DNA-Sequenz B hierin identifiziert werden. Wenn mindestens ein Abschnitt der DNA-Sequenz B bekannt ist, kann die DNA-Sequenz B durch Screenen nach positiven Klonen durch herkömmliche Hybridisierungsvorgehensweisen identifiziert werden, z.B. unter Verwenden von Oligonukleotidsonden, die anhand des Abschnitts der DNA-Sequenz B gemäß Standardtechniken (vgl. Sambrook et al., 1989) synthetisiert werden, oder, stärker bevorzugt, durch die Verwendung einer Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwenden von degenerierten Oligonukleotidsonden, die auf der Basis des bekannten Abschnitts der DNA-Sequenz B hergestellt werden. Zum Beispiel kann die PCR unter Verwenden der Techniken, die in dem US-Patent Nr. 4,683,202 oder durch R. K. Saiki et al. (1988) beschrieben, durchgeführt werden.
Wenn die Nukleotidsequenz der DNA-Sequenz B unbekannt ist und ein Expressionsprodukt hiervon bekannt ist, kann man cDNA- oder genomische Klone auf eine Aktivität des Produkts hin screenen und dadurch einen Klon identifizieren, von dem die Aktivität exprimiert wird. Nachfolgend wird der Abschnitt der DNA des Klons isoliert und sequenziert und die Lokalisation der DNA-Sequenz B oder eines Abschnitts hiervon wird identifiziert.
Die zu amplifizierende DNA-Sequenz B kann durch eine Mutation identifiziert werden, z.B. durch Transposoninsertionen, welche die Fähigkeit der Zelle, das Produkt von B herzustellen, zerstören, und Abschnitte der DNA-Sequenz B können, z.B. durch inverse PCR unter Verwenden von Primern, die den Transposonsequenzen entsprechen, bestimmt werden. Auf diese Weise können die DNA-Sequenzen, die die Enden von B und flankierende Regionen umfassen, bestimmt werden, sogar wenn B entweder teilweise oder in ihrer Gesamtheit nicht klonierbar wäre.
Um in der Lage zu sein, die DNA-Sequenzen A, C und D herzustellen, sollten mindestens die 5'- und 3'-Enden von B (einschließlich mindestens ausreichender Sequenzdaten, um die spezifische Bindung einer Sonde oder eines PCR-Primers zu erlauben, z.B. 12 Nukleotide) bekannt sein. Sobald die Sequenzen dieser Enden identifiziert worden sind, kann die DNA, welche die beiden Enden der DNA-Sequenz B flankiert oder überlappt identifiziert werden, z.B. durch Hybridisierung oder PCR-Analyse, und nachfolgend sequenziert werden. Auf der Basis dieser Sequenzen werden die DNA-Sequenzen A, C und D herstellt.
Die DNA A, C, D und M können synthetisch hergestellt werden oder können von cDNA- oder genomischer Herkunft sein, z.B. unter Verwenden der oben beschriebenen Verfahren aus einer genomischen oder cDNA-Bibliothek isoliert werden.
Alternativ kann die DNA-Sequenz des DNA-Konstruktes der Erfindung synthetisch durch etablitierte Standardverfahren hergestellt werden, z.B. dem Phosphoamidit-Verfahren, beschrieben von Beaucage und Caruthers (1981) oder dem Verfahren, beschrieben von Matthes et al. (1984). Gemäß dem Phosphoamidit-Verfahren werden Oligonukleotide synthetisiert, z.B. in einem automatischen DNA-Synthetisierer, gereinigt, annealed, ligiert und in geeigneten Vektoren kloniert.
Schließlich kann das DNA-Konstrukt von gemischter genomischer und synthetischer, gemischter synthetischer und cDNA- oder gemischter genomischer und cDNA-Herkunft sein, das gemäß Standardtechniken durch Ligieren von Fragmenten von synthetischer, genomischer oder cDNA-Herkunft (wie geeignet) hergestellt wird, wobei die Fragmente verschiedenen Abschnitten des gesamten rekombinanten DNA-Moleküls entsprechen.
