DE3687112T2

DE3687112T2 - Verfahren zur ausscheidung von genprodukten in das wachstumsmedium von gram-negativen bakterien.

Info

Publication number: DE3687112T2
Application number: DE8686850415T
Authority: DE
Inventors: Lars Abrahamsen; Tomas Moks; Bjoern Nilsson; Mathias Uhlen
Original assignee: Kabigen AB
Current assignee: Pfizer Health AB
Priority date: 1985-12-13
Filing date: 1986-12-02
Publication date: 1993-06-03
Anticipated expiration: 2006-12-03
Also published as: JPH082314B2; ATE82320T1; DK175020B1; JPS62190088A; EP0225860A2; US5156959A; JPH0746988A; CA1314010C; SE8505921D0; DE3687112D1; EP0225860A3; AU6633286A; EP0225860B1; DK600386D0; AU597317B2; JP2504723B2; GR3006597T3; DK600386A; ES2052497T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung der DNA- Rekombinationstechnologie und die Verwendung von gram-negativen Bakterien, wie Escherichia coli (nachstehend mit E. coli bezeichnet), zur Expression von Genprodukten und ihrer Ausscheidung an das Wachstumsmedium solcher Organismen.
Die Erfindung stellt somit ein Verfahren zur Expression von Proteinen in gram-negativen Bakterien bereit, wodurch die Proteine extrazellular sekretiert werden. Die Erfindung stellt ferner ein rekombinantes DNA-Konstrukt, Plasmidvektoren und gram-negative Bakterien bereit, die eine solche rekombinante DNA-Konstruktion enthalten. Die Erfindung betrifft auch durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte Proteine.
Die relativ neue DNA-Rekombinationstechnologie, durch die neue DNA-Strukturen konstruiert und in eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle eingeführt werden können, hat es theoretisch möglich gemacht, eine große Anzahl von Proteinen herzustellen. Die Verwendung von Bakterien zur Produktion heterologer Genprodukte hat es möglich gemacht, Proteine zu erhalten, die sonst nur aus natürlichen Quellen unter erheblichen Kosten gewonnen werden können. Bekannte Beispiele von ursprünglich aus Menschen stammenden Polypeptiden, die in Bakterien produziert wurden, sind humanes Wachstumshormon (hGH), Insulin, α-Interferon, γ-Interferon, Somatostatin und Somatomedine (insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren).
Die Verwendung von Bakterien zur Expression fremder Gene hat viele praktische und biologische Probleme aufgeworfen, die die Stabilität des Polypeptids gebunden an eine Proteolyse, die Expressionsmenge, die mit einer Fehlfaltung korrelierte Anhäufung des Proteinprodukts und das Fehlen biologischer Aktivität des Proteins nach Reinigung umfassen. Zur Lösung dieser Probleme wurde eine Vielzahl von Techniken entwickelt, um die gut charakterisierten Enterobakterien E. coli zur Expression eines jeglichen Genprodukts zu verwenden. Diese Verfahren umfassen die Verwendung verschiedener Promotoren zur Regulierung der Expressionsmenge, Genfusionen zur Stabilisierung normaler instabiler Proteine in der Zelle und die Verwendung von Signalpeptiden zur Translokation von Proteinen aus dem Cytoplasma in den periplasmatischen Raum, in dem Disulfidbrücken im Gegensatz zum Cytoplasma, wo das reduzierende Milieu diese Ausbildung schwierig macht, gebildet werden können. Proteine mit Cysteinbrücken in der Struktur, die im Cytoplasma von E. coli exprimiert werden, erhalten üblicherweise nicht die richtige tertiäre Struktur aufgrund der Schwierigkeiten, diese Brücken auszubilden. Dies kann möglicherweise zu einer Anhäufung des Polypeptids nach Überproduktion, zu einem raschen proteolytischen Abbau, wenn die Anhäufung nicht in der Zelle erfolgt, und zu fehlender biologischer Aktivität des exprimierten und gereinigten Polypeptids führen. Dies wurde in E. coli bei der Expression von Proinsulin, Insulin-A-Kette, Insulin-B-Kette, insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren und gewebespezifischem Plasminogenaktivator (t-PA) beobachtet. Zur Überwindung dieses Problems muß das Polypeptid nach Reinigung renaturiert oder in den periplasmatischen Raum von E. coli sekretiert werden, wo die korrekte Faltung möglicherweise erreicht werden kann. Ein weiterer Aspekt der bakteriellen Genexpression und Sekretion, abgesehen von vorstehend erwähnter Faltung und Stabilität, ist die Verwendung von gram-positiven Bakterien. Diese Organismen haben eine andere Organisation der das Zellcytoplasma umgebenden Membranstrukturen im Vergleich zu dem gram-negativen Gegenstück. Die gram-positiven Prokaryoten haben nur eine Zellmembran und sekretierte Proteine werden in das Wachstumsmedium abgegeben, während die Sekretion in gram-negativen E. coli das Protein in den periplasmatischen Raum bringt, was durch eine doppelte, das Zellcytoplasma umgebende Membranschicht bedingt ist. Unter Verwendung gram-positiver Bakterien können sekretierte Genprodukte aus dem Wachstumsmedium gesammelt werden, was die nachfolgende Prozessierung des Produkts erleichtert. Der Vorstellung, gram-positive Bakterien in industriellen Verfahren zu verwenden, ist somit mit diesem sekretorischen Verfahren verbunden, wobei es wegen anderer Aspekte jedoch vorzuziehen ist, die gut charakterisierten E. coli zur Produktion von Genprodukten in großen Mengen zu verwenden, einfach weil Expressionssysteme für diesen Organismus stärker entwickelt sind.
Die vorliegende Erfindung liefert eine Lösung hinsichtlich der Beschränkungen in der Anwendung von E. coli in industriellen Verfahren. Die vorliegende Erfindung erlaubt es, Genprodukte von E. coli quantitativ in das Wachstumsmedium zu sekretieren. Dieser genetische Schritt zur Erreichung einer Proteinausscheidung in gram-negativen Bakterien basiert auf der Induktion eines filamentösen Wachstums, wo die Expression des gewünschten Genprodukts von der Reaktion auf einen Hitzeschock abhängt und dieser Hitzeschock zu einem quantitativen Verlust von periplasmatisch-lokalisierten Proteinen an das Wachstumsmedium führt. Die Idee der vorliegenden Erfindung wird nachstehend näher erläutert.
Es ist bekannt, daß Signalpeptide in dem N-Terminus von exprimierten Proteinen vorliegen, die zur Sekretion durch eine Membran in prokaryotischen und eukaryotischen Zellen bestimmt sind. Dieses 20 bis 40 Aminosäuren enthaltende Signalpeptid wird während des Translokationsprozesses abgespalten. Es ist bekannt, daß viele Proteinfaktoren an diesem Sekretionsprozeß beteiligt sind, der molekulare Mechanismus ist jedoch im Detail nicht bekannt, obwohl gute Modelle vorliegen, die vernünftigerweise der Realität nahe sind.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend durch Hinweis auf das Staphylococcus-Protein A erläutert. Dieses Protein ist als Zellwandkomponente des pathogenen Bakteriums Staphylococcus aureus bekannt, das nachstehend mit S. aureus bezeichnet wird, und ist für seine spezifische Bindung an die konstante Region bestimmter Antikörperklassen der meisten Säugetiere, einschließlich des Menschen, bekannt. Protein A ist auch als hoch-repetitiv in seiner Struktur bekannt und fünf Regionen mit jeweils etwa 58 Aminosäuren, die in einer Tandem-Wiederholung angeordnet sind, fungieren einzeln als Bindungsstelle für Immunglobuline (wie humanes IgG). Auf der DNA-Ebene wurde gezeigt, daß eine Signalsequenz (nachstehend mit "S" bezeichnet), die für die Translokation von Protein A außerhalb des Cytoplasmas verantwortlich ist, vor diesen fünf IgG-Bindungsregionen liegt. Es wurde gezeigt, daß diese Signalsequenz auch in E. coli funktioniert und das Protein A wird so in dem periplasmatischen Raum nach Einführung des Protein A-Gens gefunden.
