DE60029968T2

DE60029968T2 - Proteinherstellung

Info

Publication number: DE60029968T2
Application number: DE60029968T
Authority: DE
Inventors: Günter STEMPFER; Jörg Windisch; Franz Knauseder
Original assignee: Sandoz AG
Current assignee: Sandoz AG
Priority date: 1999-08-09
Filing date: 2000-08-07
Publication date: 2006-12-21
Anticipated expiration: 2020-08-08
Also published as: CZ2002481A3; SK287488B6; NO20020633L; CZ302366B6; WO2001011057A1; AU775662B2; US6936455B1; TR200200253T2; DE60029968D1; HK1047128B; HU230231B1; HK1047128A1; NO20020633D0; JP2003506093A; CN1369014A; AU6993300A; CA2379571A1; HUP0202519A3; MXPA02001424A; PL353101A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines gewünschten heterologen Polypeptids mit einem klar definierten homogenen N-Terminus in einer bakteriellen Wirtszelle, worin anfänglich ein Fusionsprotein, das ein Peptid mit der autoproteolytischen Aktivität einer Autoprotease N^pro eines Pestivirus und das heterologe Polypeptid umfasst, in Form von cytoplasmatischen Einschlusskörperchen in der Wirtszelle gebildet wird und die Einschlusskörperchen auf eine Weise isoliert und behandelt werden, dass das gewünschte heterologe Polypeptid vorn Fusionsprotein durch die autoproteolytische N^pro Aktivität abgespalten wird.
Bei der Herstellung von rekombinanten Proteinen in heterologen Organismen, wie der Expression von humanen oder anderen eukaryontischen Proteinen in Bakterienzellen ist es oft schwierig, einen klar definierten N-Terminus zu erhalten, der so nahe wie möglich zu 100 % homogen ist. Dies trifft insbesondere auf rekombinante pharmazeutische Proteine zu, deren Aminosäuresequenz in vielen Fällen zu der Aminosäuresequenz identisch sein muss, die natürlich bei Menschen/Tieren vorkommt.
Bei einer natürlichen Expression, beispielsweise beim Menschen, werden viele pharmazeutische Proteine, die verwendet werden, in den extrazellulären Raum transportiert und die Spaltung der Signalsequenz, die im Vorläuferprotein für diesen Zweck vorkommt, führt zu einem klar definierten N-Terminus. Ein solcher homogener N-Terminus ist beispielsweise in bakteriellen Zellen aus mehreren Gründen nicht immer einfach herzustellen.
Zur Herstellung in industriellem Maßstab werden viele pharmazeutische Proteine im Cytoplasma von bakteriellen Zellen (beispielsweise Escherichia coli) hergestellt, da die Akkumulation hiervon in angemessenen Mengen möglich ist und darüber hinaus oft unlösliche Einschlusskörperchen (IBs) gebildet werden, die bei der Aufarbeitung und Reinigung große Vorteile bieten. Zusätzlich wird das in Form von IBs exprimierte Protein vor einem Proteaseabbau durch intrazelluläre Proteasen geschützt (R. Rudolph in: Protein Engineering: Principles and Practices, Herausgeber Jeffrey L. Cleland and Charles S. Craik, John Wiley & Sons Inc. (1995), ISBN 0-471-10354-3).
Jedoch erfordert die Herstellung von IB Material eine in vitro Umfaltung des exprimierten Proteins. Dieses kann in vielen Fällen durch an sich bekannte Verfahren bewirkt werden (R. Rudolph et al., (1996) in: Protein Function: A Practical Approach, Herausgeber: T.E. Creighton, 1–39). Um dies zu tun, werden die Proteine in Form von IBs durch die Zugabe von starken denaturierenden Mitteln unter reduzierenden Bedingungen solubilisiert und dann renaturiert.
Nur in seltenen Fällen ist der Export in das bakterielle Periplasma mit Hilfe einer pro- oder eukaryontischen Signalsequenz möglich, da es gewöhnlich nur möglich ist, sehr kleine Mengen des Produkts aufgrund der geringen Transportkapazität der bakteriellen Exportmaschinerie zu akkumulieren.
Jedoch unterscheidet sich das bakterielle Cytoplasma beträchtlich vom extrazellulären Raum der Eukaryonten. Einerseits sind hierin reduzierende Bedingungen vorhanden und andererseits gibt es keinen Mechanismus zur Abspaltung von N-terminalen Signalsequenzen unter Bildung von reifen Proteinen. Die Synthese aller cytoplasmatischen Proteine beginnt mit einem Methionin, das durch das geeignete Startcodon spezifiziert wird (ATG = Initiation der Translation). Dieses N-terminale Methionin wird in vielen Proteinen behalten, während es in anderen durch die Methioninaminopeptidase (MAP) abgespalten wird, die im Cytoplasma und intrinsisch im Wirt vorhanden ist. Die Effizienz der Abspaltung hängt im wesentlichen von 2 Parametern ab: 1. Der Art der darauf folgenden Aminosäure und 2. Der Lage des N-Terminus in der dreidimensionalen Struktur des Proteins. Das N-terminale Methionin wird vorzugsweise deletiert, wenn die folgende Aminosäure Serin, Alanin, Glycin, Methionin oder Valin ist und wenn der N-Terminus exponiert ist, das heißt nicht im Protein „versteckt" ist. Andererseits findet, wenn die folgende Aminosäure eine andere ist, insbesondere eine geladene (Glutaminsäure, Asparaginsäure, Lysin, Arginin) oder falls der N-Terminus im Protein lokalisiert ist, in den meisten Fällen keine Abspaltung des N-terminalen Methionins statt (Knippers, Rolf (1995) Molekulare Genetik, 6. Ausgabe, Georg Thieme Verlag Stuttgart, New York. ISBN 3-13-103916-7).
Und selbst falls eine Aminosäure, die die Abspaltung fördert, an der Position 2 vorhanden ist, ist die Abspaltung selten vollständig. Es ist für einen nicht unbeträchtlichen Teil (1–50 %) normal, von der MAP nicht beeinflusst zu werden.
In den frühen Tagen der Produktion von rekombinanten pharmazeutischen Proteinen in bakteriellen Zellen bestand das Verfahren einfach darin, dass ein für Methionin kodierendes ATG Startcodon vor den offenen Leserahmen (ORF) für das reife Protein (das heißt ohne Signalsequenz oder N-terminale Erweiterung) gesetzt wurde. Das exprimierte Protein hatte dann die Sequenz H₂N-Met-Zielprotein.
Nur in wenigen Fällen war es möglich, eine vollständige Abspaltung des N-terminalen Methionins durch die MAP zu erreichen, die im Wirt vorhanden ist. Die meisten auf diese Weise hergestellten Proteine sind daher in Bezug auf ihren N-Terminus inhomogen (Gemisch aus Met Form und Met-freier Form) oder sie haben alle eine zusätzliche fremde Aminosäure (Met) am N-Terminus (nur Met Form).
Diese Inhomogenität oder Abweichung von der natürlichen Sequenz ist jedoch in vielen Fällen unakzeptabel, da diese Produkte häufig unterschiedliche immunologische (beispielsweise Induktion der Antikörperbildung) und pharmakologische (Halbwertszeit, Pharmakokinetik) Eigenschaften aufweisen. Aus diesen Gründen ist es nun in den meisten Fällen erforderlich, ein naturidentisches Produkt herzustellen (homogen und ohne fremde Aminosäuren am N-Terminus). Im Fall der cytoplasmatischen Expression ist das Mittel der Wahl hier in den meisten Fällen die Fusion einer Spaltsequenz (Leader) für eine spezifische Endopeptidase (beispielsweise Faktor Xa, Enterokinase, KEX Endopeptidase, IgA Protease) oder Aminopeptidase (beispielsweise Dipeptidylaminopeptidase) an den N-Terminus des Zielproteins. Jedoch ruft dies einen zusätzlichen Schritt mit einem Aufwand an Kosten und Materialien hervor, der während der weiteren Aufarbeitung, dem sogenannten Downstream-Processing des Produkts erforderlich wird. Zusätzlich kommt beim Vorkommen von IBs in vielen Fällen eine Wechselwirkung oder sogar vollständige Prävention der Rückfaltung durch die Leadersequenzen zustande.