Wie oben ausgeführt, ist die DNA-Sequenz B vorteilhafterweise eine, welche ein interessierendes Polypeptid kodiert, und die vorliegende Erfindung betrifft konsequenterweise weiterhin ein Verfahren zum Herstellen eines interessierenden Polypetids, welches das Kultivieren einer Zelle gemäß der Erfindung, die mehrere Kopien einer DNA-Sequenz, welche die Struktur M-B umfasst, in einem Genom enthält, in welcher B das interessierende Polypeptid kodiert, unter Bedingungen, die geeignet („conductive") für die Herstellung des Polypeptids sind, und Gewinnen des resultierenden Polypeptids aus der Kultur umfasst. Das durch das vorliegende Verfahren hergestellte Polypeptid kann jedes beliebige der oben aufgeführten Produkte sein, wie ein Enzym, zum Beispiel eine Protease, Amylase oder Lipase.
Die vorliegende Erfindung wird weiterhin durch die beigefügten Zeichnungen dargestellt, in welchen
1 ein Doppelrekombinationsereignis zwischen einem Genom und einem DNA-Konstrukt der Erfindung darstellt, das in einer Zelle resultiert, welche die Struktur A-B-C-M-A-D in ihrem Genom enthält,
2 ein Doppelrekombinationsereignis darstellt, welches das Resultat von zwei sequentiellen Einzelrekombinationsereignissen ist, wobei das erste aus einer Integration des Vektors, welcher die Struktur C-M-A-D enthält, in das Genom besteht, und das zweite aus dem Ausschneiden des Vektors aus dem Genom besteht, welches ein Genom ergibt, dass die Struktur A-B-C-M-A-D der Erfindung enthält. Verschiedene Möglichkeiten der Integration bzw. des Ausschneidens sind dargestellt,
3 eine Restriktionskarte des Plasmids pDN1981 ist,
4 eine Restriktionskarte des Plasmids pSJ1985 ist,
5 eine Restriktionskarte des Plasmids pSJ2024 ist,
6 eine Restriktionskarte des Plasmids pSJ980 ist,
7 eine Restriktionskarte des Plasmids pSJ1926 ist,
8 eine Restriktionskarte des Plasmids pSJ2059 ist, und
9 genomische Karten und Integrationsereignisse darstellt, auf die in Beispiel 1 Bezug genommen wird, von denen
A das amvL-Gen in dem Chromosom von B. licheniformis darstellt,
B die Integration über ein Promotorfragment (ooooooo),
C die Integration über ein amyL-Fragment (dem 5'-Abschnitt der kodierenden Sequenz **********)
D die Integration über das stromabwärts liegende amyL-Fragment (stromabwärts der kodierenden Sequenz xxxx),
E das Ausschneiden des Plasmids des Integrationstyps C über das Homolog stromabwärts der kodierenden Sequenz (xxx),
F die Amplifikation der P-amyL-kanB-Region (anfänglich über die zwei Promotorregionen oooooo) darstellt.
Die Erfindung wird weiterhin in den folgenden Beispielen dargestellt, welche in keiner Weise dazu gedacht sind, den Schutzumfang (Schutzbereich) der Erfindung, wie beansprucht, zu beschränken.
MATERIALIEN UND METHODEN
Stämme:
Bacillus licheniformis SJ1904 ist der α-Amylase-produzierende Stamm, der von dem Stamm SJ1707 durch Integration/Ausschneiden des Plasmids pSJ1755, wie beschrieben in Beispiel 6 von WO 93/10249, deren Inhalt hierin durch Bezugnahme eingeschlossen wird, abgeleitet ist.
Bacillus subtilis DN1885: ein amyE-, amyR2-, spo⁺-, Pro⁺-Derivat von B. subtilis 168 (Diderichsen et al., 1990).
Medien:
ALLGEMEINE VERFAHREN
Die experimentellen Techniken, die zum Konstruieren der Plasmide verwendet wurden, waren Standardtechniken auf dem Gebiet der rekombinanten DNA-Technologie, vgl. Sambrook et al. (1989).
Die Restriktionsendonukleasen wurden von New England Biolabs und Boehringer Mannheim bezogen und verwendet, wie von den Herstellern empfohlen. Die T4-DNA-Ligase wurde von New England Biolabs bezogen und verwendet, wie von dem Hersteller empfohlen.
Die Herstellung von Plasmid-DNA aus allen Stämmen wurde durch das von Kieser, 1994, beschriebene Verfahren vorgenommen.
Tranformation von B. subtilis
Kompetente Zellen wurden hergestellt und transformiert, wie von Yasbin et al., 1975, beschrieben,.
Transformation von B. licheniformis
