CZ2002481A3 - Způsob rekombinantní produkce heterologního polypeptidu pomocí peptidu s autoproteolytickou aktivitou - Google Patents
Způsob rekombinantní produkce heterologního polypeptidu pomocí peptidu s autoproteolytickou aktivitou Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2002481A3 CZ2002481A3 CZ2002481A CZ2002481A CZ2002481A3 CZ 2002481 A3 CZ2002481 A3 CZ 2002481A3 CZ 2002481 A CZ2002481 A CZ 2002481A CZ 2002481 A CZ2002481 A CZ 2002481A CZ 2002481 A3 CZ2002481 A3 CZ 2002481A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- polypeptide
- cleavage
- pro
- fusion protein
- autoprotease
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 61
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 56
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 230000000468 autoproteolytic effect Effects 0.000 title claims abstract description 27
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 8
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 title description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 52
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 52
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 32
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 claims abstract description 24
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 21
- 241000710778 Pestivirus Species 0.000 claims abstract description 20
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 41
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 5
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- LXWYCLOUQZZDBD-LIYNQYRNSA-N csfv Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXWYCLOUQZZDBD-LIYNQYRNSA-N 0.000 claims 6
- 241000710780 Bovine viral diarrhea virus 1 Species 0.000 claims 1
- PPBOKXIGFIBOGK-BDTUAEFFSA-N bvdv Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CN=CN1 PPBOKXIGFIBOGK-BDTUAEFFSA-N 0.000 claims 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 94
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 91
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 80
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 59
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 51
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 31
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 31
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 31
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 24
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 24
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 21
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 20
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 20
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 13
- 241000710777 Classical swine fever virus Species 0.000 description 12
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 10
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 9
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 101710181812 Methionine aminopeptidase Proteins 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 7
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 6
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 6
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 6
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 6
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 6
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 6
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 5
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 5
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 5
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 5
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical class N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 238000013411 master cell bank Methods 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 3
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 3
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 3
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 3
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- NSHWGYPCYVZQOD-UHFFFAOYSA-N 2-(1h-indol-2-yl)prop-2-enoic acid Chemical compound C1=CC=C2NC(C(=C)C(=O)O)=CC2=C1 NSHWGYPCYVZQOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 2
- 108010019653 Pwo polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 2
- 102400000827 Saposin-D Human genes 0.000 description 2
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 2
- 230000004992 fission Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 101150023497 mcrA gene Proteins 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 2
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 2
- REQCZEXYDRLIBE-UHFFFAOYSA-N procainamide Chemical compound CCN(CC)CCNC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 REQCZEXYDRLIBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 2
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 2
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 2
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- -1 0.1 M tris / HCl Chemical compound 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241001118702 Border disease virus Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000863013 Caulobacter sp. Species 0.000 description 1
- 241000010804 Caulobacter vibrioides Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 235000001543 Corylus americana Nutrition 0.000 description 1
- 240000007582 Corylus avellana Species 0.000 description 1
- 235000007466 Corylus avellana Nutrition 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010013369 Enteropeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102100029727 Enteropeptidase Human genes 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 101000930822 Giardia intestinalis Dipeptidyl-peptidase 4 Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 1
- 108010002231 IgA-specific serine endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 1
- 102100040018 Interferon alpha-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010079944 Interferon-alpha2b Proteins 0.000 description 1
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 101001055320 Myxine glutinosa Insulin-like growth factor Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 101800000021 N-terminal protease Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800001098 Serine protease NS3 Proteins 0.000 description 1
- 101800001838 Serine protease/helicase NS3 Proteins 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010051511 Viral diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 238000010217 densitometric analysis Methods 0.000 description 1
- 101150106284 deoR gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 101150045500 galK gene Proteins 0.000 description 1
- 101150041954 galU gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000004545 gene duplication Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 101150096208 gtaB gene Proteins 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003262 industrial enzyme Substances 0.000 description 1
- 238000012994 industrial processing Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 101150079876 mcrB gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 102000034288 naturally occurring fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006048 naturally occurring fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 101150012154 nupG gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000011537 solubilization buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/503—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from viruses
- C12N9/506—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from viruses derived from RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Description
Způsob rekombinantní produkce heterologního polypeptídu pomocí peptidu s autoproteolytickou aktivitou
Qbl.a s t_ t.e chniky
Předkládaný vynález se týká způsobu rekombinantní výroby požadovaného heterologního polypeptídu s jasně definovaným homogenním N-koncem v bakteriální hostitelské buňce, přičemž nejdříve exprimovaný fúzni protein, který obsahuje peptid mající autoproteolytickou aktivitu autoproteázy Npro pestiviru a heterologní polypeptid, se tvoří ve formě inkluzních tělísek v cyzoplazmě, tato inkluzní tělíska se pak izolují a ošetří tak, že požadovaný polypeptid je vyštěpen z fúzního proteinu působením autoproteolytické aktivity Npro.
Dosavadní stav techniky
Při přípravě rekombinantních proteinů v heterologních organismech jako např. při expresi humánních nebo jiných eukaryotických proteinů v bakteriálních buňkách je často obtížné získat jasně definovaný N-konec, který by byl pokud možno 100% homogenní, až se týká především rekombinantních farmaceutických proteinů, jejichž aminokyselinová sekvence by v mnoha případech měla být shodná s aminokyselinovou sekvencí proteinů přirozeně se vyskytujících u člověka/zvířat.
Při normální, přirozené expresi, např. u člověka, mnohé farmaceutické proteiny, které se užívají, jsou transportovány do extracelulárního prostoru, přičemž štěpení signální sekvence .··.···:
·· 4» • · · 4 • · · • · · >
• · * ·· ·»·* ·· ·· • · · · • · » • · Φ • · · ·· *··· účel vede ke
- 2 přítomné v prekurzorovém proteinu právě pro tento vzniku jasně definovaného N-konce. Takový homogenní N-konec není vždy snadné připravit, např. při expresi v bakteriálních buňkách, a až z několika důvodů.
K produkci v průmyslovém měřítku jsou mnohé farmaceutické proteiny produkovány v cytoplazmě bakteriálních buněk (např. Escherichia coli), jelikož je zde možné dosáhnout akumulace v požadovaném množství, a kromě toho se často tvoří nerozpustná inkluzní tělíska (IB), která jsou velmi výhodná pro další zpracování a purifikaci. Navíc protein exprimovaný ve formě IB je chráněn intracelulárními proteázami proti degradaci proteázami (R. Rudolph, in: Protein Engineering: Principles and Practíces. Eds. Jeffrey L. Cleland and Charles S. Craik, John Wiley & Sons lne., (1995), ISBN 0-471-10354-3).
Avšak produkce materiálu ve formě IB vyžaduje in vitro nové svinutí (refolding) exprimovaného proteinu. To lze provést v mnoha případech metodami, které jsou odborníkům známy (R. Rudolph et al. (1996), in: Protein Function: A Practical
Approach, Ed.: Creighton, T.E., 1-39). Při těchto postupech se protein ve formě IB solubilizuje přidáním silného denaturačního činidla v redukujících podmínkách a pak se renaturuje.
Jen ve výjimečných případech je možný export do bakteriálního periplazmatického prostoru pomocí eukaryotické prosekvence nebo signální sekvence, protože se zde může akumulovat jen velmi malé množství produktu z důvodu nízké transportní kapacity bakteriálního exportního mechanismu.
Bakteriální cytoplazma se výrazně liší od extracelulárního prostoru eukaryot. Na jedné straně jsou zde redukující podmínky, na druhé straně zde není žádný mechanismus pro odštěpení N-koncové vedoucí (leader) sekvence • · · · · ·
- 3 ·· ·· ·· • · · · · · * • · · · « • · t · · · · · · ♦· · ·· ·♦·· ·· ···· z maturovaného (zralého) proteinu. Syntéza všech cytoplazmatických proteinů začíná methioninem, který je kódován příslušným iniciačním (startovním) kodonem (ATG = iniciace translace). Tento N-koncový methionin je u mnoha proteinů zachován, zatímco u jiných je odštěpen methionin^minopeptidázou (MAP), která je přítomna v cytoplazmě a je vlastní hostiteli. Účinnost štěpení závisí v podstatě na dvou parametrech:
1. povaha následující aminokyseliny a
2. Lokalizace N-konce v trojrozměrné struktuře proteinu.
N-koncový methionin je přednostně odstraněn, když následující aminokyselinou je serin, alanin, glycin, methionin nebo valin a když N-konec je exponován, tzn. když není ukryt uvnitř proteinu. Na druhé straně, když je následující aminokyselina jiná, především nabitá aminokyselina (kyselina glutamová, kyselina asparagová, lysin, arginin), nebo když je N-konec lokalizován uvnitř proteinu, ve většině případů k odštěpení N-koncového methioninu nedojde (Knippers, Rolf (1995) Molekulare Genetik, 6th edition, Georg ThiemeVerlag, Stuttgart, New York. ISBN 3-13-103916-7).
Dokonce i když aminokyselina podporující štěpení je přítomna v poloze 2, štěpení je zřídkakdy úplné. Obvykle významné množství (1-50%) zůstane neovlivněno MAP.
