DE69635739T2 - Verwendung eines sec-abhängigen sekretionssystems zur sekretion von proteinen, welche gewöhnlich durch ein sec-unabhängiges sekretionssystem sekretiert werden - Google Patents

Verwendung eines sec-abhängigen sekretionssystems zur sekretion von proteinen, welche gewöhnlich durch ein sec-unabhängiges sekretionssystem sekretiert werden Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Sec-abhängigen Sekretionssystems zur Sekretion von Proteinen, die normalerweise durch Sec-unabhängiges Sekretionssystem sezerniert werden. Sie betrifft ferner Milchsäurebakterien, die dieses Sec-abhängige Sekretionssystem enthalten, insbesondere Lactococcus, die zur Spezies Lactococcus lactis gehören, die Verwendung bestimmter Lactococcus-Stämme, um dieses Sekretionssystem auf Stämme zu übertragen, die von technischem Interesse sind, insbesondere in der Molkereiindustrie, sowie die Verwendung bestimmter Stämme von Lactococcus lactis zur Gewinnung dieses Sekretionssystems.
  • Die Sekretion von Proteinen geschieht bei Bakterien allgemein auf zwei Wegen. Der bekannteste Weg ist der Sec-abhängige Transport. Gemäß diesem Weg wird das Protein aufgrund des Vorliegens eines Peptidsignals in N-terminaler Position, das im sezernierten Protein abgespalten ist, nach außen transportiert. Bei E. coli wurden mehrere an dieser Sekretion beteiligte Proteine nachgewiesen, insbesondere SecA, SecY und SecE. Bei L. lactis wurde das Gen für secY nachgewiesen: Es besitzt eine erhebliche Homologie zum Gen secY von E. coli, was anzeigt, dass dieses Sekretionssystem sehr wahrscheinlich auch bei L. lactis vorliegt (Koivula et al., 1991, FEBS Lett. 228 : 114-118).
  • Der zweite Weg der Sekretion bei Bakterien, der nicht von den Sec-Proteinen abhängig ist, impliziert transmembrane Translokatoren, die als Familie der Proteine A, B, C bezeichnet werden (Pugsley, 1993, Microbiol. Rev. 57 : 50-108).
  • Bei L. lactis wurden Translokatoren nachgewiesen; sie sind bei der Sekretion der Bacteriocine LcnA, LcnB und LcnM1 und der Antibiotika Lacticin 481, Nisin A und Nisin Z beteiligt (de Vos und Simons, Genetics and Biotechnology of L.A.B., Blackie Academic and Professional, 1994).
  • Die Untersuchung dieser beiden Wege der Sekretion bei L. lactis wurde vorgenommen, um verschiedene Sekretionssysteme von heterologen Proteinen ausnützen zu können. Die Gesamtheit der ermittelten Sekretionsvektoren ist in der Monographie von Vos und Simons, Genetics and Biotechnology of L.A.B., Blackie Academic and Professional, 1994, enthalten.
  • Die bei den Milchsäurebakterien nachgewiesenen Bacteriocine werden fast alle von dem Sec-unabhängigen System sezerniert (Dodd und Gasson, Genetics and Biotechnology of L.A.B., Blackie Adademic and Professional, 1994). Allerdings kann es aus Gründen der Erhöhung der Sekretion dieser Bacteriocine von Bedeutung sein, eine Sekretion dieser Bacteriocine durch ein anderes Sekretionssystem zu veranlassen.
  • Kürzlich wurde gezeigt, dass das Divergicin A, ein von Carnobacterium divergens erzeugtes Bacteriocin, über ein Sec-abhängiges System sezerniert wird (Worobo et al., J. Bacteriol. 177 : 3143-3149). Es wurde allerdings bei den Milchsäurebakterien nie nachgewiesen, dass ein von einem Sec-unabhängigen System sezerniertes Bacteriocin von einem Sec-abhängigen System sezerniert werden kann.
  • Von der Anmelderin wurden Untersuchungen auf diesem Gebiet durchgeführt, wobei in überraschender Weise festgestellt wurde, dass ein Sec-abhängiges Sekretionssystem zur Sekretion von Proteinen herangezogen werden kann, die normalerweise von einem Sec-unabhängigen Sekretionssystem sezerniert werden.
  • Gemäß der Erfindung wird das Sec-abhängige Sekretionssystem in Kombination mit der DNA-Sequenz, die ein reifes und normalerweise von einem Sec-unabhängigen System sezerniertes Protein codiert, dem Lactococcus-Promotor P32, der Signalsequenz sp der Lactococcus-Protease und dem Terminator des Gens der Immunität gegen LcnB (lciB) zur Sekretion des reifen Proteins, das normalerweise von einem Sec-unabhängigen Sekretionssystem sezerniert wird, verwendet.
