DE69837086T2

DE69837086T2 - Verbesserte prokariontische proteinenexpression

Info

Publication number: DE69837086T2
Application number: DE69837086T
Authority: DE
Inventors: Robert Colin Harwood; Keith Stephenson; Steen Jorgensen; Christina Jensen; Tina Kristensen
Original assignee: Novozymes AS; Newcastle University Ventures Ltd
Current assignee: Novozymes AS; Newcastle University Ventures Ltd
Priority date: 1997-04-26
Filing date: 1998-04-24
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2018-04-25
Also published as: JP4312834B2; GB9708452D0; EP0977875B1; DE69837086D1; CN1253591A; DK0977875T3; EP0977875A1; WO1998049328A1; JP2001527401A; CN1142280C; AU7057098A; ATE353971T1

Description

Die Erfindung betrifft ein neues prokaryotisches Expressionssystem und dadurch exprimierte Proteine.
Die industrielle Herstellung von Proteinen hat in vielen Fällen native Expressionssysteme und sekretorische Systeme von Mikroorganismen und insbesondere Bakterien ausgenutzt. Beispielsweise und ohne Beschränkung ist vom Bakterium Bacillus subtilis bekannt, dass es eine Anzahl von Proteinen produziert und sekretiert. Eines dieser Proteine, α-Amylase, ist von industrieller Bedeutung, und somit ist das Ernten dieses sekretierten Proteins eine gegenwärtig von der Industrie durchgeführte Tätigkeit. Allerdings wird die Ausbeute des Proteins durch Proteinabbau während oder unmittelbar nach oder gerade nach dem Durchtritt durch die Zellmembran vermindert.
Daraus ergibt sich, dass es einen Bedarf gibt, ein Proteinexpressionssystem bereit zu stellen, das die Produktion nativer Proteine oder tatsächlich heterologer oder rekombinanter Proteine erhöht, und insbesondere diese Produktion durch Verminderung des Abbaus des Proteins zu erhöhen.
Es ist auch bekannt, Mikroorganismen bereit zu stellen, die ein heterologes Protein, d.h. Proteine, die für bestimmte Bakterien nicht nativ sind, exprimieren und vorteilhafterweise sekretieren. Diese Art von System umfasst die Transformation einer Bakterienzelle mit heterologer DNA mit der Absicht, ein rekombinantes Protein herzustellen oder zu produzieren. Mikroorganismen, wie Escherichia coli (Bakterium), Saccharomyces cervisiae, Aspergillus nidulans und Neurospora crassa (Pilz), wurden auf diese Weise benutzt.
Die Expression eines heterologen Proteins in diesen primitiven Eukaryoten ermöglicht es, dass einige wünschenswerte eukaryotische post-translationale Modifikationen in diesen heterologen Proteinen auftreten, was dazu führt, dass die Stabilität des exprimierten Proteins und die nachfolgende Verbesserung der Ausbeute zunimmt. Kürzlich wurde die Verwendung von Säuger- und Insektenzellkultursystemen entwickelt, um die Expression eukaryotischer Proteine zu erleichtern, die aus verschiedenen Gründen in einer prokaryotischen Wirtszelle nicht exprimiert werden können.
Allerdings bleibt die Kosteneffizienz der Herstellung eines rekombinanten Proteins noch der Hauptvorteil, der von gentechnischen prokaryotischen Expressionssystemen angeboten wird, und tatsächlich wurden signifikante Vorteile bei der Entwicklung gentechnischer E.coli-Stämme gemacht, die die Ausbeute spezifischer rekombinanter Proteine erhöhen. Die Entwicklung dieser Bakterienstämme wurde mit einer ständig zunehmenden Entwicklung von effizienteren Vektoren zusammengebracht, die angepasst sind, die Expression eines rekombinanten Proteins zu optimieren. Diese Vektoren enthalten üblicherweise Promotorelemente, die in einfacher Weise an oder ausgeschaltet werden können.
Allerdings gibt es zwei Hauptnachteile, wenn E.coli als Mittel zur Expression eines rekombinanten Proteins verwendet wird. Erstens können hohe Expressionsmengen dazu führen, dass das rekombinante Protein in dem bakteriellen Cytoplasma als „Einschlusskörper" präzipitiert. Dieses Merkmal wurde als vorteilhaft angesehen, da es ein einfaches Mittel sein kann, die unlöslichen rekombinanten Proteine von den löslichen endogenen E.coli-Proteinen zu trennen. In der Realität ist dieser Vorteil jedoch kein allgemeines Merkmal des Systems, da in vielen Fällen das Protein als unlösliches Präzipitat bleibt, dass nur in die Lösung freigesetzt werden kann, indem ein starkes chaotropes Mittel verwendet wird. Dies stellt aber ein Hauptproblem dar, wenn das in Rede stehende Protein besonders labil ist und dadurch seine biochemische oder biologische Aktivität durch Denaturierung verliert. Zweitens führt die Expression eines fremden Proteins in E.coli zu einem schnellen Abbau dieser Proteine über ein effizientes proteolytisches System. Somit entstehen Schwierigkeiten hinsichtlich der Isolierung eines intakten rekombinanten Proteins aus E.coli-Zellen.
E.coli-Stämme (TOPP-Serie, BL21) wurden konstruiert, um die Expression rekombinanter Proteine zu ermöglichen, die üblicherweise in traditionellen Laborstämmen von E.coli schwierig sind, zu exprimieren. Diese konstruierten E.coli-Stämme sind nicht so invariabel wie biologisch unfähig wie traditionelle Laborstämme von E.coli, und als Folge benötigen sie Einschließungsmengen („containment levels"), die höher sind, als sie normalerweise erforderlich sind.
Die Identifizierung alternativer prokaryotischer Wirtszellen und die Entwicklung von Mitteln, die die Herstellung löslicher, intakter und biologisch aktiver Proteine erleichtern, sind offensichtlich wünschenswert. Bemerkenswerterweise ist die Anzahl von potentiellen prokaryotischen Wirtszellen enorm.
Mit der Absicht, ein neues Proteinexpressionssystem herzustellen, haben wir uns entschieden, als unser Beispiel Bacillus subtilis gentechnisch zu verändern, um ein Expressionssystem bereit zu stellen, das die Probleme der Ausbeute überwindet, die mit Systemen des Standes der Technik assoziiert sind. Wir haben unser Aufmerksamkeit auf die Bereitstellung eines bakteriellen Expressionssystems fokussiert, das Proteine (nativ und/oder heterolog und/oder rekombinant) erzeugt und idealerweise in das Kulturmedium sekretiert, das dieses System die Reinigung des hergestellten Proteins aufgrund des Fehlens von kontaminierenden endogenen bakteriellen Proteinen und anderen Makromolekülen ermöglicht.
Eine Anzahl von B.subtilis-Genen, die sekretierte Proteasen kodieren, wurde identifiziert. Ohne Beschränkung kodieren beispielsweise die aprE-, nprE-, bpf-, mpr-, epr-, nprB- und vpr-Gene von B.subtilis extrazelluläre Proteasen. Diese Proteasen werden in das Kulturmedium sekretiert, und die Deletion dieser aus dem B.subtilis-Genom vermindert die Aktivität der extrazellulären Protease auf weniger als 1 % des Wildtyp-Stammes. Trotz dieser Tatsachen legen experimentelle Belege nahe, dass B.subtilis-Stämme, die an extrazellulären Proteasen defizient sind, noch einen signifikanten Verlust der Produktion sekretorischer Proteine durch proteolytischen Abbau zeigen.
Die Identifizierung von mit der Zellwand assoziierten Proteasen führte uns dazu, zu untersuchen, ob sie eine Rolle bei der Expression und Sekretion von nativen und/oder heterologen und/oder rekombinanten Proteinen in B.subtilis spielen, und ob die Proteasen eine Hauptrolle bei der Bestimmung der Menge der Produktion sekretorischer Proteine spielen.