In den Arbeiten, die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegen, wurde das Fragment B von Protein A unmittelbar nach der Signalsequenz angebracht, wodurch eine blockierte Sekretion erhalten wurde. Der offensichtliche Schluß daraus ist der, daß die Unterschiede in der Aminosäuresequenz zwischen den Fragmenten B und E für den sekretorischen Prozeß wichtig sind. Die E. coli-Zellen, die dieses Fragment B von Protein A exprimieren, wachsen filamentös aufgrund einer unvollständigen Zellteilung. Dies wurde früher für E. coli-exprimierte Proteine beobachtet, die in der Zelle angehäuft werden. Es wurde nun gefunden, daß in dem periplasmatischen Raum vorliegende Proteine, wie β-Lactamase, in das Wachstumsmedium abgegeben werden. Bei Expression des Fragments SE wurde überraschenderweise gefunden, daß dieses Fragment E fast gänzlich in das Wachstumsmedium von E. coli ausgeschieden wird. Dies korreliert auch mit dem filamentösen Wachstum der Zellen. Andere Fragmente, die filamentöses Wachstum induzieren (obgleich in einem anderen Ausmaß), waren die Fragmente SEE und SEB. Alle diese kleineren Fragmente von Protein A führen irgendwie zu einem Defekt in der Zellteilung, der zu einer Ausscheidung von periplasmatischen Proteinen in das Wachstumsmedium führt.
Nach Fusion von SEE mit einem Gen, das humanen insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor-1 (IGF-I), einen Wachstumsfaktor von etwa 70 Aminosäuren, codiert, wodurch SEE-IGF-I erhalten wurde, konnte das Genprodukt aus dem Wachstumsmedium erhalten werden. In diesem Experiment konnte auch eine filamentöse Morphologie der Zellen beobachtet werden.
Alle vorstehend erwähnten Experimente wurden in einem in Fig. 9 gezeigten Vektor vom Typ A durchgeführt. Die Vektoren vom Typ A basieren auf pRIT4, bei dem die Protein A-Gen-Transkription in entgegengesetzter Richtung zu dem β-Lactamase(bla) Gen erfolgt. Wurde SEE-IGF-I in einen Vektor vom Typ B eingebaut, war die Expressionsmenge 20- bis 40-mal höher, verglichen mit der Typ-A-Orientierung. Der Vektor vom Typ B basiert auf pEMBL, bei dem das Protein A-Gen die gleiche Transkriptionsrichtung aufweist wie das β-Lactamase-Gen (bla). Das filamentöse Wachstum in diesen Zellen ist stark ausgeprägt. Die Ausscheidung an das Wachstumsmedium ist sehr effizient.
Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, daß die Ausscheidung der Genprodukte an das Wachstumsmedium mit filamentösem Wachstum der E. coli-Zellen korreliert und daß auch die Expressionsmenge mit dieser Induktion korreliert sein kann.
Ein Vektor vom Typ A, der das aus SEDABC bestehende Protein A-Gen enthält, wurde bei 30ºC oder 42ºC kultiviert. Bei der höheren Temperatur, die ausreichend hoch war, eine Hitzeschock-Reaktion zu erhalten, war die Expressionsmenge 20-bis 40-mal höher und die Ausscheidung an das Wachstumsmedium effizient.
Der Schluß, der aus den zu der vorliegenden Erfindung führenden Arbeiten gezogen werden kann, ist der, daß filamentöses Wachstum von E. coli zu einer Ausscheidung von periplasmatischen Proteinen in das Wachstumsmedium führt. Filamentöses Wachstum wird in E. coli-Zellen induziert, die den Protein A-Promotor und die Signalsequenz enthalten, und gebunden an die Orientierung der Fragmente in dem Plasmidvektor oder der Größe des exprimierten Teils von Protein A werden unterschiedliche Mengen der periplasmatischen Proteine in das Wachstumsmedium ausgeschieden.
Das Grundprinzip der vorliegenden Erfindung bringt einen sehr großen Vorteil für das vorliegende Fachgebiet, da die Induktion des filamentösen Wachstums in E. coli zu hoher Expression und wirksamer Sekretion führt, wenn sie hinter der Protein A- Signalsequenz und dem Promotor gesetzt ist.
Es ist zu betonen, daß die vorliegende Erfindung nicht von einer biologischen Erklärung für die Beobachtungen in dem Verhalten des vorliegenden Expressions/Sekretions-Systems abhängig ist.
Obwohl die Erfindung nicht auf eine spezielle Theorie beschränkt ist, gibt es dennoch eine vernünftige Erklärung für die gemachten Beobachtungen.
Das Protein A-Gen ist selbst ein Hitzeschock-Gen in E. coli.
Dies bedeutet, daß das Protein A stärker während der Hitzeschock-Reaktion transkribiert wird, als während der vegetativen Nicht-Hitzeschock-Reaktion. Der Grund für dieses Phänomen liegt upstream des früher beschriebenen E. coli-ähnlichen Promotors in dem Protein A-Gen, wo ein sigma-32-ähnlicher Promotor gefunden wurde. Diese vorgeschlagene sigma-32-Promotor- Sequenz ist zu der Consensus-Sequenz, die für Hitzeschock-Gene vorgeschlagen ist, homolog. Der für die Hitzeschock-Reaktion verantwortliche sigma-32-Faktor transkribiert normalerweise insgesamt 17 Gene in E. coli.
Die Hitzeschock-Reaktion wird ausgelöst, wenn die E. coli- Zelle unter Streß steht. Es wurde vorgeschlagen, daß falsch gefaltete Proteine der Hauptauslöser sind, und daß diese Induktion durch Hitze, 4% EtOH, oxidative Mittel und Chemikalien erreicht werden könnte, die ein falsches Ablesen oder die Produktion von fremden Proteinen verursachen, die keine geeignete tertiäre Struktur erlangen können.
Im vorliegenden Fall sind kleine Fragmente von Protein A oder eine starke Anfangsproduktion der Auslöser für die Hitzeschock-Reaktion. Ist diese Reaktion ausgelöst, wird das Protein A-Gen selbst mehr transkribiert, was zu einer verstärkten Auslösung führt. Diese Hitzeschock-Reaktion führt auch zu Defekten in der Zellteilung, zu sogenanntem filamentösem Wachstum. In der vorliegenden Beschreibung wird gezeigt, daß diese Art des Wachstums auch zu einer Ausscheidung des periplasmatischen Produkts an das Wachstumsmedium führt.
Durch Kultivierung eines das Protein A-Gen in einem Vektor des A-Typs enthaltenden E. coli-Stammes bei 30ºC bzw. 42ºC wird gezeigt, daß diese Temperaturinduktion zu hoher Expression und Ausscheidung führt, was die biologische Erklärung stützt und ein hervorragendes Induktionssystem liefert. Dies bedeutet, daß der Stamm bei niedriger Temperatur gezüchtet werden kann, die zu einer Produktion von geringer Menge führt, und daß, nachdem die Zellmasse erreicht ist, die Temperatur auf 42ºC erhöht wird, worauf die Produktion des Produkts stattfindet und das Produkt auch sekretiert wird.
Die Hitzeschock-Reaktion löst auch eine ATP-abhängige, mit La bezeichnete Protease aus. Die Produktion wird daher vorzugsweise in einem Stamm stattfinden, der einen Mangel an La- Protease aufgrund einer Mutation in ihrem Gen (lon) hat.
Die vorliegende Erfindung stellt demgemäß ein Verfahren zur Expression von Proteinen in gram-negativen Bakterien und zu ihrer extrazellulären Sekretion bereit, bei dem:
a) in ein gram(-) Bakterium ein rekombinantes DNA-Konstrukt eingebracht wird, das einen Promotor, eine die Translokation und das Processing ermöglichende Signalsequenz und ein, das gewünschte zu exprimierende Protein codierende Strukturgen umfaßt,
b) das Bakterium unter Bedingungen kultiviert wird, die zu filamentösem Wachstums führen, und
c) das extrazellulär sekretierte Protein gesammelt wird.
In einem solchen Verfahren ist die Expression des gewünschten Proteins vorzugsweise unter der gleichen Transkriptionskontrolle wie jene des filamentösen Wachstums. In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens basiert die Transkriptionskontrolle auf einer Induktion von htpR, das den sigma-32-Proteinfaktor exprimiert.
