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–Die Erfindung
betrifft ein rekombinantes Plasmid, das zur Expression von Glucosyltransferasen
in prokariotischen Mikroorganismen befähigt ist. Ferner betrifft die
Erfindung einen durch das Plasmid transformierten Mikroorganismus,
ein Verfahren zur Herstellung von Glucosyltransferasen unter Verwendung
des transformierten Mikroorganismus und die nach dem Verfahren hergestellten
Glucosyltransferasen.
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Glucosyltransferasen
sind wichtige Enzyme für
die enzymatische Zuckersynthese, da sie Glucosereste direkt von
Saccharose auf verschiedene Akzeptoren übertragen können. Diese Strategie der Zuckersynthese
vermeidet den Einsatz teurer nukleotidaktivierter Zucker. Für den industriellen
Einsatz der Enzyme ist die Verfügbarkeit
eines rekombinanten Produktionssystems unumgänglich. Darüber hinaus können auch
in ihrer Substrat- und Produktspezifität gentechnisch veränderte Glucosyltransferasen
hergestellt werden.
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Ein
Expressionssystem soll nicht nur eine effiziente Produktion des
rekombinanten Enzyms zulassen, sondern auch einen Export des Enzyms
(Sekretion) aus dem Mikroorganismus in das Wachstumsmedium ermöglichen,
um eine kostengünstige
Reinigung des Proteins, die Etablierung einer kontinuierlichen Fermentation
und die Entwicklung integrierter biotechnologischer Verfahren zu
ermöglichen.
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Als
für Synthesezwecke
besonders vielversprechendes Enzym hat sich die 1989 erstmals klonierte und
sequenzierte Glucosyltransferase dsrS aus Leuconostoc mesenteroides
NRRL B-512F erwiesen (Wilke-Douglas M., Perchorowicz, J.T., Houck
C.M., Thomas, B.R (1989) Methods and compositions for altering physical
characterisitcs of fruit and fruit products; PCT patent WO 89/12386,
auf die hier Bezug genommen wird). Dieses Protein wurde bisher entweder
rekombinant in Escherichia coli produziert (Monchois V., Remaud- Simeon, M., Russell,
R.R., Monsan P., Willemot, R.M. (1997), Characterization of Leuconostoc
mesenteroides NRRL B-512F dextransucrase (DSRS) and identification
of amino-acid residues playing a key role in enzyme activity, Appl.
Microbiol. Biotechnol. 48(4), 465-72, auf die hier Bezug genommen
wird) oder aus dem Überstand
einer Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F Kultur gereinigt (Bioeurope,
France).
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Beide
Verfahren haben sich jedoch als nachteilig erwiesen. Bei der Produktion
in Escherichia coli findet ein starker proteolytischer Abbau des
Enzyms statt, der die präparative
Ausbeute vermindert, die Aufreinigung des Enzyms erschwert und insgesamt
zu hohen Kosten führt.
Eine Sekretion der induzierten Glucosyltransferase in das Kulturmedium
findet nicht statt. Auch dies erschwert die Aufreinigung des Produktes.
Bei Produktion des Enzyms in Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F
erfolgt zwar eine Sekretion des Enzyms in das Kulturmedium, die
Ausbeuten sind jedoch gering, was die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens
stark beeinträchtigt.
Ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es nicht
die zuckerpolymerfreie Gewinnung des Enzyms erlaubt. In Leuconostoc
wird die Glucosyltransferaseproduktion durch Saccharose induziert. Die
Saccharose wird von der produzierten Glucosyltransferase zu einem
Zuckerpolymer umgesetzt, das dann nicht mehr von dem Enzym abtrennbar
ist. Das so enzymgebundene Zuckerpolymer verschlechtert die Einsatzmöglichkeiten
des Enzyms erheblich. Bei Einsatz des Enzyms in katalytischen Synthesen
stellt das direkt an das Enzym gebundene Zuckerpolymer einen konkurrierenden
Akzeptor dar, mit der Folge, dass die Oligosaccharidverfahrensprodukte
oftmals Verunreinigungen durch Zuckerpolymere aufweisen. Dadurch
werden die Einsatzmöglichkeiten
und der Wert des nach diesem Verfahren hergestellten Enzyms deutlich
vermindert. Darüber
hinaus kann Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F nicht als Expressionssystem
zur Produktion genetisch veränderter
Glucosyltransferase-Mutanten verwendet werden, weil die dazu benötigten genetischen Methoden
in diesem Mikroorganismus nicht ausreichend entwickelt sind.
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Bei
der Verwendung von Streptokokken und Lactobacillen als Expressionssysteme
zur Gewinnung anderer Glucosyltransferasen treten die oben genannten
Nachteile in ähnlicher
Form auf.
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Proteinexpressionssysteme
für B.
megaterium sind bereits von der Firma MOBITEC bekannt (siehe Internetdokument:
http://www.mobitec.de/download/handbook/B_megat.pdf). Vektoren mit
einem Saccharose-induzierbaren Promotor für die Expression des Dextransucrase-Gens
sind aus der
DE 44
20 223 C1 bekannt. Aus Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F
gereinigte Dextransucrase, die durch Dextranase-Behandlung während der
Präparation
frei von Dextran ist, ist in Miller, A. W. et al, 1986, Carbohydr.
Res., Vol. 147, S. 119-133 beschrieben worden.
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Ausgehend
von diesem Stand der Technik liegt der vorliegenden Erfindung die
Aufgabe zugrunde, ein effizientes Expressionssystem zur rekombinanten
Herstellung von Glucosyltransferasen bereitzustellen, das die Produktion
und Sekretion des Enzyms erlaubt und mit dem die Herstellung von
Glucosyltransferasen bei hoher Ausbeute möglich ist.
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Erfindungsgemäß wird diese
Aufgabe durch ein rekombinantes Plasmid gelöst, das umfasst
- a) einen Shuttlevektor für
Escherichia coli und Bacillus Spezies mit einer multiplen Klonierungsstelle
zur Klonierung von Genen,
- b) einen induzierbaren oder konstitutiven Promotor aus Bacillus
Spezies,
- c) ein Glucosyltransferasegen der in SEQ ID 1 gezeigten DNA-Sequenz
unter der Kontrolle des Promotors.