Die Plasmide wurden durch Polyethylenglycol-vermittelte Protoplastentransformation in B. licheniformis eingeführt, wie von Akamatzu, 1984, beschrieben.
Die Amylase-Aktivität wurde mit dem Phadebas^®-Amylase-Testkit von Pharmacia Diagnostics bestimmt, wie von dem Anbieter beschrieben.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Amplifikation eines Amylase-kodierenden Gens
Dieses Beispiel stellt die Amplifikation eines Amylase-kodierenden Gens dar, welches in dem Chromosom des B. licheniformis-Stammes SJ1904 vorhanden ist. Der gemäß diesem Beispiel konstruierte Stamm ist einer, der in seinem Chromosom in der folgenden Anordnung enthält:
1) den Amylasepromotor, 2) das Amylasestrukturgen, 3) ein Kanamycinresistenzgen und 4) eine weitere Kopie des Amylasepromotors. Die zwei Kopien des Amylasepromotors funktionieren in diesem Fall als direkt repetitive DNA-Sequenzen A.
Von der Selektion für ein Wachstum bei ansteigendem Level an Kanamycin ist gezeigt worden, dass sie zu einer Amplifikation des Amylase-kodierenden Gens (einschließlicih Promotor) und des Kanamycinresistenzgens führt.
Plasmid-Konstruktionen
Alle Plasmide wurden in B. subtilis DN1885 konstruiert, welche für eine Kanamycinresistenz (10 μg/ml) selektiert.
pDN1981 (3) enthält das B. licheniformis α-Amylase- (amyL) Gen und ist von Jørgensen et al., 1990 beschrieben worden.
pSJ1985 (4) enthält den amyL-Promotor (P_amyL), gefolgt von einem Fragment mit 210 Bp, welches ursprünglich unmittelbar stromabwärts der amyL-Terminatorsequenz gelegen war. Das Fragment wurde aus pDN1981 mit den Primern LWN3226 + LWN3223 (Tabelle 1) PCT-amplifiziert, verdaut mit NdeI und HindIII und ligiert mit dem Fragment NdeI-HindIII mit 4 kB aus pDN1981, um pSJ1985 zu ergeben.
pSJ2024 (5) enthält diese Kombination aus Promotor und stromabwärts gelegenem Fragment in einem Temperatur-sensitiven Plasmid, basiert auf pE194 (Horinouchi und Weisblum, 1982b). Es wurde durch die Ligation des Fragments BglII-HindIII mit 1,7 kB aus pSJ1985 mit dem Fragment BglII-HindIII mit 4,9 kB aus pSJ980 konstruiert (6). pSJ980 wird in WO 93/10249 beschrieben.
pSJ1926 (7) enthält das amyL-Gen einschließlich seiner Terminatorsequenz, jedoch wurden die Sequenzen stromabwärts des Terminators deletiert (das stromabwärts liegende Fragment mit 210 Bp, welches auf pSJ1985 enthalten ist, ist daher nicht in pSJ1926 vorhanden). Ein Fragment mit 0,5 kB aus pDN1981 wurde mit den Primern LWN3224 + LWN3227 (Tabelle I) PCR-amplifiziert, verdaut mit SalI und HindIII und ligiert mit dem Fragment SalI-HindIII mit 5,2 kB aus pDN1981, welches pSJ1926 ergibt. Das Fragment SalI-HindIII von pSJ1926, welches durch PCR-Amplifikation erhalten wurde, ist DNA-sequenziert worden und enthält keine PCR-induzierten Mutationen.
pSJ2059 (8) enthält ein Fragment des amyL-Gens mit 1 kB, welches lediglich die Terminatorsequenz, ein Kanamycinresistenzgen, den amyL-Promotor und schließlich das Fragment, welches stromabwärts des amyL-Terminators liegt, einschließt, wobei alle von einer Temperatur-sensitiven Herkunft sind. pSJ1926 wurde mit EcoRI und KpnI verdaut und das Fragment mit 1 kB wurde zwischen EcoRI und KpnI in pSJ2024 eingebracht, um pSJ2059 zu ergeben.
Tabelle 1 Liste der Primer
Transformation von B. licheniformis
pSJ2059 wurde in B. licheniformis SJ1904 durch Protoplastentransformation eingeführt, welches für eine Erythromycinresistenz selektiert (5 μg/ml). Ein Transformant, der so erhalten wurde, war der Stamm SJ2127.
Integration
SJ2127 wurde auf LB-Platten mit 10 μg/ml Kanamycin ausgestrichen und bei 50 °C inkubiert. Da pSJ2059 Temperatur-sensitiv für die Replikation ist, führen lediglich Zellen, die eine chromosomal integrierte Kopie des Plasmids enthalten, zu Kolonien.