V minulosti produkce rekombinantních farmaceutických proteinů v bakteriálních buňkách se jednoduše vkládal methionin-kódující ATG startovní kodon před otevřený čtecí rámec (ORF) pro maturovaný protein (tj. bez signální sekvence nebo jiných extenzí N-konce). Exprimovaný protein pak měl sekvenci H2N-Met-cílový protein. Pouze v několika případech bylo možné dosáhnout úplného odštěpené N-koncového methioninu MAP hostitele. Většina proteinů připravovaných tímto způsobem • · ··
- 4 byla tudíž buďto nehomogenní na svém N-konci (jednalo se o směs Met-formy a formy bez Met) nebo měly všechny molekuly dodatečnou cizorodou aminokyselinu (Met) ne svém N-konci(pouze Met-forma).
Tato nehomogenita nebo odchylka od přírodní sekvence je však v mnoha případech nepřijatelná, neboť takové produkty často vykazuji odlišné imunologické (např. indukce protilátek) a farmakologické vlastnosti (biologický poločas, farmakokinetika). Z těchto důvodů je nyní nutné produkovat většinou přírodně identické produkty (homogenní a bez cizorodé aminokyseliny na N-konci). V případě cytoplazmatické exprese je nápravou zpravidla fúze štěpné sekvence (leader sekvence) pro specifickou endopeptidázu (např. Faktor Xa, enterokináza, KEX endopeptidázy, IgA proteáza) nebo aminopeptidázu (např. dipeptidylaminopeptidáza) na N-konec cílového proteinu. Avšak až představuje další krok a vynaložení dalších nákladů a materiálu při následném (tzv. downstream) zpracování produktu. Navíc v přítomnost IB v mnoha případech vedoucí sekvence narušuje a někdy zcela zabraňuje svinutí proteinu.
Takže existuje stálá potřeba nových způsobů přípravy požadovaného heterologního cílového proteinu, který je exprimován v bakteriálních buňkách ve formě inkluzních tělísek, ze kterých pak může být připraven cílový protein s požadovaným uniformním N-koncem. Takový způsob přípravy požadovaného cílového proteinu z inkluzních tělísek užitím virové autoproteázy Npro z pestiviru je předmětem předkládaného vynálezu.
Pestiviry tvoří skupinu patogenů, které způsobují značné ekonomické ztráty v chovech prasat a přežvýkavců po celém • · • ·
- 5 světě. Zvláště významným patogenem je klasický virus horečky prasat (CSFV, Clasical swine fever virus), který způsobuje přenosné onemocnění a podléhá tudíž ohlašovací povinnosti. Ztráty způsobené virem průjmu hovězího dobytka (BVDV, bovine viral diarrhoea virus) jsou také značné, zejména z důvodu pravidelného výskytu intrauterinní infekce plodů.
Pestiviry jsou malé obalové viry, jejichž genom velikosti 12,3 kb působí přímo jako mRNA, ze které jsou v cytoplazmě transkribovány virové produkty. K tomu dochází ve formě jediného polyproteinu, který obsahuje přibližně 4000 aminokyselin a který je naštěpen virovým a buněčnými proteázami na 12 zralých proteinů.
Do nynějška byly identifikovány dvě virově kódované proteázy u pestivirů, a sice autoproteáza Npro a serinová proteáza NS3. N-koncová proteáza Npro je lokalizována na N-konci polyproteinu a má zjevnou molekulovou hmotnost 23000 (D) . Katalyzuje štěpení, ke kterému dochází mezi jejím
C-koncem vlastním (Serl69) Virol. 67 Npro byly (Cysl68) a N-koncem nukleokapsidového proteinu C (R. Stark et al., J (1993), 7088-7095). Navíc duplikace genu popsány u cytopatogenních virů BVDV. V nich je druhá kopie Npro na N-konci podobně duplikované NS3 proteázy. Autoproteolytické štěpení proteinu Npro-NS3 bylo pozorováno i v tomto případě (R. Stark et al., viz výše).
Npr0 je autoproteáza délky 168 aminokyselin a zjevnou Mr 20000 (Dalton, D) (in vivo). Je prvním proteinem v polyproteinu pestivirů (CSFV, BVDV nebo BDV (border disease virus)) a podléhá autoproteolytickému odštěpení od následujícího nukleokapsidového proteinu C (M. Wiskerchen et al., J. Virol. 65 (1991), 4508-4514; Stark et al., J. Virol. 67 (1993), • · • ·
- 6 .“.Ji
7088-7095). Toto štěpení se uskutečňuje aminokyselinou sekvence Npro, tj . Cysl68.
za poslední
Podstata vynálezu
Nyní bylo překvapivě zjištěno, že autoproteolytická funkce autoproteázy Npro může být využita k vyštěpení heterologního polypeptidů z fúzního proteinu, který byl exprimován ve formě inkluzních tělísek v bakteriálním expresním systému a který obsahuje autoproteázu Npr° z pestiviru a heterologní polypeptid. Takže neštěpený Npro fúzní protein je izolován z inkluzních tělísek, solubilizován a pak štěpen v průběhu znovusvinutí (refolding).
Jeden aspekt předkládaného vynálezu se týká způsobu rekombinantní produkce heterologního polypeptidů, který obsahuje kroky, kdy (I) kultivují se bakteriální hostitelské buňky, které jsou transformované expresním vektorem obsahujícím molekulu nukleové kyseliny, která kóduje fúzní protein, přičemž fúzní protein obsahuje první polypeptid, který má autoproteolytickou funkci autoproteázy Npro z pestiviru, a druhý polypeptid, který je navázán na první polypeptid na C-konci prvního polypeptidů takovým způsobem, že druhý polypeptid může být vyštepen z fúzního proteinu autoproteolytickou aktivitou prvního polypeptidů, a druhý polypeptid je heterologní polypeptid, přičemž kultivace probíhá za podmínek, které vedou k expresi fúzního proteinu a k vytváření odpovídajících cytoplazmatických inkluzních tělísek, (II) izolují se inkluzní tělíska z hostitelských buněk ·· ··· » »9 ··9 9 (III) izolovaná inkluzní tělíska se solubilizují, (IV) solubilizát se naředí tak, aby vznikl reakční roztok, ve kterém proběhne autoproteolytické vyštěpení heterologního polypeptidu z fúzního proteinu a (V) izoluje se vyštěpený heterologní polypeptid.
Polypeptid s autoproteolytickou funkcí autoproteázy Npro pestiviru je především autoproteáza Npro pestiviru, nebo její derivát s autoproteolytickou aktivitou.
V popisu předkládaného vynálezu termín heterologní polypeptid znamená polypeptid, který není v přírodě odštěpován autoproteázou Npro pestiviru z přírodně se vyskytujícího fúzního proteinu nebo polyproteinu. K příkladům heterologních polypeptidů patří průmyslové enzymy nebo polypeptidy s farmaceutickou aktivitou, především farmaceutickou aktivitou u člověka.
K příkladům výhodných polypeptidů s humánní farmaceutickou aktivitou patří cytokiny jako jsou interleukiny, např. IL-6, interferony jako jsou leukocytární interferony, např. interferon a2B, růstové faktory, především růstové faktory účastnící se hematopoezy hojení poranění, jako jsou např. G-CSF, erythropoetin nebo IGF, hormony jako je např. humánní růstový hormon (hGH), protilátky anebo vakcíny.
Ve způsobu podle vynálezu je pestivirus výhodně vybrán ze skupiny obsahující CSFV, BDV a BVDV, zvláště výhodně je pestivirus CSFV.
Výhodný způsob podle předkládaného vynálezu je takový, kdy první polypeptid fúzního proteinu obsahuje následující aminokyselinovou sekvenci autoproteázy Npro z CSFV (viz také sekvence s přístupovým číslem X87939 v databázi EMBL) (aminokyseliny 1 až 168, čteno ve směru od N-konce do C-konce) (1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTT LRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVT GSDGKLYHIYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC-(168), nebo aminokyselinovou sekvenci jejího derivátu, který má autoproteolytickou aktivitu.
Polypeptidy s autoproteolytickou aktivitou autoproteázy Npro pestiviru mohou být deriváty autoproteázy Npro pestiviru, získané z autoproteázy Npro pestiviru mutagenezí, zejména užitím substitucí, delecí, adicí a/nebo inzercí aminokyselin, pokud je uchována požadovaná autoproteolytická aktivita, především pro vytváření požadovaných heterologních polypeptidu s homogenním N-koncem. Způsoby přípravy takových derivátů mutagenezí jsou odborníkům známy. Takovými mutacemi je možné optimalizovat aktivitu autoproteázy Npro vzhledem k různým heterologním proteinům, které mají být vyštěpeny z fúzního proteinu. Po přípravě nukleové kyseliny, která kóduje fúzní protein, který kromě požadovaného heterologního proteinu obsahuje derivát autoproteázy Npro vykazující' jednu nebo více mutací vzhledem k přírodně se vyskytující autoproteáze Npro, se určí, zda je požadovaná funkce přítomna stanovením autoproteolytické aktivity.