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Somit
sind einerseits rekombinante Plasmide Teil der Erfindung, die das
genannte Glucosyl-Transferase-Gen als Wild-Typ umfassen. Andererseits
beinhaltet die Erfindung aber auch rekombinante Plasmide, die Mutanten
des oben genannten Glucosyl-Transferase-Gens umfassen.
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Als
besonders vorteilhaft hat es sich erwiesen, das erfindungsgemäße rekombinante
Plasmid unter Verwendung des Shuttlevektors pMM1520 herzustellen.
Dieser Vektor ging aus einer Verbesserung des bekannten Vektors
pWH1520 (Rygus und Hillen, 1991) hervor. Die Optimierung des Vektors
pWH1520 erfolgte durch die Elimierung eines bekannten „catabolite
responsive elements" und
die Einfügung
einer geigneten multiplen Klonie rungsstelle. Die Sequenz des pMM1520
Vektors ist in SEQ ID 2 gezeigt (vgl.
2). Bei
der Klonierung von dsrS wurde über
die Primer eine optimierte Ribosomenbindestelle eingefügt, die
aus der Komplementarität
zur 16S-rRNA aus Bacillus megaterium (Genbank AF142677, Kunnimalaiyaan
et al., 2001) ermittelt wurde (siehe
1). Expression
und Sekretierung eines Proteins in einem Expressionssystem hängen oftmals
in hohem Maße
von der Verwendung des Promotors ab, unter dessen Kontrolle die
Expression erfolgt. Besonders gute Ergebnisse wurden erfindungsgemäß mit dem
Xylose-induzierbaren xylA-Promotor
(Rygus, T., Hillen, W. (1991), Inducible High-Level Expression of
heterologous Genes in Bacillus megaterium Using the Regulatory Elements
of the Xylose-Utilization Operon. Appl. Microbiol. Biotechnol. 35,
594-599, auf die hier Bezug genommen wird) erzielt. Weitere besonders
geeignete Promotoren aus Bacillus Spezies sind insbesondere die
Bacillus megaterium Promotoren GlucDH (Patent Meinhardt + Merck,
EP 0 285 949 B1 ),
spoIV (Wittchen et al. 1998), bgaM (Strey et al. 1999) oder der
Bacillus subtilis Promotor P
spac.
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Die
Lösung
der obigen Aufgabe erfolgt ferner durch mit den erfindungsgemäßen rekombinanten
Plasmiden transformiertem Mikroorganismus. Dabei können prokaryotische
Mikroorganismen verwendet werden. Als Mikroorganismus erfindungsgemäß besonders
bevorzugt ist Bacillus megaterium sowie andere Bacillus Species.
So ist der Vektor pWH1520 auch in Bacillus subtilis aktiv (Conrad
et al., A T7 promotor-specific, inducible protein expression system
for Bacillus subtilis, Mol Gen Genet (1996), 250:230-236). Die vorteilhaftesten
Ergebnisse wurden mit Bacillus megaterium-Stamm WH320 (Rygus und
Hillen, 1991) erzielt.
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Des
weiteren wird die zugrundeliegende Aufgabe durch ein Verfahren zur
Herstellung von Glucosyltransferasen gelöst, bei dem die beschriebenen
transformierten Mikroorganismen zum Einsatz kommen. Durch Kultivierung
dieser Mikroorganismen in einem geeigneten Wachstumsmedium lassen
sich Polypeptide mit der gesamten oder einem Teil der Primärstruktur
und einer oder mehreren biologischen Eigenschaften von Glucosyl-Transferase
herstellen. Das zu verwendende Wachstumsmedium und die exakten Kultivierungsbedingungen
hängen
dabei von dem verwendeten Mikroorganismus ab. Besonders gute Ergeb nisse
werden bei Kultivierung von erfindungsgemäß transformierten Bacillus
megaterium erzielt. Besonders vorteilhaft ist es, einen mit dem
Plasmid pMM1520dsrS transformierten Bacillus megaterium-Stamm WH320
zu verwenden. Eine kontinuierliche Fermentation erscheint dabei
als besonders geeignetes Kultivierungsverfahren.
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Die
erfindungsgemäßen rekombinanten
Plasmide stellen neue Gen-Expressionsplasmide dar, die nach Transformation
in prokaryotischen Organismen die Produktionen und den Export rekombinanter
Proteine vom Glucosyl-Transferase-Typ ermöglichen. Die Kultivierung der
so transformierten oder transfizierten Mikroorganismen erlaubt die
Expression und Sekretion der Polypeptide vom Glucosyl-Transferase-Typ
und führt
so zu einem Expressionssystem, das hohe Ausbeuten und überlegene
Wirtschaftlichkeit ermöglicht.
Als zusätzlicher
Vorteil hat sich erwiesen, dass das erfindungsgemäße Verfahren
die zuckerpolymerfreie Gewinnung von Polypeptiden des Glucosyl-Transferase-Typs
ermöglicht.
Dadurch wird eine Nutzung der erfindunsgemäß hergestellten Enzyme in der
Synthese möglich,
die nicht zu einer Zuckerpolymer-Verunreinigung der Reaktionsprodukte
führt.
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Die
oben beschriebenen Ausführungsformen
der Erfindung sollen im folgenden durch Beispiele noch näher erläutert werden.