Das Wand-Protease-A(„wall protease A", wprA)-Gen kodierte in 96 kDa Protein, das ein Signalpeptid, ein Propeptid und eine Protease enthält, die nach Synthese und Export zwei an die Zellwand gebundene Proteine, CWBP23 und CWBP52 (1) bildet. Das CWBP52-Polypeptid besitzt Protease-Aktivität, die durch PMSF inhibiert wird, ein Inhibitor der Serin- Protease. Die Deletion von wprA ergibt keinen bemerkenswerten Phänotyp hinsichtlich der Wachstumsgeschwindigkeit, der Zellmorphologie, der Sporulation oder der Beweglichkeit.
Das wprA ist durch die folgenden Eigenschaften charakterisiert: das Polypeptid ist mit der Zellwand assoziiert und wird während sowohl der exponentiellen als auch stationären Wachstumsphasen exprimiert.
Wir entschieden uns, den Phänotyp des wprA-Deletionsstamms mit einem besonderen Bezug zur Sekretion des heterologen Proteins zu untersuchen.
Unter Verwendung der homologen Rekombination haben wir einen Stamm erzeugt, in dem das wprA-Gen aus dem B.subtilis-Genom unter die Kontrolle eines induzierbaren Promotors gestellt wurde. Wie vorstehend erwähnt wurde, besitzt dieser wprA-kontrollierbare Stamm keinen offensichtlichen Phänotyp, selbst in Abwesenheit eines Induziermittels. Überraschenderweise gab es jedoch, wenn die Ausbeute eines nativen Bakterienmodelproteins, der α-Amylase aus Bacillus licheniformis (AmyL) im Wildtyp-Stamm und in wprA-Nullstamm verglichen wurde, eine etwa 25 %ige Zunahme der Menge der α-Amylase, die am Ende des exponentiellen Wachstums nachgewiesen wurde, vgl. 2A. Die Ausbeute nahm weiter auf 41 % nach einer verlängerten Inkubation (3) zu. Ausschalten des wprA-Gens ergab auch eine Zunahme der Ausbeute der gentechnischen α-Amylase, AmyLQS50.5, wenn sie mit dem wprA-Wildtyp-Stamm verglichen wurde (2B). Dies legt nahe, dass das Ausschalten oder Deletieren des wprA-Gens signifikant die Produktion der sekretierten homologen und heterologen Proteine in B.subtilis erhöht.
Die Bedeutung des wprA-Gens im Hinblick auf die Sekretion eines nativen, heterologen oder rekombinanten Proteins wird auch durch Experimente belegt, die versuchten, zusätzliche Gene zu identifizieren, die beim sekretorischen Weg involviert sind. Wir haben einen B.subtilis-Stamm, CJ278, verwendet, der mit einem Vektor transformiert wurde, der ein chimäres α-Amylase-Gen transformiert wurde, vgl. Material und Methoden für Details des chimären α-Amylase-Gens und der B.subtilis-Stamm-Konstruktion. Dieser Stamm zeigte eine verminderte Sekretion der chimären α-Amylase verglichen mit der Menge der Sekretion durch einen Wildtyp-Stamm, der Wildtyp-α-Amylase exprimiert. Wir haben die Transposon. Mutagenese unter Verwendung des Mini-Tn-10-Abgabevektors („delivery vector") pIC333 benutzt. Die Integration dieses Transposons in das B.subtilis-Genom ist zufällig. Der Screen involviert die Identifikation von Integrationsmutanten, die eine erhöhte Sekretion einer chimären α-Amylase zeigen. Die so identifizierten Mutantenstämme wurden weiter analysiert, indem die Plasmid-DNA aus dem Mutantenstamm gewonnen und die flankierenden Regionen um die Transposon-Integrations-Stelle sequenziert wurden, um die Region des B.subtilis-Genoms zu bestimmen, in die das Transposon integriert wurde. Die Sequenz des Plasmids, ie von der Transposon-Mutante TK108 geborgen wurde, zeigt, dass das Transposon in das wprA-Gen an Position 2059 insertiert wurde.
Es ist somit offensichtlich, dass das Fehlen von WprA die Sekretion eines nativen, heterologen oder rekombinanten Proteins von B.subtilis erleichtert.
Es ist somit ein Ziel der Erfindung, ein Mittel zur Expression eines rekombinanten Proteins in einem prokaryotischen Expressionssystem zu entwickeln, das die Herstellung eines Polypetides in einer biologisch aktiven Form und in einer hohen Konzentration ermöglicht.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, ein prokaryotisches Expressionssystem zu entwickeln, dass die Sekretion eines rekombinanten Proteins in das Kulturmedium ermöglicht, um die Reinigung eines intakten rekombinanten Proteins zu erleichtern, das die biologische Aktivität behält.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Bakterienstamm nützlich, in dem das wprA-Gen oder sein entsprechender Promotor durch Deletion und/oder Insertion und/oder Mutation und/oder Substitution geändert wurde, so dass entweder die Herstellung des Genprodukts verhindert wird oder das Genprodukt in dem Ausmaß nicht funktionell ist, dass die Verwendung des Stamms gefördert wird, ein natives, heterologes oder rekombinantes Protein herzustellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Bakterienstamm vor der Änderung ein Wildtyp für das wprA-Gen.
In einer noch weiter bevorzugten Ausführungsform ist der Bakterienstamm ein Gram-positiver Bakterienstamm.
In einer noch anderen bevorzugten Ausführungsform ist der Bakterienstamm von der Genus Bacillus.
Der Bezug zu dem Ausdruck Bakterienstamm umfasst hier den Bezug zu jedem Bakterienstamm, aber idealerweise einem Gram-positiven Bakterienstamm und, noch idealer, ohne obligatorisch zu sein, zu einem Bakterienstamm des Genus Bacillus.
Für den Fachmann wird es offensichtlich werden, dass wenn ein heterologes Protein hergestellt werden soll, der Bakterienstamm transformiert werden wird, um eine DNA zu umfassen, die mindestens ein ausgewähltes natives und/oder heterologes und/oder rekombinantes Protein kodiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Stamm manipuliert, so dass mindestens ein Teil des wprA-Gens deletiert ist. Idealerweise ist eine signifikante Menge des Gens deletiert, aber in bestimmten Aspekten der Erfindung ist die Prä-Sequenz oder ein Teil davon oder alternativ die Pro-Sequenz oder ein Teil davon oder alternativ die Serin-Protease-Sequenz oder ein Teil davon deletiert. Alternativ kann ein ausgewählter alternativer Teil des Gens oder eine Kombination ausgewählter Teile deletiert sein.
In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung kann ein genetisches Material in das wprA-Gen an mindestens einer ausgewählten Stelle im Hinblick auf das Verhindern der Genexpression oder der Synthese mindestens eines Teils des funktionellen Proteinprodukts insertiert sein.
Alternativ kann mindestes eine ausgewählte Punktmutation in dem Gen im Hinblick darauf vorgesehen werden, entweder die Synthese des Proteins oder die Expression des Gens zu verhindern. Ohne Beschränkung kann beispielsweise das Leseraster des Gens geändert sein, um für ein Stopcodon zu kodieren, wodurch die Synthese eines funktionellen Proteins verhindert wird.
In einer noch weiter bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das wprA-Gen durch Modifikation eine Expressionskontrollsequenz geändert, idealerweise ein Promotor, so dass der Promotor ansprechbar auf ein spezifisches Signal wird, z.B. kann das wprA-Gen unter die Kontrolle eines induzierbaren Promotors gestellt werden, so dass die Expression des wprA-Genproduktes selektiv kontrolliert werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der bakterielle Stamm von der Genus Bacillus, und idealerweise von der Spezies Bacillus subtilis oder seinen nahen Verwandten, wie B.amyloliquefaciens, B.lichenformis und B.stearothermophilus.