Daher besteht ein Bedarf für ein Verfahren zur Herstellung eines gewünschten heterologen Zielproteins, das in Form von Einschlusskörperchen in Bakterienzellen exprimiert wird, aus dem das Zielprotein mit einem gleichförmigen, gewünschten N-Terminus hergestellt werden kann. Ein solches Verfahren zur Herstellung eines gewünschten Zielproteins aus Einschlusskörperchen unter Verwendung der viralen Autoprotease N^pro von Pestiviren wurde innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung entwickelt. In der Literatur sind auch andere Systeme zur Abspaltung von Polypeptiden beschrieben:
Die WO 99 10 503 A beschreibt zymogene Proteasevorläufer, die autokatalytisch aktiviert werden können und ihre Verwendung.
Die EP 0 321 973 A beschreibt die Verwendung von viralen Proteasen, insbesondere der Protease P2A eines Picornavirus (HRV2), um bestimmte Fusionsproteine abzuspalten.
Die WO 98 49 326 A beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Polypeptids mittels eines Fusionsproteins, das ein Propeptid umfasst, das aus einem autokatalytisch reifenden Zymogen und einem Polypeptid abgeleitet ist, das zum Propeptid heterolog ist.
Pestiviren bilden eine Gruppe an Pathogenen, die schwere ökonomische Verluste bei Schweinen und Rindern rund um die Welt verursachen. Als Pathogen einer erwähnenswerten übertragbaren Erkrankung ist das klassische Schweinefiebervirus (CSFV) besonders wichtig. Die Verluste, die durch das Virus der bovinen Virusdiarrhoe (BVDV) verursacht werden, sind ebenfalls beträchtlich, insbesondere durch das regelmäßige Auftreten von intraunterinen Infektionen der Feten.
Pestiviren sind kleine Viren mit Hüllen mit einem Genom, das direkt als mRNA wirkt und 12,3 kb groß ist und von dem die viralen Genprodukte im Cytoplasma transkribiert werden.
Dies findet in Form eines einzelnen Polyproteins statt, das etwa 4000 Aminosäuren umfasst und das sowohl durch virale als auch zelluläre Proteasen in etwa 12 reife Proteine zerlegt wird.
Bis heute wurden zwei durch Virus kodierte Proteasen in Pestiviren identifiziert, nämlich die Autoprotease N^pro und die Serinprotease NS3. Die N-terminale Protease N^pro liegt am N-Terminus des Polyproteins und hat eine scheinbare Molekularmasse von 23 kd. Sie katalysiert eine Spaltung, die zwischen dem eigenen C-Terminus (Cys 168) und dem N-Terminus (Ser 169) des Nukleokapsidproteins C stattfindet (R. Stark et al., J. Virol. 67 (1993), 7088–7095). Zusätzlich wurden Duplikationen des N^pro Gens in cytopathogenen BVDV Viren beschrieben. In diesen befindet sich eine zweite Kopie von N^pro am N-Terminus der ähnlich duplizierten NS3 Protease. Eine autoproteolytische Spaltung des N^proNS3 Proteins wird in diesem Fall ebenfalls beobachtet (R. Stark et al., siehe oben).
N^pro ist eine Autoprotease mit einer Länge von 168 Aminosäuren und einem scheinbaren M_r von etwa 20 000 (in vivo). Es ist das erste Protein im Polyprotein der Pestiviren (CSFV, BDV (Border Disease Virus) oder BVDV) und wird einer autoproteolytischen Spaltung vom folgenden Nukleokapsidprotein C unterzogen (M. Wiskerchen et al., J. Virol. 65 (1991), 4508–4514, Stark et al., J. Virol. 67 (1993), 7088–7095). Diese Spaltung findet nach der letzten Aminosäure von N^pro statt, nämlich Cys 168.
Es wurde nun überraschenderweise innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass die autoproteolytische Funktion der Autoprotease N^pro für die Spaltung eines heterologen Polypeptids von einem Fusionsprotein verwendet werden kann, das in Form von Einschlusskörperchen in einem bakteriellen Expressionssystem exprimiert wird und das eine Autoprotease N^pro eines Pestivirus und das heterologe Polypeptid umfasst. Dies führt zu ungespaltenem N^pro Fusionsprotein, das aus Einschlusskörperchen isoliert, solubilisiert und während der Rückfaltung gespalten wird.
In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung so ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines heterologen Polypeptids, das umfasst

(i) Kultivierung einer bakteriellen Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der ein Nukleinsäuremolekül umfasst, das für ein Fusionsprotein kodiert, wobei das Fusionsprotein ein erstes Polypeptid umfasst, das die autoproteolytische Funktion einer Autoprotease N^pro eines Pestivirus zeigt und ein zweites Polypeptid, das an das erste Polypeptid am C-Terminus des ersten Polypeptids auf eine Weise gebunden ist, so dass das zweite Polypetid vom Fusionsprotein durch die autoproteolytische Aktivität des ersten Polypeptids abgespalten werden kann und das zweite Polypeptid ein heterologes Polypeptid ist, wobei die Kultivierung unter Bedingungen erfolgt, die die Expression des Fusionsproteins und die Bildung der entsprechenden cytoplasmatischen Einschlusskörper verursacht,
(ii) Isolierung der Einschlusskörper aus der Wirtszelle,
(iii) Solubilisierung der isolierten Einschlusskörper,
(iv) Verdünnung des Solubilisats unter Bildung einer Reaktionslösung, worin die autoproteolytische Abspaltung des heterologen Polypeptids vom Fusionsprotein ausgeführt wird, und
(v) Isolierung des abgespaltenen heterologen Polypeptids.

Ein Polypeptid mit der autoproteolytischen Funktion einer Autoprotease N^pro eines Pestivirus ist insbesondere eine Autoprotease N^pro eines Pestivirus oder eines Derivats hiervon mit einer autoproteolytischen Aktivität.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung meint der Ausdruck „heterologes Polypeptid" ein Polypeptid, das nicht natürlicherweise durch eine Autoprotease N^pro eines Pestivirus aus einem natürlich vorkommenden Fusionsprotein oder Polyprotein gespalten wird. Beispiele für heterologe Polypeptide sind industrielle Enzyme (Verfahrensenzyme) oder Polypeptide mit pharmazeutischer, insbesondere humaner pharmazeutischer Aktivität.
Beispiele für bevorzugte Polypeptide mit humaner pharmazeutischer Aktivität sind Cytokine, wie Interleukine, beispielsweise IL-6, Interferone, wie Leukozyteninterferone, beispielsweise Interferon α2B, Wachstumsfaktoren, insbesondere hämatopoetische oder Wundheilungswachstumsfaktoren, wie G-CSF, Erythropoetin oder IGF, Hormone, wie humanes Wachstumshormon (hGH), Antikörper oder Vakzine.
Im erfindungsgemäßen Verfahren wird das Pestivirus vorzugsweise aus der Gruppe aus klassischem Schweinefiebervirus (CSFV, Border Disease Virus (BDV und dem Virus der bovinen Virusdiarrhoe (BVDV) ausgewählt, wobei CSFV besonders bevorzugt ist.
Weiter bevorzugt wird ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, worin das erste Polypeptid des Fusionsproteins die folgende Aminosäuresequenz der Autoprotease N^pro von CSFV umfasst (siehe auch EMBL Datenbankhinterlegungsnummer X87939) (Aminosäuren 1 bis 168, Leserichtung von N-terminal nach C-terminal).
oder die Aminosäuresequenz eines Derivats hiervon mit der autoproteolytischen Aktivität einer Autoprotease NP^pro.