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Zunächst werden
die in den Beispielen verwendeten Lösungen beschrieben:
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Puffer und
Lösungen
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Lösungen zur
Protoplastentransformation von Bacillus megaterium SMMP-Puffer
Antibiotic
Medium No. 3 (Difco) | 17.5
g/l |
Saccharose | 500.0
mM |
Na-Maleinat
(pH 6.5) | 20.0
mM |
MgCl2 | 20.0
mM |
Titrationsreagenz
war NaOH-Lösung. | |
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PEG-P-Lösung
PEG
6000 | 40.0
% (w/v) |
Saccharose | 500.0
mM |
Na-Maleinat
(pH 6.5) | 20.0
mM |
MgCl2 | 20.0
mM |
Titrationsreagenz
war NaOH-Lösung. | |
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cR5
Top-Agar
Saccharose | 300.0
mM |
MOPS
(pH 7.3) | 31.1
mM |
NaOH | 15.0
mM |
L-Prolin | 52.1
mM |
D-Glucose | 50.5
mM |
K2SO4 | 1.3
mM |
MgCl2 × 6
H2O | 45.3
mM |
KH2PO4 | 313.0μM |
CaCl2 | 13.8
mM |
Agar-Agar | 4.0
% (w/v) |
Casaminoacids | 0.2
% (w/v) |
Hefe-Extrakt | 10.0
% (w/v) |
Titrationsreagenz
war NaOH-Lösung. | |
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Lösungen zur
Präparation
von chromosomaler Leuconostoc meseateroides DNA TE-Puffer
TRIS-HCl
(pH 8.0) | 50.0
mM |
EDTA | 1.0
mM |
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Weitere
Lösungen
Saccharoselösung in
TE-Puffer | 6.7
% (w/v) |
SDS-Lösung in
TE-Puffer | 20.0
%(w/v) |
Lysozymlösung | 10.0
mg/ml |
RNase – Lösung | 10.0
mg/ml |
Proteinase
K | 17.0
mg/ml |
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PCIA – Phenolextraktion
Phenol | 50.0
% (v/v) |
Chloroform | 48.0
% (v/v) |
Isoamylalkohol | 2.0
% (v/v) |
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Waschlösung für Aktivitätsfärbung
Natriumacetat
(pH5.4) | 20.0mM |
Calciumchlorid | 0.05
g/L |
Triton
X-100 | 0.1
% (v/v) |
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High Molecular Weight
Marker (Sigma)
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Der
Marker enthält
Markerproteine folgender Größen (M
r):
205.000, 116.250, 97.400, 84.000,
66.000, 55.000, 45.000, 36.000 Lösungen für Proteinproduktionssexperimente
Aufschlusspuffer
Na3PO4 (pH5.4) | 100.0
mM |
Lysozym | 5.0
mg/ml |
Titrationsreagenz
war H3PO4-Lösung. | |
Harnstofflösung für unlösliche Proteine
Harnstoff
in 50 mM TRIS-HCl, pH 5.4 | 8.0
M |
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Medien und
Medienzusätze
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Vollmedium für Escherichia
coli und Bacillus megaterium
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Falls
nicht gesondert angegeben, wurde mit Vollmedium Luria-Bertani Broth
(LB) wie bei Sambrook et. al(1989) beschrieben, gearbeitet. Für feste
Medien wurden zusätzlich
15 g Agar pro Liter zugesetzt.
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Vollmedium
für Leuconostoc
mesenteroides NRRL B-512 F MRS – Medium
pH 6.2–6.5
Casein
Peptone | 10.0
g |
Fleischextrakt | 10.0
g |
Hefeextrakt | 5.0
g |
Tween
80 | 1.0
g |
K2HPO4 | 2.0
g |
Natriumacetat | 5.0
g |
Ammoniumcitrat | 2.0
g |
Magnesiumsulfat | 0.2
g |
Mangansulfat | 0.05
g |
mit
destilliertem Wasser auf 1L auffüllen | |
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Minimalmedien
für Bacillus
megaterium MOPSO-Minimalmedium
MOPSO
(pH 7.0) | 50.0
mM |
Tricin
(pH 7.0) | 5.0
mM |
MgCl2 | 520.0 μM |
K2SO4 | 276.0 μM |
FeSO4 | 50.0 μM |
CaCl2 | 1.0
mM |
MnCl2 | 100.0 μM |
NaCl | 50.0
mM |
KCl | 10.0
mM |
K2HPO4 | 1.3
mM |
(NH4)6Mo7O24 | 30.0
pM |
H3BO3 | 4.0
nM |
CoCl2 | 300.0
pM |
CuSO4 | 100.0
pM |
ZnSO4 | 100.0
pM |
D-Glucose | 20.2
mM |
NH4Cl | 37.4
mM |
Titrationsreagenz
war KOH-Lösung. | |
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Dextransucrase aus Leuconostoc
mesenteroides NRRL B-512 F
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Dextransucrase
(DsrS) aus L. mesenteroides NRRL B-512F wurde von Bioeurope bezogen.
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Referenznummer: |
DSB5112FSD9812231 |
Aktivität: |
76.27
U/ml |
Proteinkonzentration: |
0.280
g/l |
Spezifische
Aktivität: |
274
U/mg |
Dextrankonzentration: |
< 0.010 g/L |
Dextranase
frei |
|
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Beispiel 1
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Herstellen eines rekombinanten
Expressionsplasmids zur Expression des dsrS-Gen in dem optimierten
Expressionsplasmid pMM1520 unter der Kontrolle des xylA-Promotors
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Gentechnische Optimierung
des Bacillus megaterium Plasmids pWH1520
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Das
Expressionsplasmid pWH1520 (Rygus und Hillen, 1991) weist für eine Routineanwendung
noch deutliche Mängel
auf. Im xylA-Leseraster von Base 23 bis 200 befindet sich eine cre-Sequenz
(catabolite response element) (Rygus, T., Hillen, W. (1992). Catabolite
repression of the xyl operon in Bacillus megaterium. J. Bacteriol.
174(9), 3049-3055). Dieses cis-aktive Element ist zusammen mit einem
trans-aktiven katabolitkontrollierten Prote in (CcpA) essentiell
für die
Katabolitregulation in B. megaterium. Da reprimierende Kohlenstoff-
und Energiequellen Bestandteil gebräuchlicher Vollmedien sind,
ist es von Bedeutung, um eine effektive Transkription von klonierten
Genen unter der Kontrolle des xylA-Promotors zu garantieren, die cre-Box
in xylA zu eliminieren. Alternativ ist es schwierig Gene so in den
Vektor pWH1520 zu klonieren, dass man die Funktion der cre-Box eliminiert,
da nur eine SpeI Restriktionsschnittstelle vor der Region mit der
cre-Box liegt und folglich die einzige Schnittstelle ist, die benutzt
werden kann. Die vorhandene multiple Klonierungsstelle (Polylinker)
beginnt aber erst bei Base 191 des xylA-Leserasters. Um den Vektor
einer breiteren Anwendung zuzuführen,
sollte deshalb eine multiple Klonierungsstelle (MCS) nah am Startcodon
von xylA eingefügt
werden. Dies ist auch günstig
für die
Konstruktion von Translationsfusionen. Besonders wenn Fusionsproteine
mit Signalpeptiden erstellt werden sollen oder der N-Terminus eine
wichtige Funktion im Protein einnimmt, sollten möglichst wenige Aminosäuren zusätzlich eingeführt werden.