Es ist zu bemerken, dass das wprA-Gen ein Protein mit einer spezifischen Domäne kodiert, die ihrer abgeleiteten Aminosäuresequenz zugeschrieben wird. Das Polypeptid kann in ein Signalpeptid, ein Propeptid und ein Protease-Polypeptid eingeteilt werden, die in Margot und Karamata (Microbiology 1996, 142, 3437-3444) akkurat definiert wurden. Das Signalpeptid ist beim Targeting des wprA-Genproduktes zum sekretorischen Apparat involviert, der für die Translokation durch die Zellmembran notwendig ist. Das Propeptid ist wahrscheinlich ein Molekül vom Chaperon-Typ, das bei der Faltung und Reifung des CWBP52-Proteins in seine biologisch aktive Form involviert ist. Das Propeptid ist stabil und kann andere wichtige Funktionen erfüllen. Das Protease-Polypeptid wird die Anwesenheit von sowohl der Prä- als auch der Pro-Sequenz erfordern, auf die effektiv abgezielt wird und die effizient funktionieren.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Bakterienstamm geeignet, vorzugsweise von der Genus Bacillus, und idealerweise der Spezies B.subtilis mit einer Deletion in mindestens einem Teil der in 1 dargestellten Sequenz von dem Nucleinsäurebasenpaar +154 bis +247 einschließlich, oder einem entsprechenden Teil eines homologen Gens.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein B.subtilis-Stamm bereitgestellt, der hinsichtlich eines Teils des wprA-Gens deletiert ist, das das Signalpeptid der kodierenden Sequenz des WprA-Vorläuferproteins kodiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Bakterienstamm geeignet, vorzugsweise der Genus Bacillus und idealerweise B.subtilis, der eine Deletion mindestens eines Teil der in 1 von dem Nucleinsäurebasenpaar +154 bis +1392 einschließlich oder einem entsprechenden Teil eines homologen Gens, dargestellten Sequenz aufweist.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann der Bakterienstamm zusätzlich oder alternativ durch Deletion mindestens eines Teils der in 1 von +247 bis +1392 dargestellten Sequenz oder einem korrespondierenden Teil eines homologen Gens modifiziert sein.
In einer noch weiter bevorzugten Ausführungsform ist der B.subtilis-Stamm hinsichtlich des Teils des wprA-Gens deletiert, der mindestens einen Teil des Polypeptides CWBP23 kodiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein Bakterienstamm, vorzugsweise der Genus Bacillus und idealerweise der Spezies B.subtilis mit einer Deletion mindestens eines Teils der in 1 von dem Nucleinsäurepaar +1392 bis +2835 einschließlich dargestellten Sequenz oder einem geeigneten homologen Gen geeignet.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein B.subtilis-Stamm bereitgestellt, der hinsichtlich des Teils des wprA-Gens deletiert ist, der mindestens einen teil des CWBP52-Polypeptides kodiert.
In einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Bakterienstamm hinsichtlich mindestens eines Teils der in 1 von den Nucleinsäurebasen +247 bis +2835 deletiert.
In einer noch weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein B.subtilis-Stamm bereitgestellt, der hinsichtlich eines Teils des wprA-Gens deletiert ist, der entweder eines oder beide der vorgeschlagenen Propeptide (CWBP23) oder die Serinprotease (CWBP52) kodiert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst der Stamm eine Deletion in dem Teil des Gens, der ein Polypeptid kodiert, die eine Serinprotease ist.
In einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zu Herstellung eines gewünschten Polypeptides bereitgestellt, wobei ein Mikrobenstamm, wie er vorstehend angegeben wurde, zur Herstellung eines Polypeptides verwendet wird, indem der Stamm unter Bedingungen wächst, die für die Produktion des interessierenden Polypeptides förderlich ist, und das interessierende Polypeptid wiedergewinnen.
Es ist beabsichtigt, dass das interessierende Polypeptid endogen oder heterolog zu dem in Rede stehenden Stamm sein kann.
Nach einer Ausführungsform dieses Aspektes wird der Mikrobenstamm als Wirt verwendet, in den ein Polynucleotid-Konstrukt, das das interessierende Polypeptid kodiert, in einer funktionellen Art eingebracht wird, durch den der Stamm befähigt wird, das Polypeptid zu exprimieren.
Das Polynucleotid-Konstrukt kann in den Stamm durch jedes Verfahren eingebracht werden, das auf diesem Gebiet bekannt ist, wie Transformation, Konjugation oder Protoplasttransformation. Das Konstrukt kann ein Plasmid oder jeder andere Vektor sein, der für das spezifische Verfahren geeignet ist, das zur Einführung des Polynucleotid-Konstruktes in die Mikrobenzelle verwendet wird.
In der Zelle kann das Konstrukt in einem Plasmid oder integriert in dem Chromosom des Stammes vorliegen. Ferner kann es in einer einzelnen Kopie oder in multiplen Kopien vorliegen, die entweder durch Amplifikation oder durch multiple Integrationen bereitgestellt werden.
Das Polypeptid kann ein Peptid oder ein Protein von jedem Typ sein, insbesondere ein industrielles Enzym. Das Enzym kann jedes Enzym sein, dass in einem Stamm gemäß der Erfindung hergestellt werden kann, wie Carbonylhydrolase, Carbohydrase, Protease, Lipase, Amylase, Cellulase, Oxidoreduktase, Glucoamylase oder Esterase.
In der Essenz stellt die Erfindung einen Bakterienstamm bereit, idealerweise ein B.subtilis-Stamm, der durch Mutation, Substitution, Insertion oder Deletion entweder vollständig oder teilweise hinsichtlich des wprA-Gens oder einem Homologen davon geändert ist, wobei das Gen eine mit der Zellwand assoziierte Serinprotease kodiert. Es ist überraschend, dass unter der Voraussetzung, dass zusätzliche extrazelluläre Protease-Gene in B.subtilis vorliegen, dass die Deletion einer einzelnen Kopie des wprA-Gens in einem signifikanten Effekt bei der Herstellung von sowohl endogenen als auch heterologen rekombinanten Proteinen resultieren sollte.
Eine Ausführungsform der Erfindung wird nun nur in Form eines Beispiels beschrieben, wobei auf die folgenden Figuren Bezug genommen wird, wobei:
1 die Nucleotidsequenz der Region des B.subtilis-Genoms, das das wprA-Gen enthält, und die Aminosäuresequenz seines Produkts WprA zeigt;
2A die Ausbeute von α-Amylase darstellt, die in das Kulturmedium freigesetzt wird. Geschlossene Symbole stellen das Wachstum und offene Symbole die α-Amylase-Aktivität dar. B.subtilis-Stamm KS408 (∎), KS408 wprA :: pMutin2 mit (♦) oder ohne (•) IPTG (10 mM);
2B ist ähnlich zu dem in 2A beschriebenen Experiment, wobei aber der B.subtilis-Stamm eine rekombinant hergestellte chimäre α-Amylase (AmyLQS50.5) exprimiert. Experimentelle Details, die sich auf die Induktion des wprA-Genprodukts beziehen, sind wie in 2A und sind detailliert in Material und Methoden beschrieben;
2C ist eine diagrammartige Darstellung der Konstruktion eines B.subtilis-Stammes, der in induzierbares wprA-Gen kodiert. Geschlossene Fahnen repräsentieren den nativen wprA-Promotor (PwprA) und offenen Fahnen stellen den IPTG-induzierbaren Promotor (Pspac) dar. Ori Ec: Ursprung der Replikation von E.coli; A repräsentiert das Sub-Klonieren eines wprA-PCR-5'-Fragments in die BamH1-Stelle in pMutin2; B stellt ein einzelnes Cross-Over-Ereignis zwischen pM2wprAFP und dem B.subtilis-wprA-Gen dar; C repräsentiert die Integration von pM2wprAFP in das B.subtilis-Chromosom durch homologe Rekombination und D stellt die Struktur des B.subtilis-Chromosoms nach dem Integrationsereignisses dar.