Autoproteolytická aktivita může být např. detekována nejdříve solubilizací izolovaných/purifikovaných IB v roztoku 7 M guanidin/HCl a pak naředěním 1:100 v reakčním pufru. Po inkubaci 24 hodin se reakční roztok vyšetří SDS-PAGE, zda došlo ke štěpení. Pro identifikaci podílu naštěpených a nenaštěpených molekul se provede Western přenos (Western blot). Podíl • · · ·
- 9 naštěpeného materiálu se stanoví denzitometrickou analýzou SDSPAGE gelů obarvených Coomassie modří.
Výhodný způsob podle předkládaného vynálezu je např. takový, kdy expresní vektor obsahuje nukleovou kyselinu, která kóduje fúzní protein, který má N-koncový úsek, kde byla jedna nebo několik aminokyselin deletováno nebo substituováno v úsek aminokyselin 2 až 21, pokud vzniklý derivát nadále vykazuje autokatalytickou funkci autoproteázy Npro v požadovaném rozsahu. Podle vynálezu výhodný derivát autoproteázy Npro ve fúzním proteinu obsahuje např. aminokyselinovou sekvenci autoproteázy Npro z CSFV s delecí aminokyselin 2 až 16 nebo 2 až 21. Je také možné prostřednictvím substituce nebo adice aminokyselin změnit nebo vložit aminokyselinovou sekvenci, např. se vnese aminokyselinová sekvence, která napomáhá při purifikaci.
Molekula nukleové kyseliny, která je zvláště výhodná ve způsobu podle vynálezu kóduje takový fúzní protein, kde první polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci Glu22 až Cysl68 autoproteázy Npro z CSFV nebo její derivát s autoproteolytickou aktivitou, přičemž první polypeptid dále má Met jakožto N-konec a heterologní polypeptid je napojen přímo na aminokyselinu Cysl68 autoproteázy Npro z CSFV.
Molekula nukleové kyseliny, která je podobně výhodná ve způsobu podle vynálezu, kóduje fúzní protein, kde první polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci Prol7 až Cysl68 autoproteázy Npro z CSFV nebo její derivát s autoproteolytickou aktivitou, přičemž první polypeptid dále má Met jakožto N-konec a heterologní polypeptid je napojen přímo na aminokyselinu Cysl68 autoproteázy Npro z CSFV.
Molekula nukleové kyseliny ve způsobu podle vynálezu je především ve formě molekuly DNA.
• *
- 10 Expresní vektor pro způsob podle předkládaného vynálezu výhodně obsahuje alespoň jednu sekvenci pro kontrolu exprese. Sekvence pro kontrolu exprese jsou především promotory (např. lac, tac, T3, T7, trp, gac, vhb, lambda pL nebo phoA), vazebná místa ribozomů (např. přirozená vazebná místa ribozomů patřící k výše zmíněným promotorům, cro nebo syntetická vazebná místa ribozomů), nebo terminátory transkripce (např. rrnB T1T2 nebo bia). Zmíněné hostitelské buňky jsou výhodně bakteriální buňky rodu Escherichia, především E. coli. Avšak mohou být užity i jiné bakteriální buňky. Ve výhodném provedení vynálezu je expresním vektorem plazmid.
Bakteriální hostitelské buňky pro způsob podle předkládaného vynálezu mohou být vybrány ze skupiny obsahující následující mikroorganismy: Gram-negativní baktérie rodu
| Escherichia, např. E. | coli, | nebo | jiné Gram-negativní | baktérie, | ||
| např. | Pseudomonas sp. | , jako | je | např. | Pseudomonas | aeruginosa, |
| nebo | Caulobacter sp. | , jako | je | např. | Caulobacter | crescentus, |
| nebo | Gram-pozitivní | baktérie | jako | jsou baktérie rodu |
Bacillus sp., především Bacillus subtilis. Zvláště výhodné hostitelské buňky jsou E. coli.
Bakteriální hostitelské buňky, tj. expresní kmen těchto buněk, se kultivuje obvyklým mikrobiologickým způsobem, který je odborníkovi znám. Kmen je kultivován z jedné výchozí kolonie na živném médiu, ale je také možné jako výchozího materiálu užít kryoprezervovanou suspenzi buněk (buněčné banky). Kmen se obecně kultivuje v několika stupňovém procesu, aby byla získána dostatečná biomasa pro další zpracování.
V malém měřítku probíhá kultivace v protřepávaných kultivačních lahvích, ve většině případů je možné užít úplné médium (např. LB živné médium). Avšak může se užít také
- 11 • Β 9 •99 9 9 9
9 9
9 99 9 specificky definované médium (např. citrátové médium). Pro kultivaci se připraví maloobjemová prekultura hostitelského kmenu (inokulovaná jedinou kolonií nebo kryoprezervovanou buněčnou suspenzí), teplota při této kultivaci obvykle není kritická pro pozdější výsledky exprese, takže se rutinně provádí při vyšších teplotách (např. 30°C nebo 37°C). Hlavní kultura se nasadí ve větším (např. 500 ml) , kde je především nutné zajistit dobré provzdušnění (velký objem kultivační nádoby proti objemu obsahu, vysoká rychlost rotace). Jelikož je úmyslem dosáhnout exprese ve formě nerozpustných inkluzních tělísek, hlavní kultura se ve většině případů provádí při relativně vysokých teplotách (např. 30 nebo 37 °C). Indukovatelné systémy jsou zvláště vhodné k produkci inkluzních tělisek (např. užitím promotorů trp, lac, tac nebo phoA) . Po té, co bylo dosaženo pozdní logaritmické fáze (obvykle při optické hustotě 0,5 až 1,0 v třepaných lahvích) se v těchto systémech přidá induktor (např. indolylakrylová kyselina, isopropyl β-D-thiogalaktopyranosid = IPTG) a inkubace pokračuje dále 1 až 5 hodin. V průběhu této doby se většina Npro fúzního proteinu deponuje v bakteriální cytoplazmě ve formě inkluzních tělísek. Buňky je pak možné sklidit a dále zpracovat.
Ve větším měřítku vícestupňový kultivační proces probíhá v řadě bioreaktorů (fermentorů), přičemž je výhodné užít definovaná živná média, aby bylo možné zlepšit ovládání a kontrolu procesu. Kromě toho je možné významně zvýšit nárůst biomasy a tvorbu produktu dávkováním určitých živin (živná dávka). Jinak je proces analogický procesu v malém měřítku v třepaných lahvích. Tak např. se užije fermentor pro předběžnou fázi a fermentor pro hlavní fázi a zvolí se kultivační teploty shodné s teplotami při kultivaci v lahvích.
• β
- 12 ·» ··♦ ·
Fermentor pro předběžnou fázi je inokulován inokulem, které se vypěstuje z jediné kolonie nebo z kryokultury v kultivační lahvi. Ve fermentoru je také třeba zajistit dobré provzdušňování a přítomnost dostatečné koncentrace induktoru, zejména pak v hlavní fázi. Indukční fáze však musí být někdy jinak dlouhá než indukce v kultivační lahvi. Výsledné buňky se pak užiji pro další zpracování.
Ve způsobu podle předkládaného vynálezu se inkluzní tělíska izolují z hostitelských buněk způsobem, který je odborníkům znám a byl popsán např. v publikacích: R. Rudolph et al., in: Creighton, T.E. (Ed.), Protein Function, A Practical Approach, IRL Press, (1996), 1-39; R. Rudolph , in: H. Tschesche (Ed.), Modern Methods in Protein and Nucleic Acid Research, De Gruyter, Berlin, (1990), 149-171; R. Rudolph, in: J.L. Cleland & C.S. Craik (Eds.), Protein Engineering: Principles and Practices, Wiley-Liss lne., (1995), 283-298.
Tak například po ukončení fermentace se buňky sklidí centrifugaci. Inkluzní tělíska (IB) přítomná v buňkách se získají po rozrušení buněk např. vysokotlakou disperzí jednoduše centrifugaci při nízkých otáčkách rotoru. Čistota z hlediska požadovaného cílového proteinu se může zlepšit opakovaným resuspendováním IB v různých pufrech, např. s NaCl (např. 0,5 až 1,0 M) a/nebo s detergenty (např. Triton X-100). To obvykle vede k odstranění většiny cizorodých proteinů z IB. Zbytky cizorodých proteinů obvykle nenarušují autoproteolytické štěpení.
Solubilizace se rutinně provádí rozpuštěním IB např. v pufru obsahujícím guanidin (např. 0,1 M tris/HCl, 6,0 M guanidin/HCl, 5 mM EDTA, 50 mM DTT) (viz např. R. Rudolph et al., (1996); R. Rudolph (1990), R. Rudolph (1995), cit. výše).
- 13 «» · · • · · · • · Φ <· * · • · « · « » ·· · · ι
Φ < ♦ • * « · · 9
Po odstranění nerozpustného materiálu např. centrifugací lze v supernatantu provést stanovení koncentrace proteinu.
Autoproteolytického vyštěpení heterologního polypeptidu z fúzního proteinu se dosáhne naředěním solubilizátu štěpícím pufrem (např. v poměru 1 ml solubilizátu + 99 ml štěpícího pufru), např. pufrem obsahujícím Tris, výhodně v koncentraci 0,8-1,0 M, nebo štěpícím pufrem obsahujícím arginin, výhodně s 0,4-0,6 M argininem, např. při neutrálním pH, výhodně při pH 7,0-7,5, a při teplotě např. nižší než 30°C, výhodně 10 až 20 °C, čímž se vytvoří reakční roztok (viz také R. Rudolph (1996), cit. výše). Štěpící roztok se pak inkubuje po určitou dobu, např. 12 hodin, a míra štěpení Npro pak může být analyzována např. pomocí SDS-PAGE.