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Weiterhin
bot sich eine Verkleinerung des Vektors durch die Entfernung jetzt
funktionsloser Elemente an, wie dem Bruchstück eines Tetracyclinresistenzgens.
Diese Elemente sind durch die Klonierungsstrategie zur Erstellung
des Vektors im Plasmid verblieben.
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Einfügen einer multiplen Klonierungsstelle
in den Vektor pWH1520
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Um
die gentechnische Handhabung des Vektors pWH1520 (Rygus und Hillen,
1991) praktikabler zu gestalten, wurde eine multiple Klonierungsstelle
eingefügt.
Eine neue MCS wurde aus Oligonukleotiden konstruiert, die möglichst
viele einmalige Schnittstellen enthält, die nicht im pWH1520 vorkommen.
In 4 sind die beiden 48 Basen langen Oligos dargestellt,
die bei MWG Biotech bezogen wurden (vgl. SEQ ID 4).
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Assoziation von Oligonukleotiden
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Zur
Herstellung einer multiplen Klonierungsstelle wurden je 2 nmol komplementärer Oligonukleotide (Schmelztemperaturen
81.5 und 81.9 °C)
zusammenpipetiert. Es folgte ein Temperaturprogramm zur Denaturierung
von Sekundärstrukturen,
Hybridisierung der Stränge
bei der Schmelztemperatur und vollständiger Assoziation in der Abkühlungsphase: 3
min 95 °C,
1 min 81 °C,
1 min 55 °C.
Nach der Hybridisierung der komplementären Oligos entstehen überstehende
Enden, die kompatibel zu mit SpeI bzw. NgoMIV geschnittener DNA
sind.
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Restriktion des Vektors
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Das
Plasmid pWH1520 wurde also mit BcuI (Fermentas), einem Isoschizomer
von SpeI, und NgoMIV (New England Biolabs) geschnitten. Die Restriktion
von DNA erfolgte mittels Restriktionsendonukleasen in den entsprechenden
Restriktionspuffern und bei Inkubationstemperaturen nach Angaben
der Vertreiberfirmen. Die Inkubationsdauer lag zwischen 3 und 5
Stunden. Sofern möglich
wurden die Restriktionsendonukleasen hitzeinaktiviert. Die 300 Basen
eines Fragmentes eines früheren
Tetracyclinresistenzgens sind unbrauchbarer Ballast im Vektor, der
dabei gleich entfernt wurde.
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Ligation von Oligos und
Vektor
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Der
so geschnittene Vektor und das Oligopaar wurden mittels T4-Ligase
(Fermentas) ligiert. Pro 10 μl Ansatz
wurden 100 bis 150 ng Vektor-DNA eingesetzt. Der entsprechende Ligationspuffer
sowie zusätzlich
4.5 mM ATP wurden zugesetzt. Das Mengenverhältnis Insert zu Vektor, gemessen
in pmol DNA-Termini, variiert meist zwischen 2:1 und 4:1. Im Falle
der Oligos war aber ein Verhältnis
von 10:1 erfolgreicher.
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Transformation in Escherichia
coli
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Für die Transfomation
wurde der E. coli Stamm ElectroMAX DH10B von Gibco Life Technol.
eingesetzt. Zur Herstellung von kompetenten E. coli-Zellen wurden
500 ml Flüssigkulturen
mit LB-Medium bis zu einer OD578 von 0.5-1
kultiviert. Die Kultur wurde auf Eis abgekühlt und zentrifugiert (4000 × g; 15
min; 4 °C).
Das Zellsediment wurde in sterilem, deionisiertem Wasser gut resuspendiert,
abzentrifugiert (4000 × g;
8 min; 4 °C), erneut
mit sterilem, deionisiertem Wasser gewaschen und wieder zentrifugiert
(4000 × g;
8 min; 4 °C).
Nach Waschen des Sediments mit 10 %iger (v/v) Glycerin-Lösung wurde
abzentrifugiert (4000 × g;
8 min; 4 °C)
und das Sediment in so wenig wie möglich 10 %iger (v/v) Glycerin-Lösung resuspendiert.
Die kompetenten E. coli-Zellen können
bei –80 °C eingefroren
werden.
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Die
Transformation erfolgte durch Elektroporation mit Hilfe eines Gene
Pulsers mit angeschlossenem Pulse Controller (BioRad). Dazu wurden
je 40 μl
kompetente E. coli-Zellen und die Plasmid-DNA aus dem Ligationsansatz
in eine Transformationsküvette überführt und
im Gene Pulser einer Feldstärke
von 12 kV/cm bei 25 μF
und einem parallelen Widerstand von 200 Ω ausgesetzt. Zur anschließenden Regeneration
wurden die transformierten Zellen sofort nach der Transformation
in 1 ml LB-Medium eine halbe Stunde bei 37 °C auf dem Thermoschüttler inkubiert.
Von den Ansätzen
wurden anschließend
verschiedene Volumina auf LB-Platten mit entsprechendem Antibiotikazusatz
ausgestrichen und über
Nacht bei 37 °C
inkubiert.
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So
wurde der Ligationsansatz in E. coli transformiert. Gewünschte Plasmidkonstrukte
wurden nach Minipräperation
(Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1999). In Molecular
cloning; a laboratory manual. 3nd Ed., Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York) aus
dem E. coli Wirt durch Restriktionsendonukleaseverdau mit BstBI
(New England Biolabs) identifiziert, da dieses Restriktionsenzym
nur in der neuen multiplen Klonierungsstelle vorkommt. Ein so identifizierter
positiver Klon wurde durch weitere Restriktionsendonukleaseverdaue
mit Kpn2I (BspEI), Eco52I (EagI), XmaI und PaeI (SphI) getestet,
die ebenfalls jeweils eine einmalige Schnittstelle in der MCS besitzen.