3 stellt den Vergleich der Amyl-Produktion in einem B.subtilis-Wildtyp-Stamm und einem Stamm mit einem wprA-Genprodukt unter der Kontrolle eines IPTG-induzierbaren Promotors in Abwesenheit oder Anwesenheit von IPTG dar. Kulturen von B.subtilis ließ man in einer stationären Phase wachsen, und die AmyL-Aktivität wurde während der exponentiellen Wachstumsphase und nach etwa 30 Stunden in der stationären Phase verglichen.
4 stellt die Sekretionskinetik von AmyL von exponentiell wachsenden B.subtilis in Anwesenheit oder Abwesenheit des wprA-Genproduktes dar. Repräsentative Daten von Pulse-Chase-Experimenten, die an einem KS408-Stamm und KS408wprA :: pMutin2+/– 10 mM IPTG durchgeführt wurden. (A) Autoradiographie von Puls-Chase-AmyL, gefolgt von der Immunpräzipitation und SDS-PAGE. Das obere Feld zeigt den Vorläufer (p) und die Reifen, die von Gesamtkulturproben immunpräzipitiert sind, und das untere Feld reifes AmyL (m), das in das Kulturmedium abgegeben wurde. Quantifizierung durch Phosphoimaging der verschiedenen Formen von AmyL in Zeitintervallen, die dem Chase folgen; AmyL-Vorläufer ( ) und reifes AmyL in Gesamtkulturproben (♦), und reifes AmyL, das in das Wachstumsmedium freigesetzt wurde (•). Die Menge jeder Form von AmyL wird in Prozenten der gesamten AmyL (Vorläufer und reifes) ausgedrückt, das während des Pulses synthetisiert wurde;
5 stellt den Zell-assoziierten Abbau von AmyL dar, bestimmt durch Subtraktion der Daten für das freigesetzte reife AmyL von dem, das in den Gesamtkulturproben erhalten wurde. Die Menge von AmyL in jedem Intervall wird in Prozenten der maximalen Menge von AmyL (Vorläufer und reifes) ausgedrückt, das während des Pulses synthetisiert wurde.
6 stellt die Stabilität von AmyL in erschöpftem Kulturmedium bei 4 °C dar. (A) α-Amylase-Aktivität in Zeitintervallen in Abwesenheit (∎) oder Anwesenheit (♦) von 10 mM EDTA. (B) Western-Blots von AmyL in erschöpftem Kulturmedium in Zeitintervallen in Abwesenheit oder Anwesenheit von 10 mM EDTA, und
7 stellt die Transkriptionsaktivität des wprA-Gens unter Verwendung der wprAΔ-lacZ-Transkritpionsfusion dar. Wachstum ( geschlossene Symbole) und β-Galaktosidase-Aktivität ( offenen Symbole) wurden in Kulturen von B.subtilis KS408 (∎) und KS408wprA .. pMution2 mit (♦) oder ohne (•) IPTG (10 mM) gemessen.
Tabelle 2 zeigt die Produktion der AmyL-α-Amylase durch B.subtilis in Abwesenheit oder Anwesenheit des wprA-Genproduktes in einem sehr nährstoffreichen Medium eines industriellen Typs in einer ausgedehnten Batch-Fermentation. Jeder Stamm wurde etwa 7 Tage bei 37 °C wachsen gelassen und die α-Amylase-Aktivität wurde im Überstand am Ende dieser Zeitspanne gemessen. Die experimentellen Details sind in Material und Methoden angegeben.
MATERIAL UND METHODEN
Die initiale Analyse für die Beteiligung des wprA-Genproduktes bei der Sekretion eines endogenen und heterologen rekombinanten Proteins betraf die Konstruktion eines B.subtilis-Stammes, in dem eine einzelne Kopie des wprA-Genpromotors durch einen IPTG-induzierbaren Promotor ersetzt wurde. Bei Abwesenheit von IPTG wurde die Expression des wprA-Gens unterdrückt. Nach Zugabe von IPTG wurde das wprA-Gen induziert.
Alternativ kann das wprA-Gen vollständig oder teilweise vom B.subtilis-Genom deletiert werden, wie es detailliert in der nachfolgenden Beschreibung und den folgenden Methoden beschrieben ist.
Bakterienstämme
Die verwendeten Bakterienstämme sind in Tabelle 1 dargestellt.
Tabelle 1: Bakterienstämme
Wachstumsmedien
B.subtilis und E.coli wurden in einem antibiotischen Medium Nummer 3 (Difco) gehalten, das mit 1,5 % Gewicht pro Volumen Agar solidifiziert wurde und 1 % Gewicht pro Volumen lösliche Stärke enthielt. Chargenkulturen wurden in 2xYT-Brühe wachsen gelassen, das Tryptone (1,6 % Gewicht pro Volumen), Hefeextrakt (1,0 % Gewicht pro Volumen) und NaCl (0,5 % Gewicht pro Volumen) enthielt. Wenn erforderlich wurden Antibiotika in das Wachstumsmedium in den folgenden Konzentrationen umfasst: Chloramphenicol g/ml, Ampicillin g/ml und Erythromycin g/ml. Xylose (1 % Gewicht pro Volumen) wurde zugegeben, um die Synthese der α-Amylase unter einem Xylose-induzierbaren Promotor zu induzieren. Der Vergleich der α-Amylase-Produktion in B.subtilis vom Wildtyp und einem Stamm, der hinsichtlich des wprA-Genproduktes deletiert wurde, wurde auch in einem Medium vom industriellen Typ durchgeführt, das Kartoffelstärke (100 g/l), blankes Fluor (50 g/l), BAN 5000 SKB (0,1 g/l), Natriumcaseinat (10 g/l) Sojabohnenmehl (20 g/l) Na₂HPO₄· 12H₂O (9 g/l) und Pluronic (0,1 g/l) enthielt. Für den Wildtyp-Stamm wurde das Medium mit 6 g/ml Chloramphenicol und 0,2 % Xylose supplementiert. Für das Medium für den wprA-Deletionsstamm wurde das Medium mit 6 g/ml Chloramphenicol, 5 g/ml Erythromycin und 0,2 % Xylose ergänzt.
DNA-Manipulationen und Bakterientransformation
Restriktionsverdauung, DNA-Fragmentreinigung, Ligation und Transformation von E.coli wurde durchgeführt, wie früher beschrieben (Sambrool et al., 1989). Chromosomale DNA wurde aus B.subtilis unter Verwendung des IGi-Genomic-Extraktionskit (Immunogen International) isoliert. PCR wurde mit Tad-DNA-Polymerase (Appligen) unter Verwendung der chromosomalen DNA von B.subtilis DN1885 als Templat durchgeführt. Plasmid-DNA wurde aus E.coli und B.subtilis mit dem Tip-100-Plasmid-Extraktionskit (Qiagen) gereinigt. Oligonucleotid-Primer für die PCR wurden unter Verwendung eines Beckman-Oligo 1000 synthetisiert. B.subtilis wurde bis zur Kompetenz wachsen gelassen und mit integrativen Plasmiden transformiert
α-Amylase-Assay
Die Menge der sekretierten α-Amylase wurde unter Verwendung des Phadebas-α-Amylase-Assay-Kits (Kabi Pharmacia) quantifiziert. Die Zellen der Kulturproben wurden durch Mikrozentrifugation pelletisiert und die α-Amylase-Aktivität im Überstand wie vom Hersteller beschrieben bestimmt.
Konstruktion eines Stammes, der ein induzierbares wprA kodiert
Um zu bestimmen, ob die Produkte des wprA-Gens in dem co- oder post-translokationalen Abbau von AmyL beteiligt sind, haben wir einen Stamm von B.subtilis konstruiert, in dem eine intakte Kopie des Gens unter der Kontrolle eine Isopropylthio-β-D-galaktosid(IPGT)-induzierbaren Psapc-Promotors steht. Die Konstrukte wurden unter Verwendung des pMutin2-Integrationsvektors hergestellt. Ein 357-Basenpaar-DNA-Fragments, das mit dem 5'-Terminus des wprA-Gens korrespondiert, wurde mittels PCR aus der chromosomalen DNA von B.subtilis KS408 unter Verwendung des Oligonucleotid-Primers WPR-F (5' GCGCGCGCGGATCCGGGATAACATGAAACGC 3') und WPR-R (5' GCGCGCGCGGATCCCCATCCTCCGCTGTG 3') amplifiziert. Dieses Fragment wurde in die unike BamH1-Restriktionsstelle pMutin2 unter Verwendung von E.coli XL1-Blue als Wirt kloniert.