pSJ2059 enthält drei verschiedene Regionen, die homolog mit der chromosomalen amyL-Region in SJ1904 sind, und eine Integration ist durch Rekombination an einer beliebigen dieser drei Regionen möglich. Dieses würde Stämme ergeben, in denen das Chromosom wie in 9B, C oder D angezeigt, aussehen würde.
Ein Plasmid, das wie in 9B integriert ist, würde nicht ausgeschnitten werden können, um den gewollten Stamm zu ergeben.
Ein Plasmid, das wie in 9C integriert ist, könnte den gewollten Stamm ergeben, wenn das Ausschneiden durch Rekombination an dem stromabwärts gelegenen Fragment erfolgen würde.
Ein Plasmid, das wie in 9D integriert ist, könnte den gewollten Stamm ergeben, wenn das Ausschneiden durch Rekombination an dem amyL-Strukturgenfragment erfolgen würde.
8 Kolonien der 50 °C-Platten wurden durch PCR-Amplifikation unter Verwenden der Primer LWN3208 + LWN3554 (Tabelle I) überprüft. Die Reaktionen wurden direkt mit dem Material durchgeführt, das durch Resuspendieren und Kochen der Zellen in TY-Medium erhalten wurde. Die Position der Primer ist in 9B, D und E angezeigt.
Es sollte kein PCR-amplifiziertes Fragment von einer B-Typ-Integrierung erhalten werden, während ein C-Typ ein Fragment mit 2,7 kB und ein D-Typ ein Fragment mit 7,5 kB ergeben sollte.
Bei 5 von den 8 Kolonien wurde ein Fragment mit 2,7 kB beobachtet, was anzeigte, dass die Integration in diesen Fällen über das amyL-Strukturgenfragment erfolgt ist, welches Integrationen des C-Typs ergibt. Diese wurden dann in TY-Medium bei 30 °C vermehrt, um das Ausschneiden und den Verlust des Plasmids zu ermöglichen. Drei Übertragungen in TY-Medium folgend, wurden Kana^R Erm^S-Kolonien durch Replika-Ausplattierung gefunden. Die Erythromycinsensitivität zeigt den Verlust des Plasmids an. Das Fragment mit 2,7 kB konnte von diesen Kolonien dennoch durch PCT-Amplifikation hergestellt werden, wie erwartet, wenn das Ausschneiden durch eine Rekombination an dem stromabwärts gelegenen Fragment stattgefunden hatte, welches das in 9E gezeigte Resultat ergibt. Ein Stamm, der von jeder der 5 einzelnen 50 °C-Kolonien erhalten wurde, wurde aufbewahrt, als SJ2147–2151.
Amplifikation
Die α-Amylase- (amyL) + Kanamycinresistenzgene in den Stämmen SJ2148 und SJ2150 wurden durch die folgende Vorgehensweise amplifiziert:
Die Stämme wurden in 10 ml TY-Medium + 10 μg/ml Kanamycin inokuliert und bei 37 °C über Nacht geschüttelt. Neue 10 ml-Kulturen, welche 20, 50, 100 und 200 μg/ml Kanamycin enthielten, wurden mit 100 μl der 10 μg/ml-Kultur inokuliert und bei 37 °C über Nacht geschüttelt. 10 ml-Kulturen, die 500, 1000, 1500, 2000 und 2500 μg/ml Kanamycin enthielten, wurden mit 100 μl der 200 μg/ml-Kultur inokuliert.
Die 2000 und die 2500 μg/ml-Kulturen wurden für 4 Tage inkubiert, die anderen wurden nach einem Wachstum über Nacht geerntet. Es wurden Aliquots von allen Kulturen in 15 % Glycerol eingefroren und Zellen für die Herstellung von chromosomaler DNA geerntet.
Isolierte Stämme
Chromosomale DNA von den obigen Stämmen wurde mit BglII verdaut, welches ein Fragment mit 4,1 kB ergeben sollte, das von der amplifizierten DNA stammt (vgl. 9F). Dieses Fragment ist in einem EtBr-gefärbten Gel sichtbar, sogar bei den Stämmen, die bei 10 μg/ml Kanamycin selektiert wurden, es wird ansteigend deutlich sichtbar bei 20 und 50 μg/ml und verbleibt bei dem hohen Level in dem Rest der Stämme.
Ausbeuteeffekt der Amplifikation
Schüttelflaschen mit BPX-Medium wurden direkt mit den Glycerol-gefrorenen Kulturen inokuliert und bei 300 upm bei 37 °C geschüttelt.