  • Dementsprechend betrifft die Erfindung ferner auch das DNA-Konstrukt zur Sekretion von Proteinen, die normalerweise durch ein Sec-unabhängiges System sezerniert werden, durch ein Sec-abhängiges System, das den Lactococcus-Promotor P32, die Signalsequenz sp der Lactococcus-Protease, die das reife und normalerweise von einem Sc-unabhängigen System sezernierte Protein codiert, den Terminator des Gens der Immunität gegen LcnB (lciB) umfasst. Dieses DNA-Konstrukt kann in einem Expressionsvektor, wie einem Plasmid, in der genomischen DNA oder in einem beliebigen anderen DNA-Fragment vorliegen.
  • Gemäß der Erfindung kann ein beliebiges Sec-abhängiges Sekretionssystem in Kombination mit einem Gen verwendet werden, das ein interessierendes Protein codiert, das normalerweise durch ein Sec-unabhängiges System sezerniert wird.
  • Als ein interessierendes Protein codierende Gene können zum Beispiel insbesondere Gene herangezogen werden, die Bacteriocine codieren, insbesondere das Bacteriocin LcnB, das ein Bacteriocin darstellt, das von L. lactis in Abhängigkeit von einem Sec- unabhängigen Sekretionssystem sezerniert wird (Van Belkum et al., 1992, Applied Environ. Microbiol. 58 : 572-577).
  • Die Erfindung betrifft ferner Milchsäurebakterien und vorzugsweise L. lactis, die ein oder mehrere Bacteriocine sezernieren und die ein Konstrukt gemäß der Erfindung, wie oben definiert, enthalten, das die Sekretion dieser Bacteriocine erlaubt. Dieses Konstrukt kann durch Konjugation, Transformation, Protoplasten-Verschmelzung oder ein anderes Genübertragungsverfahren in die Milchsäurebakterien eingeführt werden.
  • Die Milchsäurebakterien, die mit dem Konstrukt gemäß der Erfindung vorteilhaft transformiert werden können, sind zum Beispiel Lactococcus lactis ssp cremoris, Lactococcus lactis ssp lactis, Lactococcus lactis ssp lactis var diacetylactis.
  • Diese so transformierten Stämme können zur Übertragung eines Konstrukts gemäß der Erfindung auf einen Stamm von technischem Interesse durch Konjugation, Transformation, Transduktion, Protoplasten-Verschmelzung oder ein anderes Genübertragungsverfahren verwendet werden. Dieses Konstrukt kann durch ein Plasmid oder einen anderen Teil des Bakteriengenoms transportiert werden.
  • Die Erfindung betrifft ferner auch Stämme von technischem Interesse, welche so erhaltene Proteine sezernieren, wie beispielsweise Bacteriocine. Diese Bakterien, die Bacteriocine sezernieren, können zur Inhibierung der Entwicklung pathogener Bakterien, zur Lyse von Bakterien, damit ihr Enzyminhalt an der Reinigung der durch diese Bakterien fermentierten Produkte teilnimmt, oder auch dazu verwendet werden, um über Bakterien für beliebige Zwecke zu verfügen, bei denen eine Sekretion von Bacteriocinen durch ein erfindungsgemäßes Konstrukt impliziert ist.
  • Die Erfindung wird im Folgenden anhand von Beispielen erläutert, die jedoch lediglich illustrativ und nicht einschränkend sind.
  • Ein großer Teil der Gesamtheit der in diesen Beispielen beschriebenen und den Fachleuten geläufigen Verfahren sind im Einzelnen in der Monographie von Sambrook, Fritsch und Maniatis "Molecular cloning; a laboratory manual", Veröffentlichung 1989 von dem Herausgeber Cold Spring Harbor Press, New York (2. Auflage), beschrieben.
  • Die nachstehende Beschreibung wird anhand der 1 bis 3 erläutert; es zeigen:
  • 1: Die Konstruktion des Vektors psV123
  • 2: die Konstruktion des Sekretionsvektors pSV
  • 3: die Konstruktion des Plasmids pSVLcnB, das die Sekretion von LcnB ermöglicht.
  • Beispiel 1: Konstruktion des Sekretionsvektorplasmids pSV
  • Um ein Bacteriocin sezernieren zu können, dessen Sekretion Sec-unabhängig ist, musste zuvor ein Sec-abhängiger Vektor konstruiert werden. Diese Konstruktion geschah wie folgt:
    Bei jeder der Klonierungen, bei der es erforderlich war, wurde das PCR-Verfahren unter folgenden Bedingungen herangezogen: 1 Minute bei 94 °C (Denaturierung), 2 Minuten bei 45 °C (Hybridisierung) und 2 Minuten bei 73 °C (Polymerisation), 30 Zyklen. Die Oligonucleotide wurden mit einem Synthesegerät Applied Biosystems 381A DNA (Applied Biosystems) synthetisiert.