Das resultierende Plasmid, pM2wprAFP, wurde verwendet, um B.subtilis KS408 zu transformieren, um den Stamm KS408 wprA :: pMutin2 herzustellen. Da das wprA-Gen von KS408 wprA :: pMutin2 unter der Kontrolle des Pspac-Promotors steht, kann seine Expression durch die Gegenwart oder Abwesenheit von IPTG kontrolliert werden, Zusätzlich wurde eine transkriptionale Fusion (wrpA Δ-lacZ) zwischen einem nativen wprA-Promotor und lacZ erzeugt, um zu ermöglichen, dass die Expression von wprA über die β-Galaktosidase-Aktivität überwacht wird, 7.
Konstruktion eines wprA-negativen Stammes durch Deletion im B.subtilis DN1885 wprA-Gen
Das Plasmid pCJ791, das ein N-terminales Fragment (Basenpaar 133 bis Basenpaar 615) und ein C-terminales Fragment (Basenpaar 2364 bis Basenpaar 2781) des wprA-Gens von B.subtilis DN1885 kodiert, wurde in vier Schritten konstruiert:

i) ein 382 Basenpaar N-terminales Fragment des wprA-Gens wurde mittels PCR aus B.subtilis DN1885 amplifiziert, wobei die Oligonucleotid-Primer CLJe7 (5'-GGAATTCCAAAGCTGCAGCGGCCGGCGCG-3') und CLJe8 (5'-GAAGATCTCGTATACTTGGCTTCTGCAGCT-3') verwendet wurden.

Dieses Fragment besitzt eine EcoRI-Restriktionsstelle am 5'-Ende und eine BglII-Restriktionsstelle am 3'-Ende. Simultan wurde ein 419 Basenpaar C-terminales Fragment des wprA-Gens mittel PCR aus B.subtilis DN1885 amplifiziert, wobei die Oligonucleotid-Primer CLJe9
(5'-AGATCTGGTCAACAAGCTGGAAAGCACTC-3')
und CLJe10
(5'-CCCAAGCTTCGTGACGTACAGCACCGTTCCGGC-3')
verwendet wurden.
Dieses C-terminale Fragment besitzt eine BglII-Restriktionsstelle am 5'-Ende und eine HindIII-Restriktionsstelle am 3'-Ende.

ii) Die zwei DNA-Fragmente, die die N- und C-terminalen Sequenzen des wprA-Gens kodieren, wurden mit dem Restriktionsenzym BglII verdaut und ligiert, um ein Fragment von 801 Basenpaaren zu ergeben. Unter Verwendung der Oligonucleotid-Primer CLJe7 und CLJe10 wurde das 801 Basenpaar-Fragment mittels PCR aus dem Ligationsgemisch amplifiziert. Das amplifizierte 801 Basenpaar-Fragment wurde mit den Restriktionsenzymen EcoR1 und HindIII verdaut.
iii) Ein 4,4 Kilobasen EcoRI bis HindIII Fragment aus dem Plasmid pSJ2739 (beschrieben in der Patentanmeldung WO 96/23037, 6) wurde gereinigt und als Vektor für das 801 Basenpaar Fragment verwendet. Dieses Plasmid basier auf den Replikationsursprung pE194, was bedeutet, dass die Replikation des Plasmids temperatursensitiv ist.
iv) Die beiden EcoRI und HindIII Fragmente (801 Basenpaar und 4,4Kilobasen) wurden ligiert, und das Plasmid pCJ791 wurde durch Selektion hinsichtlich der Resistenz gegenüber Erythromycin bei 28 °C unter Verwendung von B.subtilis DN1885 als Wirtsstamm erhalten.

Das Plasmid pCJ791 wurde in das Chromosom von B.subtilis DN1885 durch Selektion hinsichtlich der Resistenz gegenüber Erythromycin bei 37 °C integriert. Das pCJ791 auf dem pE194-Replikationsursprung basiert, wurden Transformanten selektiert, in die das Plasmid in das Chromosom durch homologe singluläre Crossover-Rekombination zwischen einem der Plasmid-wprA-Sequenz und der korrespondierenden chromosomalen wprA-Sequenz integriert wurde. Zwei Arten von integrierten Stämmen könnten das Ergebnis des Integrationsereignisses sein: i) das integrierte Plasmid gefolgt vom Wildtyp-wprA-Gen oder ii) das Wildtyp-wprA-Gen gefolgt vom integrierten Plasmid. Für die Konstruktion eines sauberen wprA-Deletionsstammes können beide Integrationstypen verwendet werden. Somit wurde das Integrationsereignis nicht weiter untersucht.
Ein sauberer wprA-Deletionsstamm wurde dann durch homologes singuläres Crossover konstruiert, das in der Freisetzung des integrierten Plasmids resultiert. Es gab zwei Wege, auf denen das Plasmid aus dem Chromosom freigesetzt werden könnte: i) durch die gleich Rekombination, durch die das Plasmid integriert wurde, oder ii) durch Rekombination zwischen der Sequenz, die nicht beim Integrationsereignis involviert war. Im ersten Fall, würde der resultierende Stamm ein Wildtyp-wprA-Gen auf dem Chromosom besitzen. Wenn der zweite Fall auftritt, würde der resultierende Stamm ein deletiertes wprA-Gen auf dem Chromosom und dadurch das gewünschte Ereignis haben. Um das integrierte Plasmid freizusetzen wurden zwölf Transformanten in das TY-Medium ohne Selektion beimpft und bei 28 °C über Nacht inkubiert. Die Kulturen wurden wieder einmal in frischem TY-Medium eingeimpft und bei 28 °C über Nacht kultiviert. Nach drei Beimpfungsrunden wurden die Kulturen auf einer LB-Platte ohne Selektion verteilt, und nachfolgend wurden die erhaltenen Kolonien hinsichtlich der Sensitivität auf Erythromycin gescreent. Vierundzwanzig für Erythromycin sensitive Kolonien (Erm^S) wurden auf das Vorliegen eines deletierten wprA-Gens mittels PCR direkt auf der Kolonie getestet, wobei die Oligonucleotid-Primer CLJe7 und CLJe10 verwendet wurden Vier dieser Erm^S-Kolonien besaßen ein deletiertes wprA-Gen auf dem Chromosom. Die Authentizität des B.subtilis-Stammes DN1885ΔwrpA wurde durch Southern-Blot-Hybridisierung bestätigt.
Isolierung einer wprA-Mutante mit erhöhter Menge sekretierter chimärer α-Amylase.
In einer früheren Studie, in der es das Ziel war zu untersuchen, wie die Nettoladung eines Proteins ihren Durchtritt durch die negativ geladene Zellwand in Bacillus subtilis beeinflusste, wurde festgestellt, dass sowohl die Wildtyp-AmyL (α-Amylase von Bacillus licheniformis) und chimäre Varianten einem co- und/oder posttranslokationalen Abbau unterzogen werden. Die Protease(n), die für diesen Abbau verantwortlich ist/sind, ist/sind wahrscheinlich mit der Cytoplasmamembran oder Zellwand assoziiert, da der proteolytische Abbau an der äußeren Oberfläche der Cytoplasmamembran auftrat („Construction and use of chimeric α-amylase to study Protein secretion in B.subtilis" Dissertation von Keith Stephenson, Universität von Newcastle Upon Tyne, 1996; „Secretion of chimeric α-amylase from Bacillus subtilis", Dissertation von Christina Lund Jensen, Technische Universität Dänemark, 1997). Bei der Suche nach Faktoren, die bei diesem Abbau beteiligt sind, wurde ein Screening-System aufgebaut, dass auf dem B.subtilis-Stamm CJ278 basiert, der die chimäre α-Amylase (AmyLQS55-6) exprimiert. Eine Mutantenbibliothek wurde durch Transposon(„transposon")-Mutagenese hergestellt und nachfolgend hinsichtlich Mutanten gescreent, die die Halo-Bildung („halo formation") auf Amylasescreeningplatten erhöhen.