Wie vorstehend darauf hingewiesen wurde, basiert das Prinzip der vorliegenden Erfindung auf der Kultivierung von gramnegativen Bakterien unter Bedingungen, die zu filamentösem Wachstum führen. Ein solches filamentöses Wachstum kann von dem Charakter der rekombinanten DNA-Konstruktion und des dadurch exprimierten Proteins abhängen. Das filamentöse Wachstum kann auch an eine externe Induktion oder an eine Kombination von beiden gebunden sein. Somit kann filamentöses Wachstum durch eine erhöhte Temperatur in der Kultivierung verursacht sein, wodurch eine Hitzeschock-Reaktion induziert wird, es kann aber auch durch die Einführung eines denaturierenden Mittels, wie Ethanol, in das Kulturmedium verursacht sein.
Gebunden an die Tatsache, daß das in einer Wirtszelle durch ein wie vorstehend beschriebenes rekombinantes DNA-Konstrukt exprimierte Protein von der Zelle als fremd oder falsch-gefaltet erkannt wird, kann dies eine Langzeit-Reaktion in dem Bakterium induzieren.
Das rekombinante DNA-Konstrukt kann in das Bakterium auf verschiedene Weise eingeführt werden. Es kann so in die chromosomale DNA des Bakteriums eingeführt werden oder es kann in einem Plasmidvektor vorliegend eingeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält das rekombinante DNA-Konstrukt als einzelne Sequenz jene von Protein A. Vorzugsweise enthält das der Signalsequenz benachbarte Strukturgen eine Spaltungsregion, die für die N-terminalen Aminosäurereste des zu erhaltenden, reifen Proteins codiert. Eine solche Spaltungsregion kann konstruiert werden derart, daß sie für mindestens sechs Aminosäurereste codiert. Solche Reste sind vorzugsweise Ala Gln His Asp Glu Ala.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das Strukturgen Gene umfassen, die aus E-, EE- und EB-Domänen von Protein A ausgewählt sind. Das Strukturgen kann auch ein Produktions-Gen umfassen, wie jenes, das für den insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor 1 (IGF-I) codiert.
Die Erfindung stellt auch ein rekombinantes DNA-Konstrukt bereit, umfassend:
einen Promotor, eine Signalsequenz und ein Strukturgen einschließlich einer Spaltungsregion, worin das Strukturgen die Formel
(E)n(B)m - Y
hat, worin n eine ganze Zahl ≥ 1 ist, m eine ganze Zahl ist, Y eine ein gewünschtes Protein codierende DNA-Sequenz ist und E und B die Gene sind, die den Regionen E und B von Protein A entsprechen, außer, daß sich deren Strukturgen von jenem das natürliche Protein A codierende unterscheidet. In einer solchen Konstruktion kann n 1 sein und m 0 sein, n kann auch 2 sein und m kann auch 0 sein. In einer speziellen Ausführungsform können n und m 1 sein.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die rekombinante DNA-Konstruktion eine solche, in der n 2 ist, m 0 ist und Y das IGF-I- oder IGF-II-codierende Gen.
Die Erfindung umfaßt auch Plasmidvektoren, die die vorstehend angegebene rekombinante DNA-Konstruktion umfassen. Ein solcher Plasmidvektor kann jener sein, der von pEMBL9 abstammt.
Gemäß eines weiteren Aspekts umfaßt die Erfindung gram-negative Bakterien, die ein solches rekombinantes DNA-Konstrukt enthalten, wobei sie ein solches Konstrukt in ihrem Chromosom tragen oder einen es enthaltenden Plasmidvektor aufweisen. Ein zur Verwendung dieser Erfindung bevorzugtes Bakterium ist E. coli, wie E. coli HB101.
Gemäß eines weiteren Aspekts der Erfindung werden auch Proteine bereitgestellt, die unter Verwendung des erfindungsgemäßen Konzepts hergestellt worden sind.
Die vorliegende Erfindung wird ferner durch spezielle Beispiele unter Hinweis auf die bei liegenden Zeichnungen erläutert:
Fig. 1 ist eine schematische Darstellung des Protein A-Gens, die auf seine verschiedenen codierenden Regionen hinweist. S ist die Signalsequenz, A-E sind die IgG-Bindungsregionen, und X ist der C-terminale Teil, der keine IgG-Bindungsaktivität aufweist.
Fig. 2 erläutert den das Protein A-Gen enthaltenden Plasmidvektor pRIT4. Der mp 9-Multirestriktions-Enzymlinker wird mit seinem tatsächlichen, für Genfusionen relevanten Leserahmen gezeigt. CML ist das Chloramphenicolacyl-Transferase-Gen, Sa ist der Replikationsursprung von S. aureus, Ec ist der Replikationsursprung von E. coli, AMP ist das β-Lactamase-Gen, und Prot A zeigt den IgG-Bindungsteil des Protein A-Gens.
Fig. 3 zeigt die unterschiedlichen pAS- und pASE-Vektoren, die, wie in Teil I beschrieben, konstruiert wurden. CML ist das Chloramphenicolacyl-Transferase-Gen, ori Bs ist der Replikationsursprung von B. subtilis und S. aureus, ori Ec ist der Replikationsursprung von E. coli, AMP ist das β-Lactamase-Gen, S ist die Signalsequenz, und E ist die E-Region von Protein A.
Fig. 4 zeigt einen Plasmidvektor, der das Protein A-Gen, gefolgt von einem Multirestriktions-Enzymlinker trägt. Prot A ist das die IgG-Bindungsregion von Protein A codierende Gen. TC ist das die Tetracyclinresistenz codierende Gen und ori ist der Replikationsursprung von E. coli.
Fig. 5 zeigt die unterschiedlichen die B-Region von Protein A codierenden Gen-Fragmente. Die Pfeile auf der linken Seite zeigen die erhaltenen unterschiedlichen Bal 31-Klone. Der an die unterschiedlichen Bal 31-Konstrukte angeheftete Linker EcoRI ist gezeigt. Die Aminosäuresequenzen über die EcoRI- Stelle hinaus in die B-Region für das B-0-, B-1- und B-2-Konstrukt sind gezeigt. Auf der rechten Seite ist die Position des BamHI-Linkers am 3'-Ende des B-Fragments gezeigt. Ebenfalls ist auch der Translationsstop des Stop-Linkers (Fig. 6) in den zwei möglichen Orientierungen gezeigt.
Fig. 6 zeigt den Stop-Linker, der zu einem sofortigen Translationsstop unabhängig von der Orientierung des Stop-Linkers führt. Die drei unterschiedlichen Leserahmen für jede Orientierung sind gezeigt.
Fig. 7 zeigt die Aminosäuresequenz der Verbindung zwischen dem Signalpeptid und den unterschiedlichen pASB-Konstrukten im Vergleich zu der Verbindung in dem nativen Protein A. Die Pfeile über jeder Aminosäuresequenz zeigen die Processing- Position, wie durch Aminosäure-Sequenzierung von durch E. coli HB101 exprimierten Fragmenten analysiert.
Fig. 8 zeigt die Nukleotidsequenz des synthetischen IGF-I- Gens. Die EcoRI-Stelle und die HindZII-Stelle, die das synthetische Fragment flankieren, sind ebenfalls gezeigt, genau so wie die abgeleitete Aminosäuresequenz.
Fig. 9 zeigt die zwei verwendeten Typen von Plasmidvektoren zur Expression der unterschiedlichen von Protein A stammenden Konstrukte. CML ist das Chloramphenicolacyl-Transferase-Gen, S.a. ist der Replikationsursprung von S. aureus, Ec ist der Replikationsursprung von E. coli, AMP ist das β-Lactamase-Gen und Prot A betrifft die unterschiedlichen Protein A-Konstrukte, wie in der graphischen Erläuterung gezeigt.
Die Erfindung wird weiterhin durch spezielle Beispiele erläutert, die jedoch in keiner Weise für die Erfindung als limitierend angesehen werden können. Die Beispiele zeigen die Anwendung des Systems bei einem synthetischen, humanen insulinähnlichen Wachstumsfaktor I (IGF-I) codierenden Gen, das an SEE fusioniert ist, wodurch SEE-IGF-I erhalten wird. Es wurde gefunden, daß dieses Protein in gleicher Weise wie die kleinen Teile des Protein A-Gens sekretiert wurde und in einem Vektor vom Typ B war die Expressionsmenge sehr hoch.
Der Vektor pASEE wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Göttingen, Deutschland, unter der Hinterlegungsnummer 3593 in E. coli RR1 M15 hinterlegt.