Ein Polypeptid, das die autoproteolytische Aktivität einer Autoprotease N^pro zeigt, kann auch ein Derivat einer Autoprotease N^pro eines Pestivirus sein, das sich von der Autoprotease N^pro eines Pestivirus durch Mutagenese ableitet, insbesondere durch eine Aminosäuresubstitution, Deletion, Addition und/oder Aminosäureinsertion, solange die erforderliche autoproteolytische Aktivität, insbesondere zur Erzeugung eines gewünschten heterologen Polypeptids mit homogenem N-Terminus erhalten bleibt. Verfahren zur Erzeugung solcher Derivate durch Mutagenese sind dem Fachmann bekannt. Es ist durch solche Mutationen möglich, die Aktivität der Autoprotease N^pro in Bezug auf die unterschiedlichen vom Fusionsprotein abzuspaltenden heterologen Proteine zu optimieren. Nach der Herstellung einer Nukleinsäure, die für ein Fusionsprotein kodiert, das neben dem gewünschten heterologen Protein ein Autoprotease N^pro Derivat umfasst, das eine oder mehrere Mutationen im Vergleich zu einer natürlich vorkommenden Autoprotease N^pro zeigt, wird durch Bestimmung der autoproteolytischen Aktivität ermittelt, ob die erforderliche Funktion vorhanden ist.
Die autoproteolytische Aktivität kann beispielsweise durch anfängliche Solubilisierung der isolierten/gereinigten IBs in 7 M Guanidin/HCl Lösung und einer anschließenden Verdünnung 1:100 in Reaktionslösung detektiert werden. Nach einer Inkubation für etwa 24 Stunden wird die Reaktionslösung durch SDS-PAGE untersucht, ob eine Spaltung stattgefunden hat. Es wird ein Western Blot ausgeführt, um die prozessierten und unprozessierten Anteile zu identifizieren. Der Anteil an gespaltenem Material wird durch densitometrische Analyse des mit Coomassie-gefärbten SDS-PAGE Gels bestimmt.
Ein bevorzugtes Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ist beispielsweise eines, worin der Expressionsvektor ein Nukleinsäuremolekül umfasst, das für ein Fusionsprotein kodiert, welches eine N-terminale Region aufweist, worin eine oder mehrere Aminosäuren in der Region der Aminosäuren 2 bis 21 deletiert oder substituiert wurden, solange das entstehende Derivat weiterhin die autokatalytische Funktion der Autoprotease N^pro in einem gewissen Ausmaß aufweist. Für den Zweck der vorliegenden Erfindung umfassen die Autoprotease N^pro Derivate, die im Fusionsprotein bevorzugt sind, beispielsweise die Aminosäuresequenz der Autoprotease N^pro von CSFV mit einer Deletion der Aminosäuren 2 bis 16 oder 2 bis 21. Es ist auch möglich, durch Aminosäuresubstitution oder Aminosäureaddition Aminosäuresequenzen auszutauschen oder einzuführen, beispielsweise um eine Aminosäuresequenz einzuführen, die bei der Reinigung hilft.
Ein Nukleinsäuremolekül, das im erfindungsgemäßen Verfahren besonders bevorzugt ist, kodiert für ein Fusionsprotein, worin das erste Polypeptid die Aminosäuresequenz Glu22 bis Cys168 der Autoprotease N^pro von CSFV oder eines Derivats hiervon mit der autoproteolytischen Aktivität einer Autoprotease N^pro umfasst wobei das erste Polypeptid ferner Met als N-Terminus aufweist und das heterologe Polypeptid direkt an die Aminosäure Cys 168 der Autoprotease N^pro von CSFV gebunden ist.
Ein Nukleinsäuremolekül, das ähnlich im erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt ist, kodiert für ein Fusionsprotein, worin das erste Polypeptid die Aminosäuresequenz Pro 17 bis Cys 168 der Autoprotease N^pro von CSFV oder ein Derivat hiervon mit der autoproteolytischen Aktivität einer Autoprotease N^pro umfasst, wobei das erste Polypeptid ferner ein Met als N-Terminus aufweist und das heterologe Polypeptid direkt an die Aminosäure Cys 168 der Autoprotease N^pro von CSFV gebunden ist.
Das Nukleinsäuremolekül liegt im erfindungsgemäßen Verfahren insbesondere in Form eines DNA Moleküls vor.
Ein im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeter Expressionsvektor umfasst vorzugsweise zumindest eine Expressionskontrollsequenz. Expressionskontrollsequenezn sind insbesondere Promotoren (wie lac, tac, T3, T7, trp, gac, vhb, Lambda pL oder phoA), Ribosomenbindungsstellen (beispielsweise natürliche Ribosomenbindungsstellen, die zu den oben erwähnten Promotoren gehören, cro oder synthetische Ribosomenbindungsstellen) oder Transkriptionsterminatoren (beispielsweise rrnB T1T2 oder bla). Die oben erwähnte Wirtszelle ist vorzugsweise eine bakterielle Zelle der Gattung Escherichia, insbesondere E. coli. Jedoch ist es auch möglich, andere bakterielle Zellen (siehe unten) zu verwenden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Expressionsvektor ein Plasmid.
Eine bakterielle Wirtszelle, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann, kann beispielsweise aus der Gruppe der folgenden Mikroorganismen ausgewählt werden: Gram-negative Bakterien, wie Escherichia Arten, beispielsweise E. coli, oder andere Gram-negative Bakterien, beispielsweise Pseudomonas sp., wie Pseudomonas aeruginosa oder Caulobacter sp., wie Caulobacter crescentus oder Gram-positive Bakterien, wie Bacillus sp., insbesondere Bacillus subtilis. E. coli ist als Wirtszelle besonders bevorzugt.
Die bakterielle Wirtszelle, das heißt der Expressionsstamm, wird gemäß der an sich bekanten mirkobiologischen Praxis kultiviert. Der Stamm wird im allgemeinen ausgehend von einer Einzelkolonie in einem Nährmedium angezogen, es ist aber auch möglich, eine kryokonservierte Zellsuspension (Zellbank) zu verwenden. Der Stamm wird im allgemeinen in einem Mehrstufenverfahren kultiviert, um ausreichend Biomasse für eine weitere Verwendung zu erhalten.
In kleinem Maßstab kann dies in Schüttelkolben ausgeführt werden, wobei es in den meisten Fällen möglich ist, ein komplexes Medium zu verwenden (beispielsweise LB Medium). Jedoch ist es auch möglich, definierte Medien zu verwenden (beispielsweise Citratmedium). Zur Kultivierung wird ein kleines Volumen an Vorkultur des Wirtsstamms (angeimpft mit einer Einzelkolonie oder mit einer Zellsuspension aus einer Kryokultur) angezogen, wobei die Temperatur für diese Kultivierung im allgemeinen nicht für das spätere Expressionsergebnis kritisch ist, so dass es möglich ist, routinemäßig bei relativ hohen Temperaturen zu operieren (beispielsweise 30°C oder 37°C). Die Hauptkultur wird in einem größeren Volumen (beispielsweise 500 ml) angesetzt, wo es besonders notwendig ist, eine gute Belüftung sicherzustellen (große Volumina der Kolben im Vergleich zu den Volumina der Inhalte, schnelle Rotation). Da es beabsichtigt ist, dass die Expression in Form von unlöslichen Einschlusskörperchen stattfindet, wird die Hauptkultur in den meisten Fällen bei relativ hoher Temperatur ausgeführt (beispielsweise 30 oder 37°C). Induzierbare Systeme sind besonders zur Herstellung von Einschlusskörperchen geeignet (beispielsweise mit trp, lac, tac oder phoA Promotor). Nachdem die späte logarithmische Phase erreicht wurde (gewöhnlich bei einer optischen Dichte von 0,5 bis 1,0 in Schüttelkolben), wird die Induktorsubstanz (beispielsweise Indolacrylsäure, Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid = IPTG) zugegeben und die Inkubation wird für 1 bis 5 Stunden fortgesetzt. Während dieser Zeit wird das meiste des N^pro Fusionsproteins als Einschlusskörperchen in das bakterielle Cytoplasma abgelagert. Die entstehenden Zellen können geerntet und weiter prozessiert werden.