Konstruktion einer chimären α-Amylase, AmyLQS55-6
Nachfolgen wird ein Überblick über die Schritte gegeben, die bei der Konstruktion der chimären α-Amylase AmyLQS55-6 beteiligt sind. Eine detaillierte Beschreibung ist in „Secretion of chimeric α-amylase from Bacillus subtilis." Dissertation von Christina Lund Jensen, Technische Universität Dänemark, 1997 angegeben.
Die chimäre α-Amylase AmyLQS55-6 wurde dadurch konstruiert, dass spezifische Blöcke des reifen Teils der α-Amylase aus B.licheniformis (AmyL) mit den entsprechenden Blöcken der α-Amylase aus B.amyloliquefaciens (AmyQ) oder aus B.stearothermophilus (AmyS) ausgetauscht wurden. Die individuellen DNA-Blöcke wurden unter Verwendung eines auf PCR basierenden in vitro Gensplicingverfahrens, dem SOE-Verfahren (Splicing durch überlappende Extension, Horton et al., Gene 77, 61-68, 1989) konstruiert. Das AmyL-Gen hat eine unike Pst1-Stelle, die sich innerhalb der Signalsequenz befindet, und eine unike HindIII-Stelle 3' vom Transkriptionsterminator. Das amyLQS55-6-Gen wurde deshalb als in frame-DNA-Fragment von PstI bis HindIII konstruiert, das den reifen Teil der α-Amylase kodiert. Das amyLQS55-6-Gen wurde in 3 getrennte DNA-Blöcke unterteilt, wobei Block 1 ein PstI-BamHI-Fragment, Block 3 ein KpnI-SalI-Fragment und Block 4 ein SalI-HindIII-Fragment abdeckt.
Die Eigenschaften jedes Blocks sind nachfolgend angegeben, wobei die Rasennummer in Bezug zum Start-Codon jedes Gens berechnet wurde.

Block 1: Basenpaare 79-132 amyL, Basenpaare 151-174 amyS, Basenpaare 157-198 amyQ, Basenpaare 199-213 amyL,
Block 3: Basenpaare 562-993 amyL, Basenpaare 1018-1095 amyS, Basenpaare 1072-1095 amyL,
Block 4: Basenpaare 1096-1221amyL, Basenpaare 1237-1419 amyS, Basenpaare1411-1542 amyQ, Basenpaare 1537-1798 amyL.

Zwischen Block 1 und Block 3 lag ein Wildtyp-amyL-Block, der die Basenpaare 214-561 abdeckte.
Die individuellen Blöcke wurden in pUC19 in der richtigen Ordnung geklont, um das PstI bis HindIII-Genfragment herzustellen, das das reife AmyLQS55-6-Protein kodiert.
Zum Zusammenbau der individuellen Blöcke wurde von den uniken Restriktionsstellen profitiert, die an ihren Enden erzeugt wurden (erzeugt durch das SOE-Verfahren).
Expression der chimären α-Amylase amyLQS55-6
Das amyLQS55-6-Gen wurde in das B.subtilis-Chromosom durch homologe Rekombination zwischen einem kodierten Plasmid und einer chromosomal kodierten Kopie des xylR-Gens integriert. Das zusammengebaute amyLQS55-6-Gen wurde in das Plasmid pCJ92 kloniert. Das Plasmid pCJ92 ist von pSY63 abgeleitet, das das Xylose-induzierbare Promotor-System kodiert (für detaillierte Informationen über die Konstruktion des Plasmids pCJ92, die Sekretion der chimären α-Amylase aus Bacillus subtilis siehe Dissertation von Christina Lund Jensen, Technische Universität Dänemark, 1997). Das Fragment von EcoRI bis BglII des amyLQS55-6-Gens, das durch pCJ92 kodiert ist, wurde in die pUC19-EcoRI und BamH1-Restriktionstellen in E.coli SJ2 kloniert, wodurch das Plasmid pCJ272 resultiert. Das Plasmid pCJ272 enthält einen Replikationsursprung, der in B.subtilis funktionell ist. Das Integrationsplasmid pCJ272 wurde in den B.subtilis-Stamm DN1885 eingeführt und die Transformanten wurden durch Selektion hinsichtlich Chloramphenicol-resistenter Kolonien erhalten. As Plasmid wurde in das Chromosom von DN1885 durch eine einzelne homologe Rekombination zwischen dem kodierten Plasmid und den chromosomal kodierten Kopien des xylR-Gens integriert.
Die Integration der α-Amylase-Expressionskassette in das Chromosom von DN1885 resultiert in einem stabilen System, das die Herstellung von α-Amylase ermöglicht, die durch die Gegenwart von Xylose induziert wird.
Screening-System
Das Screening-System zur Identifikation von Mutanten mit einer verbesserten Sekretion der α-Amylase basiert auf dem B.subtilis-Stamm CJ278 (DN1885 xylR :: pCJ272), der das Gen aufweist, das die chimäre α-Amylase AmyLQS55-6 kodiert. Im Vergleich zum Wildtyp-AmyL beträgt die Menge der α-Amylasesekretion vom Stamm CJ278 etwa 1 %, was bedeutet, dass CJ278 Kolonien mit einem kleinen und gut definierten Halo („halo") des Stärkeabbaus auf den Platten entstehen lässt. Daher wurde er als idealer Kandidat für das Screenen der Ausbeute der Mutanten angesehen.
Mutageneseprotokoll
Für die Transposonmutagenese des Stammes CJ278 wurde der Mini-Tn10-Delivery-Vektor pIC333 (Steinmetz, M. und Richter R. 1994, J. Bacteriol. 172 : 5019) verwendet. Außerhalb des Transposons trägt das Plasmid ein modifiziertes Transposase-Gen, das eine relaxierte Target-Spezifität verleiht, einen thermosensitiven Replikationsursprung und ein Erythromycin-Resistenzgen für die Selektion bei einer fakultativen Temperatur. Das 2,2 Kilobasen Transposon kodiert das Spectinomycin-Resistenzgen und den pUC8-Replikationsursprung, was die Replikation in E.coli ermöglicht. Das Plasmid pIC333 wurde in den Stamm CJ278 transformiert, und die Erythrmomycin-resistenten Transfomanten wurden in ein TY-Medium eingeimpft, das mit 0,4 % Glucose und Spectinomycin (120 μg/ml) ergänzt war und über Nacht bei 28 °C wachsen gelassen. Die Über-Nacht-Kultur wurde 1/100 mit TY-Medium verdünnt, das mit 0,4 % Glucose und Spectinomycin (120 μg/ml) ergänze wurde. Nach 3 Stunden Kultivierung wurde die Temperatur auf 37 °C verschoben (was die restriktive Temperatur ist), und die Kultur wurde für weitere 4 Stunden kultiviert. Aliquote der Kultur wurde auf LB-Amylopektin(gekoppelt mit Ciba-Crone-Red)-Platten plattiert, die mit 0,4 % Glucose, 0,01 M Phosphate pH 7, 0,2 % Xylose und 120 μg/ml Spectinomycin ergänzt wurde, und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Kolonien mit einem deutlich größerem Halo, was eine höhere Menge von sekretierter α-Amylase anzeigt, traten mit einer Häufigkeit von 1/150 auf. Eine solche Tranposon-Mutante, die einen größeren Halo des Stärkeabbaus als der Vorgängerstamm bildete, war der Stamm TK108.