  • Zum Aufbau des Sekretionsvektors pSV wurden die Oligonucleotide A, B, C und D verwendet.
  • Die Sequenzen dieser Oligonucleotide sind wie folgt (die zur Klonierung verwendeten Restriktionsstellen sind unterstrichen, die RBS im Oligonucleotid B ist fett gedruckt):
  • Oligonucleotid A:
    Figure 00060001
  • Oligonucleotid B:
    Figure 00060002
  • Oligonucleotid C:
    Figure 00060003
  • Oligonucleotid D:
    Figure 00060004
  • PCR (Polymerase Chain Reaction)-Produkte, die den Promotor und die Ribosomen-Bindungsstelle RBS (Ribosome Binding Site) des ORF32 (Open Reading Frame = offenes Leseraster) enthielten, wurden aus dem Plasmid pMG36c (Van de Guchte et al., 1989, Applied Environ. Microbiol. 55 : 224-228) erhalten, das sich von dem nachstehend verwendeten Plasmid pMG36e ableitet.
  • Die Signalsequenz sp der Lactococcus-Protease prtP wurde aus dem Gen prtP erhalten, das in dem Plasmid pGKV500 vorliegt (Kok et al., 1988, Applied Environ. Microbiol. 54 : 221-228).
  • Diese PCR-Produkte wurden nach Abbau mit den Restriktionsenzymen BgIII und PstI in dem Plasmid pUK21 (Vieira und Messing, 1991, Gene 100 : 189-194) kloniert und ergaben die Plasmide pSV1 und pSV23 (1). Anschließend wurde das Plasmid pSV23 mit den Restriktionsenzymen ClaI und NdeI abgebaut; das Fragment, welches das Sequenzsignal enthielt, wurde in dem Plasmid pSV1 kloniert, nachdem zuvor ein Abbau mit den Restriktionsenzymen ClaI und NdeI vorgenommen worden war, wonach das Plasmid pSV123 (1) erhalten wurde. Schließlich wurde das Fragment EcoRI-SacI von pSV123, das den Promotor P32 und das Sequenzsignal sp enthielt, in dem Plasmid pMG36e kloniert (Van de Guchte et al., 1989, Applied Environ. Microbiol. 55 : 224-228), wonach der Sekretionsvektor pSV erhalten wurde (2).
  • Beispiel 2: Konstruktion des Plasmids pSVLcnB, das an der Sekretion des Bacteriocins LcnB beteiligt ist
  • Das Plasmid pMB580 (von dem Plasmid pGK210 abgeleitetes Plasmid, das Resistenz gegen Erythromycin verleiht und das Lactococcin B-Operon enthält, das heißt, LcnB und LciB – Van Belkum et al., 1992 Applied Environ. Microbiol 58 : 572-577) wurde mit den Restriktionsenzymen NsiI und HindIII abgebaut. Das HindIII-Ende wurde hydrolysiert um es in ein Produkt mit offenem Ende umzuwandeln. Das HindIII-NsiI-Fragment wurde mit dem Plasmid pSV, das zuvor mit den Restriktionsenzymen PstI und SacII abgebaut worden war und dessen SacII-Ende hydrolysiert worden war, um es in ein Produkt mit offenem Ende umzuwandeln, ligasiert, wodurch das Plasmid pSVLcnB erhalten wurde (3). Die resultierende Aminosäuresequenz dieses LcnB-Derivats mit der Signalsequenz des Proteins PrtP ist die nachstehende Sequenz:
    N-MQRKKKGLSILLAGTVALGALAVLPVGEIQAKA
    SLQYVMSAGPYTWYKDERTGKTECKQTIDTASYTFGVMAEGWGKTFH-C
  • Beispiel 3: Sekretion von LcnB durch ein Sec-abhängiges Sekretionssystem
  • Das von dem Plasmid pSV abgeleitete Plasmid (pSVLcnB), welches das Strukturgen des Lactococcins LcnB (lcnB) und das Gen der LcnB (lciB)-Immunität enthält, diente zur Transformierung des Stamms E. coli JM101 (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory), des Stamms Lactococcus lactis MG1363 (Gasson, 1983, J. Bacteriol. 154 : 1-9) und des Stamms Lactococcus lactis IL1403 (Chopin et al., 1984, Plasmid, 11 : 260-263) herangezogen. Bei diesen Konstrukten wurde das N-terminale Ende des Prebacteriocins durch das Signalpeptid von PrtP ersetzt (1, 2 und 3).