Ausgangsmaterialien

Bakterielle Wirte

Zwei verschiedene Stämme von E. coli K12 wurden in den Beispielen verwendet: HB101 (Boyer, H. W. et al., J. Mol. Biol. 41 (1969), 459-472) und JM 103 (Messing, J. Methods Enzymol., 101 (1983), 20-79). (Die Stämme sind bei dem Department of Biochemistry and Biotechnology, Royal Institute of Technology, Stockholm, Schweden erhältlich.)

Klonierungsvehikel

Die in den Beispielen verwendeten Klonierungsvehikel waren pBR322 (Bolival, F. et al., Gene 2 (1977), 93-113), pEMBL8 (Dente et al., Nucl. Acids Res. 11 (1983), 1645), pEMBL 9 (Dente et al., Nucl. Acids Res. 11 (1983), 1645), pRIT4 (Nilsson, B. et al., EMBO J. 4 (1985), 1075), pSPA 11 (Uhlen, M. et al., Gene 23 (1983), 369) und pSPA 16 (Uhlen, M. et al., J. Bacteriol., 159 (1984), 713). Das synthetische IGF-I-codierende Gen wurde anderswo beschrieben (Elmblad, A. et al., in Third European Congress on Biotechnology 111, Verlag Chemie, Weinheim (1984), 287-296). Der in den Beispielen konstruierte Plasmidvektor pASEE wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Göttingen, Deutschland, unter der Nummer DSM hinterlegt.

Puffer und Medien

Beschichtungspuffer

1,59 g Na&sub2;CO&sub3;, 2,93 g NaHCO&sub3; und 0,2 g NaN&sub3;, aufgefüllt auf 1 Liter mit destilliertem H&sub2; O.

PBST

8,0 g NaCl, 0,2 g KH&sub2;PO&sub4;, 2,9 g Na&sub2;HPO&sub4; X 12H&sub2;O, 0,2 g KCl, 0,2 ml Twee® und 0,2 g NaN&sub3;, aufgefüllt auf 1 Liter mit destilliertem H&sub2;O (pH 7,4).

TSB

30 g Trypton/Soja-Brühe, aufgefüllt auf 1 Liter und autoklaviert.

TBAB

30 g Trypton auf Blutagarbasis, aufgefüllt auf 1 Liter und autoklaviert.

ONPG-Puffer

2 mM o-Nitrophenyl-β-D-galactosid (ONPG, Sigma- Produkt Nr. N-1127) in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,3 mit 15 mM 2-Mercaptoethanol und 1 mM MgCl&sub2;.

Routineverfahren

Bestimmte Verfahren wurden wiederholt in den Beispielen durchgeführt. Wenn nichts anderes angegeben, wurden sie jeweils wie nachfolgend durchgeführt.
Verfahren, die routinemäßig in der Molekularbiologie verwendet werden, werden nicht beschrieben (wie die Verwendung von käuflichen Restriktionsenzymen, DNA-Ligierungen, Bal 31-Exonuklease, S1-Nuklease und Klenow-Polymerase).

Transformationen

Eine Transformation von E. coli K12 mit einer Plasmid-DNA wurde exakt wie beschrieben durchgeführt (Morrison, D. A., Methods in Enzymology, Academic Press 68 (1979), 326-331). Die Transformanten wurden üblicherweise auf 70 mg/l Ampicillin enthaltenden Platten (TBAB) selektiert.

Isolierung von Plasmid-DNA

Plasmid-DNA wurde wie von Birnboim, H. C. et al., Nucl. Acids Res. 7 (1979), 1513 beschrieben, isoliert. Zum Screenen einer großen Anzahl von Transformanten wurden Präparationen kleiner Mengen exakt wie von Kieser, T., Plasmid 12 (1984), 19-36 beschrieben, durchgeführt.

Sepharose-6B-Chromatographie

Eine für eine Bal 31-Vorbehandlung zu verwendende Plasmid-DNA wurde einer Sepharose-6B-Gelfiltration in einem 10 mM Tris, 1 mM EDTA und 500 mM NaCl-Puffer unterworfen. Auf diesem Wege wird DNA von RNA abgetrennt.

Elution von DNA-Fragmenten

Eine Elution von DNA-Fragmenten aus Agarose- oder Polyacrylamidgel-Stücken wurde exakt, wie von Maxam et al., P.N.A.S. (USA), 74 (1977), 560-564 beschrieben, durchgeführt.