Ve výhodném provedení je solubilizát nařěděn pufrem obsahujícím arginin tak, aby výsledná koncentrace argininu byla do 1,0 M, výhodně 0,4 až 0,6 M. Alternativně se nařědění provede dialýzou solubilizovaných inkluzních tělísek proti vhodnému štěpícímu pufru obsahujícímu arginin.
Teplota reakčního pufru pro štěpení je v rozmezí 0 °C až 30°C, výhodná teplota je 10 °C až 20 °C.
pH reakčního pufru je např. v rozmezí '5,0 až 9,0. pH je výhodně 7,0 až 8,0, zvláště výhodně 7,0 až 7,5.
Tam, kde je to vhodné, reakční pufr obsahuje také DTT v koncentraci 0,5 až 100 mM. DDT koncentrace je výhodně přibližně 5,5 mM.
Koncentrace proteinu v reakčním roztoku pro štěpení je např. v rozmezí 20 až 150 μg/ml. Koncentrace proteinu je výhodně nižší než 40 gg/ml.
Reakční pufr při štěpení může obsahovat Tris/HCl v koncentraci např. do 1,0 M. Koncentrace Tris/HCl je výhodně ·
- 14 « « ♦ * • · • · • · • «
0,8 Μ až 1,0 Μ.
Místo pufru obsahujícího arginin nebo Tris/HCl pufru je možné užít i jiný pufrovací systém.
Ve zvláště výhodném provedení vynálezu je pH štěpícího pufru 7,0 až 7,5, teplota při štěpení je 10 °C až 20 °C, koncentrace proteinu nepřesahuje 40 až 50 μ9/τη1, a přitom štěpící pufr obsahuje jakožto redukční činidlo 5mM DTT.
A nakonec, heterologní polypeptid, který byl vyštěpen z fúzního proteinu, je izolován způsobem, který je odborníkům znám (viz např. M.P. Deutscher, in: Methods in Enzymology: Guide to Protein Purification, Academie Press lne., (1990), 309-392).
Následující příklady slouží k ilustraci a předkládaného vynálezu, aniž by jakkoliv omezovaly jeho rozsah.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Exprese a in vitro štěpení Npro-hGH (humánní růstový hormon)
Fúzní proteiny jsou produkovány heterologní expresí v bakteriálním expresním systému Escherichia coli (vektor pl60TPl s hostitelem W3110). Všechny elementy pro konstrukci vektoru tohoto systému pocházejí z genomu E. coli.
pl60TPl je vektor odvozený z pBR322, ve kterém je exprese řízena modifikovaným E. coli trp promotorem s deletovaným atenuátorem. Sekvence Shine-Dalgarnova v atenuátorovém peptidu ze stejného operonu byla užita jako • · ··· ♦ * · «· ·· ··
- 15 vazebné místo ribozomů (RBS). Dvojitý terminátor T1T2 z genu E. coli rrnB zajiščuje, společně s terminátorem genu bia ponechaným v konstruktu, účinnou terminaci transkripce.
Expresní kazeta byla vložena do místa EcoRI v pBR322 v opačném směru (proti směru hodinových ručiček, tj . opačně orientovaná než je gen rezistence k tetracyklinu) . Gen pro β-laktamázu (bia) byl deletován společně s promotorem. Strukturní geny pro heterologní proteiny, které mají být exprimovány, jsou vloženy (obecně jako PCR fragmenty přiměřeně naštěpené) prostřednictvím štěpného místa Xbal v poloze 3506.
Expresní plazmid (NPH-pET) sloužil jako zdroj strukturního genu Npro-hGH. Plazmid obsahuje známý expresní vektor pETlla (F.W. Studier et al., Methods. Enzymol. 185 (1990), 60-89). Nejdříve byl fúzní protein sestávající z Npro a CSFV nukleokapsidového proteinu klonován do expresního vektoru. To umožnilo prvních 16 aminokyselin (aa) přírodní sekvence Npr0 (MELNHFELLYKTSKQK) nahradit 10 aa dlouhou oligo-histidinovou sekvencí (MASHHHHHHH) napomáhající purifikaci. Štěpné místo Spěl bylo vneseno do výsledného expresního plazmidu v místě spojení mezi Npro a nukleokapsidovým proteinem cílenou mutagenezí. To umožnilo deletovat strukturní gen pro nukleokapsidový protein z vektoru restrikcí Spěl (na 5'-konci) a Xhol (na 3'-konci). Odpovídající linearizovaný vektor NpropETlla byl oddělen od fragmentu nukleokapsidového genu preparativní gelovou elektroforézou. Pak bylo možné vložit strukturní gen hGh prostřednictvím lepivých konců Spěl a Xhol.
Byly potřebné následující přípravné práce. Strukturní gen byl amplifikován pomocí vysoce přesného systému PCR (například Pwo systém od firmy Roche Biochemicals, postup byl
proveden podle pokynů výrobce) z cDNA knihovny humánního mozku.
Pro tento účel byly použity následující oligonukleotidy:
Oligonukleotid 1 (N-koncový):
5'- ATAATTACTA GTTGTTTCCC AACCATTCCC TTATCCAGGC C -3'
Oligonukleotid 2 (C-koncový):
5'- ATAATTGGAT CCTCGAGTTA TTAGAAGCCA CAGCTGCCCT CCAC -3'
Pomocí těchto oligonukleotidů bylo vneseno štěpné místo Spěl na 5'-konec, a štěpné místo Xhol bylo vneseno na 3'-konec. Navíc byl na 3'-konec strukturního genu vložen dvojitý stop kodon ochre (TAATAA) kvůli účinné terminaci translace. Štěpné místo Spěl na předním konci dovoluje ligaci ve shodě se čtecím rámcem vektoru Npr°-pETlla popsaného výše. Štěpné místo Xhol na zadním konci umožňuje přímé klonování. Takto připravený plazmid byl nazván NPH-pET.
Tento plazmid NPH-pET byl, jak již bylo zmíněno, užit jako zdroj strukturního genu pro fúzní protein Npro-hGH. Pro tento účel byla užita vysoce přesná PCR s Pwo polymerázou, kdy templátem byl plazmid NPH-pET linearizovaný Xhol. Pro přípravu fragmentu vhodného pro klonování byly užity následující primery:
Přední konec (odpovídá N-konci proteinu) strukturního genu:
5'-AGGGTATCTA G&ATTCTATG CCAGTGGGAG TGGAGGAACC G-3'
Zadní konec (odpovídá C-konci proteinu) strukturního genu: 5'-AGAATTAAGC TTCTAGArrA TTAGAAGCCA. CAGCTGCCCT CCAC-3' i
- 17 »♦«» ι· «·
Štěpná místa Xbal (přední a zadní) použitá pro následné klonování jsou vyznačena podtržením, a start-kodon (ATG) a stop-kodon (TAATAA) jsou vyznačeny většími typy.
Tyto dva oligonukleotidy vedly k amplifikací strukturního genu s otevřeným čtecím rámcem (ORF) pro fúzní protein (FP), kde purifikační pomůcka His7 a předcházející aminokyseliny (s výjimkou methioninu nezbytného pro zahájené translace) byly zcela odstraněny.
Sekvence PCR fragmentu (1072 bp) , který obsahuje otevřený čtecí rámce pro fúzní protein Npro-hGH je uveden níže. Start-kodon a dva stop-kodony jsou vyznačeny tučně a štěpná místa Xbal užitá pro klonování jsou vyznačena podtržením.