Im größeren Maßstab besteht das Mehrstufensystem aus einer Vielzahl an Bioreaktoren (Fermentern), wobei es in diesem Fall bevorzugt ist, definierte Nährmedien zu verwenden, um in der Lage zu sein, die Verfahrenskontrolle des Prozesses zu verbessern. Zusätzlich ist es möglich, die Biomasse und die Produktbildung deutlich zu erhöhen, indem man bestimmte Nährstoffe zudosiert (Fedbatch). Ansonsten ist das Verfahren analog zum Schüttelkolben. Beispielsweise werden ein Vorfermenter und ein Hauptfermenter verwendet, wobei die Kultivierungstemperatur ähnlich zu der im Schüttelkolben gewählt wird. Der Vorfermenter wird mit einem sogenannten Inokulum angeimpft, das im allgemeinen aus einer Einzelkolonie oder einer Kryokultur in einem Schüttelkolben angezogen wurde. Eine gute Belüftung und eine ausreichende Induktorkonzentration müssen auch im Fermenter und speziell in der Hauptstufe hiervon sichergestellt werden. Die Induktionsphase muss jedoch in manchen Fällen im Vergleich zum Schüttelkolben deutlich länger gehalten werden. Die entstehenden Zellen werden erneut für eine weitere Prozessierung geerntet.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden die Einschlusskörperchen aus der Wirtszelle auf eine bekannte Weise isoliert, wie dies beispielsweise beschrieben ist in R. Rudolph et al., in: T.E. Creighton (Herausgeber), Protein Function, A Practical Approach, IRL Press (1996) 1–39, R. Rudolph in: H. Tschesche (Herausgeber), Modern Methods in Protein and Nucleic Acid Research, De Gruyter, Berlin (1990), 149–171, R. Rudolph in: J.L. Cleland & C.S. Craik (Herausgeber), Protein Engineering: Principles and Practices, Wiley-Liss Inc., (1995), 283–298.
Beispielsweise werden, nachdem die Fermentation stattgefunden hat, die Zellen durch Zentrifugation geerntet. Die hierin enthaltenen Einschlusskörperchen (IBs) können nach der Zerstörung der Zellen beispielsweise durch Hochdruckdispersion durch eine einfache Zentrifugation bei einer langsamen Rotorgeschwindigkeit erhalten werden. Die Reinheit in Bezug zum gewünschten Zielprotein kann dann durch mehrfache Resuspendierung der IBs in verschiedenen Puffern, beispielsweise in Gegenwart von NaCl (beispielsweise 0,5–1,0 M) und/oder Detergenz (beispielsweise Triton X-100) verbessert werden. Dies führt gewöhnlich dazu, dass die meisten Fremdproteine in den IBs entfernt werden. Die verbleibenden Fremdproteine wechselwirken gewöhnlich nicht mit der autoproteolytischen Spaltung.
Die Solubilisierung findet routinemäßig durch Auflösen der IBs beispielsweise in einem Guanidinenthaltenden Puffer (beispielsweise 0,1 M Tris/HCl, 6,0 M Guanidin/HCl, 5 mM EDTA, 50 mM DTT) statt (siehe beispielsweise R. Rudolph et al., (1996), R. Rudolph (1990), R. Rudolph (1995), siehe obige Literaturangaben). Nach der Entfernung des unlöslichen Materials, beispielsweise durch Zentrifugation, kann mit dem Überstand eine Proteinbestimmung ausgeführt werden.
Die autoproteolytische Spaltung des heterologen Polypeptids aus dem Fusionsprotein wird durch Verdünnung des Solubilisats mit einem Spaltpuffer (beispielsweise 1 ml Solubilisat + 99 ml Spaltpuffer), beispielsweise mit einem Tris-enthaltenden Spaltpuffer, vorzugsweise einer Konzentration von 0,8–1,0 M oder mit einem Arginin-enthaltenden Spaltpuffer, vorzugsweise mit 0,4–0,6 M Arginin, beispielsweise bei einem neutralen pH, vorzugsweise pH 7,0–7,5 und bei einer Temperatur von beispielsweise weniger als 30°C, vorzugsweise 10–20°C unter Bildung der Reaktionslösung erreicht (siehe auch R. Rudolph (1996), siehe obige Literaturstelle). Die Spaltlösung wird anschließend für einen bestimmten Zeitraum, beispielsweise 12 Stunden inkubiert und das Ausmaß der N^pro Spaltung kann durch SDS-PAGE analysiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Solubilisat mit einem Arginin-enthaltenden Puffer so verdünnt, dass die Endkonzentration von Arginin bis zu 1,0 M, vorzugsweise 0,4–0,6 M beträgt. Alternativ dazu ist eine Verdünnung auch durch Dialyse der solubilisierten Einschlusskörperchen gegen einen geeigneten Arginin-enthaltenden Spaltpuffer möglich.
Die Temperatur der Reaktionslösung für die Spaltung liegt beispielsweise zwischen 0°C und 30°C. Die Temperatur kann vorzugsweise 10°C bis 20°C betragen.
Der pH der Reaktionslösung beträgt beispielsweise 5,0 bis 9,0. Der pH beträgt vorzugsweise 7,0 bis 8,0, insbesondere 7,0 bis 7,5.
Wenn es geeignet ist, enthält die Reaktionslösung DTT in einer Konzentration von 0,5 bis 100 mM. Die DTT Konzentration beträgt vorzugsweise etwa 5,5 mM.
Die Proteinkonzentration in der Reaktionslösung während der Spaltung kann beispielsweise im Bereich von 20 bis 150 μg/ml liegen. Die Proteinkonzentration beträgt vorzugsweise weniger als 40 μg/ml.
Die Reaktionslösung kann Tris/HCl in einer Konzentration von beispielsweise bis zu 1,0 M während der Spaltung enthalten. Die Tris/HCl Konzentration liegt vorzugsweise zwischen 0,8 M und 1,0 M.
Andere Puffersysteme sind auch anstelle von Arginin-enthaltenden und/oder Tris/HCl enthaltenden Puffern möglich.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform beträgt der pH im Spaltpuffer 7,0 bis 7,5, wobei die Temperatur während der Spaltung 10°C bis 20°C beträgt, die Proteinkonzentration 40–50 μg/ml nicht übersteigt und der Spaltpuffer etwa 5 mM DTT als Reduktionsmittel enthält.
Schließlich wird das heterologe Polypeptid, das vom Fusionsprotein abgespalten wurde, auf eine an sich bekannte Weise isoliert (siehe beispielsweise M.P. Deutscher in: Methods in Enzymology: Guide to Protein Purification, Academic Press Inc., (1990) 309–392).
Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung ohne den Umfang hiervon zu beschränken.
Beispiele
Beispiel 1: Expression und in vitro Spaltung von N^pro-hGH (humanes Wachstumshormon)
Die Fusionsproteine werden durch heterologe Expression in Escherichia coli in einem Expressionssystem (Vektor p160TP1 mit Wirt W3110) hergestellt. Alle Elemente in diesem System zur Konstruktion des Vektors stammen vom E. coli Genom.
p160TP1 ist ein von pBR322 stammender Vektor, worin die Expression unter der Kontrolle eines modifizierten E. coli trp Promotors mit deletiertem Attenuator stattfindet. Die Shine-Dalgarno Sequenz des Attenuatorpeptids vom selben Operon wird als Ribosomenbindungsstelle (RBS) verwendet. Der doppelte Terminator T1T2 vom E. coli rrnB Gen stellt zusammen mit dem bla Gen Terminator, der im Konstrukt verbleibt, eine wirksame Termination der Transkription sicher. Die Expressionskassette wird ausgehend von der pBR322 EcoRI Spaltstelle in der Orientierung gegen den Uhrzeigersinn (das heißt gegen die Orientierung des Tetracyclinresistenzgens) eingebaut. Das β-Lactamasegen (bla) wird zusammen mit dem Promotor deletiert. Die Strukturgene für die zu exprimierenden heterologen Proteine werden über die Xbal Schnittstelle an der Position 3506 eingeführt (im allgemeinen als zurechtgeschnittenes PCR Fragment).