DNA-Sequenzierung

Eine DNA-Sequenzanalyse wurde exakt wie von Sanger, F. et al., J. Mol. Biol. 143 (1980), 161 beschrieben, durchgeführt.

Nachweis und Quantifizierung von Protein A

Ein ELISA-Test (Enzyme linked immunosorbent assay) wurde zur Quantifizierung von Protein A verwendet. Der Test verwendet eine spezielle Mikrotiterplatte (Titertek, Amstelstad, Niederlande) ohne Netto-Ladung. Die Löcher werden mit Human-IgG (Kabi AB, Schweden) in einem Beschichtungspuffer beschichtet. Testproben werden zugegeben und Protein A wird an die Fc-Teile des an die Wände adsorbierten IgG gebunden. Protein A wird dann mittels eines an β-Galactosidase (von Pharmacia AB, Uppsala, Schweden) konjugierten Anti-Protein A (von Kaninchen) getestet.

Test

Die Löcher einer Mikrotiterplatte werden mit 75 ul einer Lösung von Human IgG (16 ng/ml) in Beschichtungspuffer gefüllt und die Platte wird für mindestens 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Löcher werden dreimal mit 100 ul PBST gewaschen und 50 ul einer Probe in jedes Loch gegeben. Für eine quantitative Bestimmung werden Zweifach-Verdünnungen hergestellt. Nach 1-stündiger Inkubation werden die Löcher dreimal mit 100 ul PBST gewaschen, anschließend werden 50 ul Anti-Protein A-β-Galactosidase (die jedem Loch zugegebene Menge von Protein A-Bindungsfähigkeit entspricht der jedem Loch zugegebenen molaren Menge von IgG, wie durch Titration mit Protein A im Überschuß bestimmt) zugegeben. Nach 45-minütiger Inkubation wurden die Löcher dreimal mit 100 ul PBST gewaschen, anschließend wurden 125 ul ONPG-Puffer zugegeben. Nach 20-30-minütiger Inkubation wurde die Reaktion durch Zugabe von 150 ul 0,1 M NaOH gestoppt. Die Quantifizierung wird durchgeführt, indem eine 2-fache Verdünnung einer Protein A- Standardlösung bekannter Konzentration parallel mit den 2- fachen Verdünnungen der Testproben gefahren wird. Die Absorption bei 405 nm wird für jedes Loch photometrisch bestimmt.

β-Galactosidase-Test

Eine Quantifizierung von β-Galactosidase wurde kolorimetrisch durchgeführt, indem o-Nitrophenylβ-D-galactosid (ONPG, Sigma Produkt Nr. N-1127) als Substrat, wie von Miller, J. H. (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, New York; Cold Spring Harbor Laboratory, 1972) beschrieben, verwendet wurde. Der Reaktion folgte eine Spektrophotometrie bei 405 nm.

β-Lactamase-Test

Die Menge von β-Lactamase-Aktivität wurde exakt, wie von O'Callaghan et al., Antimicrob. Agents Chemother. 57 (1968) beschrieben, spektralphotometrisch bestimmt.

Osmotischer Schock

Die periplasmatisch-lokalisierten Proteine wurden exakt, wie von Nossal et al., J. Biol. Chem. 241 (1965), 3055 beschrieben, durch einen osmotischen Schock freigesetzt.

Beispiele

I. Analyse der Protein A-Nukleotidsequenz

Das Protein A-Gen umfaßt eine IgG-Bindungsregion (Domänen E, D, A, B, C) und eine Zellwand-Anheftungsregion (Region X) (Fig. 1). Diesen zwei Regionen geht eine Signalsequenz voraus.
Zur Herstellung von Fusionsvektoren, die Fusionspunkte nach der Signalsequenz bzw. Region E enthalten, ist es wünschenswert, die Nukleotidsequenz um den Fusionspunkt zu kennen.
Die Nukleotidsequenz von Protein A ist bekannt (Uhlen, M. et al., J. Biol. Chem. 259 (1984), 1695-1702). Die vollständige Offenbarung dieser Literaturstelle ist durch Hinweis aufgenommen.
In dem Fusionspunkt nach der Signalsequenz (nachstehend mit S bezeichnet) gibt es eine Mst I-Restriktionsenzymstelle. Nach der Region E gibt es ebenfalls eine Mst I-Restriktionsenzymstelle. Durch Spaltung des Protein A-Gens in einem geeigneten Plasmidvektor mit Mst I, gefolgt von einer Insertion von Linkern, können allgemein verwendbare Vektoren erhalten werden, wie nachstehend beschrieben.

II. Konstruktion von pAS, pASE und pASEE

In dem folgenden Schritt wird die Konstruktion von Plasmidvektoren beschrieben, in denen eine einzelne EcoRI-Stelle nach S bzw. SE integriert wird. Es wird ebenfalls beschrieben, wie SEE konstruiert wird, das eine EcoRI-Stelle zwischen den EE-Regionen, wie auch nach dem SEE-Konstrukt aufweist.

A. Konstruktion der Plasmidvektoren pAS, pASE und pASEE

50 ug von pRIT4 (Nilsson, B. et al., EMBO J., 4 (1985), 1075) (Fig. 2) wurden partiell mit Mst I gespalten, indem sie mit 5U des Restriktionsenzyms 2 Stunden bei 37ºC inkubiert wurden. Nach 30-minütiger Inkubation bei 65ºC wurde das Reaktionsgemisch in drei getrennte Reaktionsgemische aufgeteilt. EcoRI-Linker verschiedener Längen wurden den einzelnen Reaktionsgemischen zugegeben. Zu Röhrchen Eins wurde ein 8-mer- Linker (GGAATTCC), zu Röhrchen Zwei ein 10-mer-Linker (CCGAA TTCGG), und zu Röhrchen Drei ein 12-mer-Linker (CCCGAATTCGGG) zugegeben. Nach Ligierung (wie in Routineverfahren beschrieben) wurden die Ligierungsgemische entsprechend mit EcoRI gespalten, anschließend auf 2 ug/ml verdünnt und ligiert. Eine Transformation wurde, wie in Routineverfahren beschrieben, durchgeführt und Ampicillin-resistente Transformanten wurden selektiert. In jeder Reaktion wurden zwei Haupttypen von Vektoren gefunden. Ein Typ enthält die Signalsequenz, gefolgt von dem EcoRI-Linker und dem mp9-Multilinker. Der andere Vektortyp enthält den EcoRI-Linker nach der Region E, gefolgt von dem mp9-Linker. Durch die Zugabe von unterschiedlich langen EcoRI-Linkern sind die mp-9-Linker-Restriktionsstellen in den drei Leserahmen für jeden Konstruktionstyp (Fig. 3) verfügbar.
Neben diesen zwei in Fig. 3 gezeigten Vektortypen konnte in dem Experiment, das den 12-mer-EcoRI-Linker enthielt, ein weiterer Typ eines Plasmidvektors entdeckt werden. Dieses Konstrukt enthält einen SE-12-mer-Linker-E-mp9-Linker. Auf diesem Wege werden vier Aminosäuren zwischen die zwei E- Regionen wie auch eine EcoRI-Restriktionsstelle eingeführt.
Dieser Vektor wurde mit pASEE bezeichnet und hat den mp9- Linker in dem Leserahmen des Typs 3 (Fig. 3). Alle Konstrukte wurden über die Linker-Regionen durch DNA-Sequenzierung bestätigt.