Die Ausbeuten an α-Amylase, die mit den amplifizierten Stämmen erhalten wurden, wurden mit der Ausbeute verglichen, die mit dem Stamm SJ1904 erhalten wurde.
Es ist offensichtlich, dass die amplifizierten Stämme alle mehr α-Amylase produzieren als der Eltern-Stamm.
BEISPIEL 2
Amplifikation eines CGTase-kodierenden Gens
Dieses Beispiel stellt die Amplifikation eines Gens dar, das für eine Cyclodextringlycosyltransferase (cgtA) kodiert. Das Gen wurde ursprünglich aus einem Thermoanaerobacter sp. kloniert und in einer Kopie in das Chromosom eines Stamms von Bacillus licheniformis eingebracht, wobei es das endogene alpha-Amylasegen (amyL) des Stamms ersetzte. Das CGTase-Gen wurde mit einer effizienten mutierten Version des alpha-Amylasepromotors und des alpha-Amylasesignalpeptids in dem in diesem Verfahren verwendeten Plasmid kombiniert und eine Transformation von B. licheniformis mit dem rekombinanten Konstrukt war lediglich erfolgreich, wenn ein spontanes Rekombinationsereignis das amyL-cgtA-Gen auf das Chromosom unter der Kontrolle des Wildtyp-amyL-Promotors übertrug. Ein späterer Rekombinationsschritt wurde dann verwendet, um den mutierten Promotor vorgeschaltet zu dem chromosomalen amyL-cgtA-Gen einzuführen. Diese Arbeit, die unter anderem in dem Stamm SJ1707, der in dem vorliegenden Beispiel verwendet wird, resultierte, ist in WO 93/10249 und WO 93/10248 beschrieben worden.
Da der Erfinder nicht in der Lage war, Transformanten von B. licheniformis mit Plasmiden zu erhalten, welche das amyL-cgtA-Gen, das von dem mutierten Promotor exprimiert wurde, enthalten, war die Amplifikation dieser Expressionskassette in dem Chromosom nicht mit Verfahren möglich, die die Einführung der gesamten Kassette in einem Schritt erfordern, sie war jedoch mit dem in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Verfahren möglich.
Der Stamm, der gemäß diesem Beispiel konstruiert wurde, ist einer, welcher in seinem Chromosom in der folgenden Anordnung enthält:
1) Den mutierten amyL-Promotor, 2) das amyL-cgtA-Gen, 3) ein Kanamycinresistenzgen und 4) eine weitere Kopie des mutierten amyL-Promoters. Die zwei Kopien des amyL-Promotors funktionieren in diesem Fall als die direkt repetitiven DNA-Sequenzen A.
Von der Selektion für ein Wachstum bei ansteigendem Level an Kanamycin ist gezeigt, dass sie zu einer Amplifikation des amyL-cgtA-Gens, einschließlich des mutierten Promoters und des Kanamycinresistenzgens führt.
Das Chromosom von SJ1707 enthält ein Fragment des amyL-Gens, distal zu dem amyL-cgtA-Konstrukt gelegen (vgl. WO 93/10249). Das Plasmid pSJ2059 könnte daher als ein Werkzeug verwendet werden, um ein amplifizierbares Derivat des Stamms SJ1707 auf die gleiche Weise zu konstruieren, wie es in Beispiel 1 für die Amplifikation des Amylasegens von B. licheniformis verwendet wurde.
Transformation:
pSJ2059 wurde in B. licheniformis SJ1707 durch Protoplastentransformation eingeführt, welches für eine Erythromycinresistenz selektiert (5 μg/ml) bei 30 °C.
Ein erhaltener Transformant wurde als SJ2285 aufbewahrt.
Integration:
SJ2285 wurde auf LB-Platten mit 10 μg/ml Kanamycin ausgestrichen und bei 50 °C über Nacht inkubiert.
10 Kolonien, die bei 50 °C gebildet wurden, wurden in TY-Medium bei 30 °C vermehrt, um das Ausschneiden und den Verlust des integrierten Plasmids zu ermöglichen.
Auf einen Transfer in TY-Medium folgend, wurden Kana^R Erm^S-Kolonien gefunden durch Replika-Plattierung der Kulturen, die von 7 der 10 Integrationskolonien stammten.
Amplifikationen (wie in Beispiel 1) wurden mit 4 dieser Stämme vorgenommen und Isolate, die letztendlich in 2000 μg/ml Kanamycin wuchsen, wurden von 3 dieser 4 erhalten.
Eine amplifizierte Reihe wurde aufbewahrt:

Kanamycinkonzentration Stamm

μg/ml

10 SJ2322

20 SJ2323

50 SJ2324

100 SJ2325

200 SJ2326

500 SJ2327

1000 SJ2328

1500 SJ2329

2000 SJ2330
SJ2323–SJ2326 wurden aus SJ2322 (100 μl in 10 ml) inokuliert und SJ2327–SJ2330 wurden von SJ2326 inokuliert. Aliquots von allen Kulturen wurden in 15 % Glycerol eingefroren und Zellen für die Herstellung von chromosomaler DNA wurden geerntet.
Southern-Analysen von chromosomaler DNA der Stämme SJ2324 und SJ1328, die mit EcoRI verdaut wurden, ergaben ein Fragment mit 5,5 kB, wie es von der Amplifikation der amyL-cgtA- + Kanamycinresistenzgene erwartet wurde. Das Fragment mit 5,5 kB aus dem Stamm SJ2328 wurde bereits in dem EtBr-gefärbten Agarosegel sehr deutlich sichtbar.
Ausbeuteeffekt der Amplifikation:
Schüttelflaschen mit BPX-Medium wurden direkt mit den Glycerol-gefrorenen Kulturen inokuliert und bei 300 upm bei 37 °C geschüttelt. Die Ausbeuten an CGTase, die mit den amplifizierten Stämmen erhalten wurden, wurden mit der Ausbeute verglichen, die mit dem Stamm SJ1707 erhalten wurde.
Es ist offensichtlich, dass die amplifizierten Stämme mehr CGTase produzieren, als der Eltern-Stamm.

Die Stabilität von einigen der Stämme aus den Schüttelflaschen ohne Kanamycin wurde durch Ausplattierung auf LB-Platten, welche Stärke enthielten, und Bewerten einer Hof-Bildung enthielten, überprüft. Der ultimative Effekt der genetischen Instabilität würde ein Verlust sogar der letzten Kopie des CGTase-Gens sein, was in CGTase-negativen Segreganten resultieren würden, die nicht in der Lage sein würden, Höfe auf Stärkeplatten zu produzieren.