Eine Bestimmung der DNA-Sequenz (MWG Biotech) der MCS des gefundenen
Klons bewies die erfolgreiche Konstruktion des neubenannten Vektors
pMM1520. Der in 2 dargestellte Vektor besitzt
nun 13 einmalige Schnittstellen mit überstehenden Enden (sticky
ends) und ist ca. 550 Basen kleiner als sein Vorgänger pWH1520
(vgl. SEQ ID 2). Die Schnittstellen befinden sich in einem offenen
Leseraster mit der xylA-Sequenz. So sind Translations- und Transkriptionsfusionen
möglich.
Die vier einmaligen Schnittstellen SacI, BstBI, BspEI und EagI sind
neu.
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Klonierung des Gens dsrS
für die
Dextransucrase aus Leuconostoc meseateroides NRRL B-512 F in pMM1520
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Die
DNA-Sequenzinformation zu dsrS (Genbank U81374) enthält Informationen
zu einem Promotor, einer Ribosomenbindestelle, dem eigentlichen
Strukturgen dsrS und einer ab schließenden AT-reichen Haarnadelschleife
aus 32 Basen. Diese haarnadelförmige
Sekundärstruktur
im 3'-nichtkodierenden-Bereich
könnte als
Terminator für
die Transkription dienen. Das 4583 bp lange Gen kodiert für ein monomeres
Enzym, das durch L. mesenteroides sekretiert wird.
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Optimierung der ribosomalen
Bindestelle der dsrS-mRNA
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Um
die Originalaminosäuresequenz
des Signalpeptids der L. mesenteroides Dextransucrase nicht zu verändern, wurde
eine Transkriptionsfusion konstruiert, die das dsrS-Gen unter die
Kontrolle des xylA-Promotors stellt. Dazu wurde das xylA-Leseraster
mit einem Stop-Codon,
abgeschlossen. Weiterhin musste eine Ribosomenbindestelle (RBS)
vor dem Dextransucrasegen eingeführt
werden; die die Translation der zugehörigen mRNA ermöglicht.
Da das Gen über
eine Polymerasekettenreaktion (PCR) aus dem Genom von L. mesenteroides
kloniert wurde, konnten diese Funktionselemente über die benutzten Primer in
die DNA-Sequenz eingefügt
werden. Die Sequenz der bereits vorhandenen RBS vor dem dsrS-Gen,
wurde in die Strategie einbezogen.
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Die
RBS ist zentral für
die Translation einer mRNA. Sie steuert die Effizienz des Prozesses
durch die sequenzspezifische Kontrolle der Bildung des dazu nötigen Initiationskomplexes.
Sie beinhaltet eine kanonische Sequenz, die auch Shine-Dalgarno-Sequenz
genannt wird. Diese Basen der mRNA gehen Watson-Crick-Basenpaarung
mit dem 3'-Ende
der 16S rRNA ein und leiten so die Bindung des Ribosoms an die mRNA
ein. In B. subtilis wurde der Einfluss der RBS auf die Expression
von Genen intensiv untersucht (Vellanoweth, R. L. (1993). Translation
and its regulation. In: Sonenshein A. L. et al. (Hrsg.) Bacillus
subtilis and other Gram-positive Bacteria, American Society of Microbiology,
Washington DC). Es stellte sich heraus, dass die Komplementarität der Shine-Dalgarno-Sequenz
eine bedeutendere Rolle spielt im Vergleich zu Gram-negativen Bakterien.
So darf die freie Bindungsenergie der Basenpaarung zwischen Shine-Dalgarno-Sequenz
und ribosomaler 16S rRNA nicht unter –12 kcal/mol sinken. Diese
freie Bindungsenergie lässt
sich über
einen Bereich hinweg direkt mit der Translationseffizienz des nachfolgenden
Genes korrelieren. Diese Korrelation findet sich so stringent in
E. coli nicht. So steigert zum Beispiel eine Änderung der Shine-Dalgarno-Sequenz
von AAGGA (–11.8
kcal/mol) in AAGGAGG (–19.8
kcal/mol) die Translation in E. coli nur 9-fach, in B. subtilis
hingegen 114-fach. Optimale RBS haben 7 bis 10 Basen, die mit dem
3'-Ende der 16S
rRNA paaren. Sie müssen die
kanonische Sequenz GGAGG enthalten. Das Startcodon mit der höchsten Translationseffizienz
ist AUG gefolgt von UUG und GUG. Der Zwischenraum von der RBS zum
Startcodon muss mindestens 6 Basen betragen, wobei 7 bis 9 Basen
optimal sind. Er sollte keine Cytosine und Guanine enthalten. Außerdem ist
wichtig, dass die gesamte Region keine sekundäre Struktur bildet, um eine
Bindung des Ribosoms nicht zu behindern.
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Ausgehend
von diesen Erkenntnissen aus Untersuchungen mit B. subtilis wurde
die RBS vor dsrS aus L. mesenteroides untersucht und optimiert.
Um die Basenpaarung zwischen Shine-Dalgarno-Sequenz und ribosomaler
16S rRNA zu optimieren, muss die Sequenz des 3'-Endes der 16S rRNA bekannt sein, die
mit der Shine-Dalgarno-Sequenz hybridisiert. Seit kurzem ist die
Sequenz eines rRNA-Operons kodiert von einem Plasmid aus B. megaterium
QM B1551 bekannt (Genbank AF142677; Kunnimalaiyaan, M., Stevenson,
D. M., Zhou, Y. and Vary, P. S. (2001). Analysis of the replicon
region and identification of an rRNA operon on pBM400 of Bacillus
megaterium QM B1551, Mol. Microbiol. 39(4), 1010-1021). Durch ein
Alignment der 16S rRNA Sequenz von E. coli (Genbank NC_000913: 223771-225312))
mit dem gesamten rRNA-Operon, konnte das 3'-Ende der 16 S rRNA aus B. megaterium
ermittelt werden. Diese Region ist vollständig konserviert zwischen beiden
16S rRNA-Molekülen
(5), mit Ausnahme des Adenins, das das 3'-Ende der 16S rRNA von E. coli bildet.
Diese Base fehlt in der 16S rRNA von B. megaterium oder ist durch
ein Uracil ersetzt.