III. Konstruktion eines B-Gen-Fragments

Das folgende Experiment beschreibt die Sub-Klonierung eines Gen-Fragments, das für eine Region B von Staphylococcus- Protein A codiert.
Das Ausgangsmaterial, der Plasmidvektor pSPA11, hat das Protein A-Gen nach einer Sau3 AI-Restriktionsstelle, die in der Region C 117 Basenpaare downstream der Region B liegt. Nach Reinigung von pSPA11 wurde das gereinigte Plasmid auf eine Sepharose-6B-Säule gegeben, wodurch das Plasmid von RNA befreit wurde, die als kommpetitiver Inhibitor in der Bal 31-Behandlung fungiert. Etwa 100 ug des gereinigten pSPA11 (Fig. 4) wurden mit EcoRI gespalten, das 117 Basenpaare downstream der Region B schneidet. Exonuklease Bal 31 wurde, wie in Routineverfahren beschrieben, verwendet. Nach der Bal 31-Spaltung wurde das Reaktionsgemisch mit EtOH präzipitiert, anschließend mit 10U Klenow-Polymerase in Gegenwart von 0,5 mM dNTPs behandelt, wodurch stumpfe Enden erhalten wurden. Der Pool von DNA heterologer Längen wurde mit BamHI 8-mer-Linkern (CGGATCCG) ligiert. Nach der Ligierung wurde das Reaktionsgemisch mit BamHI und HindIII gespalten. Die HindIII-Stelle liegt 79 Basenpaare upstream der Region B. Das Reaktionsgemisch wurde einer 5% Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterzogen, wodurch Fragmente heterologer Längen getrennt wurden. Die Fragmente von etwa 250 Basenpaaren wurden aus dem Gel ausgeschnitten, elektroeluiert und mit pEMBL9 ligiert, der vorher mit BamHI und HindIII gespalten worden war. Nach Transformation von E. coli JM103 wurden weiße Kolonien auf TBAB-Platten selektiert, die X-gal und IPTG enthielten. Ein Klon, bei dem vier Nukleotide der Region B fehlten, wurde zur weiteren Bearbeitung (Fig. 5) ausgewählt.
Plasmid-DNA von diesem Klon wurde gereinigt und auf Sepharose- 6B zur Entfernung von RNA laufen gelassen. Etwa 100 ug Plasmid-DNA wurden ferner mit HindIII gespalten und mit Exonuklease Bal 31, wie in Routineverfahren beschrieben, behandelt. Nach 30-minütiger Behandlung bei 37ºC mit Klenow-Polymersase (10U) in Gegenwart von 0,5 mM dNTP, wodurch stumpfe Enden erhalten wurden, wurde das Reaktionsgemisch mit EcoRI 10-mer- Linkern (CCGAATTCGG) ligiert. Nach Spaltung mit EcoRI und BamHI wurde die DNA einer 5% Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterzogen. Stücke mit der gewünschten Länge von etwa 179 Basenpaaren wurden ausgeschnitten und elektroeluiert. Die aus der Elution isolierte DNA wurde mit EcoRI und BamHI gespaltenem pEMBL9 ligiert. Nach Transformation von E. coli JM103 wurden weiße Kolonien auf TBAB-Platten selektiert, die X-gal und IPTG enthielten. Eine Sequenzanalyse ergab drei interessante Kolonien (mit 0, -1 und -2 bezeichnet), die zur weiteren Bearbeitung ausgewählt wurden. Die Figuren (-0, -1 und -2) beschreiben die in der Region B gespaltene Nukleotidanzahl vor der EcoRI-Linker-Anfügung, wie in Fig. 5 gezeigt.
Die drei Klone der drei verschiedenen Leserahmen in der Region B (nachstehend mit B-0, B-1 und B-2 bezeichnet) wurden mit BamHI gespalten. Das überhängende Ende der BamHI-Spaltung wurde, wie in Routineverfahren beschrieben, mit S1-Nuklease entfernt. Der in Fig. 6 gezeigte Translationsstop-Linker wurde mit jedem Reaktionsgemisch ligiert. Der Lysin-Rest in jedem Konstrukt wird jetzt entweder mit einem Gly- oder Ala-Rest in Abhängigkeit von der Orientierung des hineinkommenden Stop- Linkers, wie in Fig. 6 gezeigt, ersetzt. Nach Transformation von E. coli dM103 wurde eine Sequenzanalyse von isolierten Klonen durchgeführt, die die B-Fragmente mit dem downstream angefügten Stop-Linker enthalten. Die Sequenzanalyse ergab, daß B-0 mit einem Gly-Rest, B-1 mit einem Ala-Rest, und B-2 mit einem Ala-Rest endet.
Diese Fragmente werden nun in einigen der in I beschriebenen Vektoren kloniert.

IV. Konstruktion von pASEB, pASB1 und pASB2

Das B-Fragment wurde in pAS und pASE kloniert.
Etwa 50 ug der Vektoren, die B-0, B-1 bzw. B-2 und den Stop- Linker enthalten, wurden mit EcoRI bzw. HindIII gespalten. HindIII spaltet direkt nach dem Stop-Linker. Das B-Fragment eines jeden Vektors wurde unter Verwendung einer Polyacrylamidgel-Elektrophorese isoliert.
Das B-0-Fragment wurde mit EcoRI und HindIII gespaltenem pAS2 (Fig. 3) ligiert. Nach Transformation von E. coli HB101 und der Restriktionsanalyse der Plasmid-DNA von einzelnen Klonen konnte der Plasmidvektor pASB-1 isoliert werden, der das B- Fragment von Protein A nach der Signalsequenz enthält.
Das B-1-Fragment wurde mit EcoRI und HindIII gespaltenem pAS3 (Fig. 3) ligiert. Nach Transformation von E. coli HB101 und der Restriktionsanalyse der Plasmid-DNA von einzelnen Klonen konnte der Plasmidvektor pASB-2 isoliert werden, der das B- Fragment von Protein A nach der Signalsequenz enthält.
Der Unterschied zwischen pASB-1 und pASB-2 sind die drei Aminosäuren, die in der EcoRI-Linker-Region, wie in Fig. 7 gezeigt, vorliegen.
Das B-2-Fragment wurde mit EcoRI und HindIII gespaltenem pASE1 (Fig. 3) ligiert. Nach Transformation von E. coli HB101 und der Restriktionsanalyse der Plasmid-DNA von einzelnen Klonen konnte der Plasmidvektor pASEB isoliert werden, der das B- Fragment von Protein A angeheftet an die Region E enthält.

V. Konstruktion von pASEE-IGF-I

In diesem Experiment wird gezeigt, wie ein synthetisches, humanen insulin-ähnlichen Wachstumsfaktor I (IGF-I) codierendes Gen in dem Vektor pASEE, wie in Teil I beschrieben, kloniert wurde.
Das synthetische IGF-I (Fig. 8) codierende Gen (Elmblad, A. et al., in Third European Congress of Biotechnology 111, Verlag Chemie, Weinheim (1984), 287-296) wurde aus pUC8 mit EcoRI und HindIII herausgeschnitten. Das IGF-I-codierende Gen-Fragment wurde durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese und anschließender Elektroelution isoliert.
Der Plasmidvektor pASEE wurde partiell mit EcoRI gespalten und der linearisierte Vektor aus einem 1% Agarosegel durch Elektrophorese isoliert. Nach Elektroelution wurde der lineare Vektor mit HindIII gespalten und nachfolgend durch eine 1% Agarosegel-Elektrophorese isoliert. Das IGF-I-Fragment wurde mit diesem pASEE-Vektor ligiert und nach Transformation konnte pASEE-IGF-I bei einem Hintergrund von pASE-IGF-I isoliert werden. pASEE-IGF-I codiert nach der Signalsequenz für ein mit IGF-I fusioniertes EE.