SJ2322:	100/100 positiv (Exp. A) 300/300 positiv (Exp. B)
SJ2324:	100/100 positiv (Exp. A) 300/300 positiv (Exp. B) 120/120 positiv (Exp. C)
SJ2328:	200/200 positiv (Exp. A) 500/500 positiv (Exp. B) 120/120 positiv (Exp. C)

Keiner dieser untersuchten Stämme verlor die letzte Kopie des CGTase-Gens unter den getesteten Bedingungen.
REFERENZEN

Jørgensen et al. (1990). In vivo genetic engineering : homologous recombination as a tool for plasmid construction. Gene 96, 37–41.
Horinouchi, S. und Weisblum, B. (1982b). Nucleotide sequence and functional map of pE194, a plasmid that specifies inducible resistance to macrolide, lincosamide, and streptogramin type B antibiotics. J. Bacteriol., 150, 804–814.
B. Diderichsen, (1986), Bacillus: Molecular Genetics and Biotechnology Applications, A.T. Ganesan und J.A. Hoch, Herausgeber, Academic Press, S. 35–46.
Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning : a laboratory manual. 2. Auflage Beaucage et al., Tetrahedron Letters 22, 1981, S. 1859–1869,
Matthes et al., EMBO Journal 3, 1984, S. 801–805
Saiki et al. (1988), Science 239, 1988, S. 487–491.
Diderichsen et al. (1990). Cloning of aldB, which encodes α-acetolactate decarboxylase, an exoenzyme from Bacillus brevis. J. Bacteriol., 172, 4315–4321.
Kieser, T. (1984), Factors affecting the isolation of CCC DNA from Streptomyces lividans and Escherichia coli. Plasmid 12, 19–36.
Akamatzu et al. (1984), An improved method of protoplast regeneration for Bacillus species and its application to protoplast fusion and transformation. Agric. Biol. Chem. 48, 651–655. Yasbin et al. (1975), J. Bacteriol. 121, 296–304.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Amplifizieren einer DNA-Sequenz B in vivo, welche in einem Genom von einer prokaryotischen Eltern-Bakterienzelle vorhanden ist, welches umfasst a. Integrieren eines DNA-Konstruktes, welches die Struktur C-M-A-D umfasst, in ein Genom der Zelle, wobei A eine DNA-Sequenz bezeichnet, welche homolog mit einem genomischen DNA-Fragment ist, welches die zu amplifizierende DNA-Sequenz B entweder flankiert oder überlappt, oder welche eine Untersequenz der DNA-Sequenz B ist, die eines der Enden der Sequenz B darstellt, C eine DNA-Sequenz bezeichnet, welche homolog mit einem genomischen DNA-Fragment ist, welches die zu amplifizierende DNA-Sequenz B entweder flankiert oder überlappt, oder welche eine Untersequenz der DNA-Sequenz B ist, die eines der Enden der Sequenz B darstellt, wobei die Sequenz C, verglichen mit A, an dem gegenüberliegenden Ende der Sequenz B lokalisiert ist, D eine DNA-Sequenz bezeichnet, welche homolog mit einem genomischen DNA-Fragment ist, welches distal zu C, verglichen mit B, lokalisiert ist, und M eine DNA-Sequenz bezeichnet, welche einen Selektionsmarker kodiert, b. Selektieren von Zellen, in denen die DNA-Sequenz M entweder stromaufwärts oder stromabwärts von der DNA-Sequenz B zusammen mit der Sequenz A in das Genom integriert worden ist, welche Zellen die Struktur A-B-C-M-A-D in beliebiger Orientierung umfassen, und c. Vermehren der in Schritt b. selektierten Zellen unter ansteigendem Selektionsdruck für den Selektionsmarker, der durch die DNA-Sequenz M kodiert wird, um eine Zelle zu erhalten, die, verglichen mit der Elternzelle, eine erhöhte Anzahl an genomisch integrierten Kopien der DNA-Sequenzen B und M erhalten hat.
Verfahren nach Anspruch 1, in welchem das DNA-Konstrukt von einem geeignteten Vektor übertragen wird, bevorzugt einem Plasmid oder einem Phagen.