5'-AGGGTATCTAGAATTCTATGCCAGTGGGAGTGGAGGAACCGGTGTATGACACCGCGGGGA
GACCACTATTTGGGAACCCAAGTGAGGTACACCCACAATCAACGCTGAAGCTGCCACACGACA
GGGGGAGAGGAGATATCAGAACAACACTGAGGGACCTACCCAGGAAAGGTGACTGTAGGAGTG
GCAACCATCTAGGCCCGGTTAGTGGGATATACATAAAGCCCGGCCCTGTCTACTATCAGGACT
ACACGGGCCCAGTCTATCACAGAGCTCCTTTAGAGTTCTTTGATGAGGCCCAGTTCTGCGAGG
TGACTAAGAGAATAGGCAGGGTCACGGGTAGTGATGGTAAGCTTTACCACATATATGTGTGCG
TCGATGGTTGCATACTGCTGAAATTAGCCAAAAGGGGCACACCCAGAACCCTAAAGTGGATTA
GGAACTTCACCAACTGTCCATTATGGGTAACTAGTTGTTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGC
CTTTTGACAACGCTATGCTCCGCGCCCATCGTCTGCACCAGCTGGCCTTTGACACCTACCAGG
AGTTTGAAGAAGCCTATATCCCAAAGGAACAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCT
CCCTCTGTTTCTCAGAGTCTATTCCGACACCCTCCAACAGGGAGGAAACACAACAGAAATCCA
ACCTAGAGCTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCGTGGCTGGAGCCCGTGCAGTTCC
TCAGGAGTGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTACGGCGCCTCTGACAGCAACGTCTATGACCTCC
TAAAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGGGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGGA
CTGGGCAGATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACAAACTCACACAACGATGACGCAC
TACTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAGACATTCC
TGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAATAATdAG&AGCTTAA ♦ · * ·
- 18 TTCT-3'
Tento ORF tedy kóduje fúzni protein znázorněný níže, kde proline v pozici 2 odpovídá prolinu v pozici 17 původního přírodního proteinu Npro. Sekvence fúzního proteinu Npro-hGH (344 aminokyselin, z toho 153 aminokyselin je Npro a 191 aminokyselin je hGH) je následující (čteno ve směru od N-konce k C-konci), kde prolin 17 (pozice 2 fúzního proteinu) z přírodní sekvence Npro je uveden kurzívou a sekvence hGH je vyznačena tučně:
MPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPV SGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYHIYVCVDGCILL KLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSCFPTIPLSRPFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYI PKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFAN SLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGL LYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGS CGF
Fúzni protein má Mr 39316,92 (D) v redukovaném stavu, a po případném rozštěpeni by část Npro (redukovaná) měla Mr 17220,02 (D) a část hGh (redukovaná) by měla 22114,88 (D) . Npr0 obsahuje šest cysteinů a hGh čtyři. Je pravděpodobné, že v bakteriální cytoplazmě jsou tyto cysteiny většinou v redukované formě. V průběhu dalšího opracování dochází pravděpodobně alespoň k částečnému vytvoření disulfidických můstků. Je třeba předpokládat, že N-koncový methionin ve fúzním proteinu (nebo části Npr0) je většinou štěpen methioninaminopeptidázou (MAP) vlastní hostiteli, což by redukovalo Mr přibližně o 131 (D) na 39186 (D) (FP) a 17089 (D) (Npro) .
PCR fragment s popsaným strukturním genem pro PP byl purifikován a naštěpen Xbal, a dva produkty štěpení byly odděleny od cílového fragmentu. Tento fragment byl pak ligován do expresního vektoru pl60TPl.
Vektor byl nejdříve linearizován štěpením Xbal a na 5'-konci defosforylován působením telecí intestinální fosfatázy (CIP) . Pro ligaci byla užita T4 DNA ligáza. Ligovaná DNA byla vnesena eletroporací do buněk Escherichia coli K-12 DH10B a buňky pak byly naneseny na plotny s LB (Luria broth) agarem obsahujícím 15 mg/1 tetracyklinu. Z této transformace vznikly četné kolonie. Plazmidová DNA byla izolována z několika klonů a byla vyšetřena restrikční analýzou na přítomnost inzertu správné velikosti a orientace. Jeden klon byl vybrán a byla provedena jeho podrobná analýza a charakterizace restrikčními enzymy a sekvencováním. Plazmid odpovídal všem předchozím výpočtům a analýzám. Tento plazmid byl nazván pNPHl a byl použit v další práci.
Sekvence Npro-hGH expresního plazmidu pNPHl (4840 bp) je uvedena níže. Start-kodon a stop-kodon fúzního proteinu Npro-hGH jsou podtrženy. Otevřený čtecí rámec probíhá v opačné orientaci než jak je znázorněno v této formě.
' -GAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTT AAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGG CACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCG GGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTT GATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCAGT CCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCACACCCGTCCT GTGGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGG CGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGC ·
- 20 • · ·
*99 •* 9999
TTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTT
GCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCT
AATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAG
CTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCAT
GCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCTCTGGGTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTG
GAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGC
CTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTATCGCCGGCATGGC
GGCCGACGCGCTGGGCTACGTCTTGCTGGCGTTCGCGACGCGAGGCTGGATGGCCTTCCCCAT
TATGATTCTTCTCGCTTCCGGCGGCATCGGGATGCCCGCGTTGCAGGCCATGCTGTCCAGGCA
GGTAGATGACGACCATCAGGGACAGCTTCAAGGATCGCTCGCGGCTCTTACCAGCCTAACTTC
GATCACTGGACCGCTGATCGTCACGGCGATTTATGCCGCCTCGGCGAGCACATGGAACGGGTT
GGCATGGATTGTAGGCGCCGCCCTATACCTTGTCTGCCTCCCCGCGTTGCGTCGCGGTGCATG
GAGCCGGGCCACCTCGACCTGAATGGAAGCCGGCGGCACCTCGCTAACGGATTCACCACTCCA
AGAATTGGAGCCAATCAATTCTTGCGGAGAACTGTGAATGCGCAAACCAACCCTTGGCAGAAC
ATATCCATCGCGTCCGCCATCTCCAGCAGCCGCACGCGGCGCATCTCGGGCAGCGTTGGGTCC
TGGCCACGGGTGCGCATGATCGTGCTCCTGTCGTTGAGGACCCGGCTAGGCTGGCGGGGTTGC
CTTACTGGTTAGCAGAATGAATCACCGATACGCGAGCGAACGTGAAGCGACTGCTGCTGCAAA
ACGTCTGCGACCTGAGCAACAACATGAATGGTCTTCGGTTTCCGTGTTTCGTAAAGTCTGGAA
ACGCGGAAGTCAGCGCCCTGCACCATTATGTTCCGGATCTGCATCGCAGGATGCTGCTGGCTA
CCCTGTGGAACACCTACATCTGTATTAACGAAGCGCTGGCATTGACCCTGAGTGATTTTTCTC
TGGTCCCGCCGCATCCATACCGCCAGTTGTTTACCCTCACAACGTTCCAGTAACCGGGCATGT
TCATCATCAGTAACCCGTATCGTGAGCATCCTCTCTCGTTTCATCGGTATCATTACCCCCATG
AACAGAAATTCCCCCTTACACGGAGGCATCAAGTGACCAAACAGGAAAAAACCGCCCTTAACA
TGGCCCGCTTTATCAGAAGCCAGACATTAACGCTTCTGGAGAAACTCAACGAGCTGGACGCGG
ATGAACAGGCAGACATCTGTGAATCGCTTCACGACCACGCTGATGAGCTTTACCGCAGCTGCC
TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAG
CTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCG
GGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTA
TGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATG
CGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTC
• « • β ♦ · · ♦· ·♦··
GGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGA
ATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAA
AAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCG
ACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGG
AAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCT
CCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGT
CGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATC
CGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCAC
TGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCC
TAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTT
CGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTT
TGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTC
TACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATC
AAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTAT
ATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCTCGAGGCCATCCGTCAGGATGGCCTTCTGCTTAA
TTTGATGCCTGGCAGTTTATGGCGGGCGTCCTGCCCGCCACCCTCCGGGCCGTTGCTTCGCAA
CGTTCAAATCCGCTCCCGGCGGATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGA
TAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTCTAGATTATTAGAAGCCAC
AGCTGCCCTCCACAGAGCGGCACTGCACGATGCGCAGGAATGTCTCGACCTTGTCCATGTCCT
TCCTGAAGCAGTAGAGCAGCCCGTAGTTCTTGAGTAGTGCGTCATCGTTGTGTGAGTTTGTGT
CGAACTTGCTGTAGGTCTGCTTGAAGATCTGCCCAGTCCGGGGGCTGCCATCTTCCAGCCTCC
CCATCAGCGTTTGGATGCCTTCCTCTAGGTCCTTTAGGAGGTCATAGACGTTGCTGTCAGAGG
CGCCGTACACCAGGCTGTTGGCGAAGACACTCCTGAGGAACTGCACGGGCTCCAGCCACGACT
GGATGAGCAGCAGGGAGATGCGGAGCAGCTCTAGGTTGGATTTCTGTTGTGTTTCCTCCCTGT
TGGAGGGTGTCGGAATAGACTCTGAGAAACAGAGGGAGGTCTGGGGGTTCTGCAGGAATGAAT
ACTTCTGTTCCTTTGGGATATAGGCTTCTTCAAACTCCTGGTAGGTGTCAAAGGCCAGCTGGT
GCAGACGATGGGCGCGGAGCATAGCGTTGTCAAAAGGCCTGGATAAGGGAATGGTTGGGAAAC
AACTAGTTACCCATAATGGACAGTTGGTGAAGTTCCTAATCCACTTTAGGGTTCTGGGTGTGC
CCCTTTTGGCTAATTTCAGCAGTATGCAACCATCGACGCACACATATATGTGGTAAAGCTTAC
CATCACTACCCGTGACCCTGCCTATTCTCTTAGTCACCTCGCAGAACTGGGCCTCATCAAAGA ·♦ ····
- 22 ACTCTAAAGGAGCTCTGTGATAGACTGGGCCCGTGTAGTCCTGATAGTAGACAGGGCCGGGCT
TTATGTATATCCCACTAACCGGGCCTAGATGGTTGCCACTCCTACAGTCACCTTTCCTGGGTA
GGTCCCTCAGTGTTGTTCTGATATCTCCTCTCCCCCTGTCGTGTGGCAGCTTCAGCGTTGATT
GTGGGTGTACCTCACTTGGGTTCCCAAATAGTGGTCTCCCCGCGGTGTCATACACCGGTTCCT
CCACTCCCACTGG£AIAGAATTCTAGATACCCTTTTTACGTGAACTTGCGTACTAGTTAACTA
GTTCGATGATTAATTGTCAACAGCTCATTTCAGAATATTTGCCAGAACCGTTATGATGTCGGC
GCAAAAAACATTATCCAGAACGGGAGTGCGCCTTGAGCGACACGAATTATGCAGTGATTTACG
ACCTGCACAGCCATACCACAGCTTCCGATTGGCTGCCTGACGCCAGAAGCATTGGTGCACCGT
GCAGTCGAGATGCGCGTCGGCACCCTGGCGATCACCGACCATGACACCACAGCAT-3'
Hostitelský kmen Escherichia coli pro expresi fúzního proteinu Npr0-hGH byl vybrán na základě zvážení produktivity a biologické bezpečnosti. Kmen Escherichia coli K-12 je nejlépe charakterizovaná linie druhu E. coli (viz B.J. Bachmann; in: J.L. Ingraham et al., (Ed.) Escherichia coli and Salmonella typhimurium-. cellular and molecular biology. American Society for Microbiology, Washington D.C. (1987a), pp. 1191-1219; B.J. Bachmann 1987b; Barbara J. (1987b) Linkage map of Escherichia coli K-12, edition 7. In: Escherichia coli and Salmonella typhimurium, Vol. 2. Ed.: F. C. Neidhard. Am. Soc. Microbiol., Washington DC (1987b), 807-876; K.F. Jensen, J. Bacteriol. 175 (1993), 3401-3407) a je obecně považována za bezpečnou.