Ein Expressionsplasmid (NPH-pET) dient als Quelle des N^pro-hGH Struktugens. Das Plasmid umfasst den bekannten Expressionsvektor pET11a (F.W. Studier et al., Methods Enzymol. 185 (1990), 60–89). Zuerst wird ein Fusionsprotein, das aus N^pro und dem CSFV Nukleocapsidprotein besteht, in den Expressionsvektor kloniert. Dies führt dazu, dass die ersten 16 Aminosäuren der natürlichen N^pro Sequenz (MELNHFELLYKTSKQK) durch eine 10 Aminosäuren lange Oligohistidinreinigungshilfe (MASNHHHHHH) ersetzt werden. Es wird eine SpeI Schnittstelle am Übergang zwischen N^pro und dem Nucleokapsidprotein in das entsprechende Expressionsplasmid durch eine gezielte Mutagenese eingeführt. Dies ermöglicht es, das Strukturgen für das Nukleokapsidprotein aus dem Vektor durch Restriktionen mit SpeI (am 5'-Ende) und XhoI (am 3'-Ende) zu deletieren. Der entsprechend linearisierte N^pro-pET11a Vektor wird durch präparative Gelelektrophorese aus dem Nukleocapsidgenfragment entfernt. Es ist dann möglich, das hGH Strukturgen über die „klebrigen" SpeI und XhoI Enden einzuführen.
Für diesen Zweck ist die folgende vorbereitende Arbeit mit dem hGH Gen erforderlich. Das Strukturgen wird aus einer cDNA Bank aus dem menschlichen Gehirn amplifiziert, was mittels einer Hochpräzisions PCR (beispielsweise Pwo Polymerase von Roche Biochemicals, Verfahren vom Hersteller angegeben) prozessiert (Clontech) werden kann. Es werden die folgenden Oligonukleotide für diesen Zweck verwendet:
Oligonukleotid 1 („N-terminal"):
Oligonukleotid 2 („C-terminal"):
Es werden eine SpeI Schnittstelle am 5'-Ende und eine XhoI Schnittstelle am 3'-Ende über das verwendete Oligonukleotid eingeführt. Zusätzlich wird das doppelte ochre Stopcodon (TAATAA) am Ende des Strukturgens für eine effiziente Termination der Translation eingeführt. Die SpeI Spaltstelle am vorderen Ende erlaubt die Ligation im Leserahmen mit dem wie oben beschriebenen N^pro-pET11a Vektor. Die XhoI Schnittstelle am hinteren Ende ermöglicht eine direkte Klonierung. Das auf diese Weise hergestellte Plasmid wird NPH-pET genannt.
Dieses Plasmid NPH-pET wird dann wie bereits erwähnt als Quelle des Strukturgens des N^pro-hGH Fusionsproteins verwendet. Für diesen Zweck wird erneut eine Hochpräzisions PCR mit Pwo Polymerase unter Verwendung des Plasmids NPH-pET als Matrize verwendet, das mit XhoI linearisiert ist. Die folgenden Primer werden zur Herstellung eines klonierbaren Fragments verwendet:
Vorderes Ende des Strukturgens (entspricht dem N-Terminus des Proteins):
Hinteres Ende des Strukturgens (entspricht dem C-Terminus des Proteins):
Die anschließend für die Klonierung (vorne und hinten) verwendeten Xbal Schnittstellen sind unterstrichen gezeigt und die Start-(ATG) und Stopcodons (TAATAA) sind in Großbuchstaben geschrieben.
Diese zwei Oligonukleotide führen zu einer Amplifizierung eines Strukturgens mit einem offenen Leserahmen (ORF) für ein Fusionsprotein (FP), worin die His₇ Reinigungshilfe und die vorangehenden Aminosäuren (mit Ausnahme des für den Start erforderlichen Methionins) vollständig deletiert wurden.
Die Sequenz des PCR Fragments (1072 bp), das den offenen Leserahmen für das N^pro-hGH Fusionspotein enthält, ist im folgenden gezeigt. Das Startcodon und die zwei Stopcodons sind fett gedruckt und die zwei Xbal Spaltstellen für die Klonierung sind unterstrichen.
Dieser ORF kodiert so für das im folgenden gezeigte Fusionsprotein, wobei das Prolin an der Position 2 dem Prolin an der Position 17 des natürlichen N^pro Proteins entspricht. Die Sequenz des N^pro hGH Fusionsproteins (344 Aminosäuren, von denen 153 aus N^pro und 191 aus hGH stammen) lautet folgendermaßen (in N-terminaler nach C-terminaler Richtung gelesen), wobei das Prolin 17 (Position 2 des Fusionsproteins) aus der natürlichen N^pro Sequenz kursiv gedruckt ist und die hGH Sequenz fett gedruckt ist:
Das FP hat im reduzierten Zustand eine M_r von 39 316,92 Da und die M_r nach einer möglichen Spaltung wäre 17 220,02 Da für den N^pro Teil (reduziert) und 22114,88 Da für den hGH Teil (reduziert). N^pro hat 6 Cysteine und hGH vier. Im bakteriellen Cytoplasma dürften diese Cysteine für den Großteil reduziert vorliegen. Während einer anschließenden Prozessierung findet vermutlich teilweise eine Bildung von Disulfidbrücken statt. Es muss erwartet werden, dass das N-terminale Methionin im Fusionsprotein (oder dem N^pro Teil) meist durch die Methinoninaminopeptidase (MAP), die intrinsisch im Wirt vorkommt, abgespalten wird, was die M_r jeweils um 131 Da auf 39 186 Da (FP) und 17 089 Da (N^pro) verringert.
Das PCR Fragment mit dem Strukturgen für das beschriebene FP wird gereinigt und mit Xbal geschnitten und die zwei gewünschten Spaltprodukte werden aus dem Zielfragment entfernt. Dieses Fragment wird wie beschrieben in den Expressionsvektor p160TP1 ligiert.
Für diesen Zweck wird der Vektor anfänglich mit Xbal linearisiert und mit Phosphatase aus dem Kälberdarm (CIP) 5'-dephosphoryliert. Es wird T4 DNA Ligase zur Ligation verwendet. Die ligierte DNA wird durch Elektroporation in Escherichia coli K12 DH10B eingeführt und auf Agarplatten aus Luria-Medium (LB) mit 15 mg/l Tetracyclin ausplattiert. Es entstehen viele Kolonien aus dieser Transformation. Die Plasmid DNA wird aus mehreren Klonen isoliert und durch Restriktionsanalyse auf die Anwesenheit eines Inserts mit der korrekten Größe und Orientierung untersucht. Es wird ein Klon ausgewählt und einer detaillierten Charakterisierung durch Restriktionsanalyse und DNA Sequenzierung unterzogen. Das Plasmid verhält sich in allen Untersuchungen gemäß der Berechnungen. Das Plasmid wird pNPH1 genannt und wird für die anschließende Arbeit verwendet.
Die Sequenz des N^pro-hGH Expressionsplasmids pNPH1 (4840 bp) ist im folgenden gezeigt. Das Startcodon und das Stopcodon für das N^pro-hGH Fusionsprotein sind unterstrichen. Der offene Leserahmen läuft in die umgekehrte Richtung, wenn dies in dieser Form gezeigt wird.