Das Mini-Tn10-Transposon und seine flankierenden Regionen vom Stamm TK108 wurden zurückerhalten, wobei vom pUC-Replikationsursprung profitiert wurde, der im Transposon vorliegt. Das TK108-Chromosom wurde vollständig mit EcoRI verdaut und mit T4-DNA-Ligase re-ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in E.coli SJ2 (Diderichsen et al., 1990, J. Bacteriology 172, 4315-4321) transformiert, wobei hinsichtlich der Spectinomycin-Resistenz selektiert wurde. Plasmid-DNA von Spectinomycin-resistenten Transfomanten wurde für die DNA-Sequenzierung verwendet. Die DNA-Sequenzen wurden durch das Dideoxy-Kettenterminations-Verfahren (Sanger et al., 1997) und durch Verwendung der Mini-Tn10-spezifischen Primer bestimmt: 5'-CCA ATA CGC AAA CGC CCT CTC-3' und 5'-TAG TGA CAT TTG CAT GCT TC-3', die der Position 137-117 bzw. 2181-2200 auf der Mini-Tn10-Transposon-Sequenz entsprechen.
Die Sequenz des Plasmids, das von der Transposon-Mutante TK108 zurückgehalten wurde, zeigte, dass das Transposon in das wprA-Gen in Position 2059 insertiert wurde.
Ergebnisse und Diskussion
Die Entwicklung effizienter alternativer Methoden zur Herstellung eines nativen heterologen oder rekombinanten Proteins ist offensichtlich wünschenswert. Es ist offensichtlich, dass nicht jedes heterologe Protein in löslicher biologisch aktiver Form hergestellt werden kann, weshalb Verfahren, die die Herstellung solcher Proteine erleichtern, ständig kontinuierlich konstruiert werden.
Wir habenden Ansatz verfolgt, die Genus Bacillus und ihre nahen verwandten als alternative Wirtszelle für die Herstellung eines sowohl nativen als auch rekombinanten Proteins zu entwickeln. Diese Bakterien haben bemerkenswerte Vorteile gegenüber anderen Spezien aufgrund der Einfachheit ihres Wachstums in diskontinuierlichen Kulturen und ihrer schnellen Zellteilungsrate und weiterhin wegen ihrer Fähigkeit, Proteine in die Kultur in hohen Konzentrationen zu sekretieren. Ferner haben wir uns entschlossen, uns auf die Entwicklung eines Expressionssystems zu fokussieren, das sekretierte lösliche Proteine in den Kulturmedium erzeugt, um die Reinigung solcher Proteine von den kontaminierenden endogenen bakteriellen Proteinen und Makromolekülen zu erleichtern. Ein Hauptproblem mit dieser Methodologie ist, dass viele bakterielle Systeme aktiv Proteasen in das Kulturmedium sekretieren, die die Proteine in der unmittelbaren Umgebung der Bakterienzellen abbauen. Einige B.subtilis-Stämme wurden konstruiert, um diese Gene aus dem bakteriellen Genom zu deletieren, um den Proteinverlust durch die proteolytische Aktivität zu vermindern. Dies kann jedoch noch zu verminderten Ausbeuten des intakten Proteins führen, da unter anderem die Freisetzung intrazellulärer Proteasen in das Wachstumsmedium wie bei Stämmen, die multipel defizient an extrazellulären Proteasen sind, für eine Lyse anfällig werden, wodurch zelluläre Bestandteile in das umgebende Wachstumsmedium abgegeben werden.
Des Weiteren haben wir Puls-Chase-Markierungsexperimente durchgeführt, um die Stellen zu identifizieren, an denen die Proteolyse der sekretierten Proteine auftritt. Von der Menge an reifem AmyL (eine sekretiertes Modellprotein), das in das Kulturmedium freigesetzt wurde, kann gesehen werden, dass sie mit der Zeit zunimmt, bis sie eine konstante Menge erreicht. Diese Menge stellt etwa nur 25 % des gesamten synthetisierten AmyL dar, eine Menge, die mit der in den Gesamtkulturproben zurückbleibenden Mengen konsistent ist. Das bedeutet, dass 75 % des anfänglich synthetisierten AmyL abgebaut wird. Durch Bestimmung des Anteils des AmyL, das zu jedem Zeitpunkt nach der Zugabe der Chase-Lösung mit der Zelle assoziiert blieb, in dem die Menge des freigesetzten AmyL von dem in den Gesamtkulturproben beobachteten subtrahiert wird, war es möglich zu bestimmen, dass der AmyL-Abbau an einer Zell-assoziierten Stelle und innerhalb 7 Minuten nach der Zugabe des Chase auftrat, vgl. 6. Diese Daten lagen nahe, dass der beobachtete Abbau von AmyL während oder kurz nach der Translokation durch die Membran und an einem Zell-assoziierten Ort auftritt.
Das wprA-Gen von B.subtilis kodiert eine mit der Zellwand assoziierte Serin-Protease. Das wprA-Genprodukt ist zusammengesetzt aus einer Präsequenz (Signalpeptid), um beim Targeting der Protease an den sekretorischen Apparat zu unterstützen, einer Prosequenz, das ein stabiles 23 kDa Proteinprodukt erzeugt, am wahrscheinlichsten mit einer Aktivität vom Chaperon-Typ, und einer 52 kDa Serinprotease. Wir haben das wprA-Gen konstruiert, in dem es unter die Kontrolle eines IPTG-induzierbaren Promotorelements gestellt wurde. Dies ermöglicht die Expression von wprA strikt zu regulieren, einfach durch die Anwesenheit oder Abwesenheit von IPTG in dem Wachstumsmedium. Wenn ein B.subtilis-Stamm, der eine verminderte α-Amylase-Produktion zeigt, zufällig mit dem Mini-Tn10-Tranposon mutagenisiert wird, wurde eine Integrantenmutante mit erhöhter α-Amylase-Produktion identifiziert. Die Sequenzanalyse der geretteten Tn10-DNA ergab, dass die Integrationsstelle das wprA-Gen ist. Wir haben auch einen B.subtilis-Stamm erzeugt, der gentechnisch verändert wurde, um das wprA-Gen vollständig vom Genom zu deletieren.
Wir haben den Wildtyp-B.subtilis-Stamm DN1885 xylR :: pKS405B, der mit einem chimären α-Amylase-Gen transformiert wurde, und den Stamm DN1885 xylR :: pKS408, der mit der Wildtyp-α-Amylase transformiert wurde, genommen und die wprA-Promotor-Sequenz mit einem IPTG-induzierbaren Promotor, der in dem Plasmid pM2wprAFP (sie Material und Methoden) ersetzt wurde.
Die Aktivität der sekretierten Wildtyp-α-Amylase wurde in B.subtilis-Kulturen in Gegenwart oder Abwesenheit von 10 mM IPTG beurteilt. Eine Kultur, in der wprA von seinem nativen Promotor exprimiert wurde, wurde als Kontrollkultur verwendet. 2A stellt die Wachstumsgeschwindigkeit dar, und die Kinetiken eines B.subtilis-Stammes wird nicht signifikant durch die Abwesenheit des WprA-Proteins (kein IPTG ist zugegeben) beeinflusst, gemessen durch die optische Dichte in der Kultur. Bei Abwesenheit von 10 mM IPTG gibt es eine etwa 25 %ige Zunahme der α-Amylase Aktivität im Kulturmedium, verglichen mit dem Wildtyp-Stamm, in dem das wprA-Gen von seinem nativen Promotor exprimiert wird (2A). 2B zeigt einen vergleichbaren Effekt auf die Produktion einer chimären Amylase.