Escherichia coli K-12 W3110 (ATCC 27325) je prototropní derivát silně příbuzný s divokým typem Escherichia coli K-12 a je často využíván jako hostitelský kmen pro expresi heterologních proteinů. Byl uložen v Americké sbírce mikroorganismů (American Type Culture Collection, ATCC) a má následujcí genotyp:
[F' mcrA mcrB IN(rrnD-rrnE) 1 lambda'] • «
- 23 Kmen byl zakoupen ze sbírky ATCC. Jeho růst byl vynikající na plně syntetickém médiu bez komplexního zdroje dusíku a účinné řízení růstového procesu při průmyslovém zpracování je proto možné.
Expresní kmen W3110 [pNPHl] byl připraven transformací již popsaného expresního plazmidu pNPHl do W3110. Transformace byla provedena elektroporací užitím 10% glycerolu jako média pro resuspendování. 50 ng (1 μΐ) roztoku pNPHl ve vodě bylo smícháno se 30 μΐ suspenze buněk W3110 a pak podrobeno pulzu 1800 V v 1 mm kyvetě (Eppendorf Electroporator 2510) . Buňky pak byly resuspendovány v médiu SOC, třepány 1 hodinu ve 37°C a pak vysety na plotny s LB (Luria broth) agarem a 15 mg/1 tetracyklinu. Z této transformace po inkubaci ve 37 °C (přes noc) vznikly četné klony.
Středně velké kolonie s odlišitelnými okraji byly odebrány a staly se základem pro expresní kmen W3110[pNPHl]. Klon byl kultivován a pak konzervován v kryoampulích v teplotě -80°C (hlavní buněčná banka, MCB, master cell bank). Pro běžnou denní práci byl kmen vždy nanesen na plotnu s LB agarem obsahujícím tetracyklin.
Kmen W3110[pNPHl] z jediné kolonie na agarové plotně byl použit pro inokulaci předkultury v LB médiu s tatracyklinem 15 mg/1 (200 ml v 1 1 kultivační láhvi s míchacími přepážkami). Předkultura byla třepána při 250 rpm ve 30 °C po dobu 14 hodin, kdy dosáhla OD600 přiblžně 1,0. lOml alikvot předkultury byl užit k inokulaci hlavní kultury (v 330 ml citrátového média v 1 1 kultivační láhvi s míchacími přepážkami)(3% inokulum). Hlavní kultura pak byla byla kultivována ve 37 0(250 rpm) až do dosažení OD600 0,8 , kdy byla indukována produkce fúzního
• 4 * « • · 4
4 • 4 4
4
4
4
4 4 proteinu přidáním 50 gg indolylakrylové kyseliny na 1 ml kultury (výsledná koncentrace, zásobná roztok byl 5 mg/ml ve 100 % ethanolu analytické čistoty). Kultury byly dále kultivovány 4 hodiny, ve 37 °C při 250 rpm dokud nebylo dosaženo OD600 1,5 až 3,0.
Kultury pak byly přeneseny do sterilních 500 ml centrifugačních lahví a centrifugovány 30 minut při 10,000 g. Supernatant po centrifugaci byl odstraněn a pelety byly zamraženy v -80 °C až do dalšího zpracování.
Přibližně 12 g (čerstvá hmotnost) peletu buněk BL12 1(DE3) bylo resuspendováno ve 30 ml 50 mM Tris/HCl, 5 mM benzamidinu, pH 8,0 a homogenizováno užitím mixéru Ultraturrax. Po přidání 0,5 mM EDTA a 0,1 % (hmot./obj.) lysozymu, byla buněčná suspenze inkubována 30 minut v ledové lázni. Následné ošetření ultrazvukem (7 x 20 sekund, s 20 přestávkami po 20 sekundách) vedlo k úplnému rozpadu buněk. Pak bylo k suspenzi přidáno 10 mM MgCl2 a 0,006 % (hmot./obj.) DNázy a suspenze se inkubovala ve 4 °C po 30 minut. Nerozpustné a rozpustné složky byly pak odděleny centrifugaci (JA 20; 7700g). Pelet byl suspendován ve 40 ml 50 mM Tris/HCl, 5 mM benzamidinu, 5 mM EDTA, pH 8,0 a znovu centrifugován (JA 20; 7700g). Tento krok byl opakován ještě dvakrát a vzniklý pelet byl suspendován ve 40 ml 2 0 mM Tris/HCl, pH 7,0. K suspenzi bylo přidáno 20 mL 1,5 M NaCl, 60 mM EDTA, pH 7,0 a suspenze se inkubovala 30 minut v ledové lázni. Nakonec byla provedena další centrifugace (JA 20; 7700g) a promytí vodou.
Vzniklý pelet představuje materiál inkluzních tělísek Npro-hGH (IB Npro-hGH) .
Po té následovalo rutinní resuspendování přibližně 100 mg IB materiálu ve 2 ml 6,0 M guanidinhydrochloridu, · 4 4 4 4
44 • 4 4 4
4 4
4 4
4 4
4444 • · · · · 4 4 • 4 4 9 9 9 ♦ · · 4 ♦ 4 4··
- 25 0,1 M Tris, 5 mM EDTA, 50 mM DTT, pH 9,0 po 30 minut při teplotě místnosti. Nerozpustné složky pak byly odstraněny centrifugací (10 minut/30000 g) . Stanovení proteinu se pak provedlo v získaném supernatantu (koncentrace proteinu přibližně 20 mg/ml). Solubilizát takto připravený byl buďto ihned použit k testům štěpení nebo byl uschován při teplotě -20°C (nejdéle po 7 dnů).
Příklad 2
Štěpení inkluzních tělísek fúzních proteinů v různých podmínkách
Odštěpení části Npr° bylo umožněno v principu naředěním solubilizátu 1:100 (nebo větším) ve štěpícím pufru (reziduální koncentrace guanidinhydrochloridu < 0,06 M) . Koncentrace proteinu byla rutinně 20 Mg/ml (případné výjimky jsou zvýrazněny).
Dále bylo možné dosáhnout štěpení části Npro dialýzou (1:100) solubilizovaného materiálu proti štěpícímu pufru.
Rozsah odštěpení Npro části může být určen detekcí produktů štěpení užitím SDS-PAGE. Po ukončení SDS-PAGE je gel fotografován a měří se intenzita příslušných pásů. Příslušné pásy se identifikují pomocí Western blotu v předběžných testech.
Příklad 2.1
In vitro štěpení Npro-hGH argininem
Štěpení probíhalo při ředění (1:100) solubilizátu ve « 9 • · • · • · ♦ · *··» »· ** * · · · ♦ ♦ · • · « « · · ·* ···· ·· ·»
9 9 9
9 ·
9 9
9 9
9999 štěpícím pufru (20 mM tris/HCl, 2 mM EDTA, 5 mM DTT, pH 7,0 a určitá koncentrace argininu) při teplotě místnosti. Koncentrace proteinu ve štěpné směsi byla 20 ^g/ml. Rozsah štěpení byl stanoven po 24 hodinách detekcí štěpných produktů užitím SDSPAGE.
Ukázalo se, že účinnost štěpení Npro může být významně zvýšena přídavkem argininu do štěpícího pufru. Maximum štěpení probíhalo při koncentraci argininu 0,4 až 0,6 M.
Příklad 2.2
Vyštěpení Npro z Npr0-hGH argininem při různých teplotách
Štěpení probíhalo při ředění (1:100) solubilizátu ve štěpícím pufru (20 mM Tris/HCl, 2 mM EDTA, 5 mM DTT, pH 7,0, 0 až 1,0 M arginin) vždy při dané teplotě. Koncentrace proteinu ve štěpné směsi byla 20 /xg/ml. Rozsah štěpeni byl stanoven po 24 hodinách detekcí štěpných produktů užitím SDS-PAGE.