Der Escherichia coli Wirtsstamm zur Expression des N^pro-hGH Fusionspoteins wird auf der Grundlage von Betrachtungen über Produktivität und biologische Sicherheit ausgewählt. Escherichia coli K12 ist die am besten charakterisierte Linie der Spezies E. coli (B.J. Bachmann in: J.L. Ingraham et al., (Herausgeber) Escherichia coli and Salmonella typhimurium: Cellular and molecular biology. American Society for Micorbiology, Washington D.C. (1987a), Seiten 1191–1219, B.J. Bachmann 1987b, J. Barbara (1987b) Linkage map of Escherichia coli K-12, Ausgabe 7 in: Escherichia coli and Salmonella typhimurium, Band 2, Herausgeber: F.C. Neidhardt. Am. Soc. Microbiol., Washington DC (1987b), 807–876, K.F. Jensen, J. Bacteriol. 175 (1993), 3401–3407) und dessen Repräsentanten werden im allgemeinen als sicher betrachtet.
Escherichia coli K12 W3110 (ATCC 27325) ist ein prototrophes Derivat, das sehr nahe am Wildtyp von Escherichia coli K12 ist und wird häufig als Wirtsstamm zur Expression von heterologen Proteinen verwendet. Er wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt und hat den folgenden Genotyp:
[F^– mcrA mcrB IN(rrnD – rrnE)1 lamda^–]
Der Stamm kann von der ATCC bezogen werden. Sein Wachstum ist auf vollkommen synthetischen Medien ohne komplexe Stickstoffquellen exzellent und die Prozessverbesserungskontrolle ist daher sehr effektiv.
Der Expressionsstamm W3110 [pNPH1] wird durch Transformation des oben beschriebenen Expressionsplasmids pNPH1 in W3110 gebildet. Die Transformation findet durch Elektroporation mittels 10 % Glycerin als Suspensionsmedium statt. 50 ng (1 μl) einer pNPH1 Lösung in Wasser werden mit 30 μl einer W3110 Zellsuspension gemischt und einem 1800 V Puls in einer 1 mm Küvette ausgesetzt (Eppendorf Electroporator 2510). Die Zellen werden in SOC Medium resuspendiert, für 1 Stunde bei 37°C geschüttelt und dann auf Agarplatten mit Luria Medium mit 15 mg/l Tetracyclin ausplattiert. Es entstehen viele Klone aus dieser Transformation nach einer Inkubation bei 37°C (über Nacht).
Eine mittelgroße Kolonie mit deutlichen Grenzen wird gepickt und bildet die Basis für den Expressionsstamm W3110 [pNPH1]. Der Klon wird kultiviert und in Kryoampullen bei –80°C (Masterzellbank MCB) konserviert. Zur täglichen Verwendung wird der Stamm auf LB-Tetracyclin-Agarplatten ausgestrichen.
Der Stamm W3110 [pNPH1] wird aus einer Einzelkolonie auf einer Agarplatte subkultiviert und dieser wird zum Beimpfen einer Vorkultur in Luria Medium + 15 mg/l Tetracyclin (200 ml in einem 1 l Schikanenkolben) verwendet. Die Vorkultur wird bei 250 Upm bei 30°C für 14 Stunden geschüttelt und erreicht hierbei eine OD₆₀₀ von etwa 1,0. 10 ml Portionen der Vorkultur werden dann zur Beimpfung der Hauptkulturen verwendet (jeweils 330 ml Citratmedium in 1 l Schikanenkolben) (3 % Inokulum). Die Hauptkulturen werden bei 37°C (250 Upm) angezogen, bis die OD₆₀₀ 0,8 beträgt und dann wird die Herstellung des Fusionsproteins mit 50 μg Indolacrylsäure pro ml Kultur induziert (Endkonzentration, Stammlösung 5 mg/ml in 100 % EtOH mit analytischer Reinheit). Die Kulturen werden weiter bei 37°C und 250 Upm für 4 Stunden kultiviert, wobei die OD₆₀₀ etwa 1,5 bis 3,0 erreicht.
Die Kulturen werden in sterile 500 ml Zentrifugenflaschen gegeben und bei 10 000 × g für 30 Minuten zentrifugiert. Der Zentrifugationsüberstand wird vollkommen verworfen und die Pellets werden bei –80°C eingefroren, bis sie weiter prozessiert werden.
Etwa 12 g (Nassgewicht) an BL 12 l (DE3) Zellpellet werden in 30 ml an 50 mM Tris/HCl, 5 mM Benzamidin, pH 8,0 suspendiert und mittels eines Ultraturrax homogenisiert. Nach der Zugabe von 0,5 mM EDTA und 0,1 % (G/V) Lysozym wird die Zellsuspension in einem Eisbad für 30 Minuten inkubiert. Eine anschließende Behandlung mit Ultraschall (7 × 20 Sekunden mit jeweils 20 Sekunden Pause) führt zu einer vollständigen Zerstörung der Zellen. Dann werden 10 mM MgCl₂ und 0,006 % (G/V) DNase zur zerstörten Suspension gegeben und bei 4°C für 30 Minuten inkubiert. Unlösliche und lösliche Bestandteile werden anschließend durch Zentrifugation (JA 20, 7700 × g) abgetrennt. Das Pellet wird in 40 ml an 50 mM Tris/HCl, 5 mM Benzamidin, 5 mM EDTA, pH 8,0 suspendiert und erneut zentrifugiert (JA 20, 7700 × g). Dieser Schritt wird weitere zweimal wiederholt und die entstehenden Pellets werden in 40 ml an 20 mM Tris/HCl, pH 7,0 suspendiert. 20 ml an 1,5 M NaCl, 60 mM EDTA, pH 7,0 werden zur Suspension gegeben und im Eisbad für 30 Minuten inkubiert. Schließlich wird eine weitere Zentrifugation (JA 20, 7700 × g) und ein H₂O Waschschritt ausgeführt. Das entstehende Pellet stellt das N^pro-hGH IB (Einschlusskörperchen) Material dar.
Danach erfolgt routinemäßig ein Suspendieren von etwa 100 mg an IB Material in 2 ml an 6,0 M Guanidinhydrochlorid, 0,1 M Tris, 5 mM EDTA, 50 mM DTT, pH 9,0 bei RT für 30 Minuten. Die unlöslichen Bestandteile werden anschließend durch Zentrifugation (10 min/30 000 × g) entfernt. Es wird eine Proteinbestimmung mit diesem Überstand ausgeführt (Proteinkonzentration etwa 20 mg/ml). Das auf diese Weise hergestellte Solubilisat wird entweder direkt in den Spalttests verwendet oder bei –20°C gelagert (maximal 7 Tage).
Beispiel 2: Spaltung der Einschlusskörperchenfusionsproteine unter verschiedenen Bedingungen
Die Spaltung des N^pro Teils wird im Prinzip durch eine 1:100 (oder stärkere) Verdünnung des Solubilisats (siehe oben) in Spaltpuffer ermöglicht (Restkonzentration an Guanidinhydrochlorid ≤ 0,06 M). Die Proteinkonzentration beträgt währenddessen routinemäßig 20 μg/ml (im Fall von Ausnahmen werden diese später herausgestellt).
Es ist ferner möglich, eine Spaltung des N^pro Teils durch Dialyse (1:100) des solubilisierten Materials gegen den Spaltpuffer zu erreichen.
Das Ausmaß der Spaltung des N^pro Teils kann durch Detektion der Spaltprodukte nach einer SDS-PAGE gemessen werden. Dies wird dadurch erreicht, dass die Polyacrylamidgele photographiert werden, nachdem die SDS-PAGE stattgefunden hat und die Intensität der geeigneten Banden gemessen wird. Die geeigneten Banden werden durch Western Blot in vorhergehenden Tests identifiziert.