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In 6 ist
dargestellt, wie durch den Austausch von vier Basen eine optimierte
RBS konstruiert werden konnte. Vier zusätzliche Watson-Crick-Basenpaare
der Shine-Dalgarno-Sequenz
der dsrS-mRNA mit der 16S rRNA von B. megaterium wurden eingeführt, ohne
dass der Mindestabstand von 6 Nukleotiden zum Startcodon unterschritten
wurde. Diese RBS ähnelt
der des spoVG-Gens von B. megaterium. Ein β-Galaktosidasegen wurde bereits
unter der Kontrolle der spoVG-Gen-RBS erfolgreich auf hohem Niveau
in B. megaterium exprimiert (Rygus und Hillen, 1991). Die erforderlichen
vier Mutationen der Shine-Dalgarno-Sequenz konnten genauso wie eine
SacI-Schnittstelle zur Klonierung und ein Stop-Codon für das xylA-Leseraster
in den Primer für
die PCR eingebaut werden.
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Klonierung von Leuconostoc
mesenteroides dsrS in den Expressionsvektor pMM1520 Gewinnung chromosomaler
DNA
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Zur
Gewinnung von chromosomaler DNA wurden 150 ml MRS-Medium mit L.
mesenteroides NRRL BS12-F bezogen von der Deutschen Smmlung für Mikroorganismen
und Zellkulturen, Braunschweig unter DSM20240 angeimpft und bei
30 °C und
250 rpm inkubiert. Nach 4 Stunden wurde bei einer OD578 von
0.54 30 ml der Kultur abgenommen und die Zellen geerntet (8000 × g; 10
min; 4 °C).
Das Bakterienpellet wurde nach einer Methode zur Gewinnung chromosomaler
DNA aufgearbeitet, die bereits für
die PCR von zahlreichen Leuconostoc Species verwendet wurde (Kim,
J., Chun, J. und Han, H.-H. (2000). Leuconostoc kimchii sp. nov.,
a new species from kimchii. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 50, 1915-1919;
Lee, H. J., Park, S. Y., Kim, J. (2000). Multiplex PCR-based detection
and identification of Leuconostoc species. FEMS Microbiol. Lett. 193(2),
243-247). Das Sediment wurde in 3.8 ml Saccharoselösung resuspendiert.
Nach Zusatz von 5 ml Lysozym und 50 μl RNaseA wurde eine Stunde bei
37 °C inkubiert.
Die Zellen wurden durch Zugabe von 545 μl SDS-Lösung lysiert und unter Zugabe
von 200 μl
Proteinase K bei 50 °C
für eine
Stunde inkubiert. Anschließend
wurde die chromosomale DNA mit Phenol (PCIA) extrahiert und anschließend mit
Ethanol gefällt.
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Polymerasekettenreaktion
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Nach
der Isolierung von genomischer DNA aus L. mesenteroides wurde das
Gen der Dextransucrase (dsrS) mittels einer Polymerasekettenreaktion
(PCR) amplifiziert.
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Zur
Amplifikation des dsrS aus dem L. mesenteroides-Chromosom wurden
20 μl PCR-Reaktionsansätze gefahren.
Pro Ansatz verwendete man 2 μl
10fach-PCR-Puffer, 50 ng chromosomale DNA von L. mesenteroides,
1.25 mM MgCl2-Lösung und jeweils 0.4 μl dATP-,
dCTP-dGTP- und dTTP-Mix (jeweils 10 mM). Dazu wurden jeweils 20
pmol der beiden Primer gegeben und auf 20 μl mit sterilem Wasser aufgefüllt. Der
Deckel der PCR-Apparate
wird auf 105 °C
beheizt, so dass ein Überschichten
mit Öl
entfällt.
Nach der quantitativen Denaturierung für 8 min bei 95 °C wurde jeweils
1 U Taq-Polymerase zugegeben, um die PCR zu starten (Hot Start).
Als optimale Temperatur wurden 62.9 °C bestimmt durch parallele Erprobung
mehrerer Temperaturen im Gradientencycler. Ausreichend PCR-Produkt
für die
Klonierung wurde in vielfachen Ansätzen im Thermocycler hergestellt.
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Temperaturprogramm
der PCR
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Primer für Klonierung
des Dextransucrasegens (dsrS):
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DsrS_SpoVG_A (50-mer)
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- 5'-CGAGCTCCCGGGTAAGAATATAAGGAGGTGAAAATTTATGCCATTTAC-3'
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DsrS_SpoVG_B (40-mer)
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- 5'-AAGATCTGCATGCGAAAGCTTATGCTGACACAGCATTTC-3'
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In
die PCR-Primer wurden SacI- und SphI- Schnittstellen integriert.
Sowohl die amplifizierte Gensequenz, als auch der Expressionsvektor
pMM1520 wurden daraufhin jeweils mit den Restriktionsendonukleasen
SacI und PaeI, dem Isoschizomer von SphI, geschnitten.
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Reinigung von PCR-Amplifikaten
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Für die Reinigung
von PCR-Amplifikaten wurde der gesamte PCR-Ansatz elektrophoretisch
durch ein Agarosegel aufgetrennt. Nach Ethidiumbromid-Färbung wurde
das entsprechende DNA-Fragment aus dem Agarosegel ausgestochen und
die DNA über
ein DNA-Agarosegel-Extraktions
Kit (E.Z.N.A.-Gel-Extraction-Kit) der Firma peQLab nach dem angegebenen
Protokoll gereinigt.
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Dephosphorylierung des
Vektors
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Zur
Dephosphorylierung geschnittener Vektor-DNA wurde der gesamte gereinigte
Ansatz mit 0.5 U alkalischer Phosphatase aus Garnelen (Fermentas)
im entsprechenden Puffer für
1 h bei 37 °C
inkubiert und anschließend
für 15
min bei 65 °C
hitzeinaktiviert.
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Ligation,
Transformation und Isolation positiver Klone Nach der Dephosphorylierung
des Vektors wurden die so entstandenen kohäsiven Enden wie bereits beschrieben
ligiert und die Ligationsansätze
für eine Transformation
per Elektroporation in kompetente Escherichia coli DH10B Zellen
verwandt.
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Es
konnten Klone isoliert werden, die nach Verdau mit SacI und PaeI
ein Insert der gewünschten
Größe (4.6
kb) aufwiesen. Die Integrität
der klonierten DNA wurde durch eine partielle DNA-Sequenzbestimmung (MWG-Biotech)
des klonierten Inserts überprüft. Der
so erhaltene neue Vektor erhielt die Bezeichnung pMM1520-dsrS (vgl.