Die Ausbeute der nativen α-Amylase im Kulturmedium wurde ebenfalls in Kulturen in stationärer Phase des B.subtilis-Wildtyps oder des IPTG-induzierbaren wprA-Gens beurteilt (3). Die Stämme ließ man für etwa 39 Stunden wachsen, wobei in dieser Zeit die Kulturen für etwa 30 Stunden in einer stationären Phase waren. Bei Abwesenheit von IPTG nahm die Ausbeute der α-Amylase in dem Kulturmedium um etwa 40 % zu, verglichen mit einem Stamm, der wprA von seinem nativen Promotor exprimiert. Im Gegensatz dazu war die Ausbeute der α-Amylase aus KS408 wprA :: pMutin2 in Gegenwart von IPTG (wprA an) niedriger und beim Übergang in die stationäre Phase betrug die Ausbeute der α-Amylase 95 % der von KS408.
Zusätzlich gibt es, wenn die Stämme in einem reichen Medium vom industriellen Typ in einer ausgedehnten Chargen-Fermentations-Kultur wachsen, eine etwa 78 %ige Zunahme der α-Amylase-Aktivität bei Abwesenheit des WprA-Proteins.
Diese Daten zeigen, dass die Expression von wprA deutlich die Ausbeute der freigesetzten α-Amylase beeinflusst.
Wir haben zusätzlich gekoppelte Puls-Chase- und Immunpräzipitations-Techniken verwendet, um die Sekretionskinetik von AmyL in KS408 und KS408 wprA :: pMutin2 zu untersuchen. Die Kulturen wuchsen bis zur exponentiellen Phase (OD₆₀₀ ~ 0,6) und wurden mit L-(³⁵S)Methionin einer Pulse-Chase-Behandlung unterzogen. Nach der Immunpräzipitation und nachfolgender SDS-PAGE, wurden sowohl der Vorläufer als auch die reife Form von AmyL durch Autoradiographie visualisiert, 4. Im Fall von KS408 war das Processing des AmyL-Vorläufers in die reife Form schnell; in Proben, die sofort nach dem Chase (0 Minuten) genommen wurden, waren nur 27 % des gesamten AmyL (Vorläufer + reifes), die während des Pulses synthetisiert wurden, in Vorläufer-Form, 4. Das Processing war vollständig nach 5 Minuten post-Chase, wenn die gesamte α-Amylase in reifer Form vorlag. Die Menge des reifen AmyL in der Gesamtkulturprobe (Zellen + Wachstumsmedium, gepickt („peaked") bei 1 Minute, nach dieser Zeit nahm es ab bis es eine konstante Menge bei etwa 25 % des nachgewiesenen Maximums erreicht, was einen signifikanten Verlust der neu synthetisierten α-Amylase während oder kurz nach der Translokation durch die Cytoplasmamembran darstellt.
Die Beteiligung des WprA-Proteins bei der Sekretion des Proteins aus B.subtilis wird auch durch Mutantenscreenen bestätigt, das durchgeführt wurde, um Mutantenstämme zu identifizieren, die eine erhöhte Sekretion der chimären α-Amylase zeigen. Das Mini-Tn10-Transposon integriert zufällig in die bakterielle genomische DNA, wodurch Insertionsmutationen erzeugt werden, wenn das Transposon nicht in ein essentielles Gen integriert. Der Mutantenstamm TK108 zeigt eine erhöhte Sekretion der chimären α-Amylase, wenn es mit einem Wildtyp-Kontroll-Stamm verglichen wird. Der Mini-Tn10-Abgabe-Verktor wurde aus der genomischen DNA von TK108 wieder gewonnen, und die flankierenden Regionen, die den Vektor umgeben, wurden sequenziert, um die Stelle der Integration zu bestimmen. Das Transposon wurde an der Position 2059 des wprA-Gens integriert. Der gestörte B.subtilis-Stamm TK108 zeigte eine erhöhte α-Amylase-Sekretion, was durch die Größe des Halos kontrolliert wurde, der um TK108 erzeugt wurde, wenn sie mit CJ278 (Wildtyp) auf Starke-Agar-Platten verglichen werden.
Als Schlussfolgerung haben wir gezeigt, dass das Ausschalten oder Unwirksam machen oder Deletieren der einzigen Kopie des wprA-Gens signifikant die Ausbeute der nativen, heterologen oder rekombinanten Proteine aus B.subtilis im Kulturmedium erhöht. Bedeutsamerweise werden die extrazellulären Proteasen von B.subtilis noch aktiv in das Wachstumsmedium sekretiert, was anzeigt, dass ein Hauptbeteiligungsfaktor bei der Herstellung erhöhter Ausbeuten der sekretierten α-Amylase die Entfernung der Zellwand-assoziierten Protease ist, die durch das wprA-Gen kodiert wird.
Tabelle 2 Relative Ausbeuten der α-Amylase in Wildtyp- und wprA-IPTG-induzierbaren B.subtilis-Stämmen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Herstellen eines nativen und/oder heterologen und/oder rekombinanten Polypeptides aus einem Mikrobenstamm, der eine Deletion und/oder Insertion und/oder Mutation und/oder Substitution im wprA-Gen oder seinem entsprechenden Promotor aufweist, so dass die Produktion und/oder Funktion des durch das wprA-Gen kodierten Genprodukts ein einer Art beeinflusst ist, die die Herstellung des Polypeptides erleichtert, umfassend (i) Wachsen des Stamms unter Bedingungen, die der Produktion und Sekretion des/der Polypeptide/s förderlich ist/sind, und (ii) Wiedergewinnen des/der Polypeptide/s aus dem Wachstumsmedium und/oder dem Bakterienstamm.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikrobenstamm ein Gram-positiver Stamm ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Mikrobenstamm vom Genus Bacillus ist
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Bakterienstamm B.subtilis, B.amyloliquifaciens, B.licheniformis oder B.stearothermophilus ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Polypeptid eine Carbonylhydrolase, eine Carbohydrase, eine Protease, eine Lipase, eine Amylase, eine Cellulase, eine Oxidoreduktase, eine Glucoamylase oder eine Esterase ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das wprA-Gen durch Deletion und/oder Insertion und/oder Mutation und/oder Substitution geändert wurde, um die Expression des Gens zu verhindern oder die Synthese mindestens eines Teils des funktionellen Proteinprodukts zu verhindern.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei das wprA-Gen durch mindestens eine ausgewählte Punktmutation mutiert wird.
Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei das wprA-Gen in einer Expressionskontrollsequenz verändert wurde.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei das wprA-Gen durch eine Insertion eines genetischen Materials in das wprA-Gen verändert wurde.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Expressionskontrollsequenz ein Promotor ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Änderung in der Bereitstellung eines induzierbaren Promotors resultiert, um die Expression des wprA-Gens selektiv zu kontrollieren.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei der Bakterienstamm B.subtilis ist, der eine Deletion mindestens eines Teils der Sequenz enthält, die in 1 von den Nucleinsäurebasen +154 bis +247 dargestellt ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei der Bacillus-Stamm hinsichtlich eines Teils des wprA-Gens deletiert ist, der die Signalsequenz des wprA-Precursorproteins kodiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei der Bakterienstamm B.subtilis ist, der eine Deletion mindestens eines Teils der Sequenz enthält, die in 1 von den Nucleinsäurebasen +154 bis +1392 dargestellt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8 oder 13, wobei die Deletion mindestens einen Teil der Sequenz umfasst, die in 1 von den Nucleinsäurebasen +247 bis 1392 dargestellt ist.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das wprA-Gen hinsichtlich mindestens eines Teils des wprA-Gens deletiert ist, der CWBP23 kodiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei der Bakterienstamm B.subtilis ist, der eine Deletion in mindestens einem Teil der Sequenz enthält, die in 1 von den Nucleinsäurebasen +1392 bis +2835 dargestellt ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das wprA-Gen hinsichtlich mindestens eines Teils des wprA-Gens deletiert ist, der CWBP52 kodiert.
Verfahren nach Ansprüchen 6 bis 8, wobei der Bakterienstamm B.subtilis ist, der eine Deletion mindestens eines Teils der Sequenz enthält, die in 1 von den Nucleinsäurebasen +247 bis +2835 dargestellt ist.