VI. Konstruktion von pE8EE-IGF-I

In diesem Teil wird gezeigt, wie SEE-IGF-I in anderer Orientierung von pEMBL verglichen mit den in Teil I beschriebenen pAS-Vektoren kloniert wird.
Etwa 50 ug pASEE-IGF-I (wie in Teil V beschrieben) wurden mit TaqI und HindIII gespalten. Die Restriktionsendonuklease TaqI spaltet 179 Basenpaare upstream des Translationsstarts des Protein A-Gens und HindIII spaltet downstream des IGF-I-Gens. Das Reaktionsgemisch wurde einer 4% Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterworfen und das SEE-IGF-I-Fragment wurde ausgeschnitten und elektroeluiert.
Dieses Fragment wurde mit AccI und HindIII geschnittenem pEMBL8 ligiert. Nach Transformation von E. coli HB101 konnte das Plasmid pE8EE-IGF-I isoliert und durch Restriktionsanalyse analysiert werden.

VII. Konstruktion von pE9EDABC

In diesem Teil wird gezeigt, wie SEDABC in pEMBL9 kloniert wird, wodurch der IgG-Bindungsteil von Protein A in umgekehrter Orientierung erhalten wird.
Der Plasmidvektor pRIT4 wurde mit TaqI und EcoRI gespalten. Die Restriktionsendonuklease TaqI spaltet 179 Basenpaare upstream des TTG-Startcodons und EcoRI spaltet in der Region C von Protein A.
Dieses Fragment wurde mit AccI und EcoRI gespaltenem pEMBL9 ligiert. Nach Transformation von E. coli HB101 konnte der Plasmidvektor pE9EDABC isoliert werden. Dieses Plasmid hat das Protein A-Gen weg vom Replikationsursprung orientiert.

VIII. Expression und Lokalisierung von von Protein A-stammenden Fragmenten in E. coli

Verschiedene Protein A-Konstrukte wurden über Nacht angereichert und Expressionsmengen sowie die Lokalisierung von Protein A, β-Galactosidase (intrazellulärer Marker) und β- Lactamase (Marker für periplasmatischen Raum) wurden bestimmt. Das Plasmid pASEE wurde zur Transformation von E. coli HB101 verwendet, wodurch es von dem gleichen E. coli-Stamm getragen wurde wie die anderen Konstrukte. Nach der Züchtung der Zellen über Nacht wurden diese zentrifugiert. Die Zellen wurden mit einem osmotischen Schock behandelt und anschließend zentrifugiert (wie in Routineverfahren beschrieben). Die Sphäroplasten im Pellet wurden beschallt, wodurch intrazelluläre Proteine freigesetzt wurden.
Der Typ (A oder B) eines Vektors betrifft die Orientierung des von Protein A-stammenden Konstrukts im Hinblick auf das β-Latamase- (AMP) Gen (Fig. 9). Testverfahren von β-Galactosidase, β-Lactamase und Protein A wurden, wie in Routineverfahren beschrieben, durchgeführt.
Die in diesen Experimenten erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Es wird deutlich, daß kleine Fragmente von Protein A filamentöses Wachstum, wie auch den Verlust der periplasmatischlokalisierten Proteine, einschließlich des von Protein A- stammenden Fragments, induzieren.
In den Gen-Konstrukten, die die Region B direkt nach der Signalsequenz (pASB1 und pASB2) enthalten, wird der Hauptteil des Protein A-Fragments in der intrazellulären Fraktion gefunden. Hieraus wird geschlossen, daß dieses Verhalten an die Unfähigkeit der Leader-Peptidase gebunden ist, das Signalpeptid abzuspalten und das translatierte B-Peptid bleibt in der cytoplasmatischen Membran stecken.
Eine N-terminale Sequenzierung (durch übliche Edman-Abbautechnik) der B-Fragmente, die aus pASB1- bzw. pASB2-Plasmiden enthaltenden E.-coli-Kulturen gereinigt worden waren, ergab Processing-Stellen in der Signalsequenz, was bestätigte, daß die Leader-Peptidase das Signalpeptid (Fig. 7) nicht abspaltet. Darüber hinaus werden erhöhte Expressionsmengen von diesen Konstrukten, filamentöses Wachstum sowie ein Verlust der normalerweise periplasmatischen Proteine an den extrazellulären Bereich beobachtet.
Das pASEE-IGF-I-Konstrukt führt auch zu einem extrazellulären Hybridprotein, das ebenfalls mit filamentösem Wachstum verbunden ist.
Die zwei einen Vektor vom Typ B (pE8EE-IGF-I und pE8EDABC) repräsentierenden Konstrukte ergeben das am meisten verstärkte filamentöse Wachstum.
Es ist bemerkenswert, daß das in E. coli HB101 exprimierte pE8EDABC zu einer hohen Expressionsmenge, wie auch zu einer Sekretion führt, während pRIT4 zu einer niedrigen Expression führt. Es kann argumentiert werden, daß diese erhöhte Expression von dem upstream gelegenen lac-Promoter in dem pE8EDABC- Konstrukt abhängig ist. Es wurde allerdings gezeigt, daß dieses filamentöse Wachstum und die Expressionsmenge unabhängig von der Zugabe von IPTG (bekannt als Transkriptions-Induktor des lac-Promoters) ist.
Hieraus kann geschlossen werden, daß unterschiedliche, auf dem Protein A-Promoter und der Signalsequenz basierende Konstrukte filamentöses Wachstum, Ausscheidung von periplasmatischen Proteinen an das Wachstumsmedium und eine erhöhte Expression der Protein A-Konstrukte induzieren.
Daß filamentöses Wachstum mit einer Hitzeschock-Reaktion in E. coli verbunden ist, wurde ein nächstes Experiment durchgeführt, um zu sehen, ob die hohe Expression des Protein A-Promotors an eine Hitzeschock-Reaktion gebunden ist, oder ob eine Expression aus unbekannten Gründen zu einer Hitzeschock- Reaktion führt.