Beispiel 2.1: In vitro Spaltung des N^pro-hGH durch Arginin
Die Spaltung findet durch Verdünnung (1:100) des Solibilisats in Spaltpuffer (20 mM Tris/HCl, 2 mM EDTA, 5 mM DTT, pH 7,0 und den entsprechenden Argininkonzentrationen) bei RT statt. Die Proteinkonzentration in den Spaltgemischen beträgt 20 μg/ml. Das Ausmaß der Spaltung wird nach 24 Stunden durch die Detektion der Spaltprodukte nach einer SDS-PAGE gemessen.
Es wird festgestellt, dass die N^pro Spaltungseffizienz deutlich durch die Zugabe von Arginin zum Spaltpuffer erhöht werden kann. Es findet eine maximale Spaltung bei einer Konzentration von 0,4 bis 0,6 M Arginin statt.
Beispiel 2.2: Abspaltung von N^pro aus N^pro-hGH durch Arginin bei verschiedenen Temperaturen
Die Spaltung findet durch Verdünnung (1:100) des Solubilisats in Spaltpuffer (20 mM Tris-/HCl, 2 mM EDTA, 5 mM DTT, pH 7,0, 0–1,0 M Arginin) bei den bestimmten Temperaturen statt. Die Proteinkonzentration im Spaltgemisch beträgt 20 μg/ml. Das Ausmaß an Spaltung wird nach 24 Stunden durch die Detektion der Spaltprodukte nach der SDS-PAGE gemessen.
Es wird festgestellt, dass eine maximale Spaltung bei Temperaturen zwischen 10 und 20°C stattfindet.
Beispiel 2.3: Ausmaß der Abspaltung von N^pro aus N^pro-hGH als Funktion des pH bei verschiedenen Temperaturen
Die Spaltung findet durch Verdünnung (1:100) des Solubilisats in Spaltpuffer (20 mM Tris/HCl, 2 mM EDTA, 5 mM DTT, 0,5 M Arginin) bei dem bestimmten pH statt. Die Proteinkonzentration im Spaltgemisch beträgt 20 μg/ml. Das Ausmaß der Spaltung wird 24 Stunden nach der Detektion der Spaltprodukte nach der SDS-PAGE gemessen.
Eine systematische Variation des pH im Spaltpuffer von 5,0 bis 9,0 wird ausgeführt. Mit der verwendeten Argininkonzentration ist ein pH von 7,0 bis 7,5 zur Abspaltung des N^pro Fusionsproteins optimal.
Beispiel 2.4: Abspaltung von N^pro aus N^pro-hGH bei verschiedenen DTT Konzentrationen
Es wird die Abhängigkeit der Spalteffizienz auf die DTT Konzentration untersucht.
Die Spaltung findet durch Verdünnung (1:100) des Solubilisats in Spaltpuffer (20 mM Tris/HCl, 2 mM EDTA, pH 7,0, 0,5 M Arginin, 0–100 mM DTT bei 15°C) statt. Aufgrund der DTT Konzentration im Solubilisat enthält das Gemisch mit „0 mM DTT" immer noch 0,5 mM DTT. Die Proteinkonzentration im Spaltgemisch beträgt 20 μg/ml. Das Ausmaß der Spaltung wird nach 24 Stunden durch die Detektion der Spaltprodukte nach einer SDS-PAGE gemessen.
Eine maximale Abspaltung des N^pro Teils wird bei etwa 5,5 mM DTT erreicht.
Beispiel 2.5: Variation des pH im Solubilisat zur Spaltung von N^pro-hGH
Die Spaltung findet durch Verdünnung (1:100) des Solubilisats bei verschiedenen pH Werten (pH 6,0, pH 7,0, pH 8,0, pH 9,0) im Spaltpuffer (20 mM Tris/HCl, 2mM EDTA, 5 mM DTT, pH 7,0, 0–0,8 M Arginin bei 15°C) statt. Die pH Werte werden durch die Titration des Solubilisierungspuffers bei den geeigneten pH Werten vor dem Mischen mit den IBs eingestellt. Die Proteinkonzentration im Spaltgemisch beträgt 20 μg/ml. Das Ausmaß der Spaltung wird nach 24 Stunden durch Detektion der Spaltprodukte nach der SDS-PAGE gemessen.
Es wird festgestellt, dass ein pH von 7,0–8,0 im Solubilisat optimal ist.
Beispiel 2.6: Kinetik der N^pro Abspaltung aus N^pro-hGH
Eine Reaktivierung des denaturierten N^pro-hGH wird durch Verdünnung (1:100) in 20 mM Tris-HCl, 0,5 M Arginin, 2 mM EDTA, 10 mM DTT, pH 7,0 bei 15°C gestartet. Es stellt sich heraus, dass der Endpunkt der Spaltung nach 24 Stunden erreicht ist.
Beispiel 2.7: Abspaltung von N^pro aus N^pro-hGH durch Verdünnung bei verschiedenen Proteinkonzentrationen
Die Spaltung findet durch Verdünnung (1:100) des Solubilisats in Spaltpuffer (20 mM Tris/HCl, 0,5 M Arginin, 2 mM EDTA, 10 mM DTT, pH 7,0 bei 15°C) statt. Es wird eine Überprüfung ausgeführt, um zu bestimmen, ob die Spaltung nach etwa 24 Stunden stattgefunden hat, indem man die Spaltprodukte nach einer SDS-PAGE detektiert.
Es wird festgestellt, dass Proteinkonzentrationen ≥ 40 μg/ml zu einer distinkten Abnahme der Spalteffizienz führen. Ferner zeigen Tests, dass die optimale Proteinkonzentration 20–40 μg/ml beträgt.
Beispiel 2.8: N^pro Abspaltung von N^pro-hGH durch Dialyse als Funktion der Proteinkonzentration
Guanidinhydrochlorid wird aus solubilisiertem N^pro-hGH IB Material durch Dialyse (1:100) gegen 20 mM Tris/HCl, 0,5 M Arginin, 2 mM EDTA, 10 mM DTT, pH 7,0 bei 4°C entfernt und so wird die Spaltung initiiert. Nach etwa 24 Stunden wird die SDS-PAGE verwendet, um zu analysieren, ob eine N^pro Abspaltung stattgefunden hat. Es wird festgestellt, dass die Abspaltung des N^pro Teils nicht nur durch Verdünnung, sondern auch durch Dialyse des solubilisierten Materials erreicht werden kann.
Beispiel 2.9: Effizienz der Abspaltung von N^pro aus N^pro-hGH als Funktion der Tris/HCl Konzentration
Die Abspaltung findet durch Verdünnung (1:100) des Solubilisats in Spaltpuffer (2 mM EDTA, 20 mM DTT, pH 7,0, 0,1–1,0 M Tris/HCl bei 15°C) statt. Die Spaltung wird nach etwa 24 Stunden durch die Detektion der Spaltprodukte nach der SDS-PAGE überprüft.
Es stellt sich heraus, dass eine zunehmende Tris/HCl Konzentration von bis zu 0,8 M im Puffer die Spaltungsausbeute des N^pro Fusionsproteins verbessert. Ein Anstieg darüber hinaus verursacht keine messbare Förderung der N^pro Spaltung.
Die Reaktion sollte somit vorzugsweise in Tris/HCl Konzentrationen von 0,8–1,0 M stattfinden.
Beispiel 3: Expression und in vitro Spaltung von N^pro-pGH (Schweinewachstumshormon)
Die Herstellung des N^pro-pGH Expressionsvektors beginnt mit pNPH1 (siehe Beispiel 1). Das Plasmid wird mit BglII linearisiert und mittels PCR amplifiziert. Dies führt dazu, dass das gesamte Plasmid von der Region des hGH Strukturgens (vom Codon für Phe 1 bis zum Codon für Phe 191) mit Pwo Polymerase und Primern ohne 5'-Phosphat amplifiziert wird. Das gereinigte PCR Fragment wird als Vektor in der Ligation mit dem pGH Strukturgen verwendet. Die Entfernung der 5'-Phosphate (beispielsweise mittels Phosphatase des Kälberdarms, alkalischer Phosphatase der Arktischen Garnele) verhindert eine Zirkularisierung durch Selbstligation.