Ukázalo se, že největší štěpení probíhalo při teplotách mezi 10 a 20 °C.
Příklad 2.3
Míra vyštěpení Npr0 z Npr0-hGH jako funkce' pH při různých teplotách
Štěpení probíhalo při ředění (1:100) solubilizátu ve štěpícím pufru (2 0 mM tris/HCl, 2 mM EDTA, 5 mM DTT, pH 7,0, 0,5M arginin) vždy při daném pH. Koncentrace proteinu ve štěpné směsi byla 20 /zg/ml. Rozsah štěpení byl stanoven po 24 hodinách detekcí štěpných produktů užitím SDS-PAGE.
pH štěpícího pufru se systematicky měnilo od 5,0 do 9,0. Ukázalo se, že při použité koncentraci argininu bylo optimum pH pro štěpení fúzního proteinu Npro-hGH 7,0 až 7,5.
«* »>·«
- 27 Příklad 2.4
Vyštěpení Npro z Npro-hGH při různých koncentracích DTT
V tomto pokuse se zkoumala závislost účinnosti štěpení na koncentraci DTT.
Štěpení probíhalo při ředění (1:100) solubilizátu ve štěpícím pufru (20 mM tris/HCl, 2 mM EDTA, , pH 7,0, 0,5M arginin, 0 až lOOmM DTT, 15 °C) . Vzhledem k přítomnosti DTT v solubilizátu i varianta 0 DTT obsahovala 0,5mM DTT. Koncentrace proteinu ve štěpné směsi byla 20 /zg/ml. Rozsah štěpení byl stanoven po 24 hodinách detekcí štěpných produktů užitím SDS-PAGE.
Maximálního štěpení bylo dosaženo při koncentraci 5,5M DTT.
Příklad 2.5
Vliv různého pH solubilizátu na štěpení Npro-hGH
Štěpení probíhalo při ředění (1:100) solubilizátu při různých pH (pH 6,0, pH 7,0, pH 8,0, pH 9,0) ve štěpícím pufru (20 mM tris/HCl, 2 mM EDTA, 5 mM DTT, pH 7,0, 0 až 0,8M arginin, 15 °C) . Hodnoty pH byly upraveny titrací solubilizačního pufru na požadované pH před smícháním s IB. Koncentrace proteinu ve štěpné směsi byla 20 ^g/ml. Rozsah štěpení byl stanoven po 24 hodinách detekcí štěpných produktů užitím SDS-PAGE.
Ukázalo se, že pH optimum solubilizátu je 7,0 až 8,0.
Příklad 2.6
Kinetika vyštěpení Npro z Npro-hGH
Reaktivace denaturovaného Npro-hGH byla zahájena naředěním (1:100) v 20 mM Tris/HCl, 0,5 M arginin, 2 mM EDTA, ** ···* 44 ·· • · 4 · > » · • · · e 4 · • · · ·4> 4 • 44 · 4 4 ·* · 44 4444
- 28 ·· 44 mM DTT, pH 7,0, při 15°C.
| Ukázalo 24 hodinách. | se, že | konce štěpení bylo | dosaženo po |
| Příklad 2.7 | |||
| Vyštěpení Npro | z Npro-hGH | ředěním při různých | koncentracích |
| proteinu | |||
| Štěpení | probíhalo | naředěním (1:100) solubilizátu ve | |
| štěpícím pufru | (20 mM Tris/HCl, 0,5M arginin, 2 | mM EDTA, 5 mM |
DTT, pH 7,0, 15 °C) . Kontrola štěpení byla provedena po 24 hodinách detekcí štěpných produktů užitím SDS-PAGE.
Ukázalo se, že koncentrace protein vyšší > 40 gg/ml vedla k významnému snížení účinnosti štěpení. Další testy ukázaly, že optimální koncentrace proteinu je 20-40 gg/ml.
Příklad 2.8
Vyštěpení Npro z Npro-hGH dialýzou v závislosti na koncentraci proteinu
Ze solubilizovaného Npro-hGH IB materiálu byl odstraněn guanidinhydrochlorid dialýzou (1:100) proti pufru (20 mM Tris/HCl, 0,5M arginin, 2 mM EDTA, 5 mM DTT, pH 7,0, 4 °C) a tím bylo zahájeno štěpení. Po 24 hodinách bylo detekcí štěpných produktů užitím SDS-PAGE stanoveno, zda došlo ke štěpení.
Ukázalo se, že odštěpení části Npro lze dosáhnout nejen naředěním, ale také dialýzou solubilizovaného materiálu.
• ·
Příklad 2.9
Účinnost vyštěpení Npro z Npro-hGH v závislosti na koncentraci Tris/HCl
Štěpení probíhalo ředěním (1:100) solubilizátu ve štěpícím pufru (2 mM EDTA, 20 mM DTT, pH 7,0, 0,1 až 1,0 M Tris/HCl, 15 °C) . Kontrola štěpení byla provedena po 24 hodinách detekcí produktů pomocí SDS-PAGE.
Ukázalo se, že zvyšující se koncentrace Tris/HCl v pufru až do 0,8 M zlepšovala výtěžek štěpení Npro z fúzního proteinu. Zvýšeni nad tuto hodnotu nevedlo k žádnému měřitelnému zlepšení Npro štěpeni.
Je proto výhodné, aby reakce probíhala při koncentraci Tris/HCl 0,8-1,0 M.
Příklad 3
Exprese a in vitro štěpení Npro-pGH (prasečí růstový hormon)
Příprava expresního vektoru Npro-pGH začala od pNPHl (viz Přiklad 1) . Plazmid byl linearizován BglIÍ a amplifikován pomocí PCR. Tím bylo možné amplifikovat celý plazmid kromě úseku strukturního genu hGH (od kodonu pro Phel ke kodonu pro Phel91) užitím Pwo polymerázy a oligonukleotidových primerů bez 5'-fosfátu. Purifikovaný PCR fragment byl užit jako vektor pro ligaci se strukturním genem pGH. Odstranění 5'-fosfátu (například užitím telecí intestinální fosfatázy nebo alkalické fosfatázy arktických garnátů) zabraňuje cirkularizaci self-ligací.
Strukturní gen pGH byl podobně připraven PCR • ·
- 30 amplifikací. Jako templát byla použita cDNA knihovna prasete (např. 5'-stretch cDNA knihovna z prasečích jater od firmy Clontech nebo cDNA knihovna z prasečího mozku nebo štítné žlázy). Pro amplifkaci byly užity následující primery, které byly v průběhu syntézy opatřeny 5'-fosfátovou skupinou:
Přední konec (odpovídající N-konci proteinu) strukturního genu (Phel až Ser7):
5'- TTC CCA GCC ATG CCC TTG TCC -3'
Zadní konec (odpovídající C-konci proteinu) strukturního genu (Phel90 to Vall84):
5'- GAA GGC ACA GCT GCT CTC CAC -3'
PCR fragment obsahuje pouze ORF (strukturní gen) zralého pGH. Ligací (užitím T4 DNA ligázy) se vytvořil ORF pro Npro-pGH analogický výše popsanému pNPHl. Fúzní protein dále popsaný je kódován tímto ORF. Ligovaná DNA byla vložena elektroporací do buněk Escherichia coli K-12 DH10B (elektrokompetentní buňky od firmy Life Technologies, genotyp Escherichia coli K-12 F~ mcrA Δ (mrr-hsdRMS-mcrBC) <(>801acZÁM15 Á2acX74 deoR recAl endAl araD139 Á(ara, leu)7697 galU galK λ- rpsL nupG) , které byly vysety na LB agarové plotny s 15 mg/1 tetracyklinu. Tato transformace poskytla mnoho klonálních kolonií. Z několika klonů byla izolována plazmidová DNA a vyšetřena restrikční analýzou na přítomnost inzertu správné velikosti a orientace. Jeden klon byl vybrán a podrobně charakterizován restrikční analýzou a sekvencováním DNA. Plazmid odpovídal očekávání. Byl označen pNPPl a použit pro další práci.
V následující aminokyselinové sekvenci (čtena ve směru • · · · • · <9 · • · · · · · · · · « · * * · · · · · f · « · · ·«· · · · I · • · · * · · ··· • · · · · · · · · · · · · ·
- 31 od N-konce k C-konci) fúzního proteinu Npro-pGH (celkem 342 aminokyselin, z toho 153 aminokyselin odpovídá Npro a 189 aminokyselin odpovídá pGH) je prolin 17 (poloha 2 ve fúzním proteinu) z přírodní sekvence Npro vyznačen kurzívou a sekvence pGH je vyznačena tučně.
MPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPV SGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYHIYVCVDGCILL KLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSCFPAMPLSSLFANAVLRAQHLHQLAADTYKEFERAYI PEGQRYSIQNAQAAFCFSETIPAPTGKDEAQQRSVELLRFSLLLIQSWLGPVQFLSRVFTNSL VFGTSDRVYEKLKDLEEGIQALMRELEDGSPRAGQILKQTYDKFDTNLRSDDALLKNYGLLSC
FKKDLHKAETYLRVMKCRRFVESSCAF
FP v redukovaném stavu má Mr 38819,82 (D) , a po případném rozštěpení by část Npro (redukovaná) měla Mr 17220,02 (D) a část pGh (redukovaná) by měla 21617,79 (D) . Npro obsahuje šest cysteinů a pGh čtyři. Je pravděpodobné, že v bakteriální cytoplazmě jsou tyto cysteiny většinou v redukované formě.