SEQ ID 3).
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Beispiel 2
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Protoplastenttransformation
von Bacillillus megaterium-Stamm DSM 509 und WH320 durch das in
Beispiel 1 hergestellte Expressionsplasmid
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Protoplastenpräparation
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50
ml LB-Medium wurden mit 1 ml einer Übernachtkultur von B. megaterium
angeimpft und bei 37 °C inkubiert.
Bei einer OD578 von 1 wurden die Zellen
abzentrifugiert (10000 × g;
15 min; 4 °C)
und in 5 ml frisch hergestellten SMMP-Puffer resuspendiert. Nach
Zugabe von Lysozym in SMMP-Puffer wurde die Suspension 60 min bei
37 °C inkubiert
und die Protoplastenbildung unter dem Mikroskop kontrolliert. Nach
Ernten der Zellen durch Zentrifugation (3000 × g; 8 min; Rt) wurde das Zellsediment
vorsichtig in 5 ml SMMP-Puffer resuspendiert und der Zentrifugations-
und Waschschritt ein zweites mal durchgeführt. Die Protoplastensuspension konnte
nun, nach Zugabe von 10 % (v/v) Glycerin, portioniert und bei –80 °C eingefroren
werden.
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Transformation
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500 μl der Protoplastensuspension
wurden mit 1 μg
DNA des Expressionsplasmids pMM1520dsrS in SMMP-Puffer versetzt
und 1.5 ml PEG-P-Lösung
zugegeben. Nach Inkubation bei Rt für 2 min wurden 5 ml SMMP-Puffer
hinzugefügt,
vorsichtig gemischt und die Suspension zentrifugiert (3000 × g; 5 min;
RT). Sofort danach wurde der Überstand
abgenommen und das kaum sichtbare Sediment in 500 μl SMMP-Puffer
resuspendiert. Die Suspension wurde 90 min bei 37 °C unter leichtem
Schütteln
inkubiert. Danach wurden 50–200 μl der transformierten
Zellen mit 2.5 ml cR5-Topagar gemischt und auf LB-Agar-Platten gegeben,
die für
die Selektion 10 μg/ml
Tetracyclin enthielten. Transformierte Kolonien wurden nach eintägiger Inkubation
bei 37 °C
sichtbar.
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Es
wurden folgende Stämme
transformiert:
- *
DSM: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Braunschweig
-
Beispiel 3
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Expression und Sekretion
des dsrS-Gens in Bacillus megaterium
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Kultivierung, Probennahme
und Zellaufschluss
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150
ml gepuffertes LB-Medium (LB in 100 mM TRIS-HCl, pH 6.4) bzw. MOPSO-Minimalmedium wurden
mit einer B. megaterium Übernachtkultur
angeimpft und bei 37 °C
aerob inkubiert. Expressionsplasmid pMM1520 bzw. pMM1520-dsrS enthaltende
Bakterien wurden durch Tetracyclinzugabe (10 μg/ml) selektioniert. Nach Erreichen
einer OD578 von 0.3 wurde der xyl-Promotor
des Expressionsplasmids durch Zugabe von 0.5 % (w/v) Xylose zum
Wachstumsmedium induziert (Rygus und Hillen, 1991). Vor der Induktion,
sowie nach der Induktion, wurden jeweils Proben mit ca. 2 × 109 Zellen abgenommen. Die entnommenen Proben
wurden zentrifugiert (12000 × g;
3 min; Rt) und der Überstand (zellfreies
Kulturmedium) bei –20°C gelagert.
Die sedimentierten Zellen wurden in 40 μl Aufschlusspuffer resuspendiert.
Anschließend
wurde die Suspension 30 min bei 37 °C inkubiert. 20 μl des Aufschlusses
wurden mit 5 μl
SDS-PAGE-Probenpuffer versetzt und nach 15 minütigem Kochen im Wasserbad 30
min bei 15000 rpm zentrifugiert. Der Überstand wurde durch eine SDS-PAGE
analysiert.
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SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
(SDS-PAGE)
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Die
SDS-PAGE wurde ausgeführt
nach dem Protokoll von Lämmli,
1970 mit den Modifikationen von Righetti et. al, 1990 für eine diskontinuierliche
SDS-PAGE unter Fokussierung der Proteine in einem großporigen
Sammelgel und Auftrennung in einem kleinporigen Trenngel. Die zu
analysierenden Proben wurden auf ein 6 %iges Gel aufgetragen, das
bei einem Stromfluss von 4 mA/cm gefahren wurde. Der Lauf wurde
beendet, sobald der Bromphenolblaumarker das Gelende erreicht hatte.
Als Molekularmassenstandard wurde der High Molecular Weight Marker
von Sigma verwendet. Die Gele wurden für eine Färbung mit Coomassie Brilliant Blue
G-250 in der Färbelösung im
Mikrowellenofen erhitzt und in der Lösung für ca. 5 min geschwenkt. Anschließend wurden
sie bis zur völligen
Entfärbung
der proteinfreien Gelmatrix in Entfärbelösung geschwenkt, über Nacht
in Fixierlösung
fixiert, fotografiert (BioRad Geldokumentationsanlage) und zur Konservierung
zwischen zwei Cellophanfolien getrocknet.
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Expression des Dextransucrasegens
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Die
Produktion der Dextransucrase mittels pMM1520-dsrS in den B. megaterium
Stämmen
DSM509 und WH320 wurde sowohl bei einer Kultivierung der Stämme in LB-Medium,
als auch in MOPSO-Minimalmedium untersucht. Da berichtet wird, daß die Dextransucrase
im Alkalischen instabil ist, wurde das LB-Medium mit 100 mM TRIS-HCl-Puffer, pH 6.4
gepuffert (Monchois, V., Remaud-Simeon, M., Russell, R.R., Monsan,
P., Willemot, R.M. (1997). Characterization of Leuconostoc mesenteroides
NRRL B-512F dextransucrase (DSRS) and identification of amino-acid
residues playing a key role in enzyme activity. Appl. Microbiol.