IX. Expression von pRIT4 in HB101 mit und ohne Hitzeschock

Das Plasmid pRIT4 trägt den IgG-Bindungsteil von Protein A in einem Vektor vom Typ A (Fig. 2, Fig. 9 und Teil VIII). Nach Kultivierung von E. coli HB101 über Nacht wird Protein A (9%) an das Wachstumsmedium sekretiert. Dieses Protein A-Konstrukt wurde zur Kultivierung mit und ohne Hitzeschock in Form einer Temperaturerhöhung ausgewählt, obwohl mit 4% EtOH und verschiedenen oxidativen Mitteln andere Wege zur Erzielung einer Hitzeschock-Reaktion bekannt sind.
E. coli HB101, das pRIT4 trägt, wurde über Nacht (30ºC) kultiviert. Die Übernachtkultur wurde zur Inokulierung (150 ul) eines 15 ml frischen TSB-Mediums verwendet, das 70 ug/ml Ampicillin enthielt, und die Zellen wurden 2,5 Stunden in zwei getrennten Schüttelflaschen kultiviert.
Eine der Kulturen wurde mit 15 ml TSB (30ºC) verdünnt und bei 30ºC inkubiert. Zu der anderen Flasche wurden 15 ml TSB bei 54ºC zugegeben und die Flasche wurde bei 42ºC inkubiert.
Nach 3-stündiger Inkubation vom Umstellungszeitpunkt aus wurden die Zellen zentrifugiert. Das Zellpellet wurde einmal mit 10 ml PBST gewaschen und in 5 ml PBST resuspendiert und 3· 30 Sekunden (in einem MSE-Beschaller, Microtip, Stärke 6) beschallt. Nach 10-minütiger Zentrifugation bei 16000 g wurde der Überstand gesammelt.
Protein A wurde in dem Medium und in der beschallten Fraktion quantifiziert, was der Gesamtmenge in dem Periplasma und Cytoplasma entsprach.
Die Resultate sind folgende: Plasmid Temperatur (ºC) Menge der Expression (mg/l) filamentöses Wachstum intrazellulär
Die relativ niedrige Expression wird durch die niedrige optische Dichte (OD&sub5;&sub8;&sub0;) bestätigt. Die Expressionsmenge in der Hitzeschock-behandelten Zellkultur ist 20-fach erhöht.
Dies kann nur erklärt werden, wenn die Transkriptionskontrolle des Protein A-Gens selbst jene der Hitzeschock-Reaktion ist.
Obgleich die Erfindung nur unter Verwendung einiger spezieller Gene erläutert worden ist, ist es dennoch klar, daß das Grundprinzip der Erfindung bei Genen angewandt werden kann, die irgendein gewünschtes Gen exprimieren. Somit kann zusätzlich zu der beispielhaften Expression von IGF-I die Erfindung auch zur Produktion anderer Proteine, wie anderer medizinisch hilfreicher Proteine, beispielsweise anderer Somatomedine, wie IGF-II, Nerven-Wachstumsfaktor (NGF), Epidermis-Wachstumsfaktor (EGF), Plättchen-abstammender Wachstumsfaktor (PDGF) verwendet werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch zur Produktion von alpha-, beta- und gamma-Interferonen, Interleukinen, Insulin, Neuropeptiden, Gastrointestinal-Peptiden oder anderen interessanten Peptiden verwendet werden.
Es wurde ferner beobachtet, daß die Erfindung nicht auf die Verwendung von E. coli als Wirtszelle beschränkt ist, sondern auch mit anderen bakteriellen Wirtszellen angewandt werden kann. Darüber hinaus können andere Signalsequenzen als jene, die von Protein A stammen, verwendet werden. Tabelle 1 Plasmid Orientierung filamentöses Wachstum Expressionsmenge (mg/l) intrazellulär (1) periplasmatisch Medium (1) ND = nicht nachgewiesen Fußnote. Abkürzungen lac, bla und spa betreffen β-Galactosidase, β-Lactamase bzw. Protein A

Claims

1. Verfahren zur Expression von Proteinen in Gram(-) Bakterien und zur Erzielung ihrer extrazellulären Sekretion, bei dem

(a) in ein Gram(-) Bakterium ein rekombinantes DNA-Konstrukt eingebracht wird, das einen Promotor, eine die Translocation und das Processing ermöglichende Signalsequenz und ein, das gewünschte zu exprimierende Protein codierende Strukturgen umfaßt,

(b) das Bakterium unter Bedingungen kultiviert wird, die zu filamentösem Wachstum führen, und

(c) das extrazellulär sekretierte Protein gesammelt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die Expression des gewünschten Proteins unter der gleichen Transkriptionskontrolle wie jene des filamentösen Wachstums erfolgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das filamentöse Wachstum von Schritt (b) an das Wesen des rekombinanten DNA-Konstrukts und des davon exprimierten Proteins (A> von Staphylokokkus aureus gebunden ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das filamentöse Wachstum von Schritt (b) an eine äußere Induktion gebunden ist.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das filamentöse Wachstum von Schritt (b) an das Wesen des rekombinanten DNA-Konstrukts und des davon exprimierten Proteins (A) sowie an eine äußere Induktion gebunden ist.

6. Verfahren nach Anspruch 4, worin das filamentöse Wachstum durch erhöhte Temperatur bei Kultivierung zur Induktion einer Hitzeschockantwort bewirkt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 4, worin das filamentöse Wachstum durch Einbringung eines Denaturierungsmittels in das Kulturmedium bewirkt wird.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das rekombinante DNA-Konstrukt mittels eines Plasmidvektors in das Bakterium eingebracht wird.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das rekombinante DNA-Konstrukt als Signalsequenz jene des Proteins A enthält.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin das an die Signalsequenz angrenzende Strukturgen eine Schnittstelle enthält, die für die N-terminalen Aminosäurereste des zu gewinnenden, reifen Proteins codiert.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin die Schnittstelle so gebildet ist, daß sie für mindestens 6 Aminosäurereste codiert.

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin die Reste Ala Gln His Asp Glu Ala sind.

13. Verfahren nach Anspruch 9, 10, 11 oder 12, worin das Strukturgen aus den E und B Domänen des Proteins A ausgewählte Genfragmente umfaßt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, worin das Strukturgen auch das für den insulinähnlichen Wachstumsfaktor 1 (IGF-1) codierende Gen umfaßt.

15. Rekombinantes DNA-Konstrukt, umfassend: Einen Promotor, eine Signalsequenz und ein Strukturgen einschließlich einer Schnittstelle, worin das Strukturgen die Formel

(E)n(B)m - Y

hat, worin n eine ganze Zahl ≥ 1 ist, m eine ganze Zahl ist, wobei die Summe von n und m höchstens 4 ist, Y eine ein gewünschtes Protein codierende DNA-Sequenz ist und E und B die den Regionen E und B des Proteins A entsprechenden Gene sind, mit der Maßgabe, daß sich das Strukturgen von jenem das natürliche Protein A codierende unterscheidet.

16. Rekombinantes DNA-Konstrukt nach Anspruch 15, worin n 1 ist und m 0 ist.

17. Rekombinantes DNA-Konstrukt nach Anspruch 15, worin n 2 ist und m Null ist.

18. Rekombinantes DNA-Konstrukt nach Anspruch 15, worin n 1 ist und m 1 ist.

19. Rekombinantes DNA-Konstrukt nach Anspruch 15, worin n 2 ist, m 0 ist und Y das IGF-1 oder IGF-2 codierende Gen ist.

20. Rekombinantes DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 15-19, worin die Schnittstelle so gebildet ist, daß sie für mindestens 6 Aminosäurereste codiert.

21. Rekombinantes DNA-Konstrukt nach Anspruch 20, worin die Reste Ala Gln His Asp Glu Ala sind.

22. Plasmidvektor, umfassend das rekombinante DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 15-21.

23. Plasmidvektor nach Anspruch 22, der von pEMBLS stammt.

24. Gram(-) Bakterium, enthaltend das rekombinante DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 15-21.

25. Gram(-) Bakterium, enthaltend den Plasmidvektor nach Anspruch 22 oder 23.

26. Gram(-) Bakterium nach Anspruch 24 oder 25, nämlich E. coli.

27. Gram(-) Bakterium nach Anspruch 26, nämlich E. coli HB101.