Verfahren nach Anspruch 2, in welchem der Vektor für eine Replikation temperatursensitiv ist.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3, in welchem die prokaryotische Eltern-Bakterienzelle eine Zelle von einem grampositiven Bakterium, bevorzugt Bacillus oder Streptomyces, oder eine Zelle von einem gramnegativen Bakterium, bevorzugt Escherichia, ist.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4, in welchem die DNA-Sequenz B einen offenen Leserahmen umfasst.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 5, in welchem die DNA-Sequenz B heterolog zu der Elternzelle ist, und von einem Mikroorganismus, einer Pflanze, einem Insekt, einem Wirbeltier oder einem Säugetier abgeleitet ist.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 6, in welchem die DNA-Sequenz B ein Enzym, ein Hormon, eine antigene Komponente, ein immunwirksames Protein oder Peptid, einen Wachstumsfaktor, ein Allergen, ein Tumor-assoziiertes Antigen oder ein Blutprotein kodiert.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 7, in welchem die DNA-Sequenz B ein oder mehrere Gen(e), welche(s) einen biosyntethischen Stoffwechselweg („pathway") kodiert/kodieren, ein oder mehrere Gen(e), welche(s) Elemente des Zelltranskriptions-, Translations- oder Proteinsekretionsapparats, einen regulatorischen Faktor, der in der Zelle wirkt, eine Metallresistenz kodiert/kodieren, umfasst, oder B eine auxotrophe Mutation der Wirtszelle ausgleicht.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 8, in welchem die DNA-Sequenz B ein Gen ist, und die DNA-Sequenz A homolog mit einer vollständigen oder teilweisen Promotorsequenz, stromaufwärts von dem kodierenden Teil der DNA-Sequenz B ist.
Verfahren nach einem beliebigen der vorangehenden Ansprüche, in welchem die DNA-Sequenz M ein Produkt kodiert, welches eine Antibiotikaresistenz auf die Elternzelle überträgt, welches Prototrophy auf eine auxotrophe Zelle überträgt, oder welches einen Defekt der Elternzelle ausgleicht.
Verfahren nach Anspruch 10, in welchem die Antibiotikaresistenz eine Resistenz gegenüber Kanamycin, Tetracyclin, Ampicillin, Erythromycin, Chloramphenicol ist, oder in welchem die DNA-Sequenz M ein Produkt kodiert, welches eine Resistenz gegenüber einem Schwermetall überträgt.
Vektor, welcher ein DNA-Konstrukt beherbergt, welches die Struktur C-M-A-D umfasst, wobei A eine DNA-Sequenz bezeichnet, welche homolog mit einem genomischen DNA-Fragment ist, welches eine zu amplifizierende DNA-Sequenz B entweder flankiert oder überlappt, oder welche eine Untersequenz der DNA-Sequenz B ist, die eines der Enden der Sequenz B darstellt, C eine DNA-Sequenz bezeichnet, welche homolog mit einem genomischen DNA-Fragment ist, welches die zu amplifizierende DNA-Sequenz B entweder flankiert oder überlappt, oder welche eine Untersequenz der DNA-Sequenz B ist, die eines der Enden der Sequenz B darstellt, wobei die Sequenz C, verglichen mit A, an dem gegenüberliegenden Ende der Sequenz B lokalisiert ist, D eine DNA-Sequenz bezeichnet, welche homolog mit einem genomischen DNA-Fragment ist, welches distal zu C, verglichen mit B, lokalisiert ist, und M eine DNA-Sequenz bezeichnet, welche einen Selektionsmarker kodiert.
Vektor nach Anspruch 12, welcher ein Plasmid oder ein Bakteriophage ist.
Vektor nach Anspruch 13, welcher weiterhin einen temperatursensitiven Replikationsursprung umfasst.
DNA-Konstrukt, welches die Struktur C-M-A-D umfasst, wobei A eine DNA-Sequenz bezeichnet, welche homolog mit einem genomischen DNA-Fragment ist, welches eine zu amplifizierende DNA-Sequenz B entweder flankiert oder überlappt, oder welche eine Untersequenz der DNA-Sequenz B ist, die eines der Enden der Sequenz B darstellt, C eine DNA-Sequenz bezeichnet, welche homolog mit einem genomischen DNA-Fragment ist, welches die zu amplifizierende DNA-Sequenz B entweder flankiert oder überlappt, oder welche eine Untersequenz der DNA-Sequenz B ist, die eines der Enden der Sequenz B darstellt, wobei die Sequenz C, verglichen mit A, an dem gegenüberliegenden Ende der Sequenz B lokalisiert ist, D eine DNA-Sequenz bezeichnet, welche homolog mit einem genomischen DNA-Fragment ist, welches distal zu C, verglichen mit B, lokalisiert ist, und M eine DNA-Sequenz bezeichnet, welche einen Selektionsmarker kodiert.