Das pGH Strukturgen wird ähnlich durch PCR Amplifizierung hergestellt. Die verwendete Matrize ist eine Schweine cDNA Bank (beispielsweise Schweineleber 5'-Abschnitt cDNA Bank von Clontech oder Gehirn oder Hypophysen cDNA Bank vom Schwein). Die folgenden Primer werden zur Amplifizierung verwendet und werden jeweils mit einem 5'-Phosphat während der Synthese ausgestattet:
Vorderes Ende (entspricht dem N-Terminus des Proteins) des Strukturgens (Phe1 bis Ser7):
Hinteres Ende (entspricht dem C-Terminus des Proteins) des Strukturgens (Phe190 bis Val184):
Das PCR Fragment enthält ausschließlich den ORF (Strukturgen) für reifes pGH. Eine Ligation (T4 DNA Ligase) führt zu einem ORF für N^pro-pGH, der zu dem von pNPH1 analog ist. Das hierin später beschriebene Fusionsprotein wird durch den ORF kodiert. Die ligierte DNA wird durch Elektroporation in Escherichia coli K-12 DH10B eingeführt (elektrokompetente Zellen werden von Life Technologies geliefert, Genotyp Escherichia coli K-12 F^– mcrA Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 ΔlacX74 deoR recA1 endA1 araD139 Δ(ara, leu)7697 galU galK λ^– rpsL nupG) und auf Agarplatten mit Luriamedium (LB) mit 15 mg/l Tetracyclin ausplattiert. Diese Transformation führt zu mehreren Kolonieklonen. Es wird die Plasmid DNA aus mehreren Klonen isoliert und durch Restriktionsanalyse auf das Vorkommen eines Inserts mit der korrekten Größe und Orientierung untersucht. Es wird ein Klon ausgewählt und einer detaillierten Charakterisierung durch Restriktionsanalyse und DNA Sequenzierung unterzogen. Das Plasmid verhält sich in den Untersuchungen gemäß aller Berechnungen. Dieses Plasmid wird pNPP1 genannt und für die anschließende Arbeit verwendet.
In der folgenden Aminosäuresequenz (gelesen in N-terminaler nach C-terminaler Richtung) des N^pro-pGH Fusionsproteins (342 Aminosäuren, wovon 153 von N^pro und 189 von pGH stammen), ist das Prolin 17 (Position 2 des Fusionsproteins) von der natürlichen N^pro Sequenz kursiv dargestellt und die pGH Sequenz ist fett gedruckt.
Das FP hat im reduzierten Zustand eine M_r von 38 819,82 Da und die M_r nach einer möglichen Spaltung wäre 17 220,02 Da für den N^pro Teil (reduziert) und 21 617,79 Da für den pGH Teil (reduziert). N^pro hat 6 Cysteine und pGH vier. Im bakteriellen Cytoplasma dürften diese Cysteine für den Großteil reduziert vorliegen. Während einer anschließenden Prozessierung findet vermutlich teilweise eine Bildung von Disulfidbrücken statt. Es muss erwartet werden, dass das N-terminale Methionin im Fusionsprotein (oder dem N^pro Teil) meist durch die Methioninaminopeptidase (MAP), die intrinsisch im Wirt vorkommt, abgespalten wird, was die M_r jeweils um 131 Da auf 38 689 Da (FP) und 17 089 Da (N^pro) verringert.
Der Expressionsstamm W31 10 [pNPP1] wird wie in Beispiel 1 beschrieben durch Transformation (Elektroporation) des Expressionsplasmids pNPP1 in Escherichia coli K-12 W3110 hergestellt. In diesem Fall zeigt sogar die detaillierte Charakterisierung keine Abweichungen vom erwarteten Restriktionsmuster.
Eine mittelgroße Kolonie mit deutlichen Grenzen wird von der Transformationsplatte gepickt und bildet die Basis für den Expressionsstamm W3110 [pNPP1]. Der Klon wird kultiviert und in Kryoampullen bei –80°C (Masterzellbank MCB) konserviert. Zur täglichen Verwendung wird der Stamm auf LB-Tetracyclin-Agarplatten ausgestrichen.
Die Expression des N^pro-pGH Fusionsproteins findet statt, wie dies in Beispiel 1 für ein N^pro-hGH Fusionsprotein beschrieben ist.
Die Herstellung der N^pro-pGH IBs findet statt, wie dies in Beispiel 1 für ein N^pro-hGH Fusionsprotein beschrieben ist.
Beispiel 4: In vitro Abspaltung von N^pro aus N^pro-pGH
Die Solubilisierungs- und Renaturierungstests, die den oben für N^pro-hGH beschriebenen entsprechen, werden für das N^pro-pGH Fusionsprotein ausgeführt. Nach einer Variation der bereits beschriebenen Parameter (siehe oben) stellt sich heraus, dass eine in vitro Spaltung des N^pro Teils nach einer Solubilisierung und Renaturierung auch im Fall des N^pro-pGH Fusionsproteins möglich ist.
Sequenzliste

Claims

Verfahren zur rekombinanten Herstellung eines heterologen Polypeptids, das umfasst (i) Kultivierung einer bakteriellen Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der ein Nukleinsäuremolekül umfasst, das für ein Fusionsprotein kodiert, wobei das Fusionsprotein ein erstes Polypeptid umfasst, das die autoproteolytische Funktion einer Autoprotease N^pro eines Pestivirus zeigt und ein zweites Polypeptid, das an das erste Polypeptid am C-Terminus des ersten Polypeptids auf eine Weise gebunden ist, so dass das zweite Polypetid vom Fusionsprotein durch die autoproteolytische Aktivität des ersten Polypeptids abgespalten werden kann und das zweite Polypeptid ein heterologes Polypeptid ist, wobei die Kultivierung unter Bedingungen erfolgt, die die Expression des Fusionsproteins und die Bildung der entsprechenden cytoplasmatischen Einschlusskörper verursacht, (ii) Isolierung der Einschlusskörper aus der Wirtszelle, (iii) Solubilisierung der isolierten Einschlusskörper, (iv) Verdünnung des Solubilisats unter Bildung einer Reaktionslösung, worin die autoproteolytische Abspaltung des heterologen Polypeptids vom Fusionsprotein ausgeführt wird, und (v) Isolierung des abgespaltenen heterologen Polypeptids.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Pestivirus aus der Gruppe aus klassischem Schweinefiebervirus (CSFV), Border Disease Virus (BDV) und Virus der bovinen Virusdiarrhoe ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 2, worin das Pestivirus CSFV ist.
Verfahren nach Anspruch 3, worin das erste Polypeptid die folgende Aminosäuresequenz umfasst
oder die Aminosäuresequenz eines Derivats hiervon mit der autoproteolytischen Aktivität einer Autoprotease N^pro.
Verfahren nach Anspruch 3, worin das erste Polypeptid die Aminosäuresequenz Glu22 bis Cys168 der Autoprotease N^pro von CSFV oder ein Derivat hiervon mit der autoproteolytischen Aktivität einer Autoprotease N^pro umfasst, worin das erste Polypeptid ein Met als N-Terminus aufweist und worin das heterologe Polypeptid direkt an die Aminosäure Cys 168 der Autoprotease N^pro von CSFV gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 3, worin das erste Polypeptid die Aminosäuresequenz Pro17 bis Cys168 der Autoprotease N^pro von CSFV oder ein Derivat hiervon mit der autoproteolytischen Aktivität einer Autoprotease N^pro umfasst, worin das erste Polypeptid ein Met als N-Terminus aufweist und worin das heterologe Polypeptid direkt an die Aminosäure Cys168 der Autoprotease N^pro von CSFV gebunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, worin das Nukleinsäuremolekül ein DNA Molekül ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin der Expressionsvektor ein Plasmid ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin die bakterielle Wirtszelle eine E. coli Zelle ist.