  • Zum Test der Bacteriocin-Wirksamkeit wurden die Stämme mit einer darüber aufgebrachten Schicht des Stamms IL1043 bedeckt, der entweder pMG36e oder pMG36c enthielt. Dieser Test wurde wie folgt durchgeführt:
    Kolonien, die das Konstrukt (pSVLcnB) enthielten, wurden 16 h bei 30 °C in Schalen mit M17 (Terzaghi und Sandine, 1975, Appl. Microbiol. 29 : 807-813) + Glucose 5 g/l + Agar 5 g/l inkubiert.
  • Nachdem die Schalen 20 Minuten Chloroformdämpfen ausgesetzt worden waren, wurden die Schalen teilweise an der Luft getrocknet, um verbliebene Spuren von Chloroform zu eliminieren. Anschließend wurden 4 ml Gelose M17 + Glucose 5 g/l + Agar 7 g/l, die mit 40 μl einer über Nacht erzeugten Kultur des Indikatorstamms L. lactis IL1403, der pMG36e oder pMG36c enthielt, inokuliert worden waren, über diese Schalen ausgestrichen. Nach 12 bis 18 h Inkubation bei 30 ° C wurden die Schalen auf Inhibitionszonen (Halos) um die Klone herum analysiert. Die Versuche mit einer aufgebrachten Schicht auf Tricin-Gelen wurden nach der von Van Belkum et al., 1992, in Applied Environ. Microbiol. 58 : 572-577, beschriebenen Methode durchgeführt.
  • Die Ergebnisse zeigten, dass ein Inhibitionshalo um Klone herum auftritt, die pSVLcnB enthalten. Dieser Halo ist um Klone herum, die pSVLcnBc enthalten, größer. Dies zeigt an, dass das Bacteriocin LcnB aufgrund des pSVLcnB und des pSVLcnBc tatsächlich sezerniert wurde. Zur Bestätigung dieses Ergebnisses sowie zur Feststellung, ob die Bacteriocin-Wirksamkeit durch eine reife Form (ohne Peptidsignal sp) oder eine unreife Form (mit dem Peptidsignal sp) bedingt ist, wurden Überstände der Kultur des Stamms IL1403, der pSVLcnB enthielt, einer Fällung mit Ammoniumsulfat unterzogen; der Niederschlag wurde der Gelelektrophorese an Tricin-SDS-PAA unterzogen. Die Gele wurden anschließend auf bactericide Wirksamkeit geprüft. Die Resultate zeigen, dass eine Inhibierung des Wachstums im Bereich von 3, 4 kDa auftritt, welcher der Größe des reifen Bacteriocins LcnB entspricht, das also das Sequenzsignal sp nicht mehr aufweist. Da der Stamm Lactococcus lactis MG 1363 das Sec-unabhängige Sekretionssystem der Bacteriocine nicht besitzt, wurde das Bacteriocin LcnB dank des Plasmids pSVLcnB über das Sec-abhängige Sekretionssystem unter Verwendung des Sequenzsignals sp der Lactococcus-Protease PrtP gleichwohl sezerniert.
  • SEQUENZLISTE
    Figure 00110001
  • Figure 00120001
  • Figure 00130001
  • Figure 00140001

Claims (6)

  1. Verwendung eines Sec-abhängigen Sekretionssystems in Kombination mit der DNA-Sequenz, die ein reifes und normalerweise von einem Sec-unabhängigen System sezerniertes Protein codiert, dem Lactococcus-Promotor P32, der Signalsequenz sp der Lactococcus-Protease und dem Terminator des Gens der Immunität gegen LcnB (lciB) zur Sekretion des reifen Proteins, das normalerweise von einem Sec-unabhängigen Sekretionssystem sezerniert wird.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz, die das reife Protein codiert, die DNA-Sequenz ist, die ein Bacteriocin codiert.
  3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Bacteriocin das Bacteriocin LcnB ist.
  4. DNA-Konstrukt zur Sekretion eines Proteins, das normalerweise durch ein Sec-unabhängiges System sezerniert wird, durch ein Sec-abhängiges System, dadurch gekennzeichnet, dass es den Lactococcus-Promotor P32, die Signalsequenz sp der Lactococcus-Protease, die DNA-Sequenz, die ein reifes und normalerweise von einem Sec-unabhängigen System sezerniertes Protein codiert, und den Terminator des Gens der Immunität gegen LcnB (lciB) enthält.
  5. Konstrukt nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA-Sequenz, die das Protein codiert, die DNA-Sequenz ist, die ein Bacteriocin codiert.
  6. Konstrukt nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Bacteriocin das Bacteriocin LcnB ist.
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