Biotechnol. 48(4), 465-72). Als Kontrolle diente jeweils der mit
dem Plasmid (pMM1520) ohne Dextransucrasegen transformierte B. megaterium-Stamm. Die Geninduktion
mittels Xylosezusatz erfolgte zu Beginn der exponentiellen Wachstumsphase
bei einer OD578 von 0.3. Vor und nach der
Induktion wurden Proben der Bakterienkultur entnommen.
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Die
Proteinzusammensetzung der aufgeschlossenen Zellen wurde mittels
einer SDS-PAGE überprüft. Beide
Stämme
DSM509 und WH320 transformiert mit pMM1520-dsrS zeigten eine deutliche
Produktion der Dextransucrase (Mr = 200.000)
in LB-Medium. Die Extrakte präpariert
aus DSM509 und WH320 mit dem Vektor pMM1520 ohne dsrS wiesen bei
der Mr von 200.000 keine Proteinbande auf.
Da die Konzentration, sowie das zeitliche Auftreten der Dextransucrasebande
für Extrakte
präpariert
aus beiden B. megaterium Stämmen WH320
und DSM509 gleich waren, ist hier nur die Proteinanalyse für Extrakte
vom DSM 509 gezeigt (7).
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Die
Produktion der Dextransucrase in B. megaterium WH320 wurde vergleichend
auch in MOPSO-Minimalmedium getestet (8). Eine
sichtbare DsrS-Bildung trat bereits nach 20 Minuten auf. Die Proteinbande schien
aber nach 4 Stunden an Intensität
zu verlieren: Dies wird besonders deutlich in einer Probe, die nach einem
Tag Kultivierung (1660 min) genommen wurde. Dies deutet auf einen
schwachen proteolytischen Abbau des Enzyms oder auf eine Abnahme
der DsrS-Produktion hin.
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Aktivitätsnachweis
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Der
Nachweis der Aktivität
konnte durch eine Aktivitätsfärbung im
Gel erzielt werden. Nach der SDS-PAGE von Proben, die nicht gekocht
wurden, wird das Gel dreimal je 20 min in der Waschlösung bei
4 °C gewaschen.
Trition X-100 führt
zu einem Auswaschen des SDS, so dass sich die Glukosyltransferasen
zurückfalten.
Nach einer Inkubation des Gels bei 37 °C über Nacht in der Waschlösung mit
100 g/l Saccharose wird das produzierte Dextran als weißes Band
sichtbar (Monchois, V., Remaud-Simeon, M., Russell, R.R., Monsan,
P., Willemot, R.M. (1997). Characterization of Leuconostoc mesenteroides
NRRL B-512F dextransucrase (DSRS) and identification of amino-acid
residues playing a key role in enzyme activity. Appl. Microbiol. Biotechnol.
48(4), 465-72). Die Intensität
dieser Bande kann durch Waschen in 50 % Ethanol erhöht werden, wobei
das Gel stark einläuft.
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9 zeigt,
dass das Enzym nach Elektrophorese in einer SDS-PAGE aktiv war und
die Bildung von Dextran aus Saccharose katalysierte. Im Zellextrakt
ist eine Proteinbande sichtbar. Durch Kochen der Probe trat Teilabbau
bzw. Inaktivierung des Enzyms auf, da kleinere Proteine mit Enzymaktivität sichtbar
wurden und die Aktivität
des Enzyms abnahm. Die anschließende
Zentrifugation hatte keinen Einfluss auf die Proteinstabilität.
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Nachweis der Sekretion
der Glukosyltransferase ins Wachstumsmedium
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Zur
Analyse der Sekretion wurden Proben des Kulturmediums von B. megaterium
genommen und bei –20 °C. gelagert.
Zum besseren Nachweis wurde 1.5 ml Kulturmedium 10 μl einer Lösung von
5 % (w/v) Sephadex-G75 zugesetzt und 2 h Stunden bei 4 °C bei 1000
rpm geschüttelt.
Nach 5 min Zentrifugation (13.000 rpm) kann das Sephadex-Sediment
mit SDS-Probenpuffer versetzt werden. Die Proben wurden per SDS-PAGE
und Aktivitätsanalyse
untersucht.
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Die
Kultur von B. megaterium WH320 mit pMM1520dsrS wurde mit 0.5 % (w/v)
Xylose behandelt und zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Geninduktion
die Dextransucraseaktivität
im Medium per Aktivitätsfärbung analysiert
(10). Eine Stunde nach Induktion fand sich DsrS
ohne Signalpeptid (188.000) im Medium, begleitet von einer dünnen Sande
pre-DsrS (200.000). Eine Stunde später war nur eine geringe Steigerung
der Proteinmenge zu beobachten. Drei Stunden nach Induktion nahm
die Menge von DsrS und pre-DsrS sprunghaft
zu. Außerdem
wurde eine kleinere aktivitätsgefärbte DsrS-Form
(Mr = 165.000) beobachtet. Ein Auftreten
von Vorläuferprotein
im Kulturmedium wurde auch bei der Produktion von AmyQ in B. subtilis
bei hohen Induktionskonzentration eine Stunde nach Induktion beobachtet
und wurde auf Sekretionsstress und zunehmende Zelllyse zurückgeführt (Vitikainen,
M., Pummi, T., Airaksinen, U., Wahlstrom, E., Wu, H., Sarvas, M.,
Kontinen, V. P. (2001). Quantitation of the capacity of the secretion
apparatus and requirement for PrsA in growth and secretion of alpha-amylase
in Bacillus subtilis. J. Bacteriol. 183(6), 1881-90). Die Proteolyse
zur DsrS-Form mit Mr von 165.000 kann aber
auch im Medium durch die neutrale Protease (Meinhardt, F., Busskamp,
M. and Wittchen, K. D. (1994). Cloning and sequencing of the leuC
and nprM genes and a putative spoIV gene from Bacillus megaterium
DSM319. Appl. Microbiol. Biotechnol. 41 (3), 344-351) oder bei der
Passage durch die Zellwand durch eine zellwandassoziierter Protease
(wie WprA in B. subtilis) auftreten. Drei Stunden nach Induktion
erreicht die DsrS-Aktivität
ca. 0.005 U in 1.5 ml Medium. Das entsprach ca. 3 U/l.
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