V průběhu dalšího opracování dochází pravděpodobně alespoň k částečnému vytvoření disulfidických můstků. Je třeba předpokládat, že N-koncový methionin ve fúzním proteinu (nebo části Npr0) je většinou štěpen methioninaminopeptidázou (MAP) vlastní hostiteli, což by redukovalo Mr přibližně o 131 (D) na 38689 (D) (FP) a 17089 (D) (Npro) .
Expresní kmen W3110 [pNPPl] byl připraven jak bylo popsáno v Příkladu 1 transformací (elektroporací) expresního plazmidu pNPPl do Escherichia coli K-12 W3110. Ani v tomto případě detailní charakterizace neodhalila žádné odchylky od očekávaného restrikčního profilu.
• 9 · 9 · • · • 9 ·· 99
Středně velká kolonie s odlišitelnými okraji byla odebrána a stala se základem pro expresní kmen W3110[pNPHl]. Klon byl kultivován a pak konzervován v kryoampulích v teplotě -80°C (hlavní buněčná banka, MCB, master cell bank). Pro běžnou denní práci byl kmen vždy nanesen na plotnu s LB agarem obsahujícím tetracyklin.
Exprese fúzního proteinu Npro-pGH probíhala stejně jak bylo popsáno v Příkladu 1 pro fúzní protein Npro-hGH.
Příprava Npro-pGH IB se prováděla stejně jak bylo popsáno v Příkladu 1 pro fúzní protein Npr°-hGH.
Příklad 4
In-vitro vyštěpení Npro z Npro-pGH
Solubilizační a renaturační testy odpovídající testům popsaným výše pro Npro-hGH byly provedeny také pro fúzní protein Npro-pGH. Po variaci různých parametrů (jak bylo výše popsáno) bylo zjištěno, že in-vitro odštěpení části Npro z fúzního proteinu Npro-pGH bylo i v tomto případě možné po solubilizaci a renaturaci.
Claims (7)
- PATENTOVÉNÁROKY1. Způsob rekombinantní produkce heterologního polypeptidu vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy (I) kultivují se buňky bakteriálního hostitelského kmene, který je transformován expresním vektorem obsahujícím molekulu nukleové kyseliny, která kóduje fúzní protein, který obsahuje první polypeptid, který má autoproteolytickou funkci autoproteázy Npro z pestiviru, a druhý polypeptid, který je navázán na první polypeptid na C-konci prvního polypeptidu takovým způsobem, že druhý polypeptid může být odštěpen z fúzního proteinu autoproteolytickou aktivitou prvního polypeptidu, přičemž druhý polypeptid je heterologní polypeptid, a kultivace probíhá v takových podmínkách, které vedou k expresi fúzního proteinu a vytvoření odpovídajících cytoplazmatických inkluzních tělísek, (II) izolují se inkluzní tělíska z hostitelských buněk, (III) solubilizují se izolovaná inkluzní tělíska, (IV) solubilizát se naředí, čímž vznikne reakční roztok, ve kterém dojde k autoproteolytickému vyštěpení heterologního polypeptidu z fúzního proteinu, a (V) izoluje se vyštěpený heterologní polypeptid.
- 2. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že pestivirus je vybrán ze skupiny obsahující CSFV, BDV a BVDV.
- 3. Způsob podle nároku 2 vyznačující • · · · · * φ · · · · • φ · · · « · · · ·· * φφ φφφφ φ» φφφφ- 34 tím, že pestivirus je CSFV.
- 4. Způsob podle nároku 3 vyznačující se tím, že první polypeptid obsahuje následující aminokyselinovou sekvenci:(1)-MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTT LRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVT GSDGKLYHIYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC-(168), nebo její derivát s autoproteolytickou aktivitou.
- 5. Způsob podle nároku 3 vyznačující se tím, že první polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci od Glu22 do Cysl68 z autoproteázy Npro z CSFV nebo její derivát s autoproteolytickou aktivitou, přičemž první polypeptid má Met jako N-konec, a heterologní polypeptid je přímo navázán na aminokyselinu Cysl68 autoproteázy Npro z CSFV.
- 6. Způsob podle nároku vyznačující se tím, že první polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci od Prol7 do Cysl68 z autoproteázy Npro z CSFV nebo její derivát s autoproteolytickou aktivitou, přičemž první polypeptid má Met jako N-konec, a heterologní polypeptid je přímo navázán na aminokyselinu Cysl68 autoproteázy Npro z CSFV.
- 7. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 vyznačující se tím, že molekula nukleové
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AT136799 | 1999-08-09 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2002481A3 true CZ2002481A3 (cs) | 2002-05-15 |
| CZ302366B6 CZ302366B6 (cs) | 2011-04-13 |
Family
ID=3512357
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20020481A CZ302366B6 (cs) | 1999-08-09 | 2000-08-07 | Zpusob rekombinantní produkce heterologního polypeptidu pomocí peptidu s autoproteolytickou aktivitou |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6936455B1 (cs) |
| EP (1) | EP1200604B1 (cs) |
| JP (1) | JP4820512B2 (cs) |
| KR (1) | KR20020026366A (cs) |
| CN (1) | CN1230543C (cs) |
| AT (1) | ATE335826T1 (cs) |
| AU (1) | AU775662B2 (cs) |
| CA (1) | CA2379571C (cs) |
| CZ (1) | CZ302366B6 (cs) |
| DE (1) | DE60029968T2 (cs) |
| ES (1) | ES2269173T3 (cs) |
| HK (1) | HK1047128B (cs) |
| HU (1) | HU230231B1 (cs) |
| IL (1) | IL147456A0 (cs) |
| MX (1) | MXPA02001424A (cs) |
| NO (1) | NO328339B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ516869A (cs) |
| PL (1) | PL200225B1 (cs) |
| SK (1) | SK287488B6 (cs) |
| TR (1) | TR200200253T2 (cs) |
| WO (1) | WO2001011057A1 (cs) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TR200200048T2 (tr) * | 1999-08-09 | 2002-04-22 | Biochemie Gesellschaft M.B.H. | Otoproteolitik klevaj vasıtasıyla proteinlerin üretimi. |
| ES2388052T3 (es) | 2004-03-30 | 2012-10-08 | Relypsa, Inc. | Polímeros de unión a potasio para su uso en un procedimiento terapéutico o profiláctico para el tratamiento de la hipercalemia |
| GB0508434D0 (en) * | 2005-04-26 | 2005-06-01 | Sandoz Ag | Organic compounds |
| GB0508435D0 (en) * | 2005-04-26 | 2005-06-01 | Sandoz Ag | Organic compounds |
| AU2006239721B2 (en) * | 2005-04-26 | 2011-07-14 | Boehringer Ingelheim Rcv Gmbh & Co Kg | Production of recombinant proteins by autoproteolytic cleavage of a fusion protein |
| AU2011253661B2 (en) * | 2005-04-26 | 2013-06-13 | Boehringer Ingelheim Rcv Gmbh & Co Kg | Production of recombinant proteins by autoproteolytic cleavage of a fusion protein |
| WO2012029529A1 (ja) | 2010-08-31 | 2012-03-08 | 天野エンザイム株式会社 | 酵素を用いた卵殻膜の可溶化方法 |
| EP2684951A1 (en) | 2012-07-13 | 2014-01-15 | Sandoz Ag | Method for producing a recombinant protein of interest |
| EP2746391A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Sandoz Ag | Method for producing a recombinant protein of interest |
| EP2746390A1 (en) | 2012-12-19 | 2014-06-25 | Sandoz Ag | Method for producing a recombinant protein of interest |
| UY35874A (es) | 2013-12-12 | 2015-07-31 | Novartis Ag | Un proceso para la preparación de una composición de proteínas pegiladas |
| RU2619217C1 (ru) * | 2015-12-04 | 2017-05-12 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГБУ "ГосНИИгенетика") | Температурочувствительный мутантный интеин для нерастворимой экспрессии предшественника целевого белка |
| CN114539425B (zh) * | 2022-02-25 | 2023-04-28 | 湖南中晟全肽生化有限公司 | 一种提高线性多肽生物表达的方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4743679A (en) * | 1986-02-24 | 1988-05-10 | Creative Biomolecules, Inc. | Process for producing human epidermal growth factor and analogs thereof |
| ES2059482T3 (es) | 1987-12-23 | 1994-11-16 | Boehringer Ingelheim Int | Expresion de la proteasa p2a de hrv2 codificada por virus. |
| DK0977873T3 (da) * | 1997-04-25 | 2007-02-05 | Sembiosys Genetics Inc | Fremgangsmåde til spaltning af fusionsproteiner |
| AU9260598A (en) * | 1997-08-22 | 1999-03-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | Zymogenic protease precursors that can be autocatalytically activated and their use |
| AU9341398A (en) | 1997-08-22 | 1999-03-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | Protease precursors that can be autocatalytically activated and their use |
-
2000
- 2000-08-07 TR TR2002/00253T patent/TR200200253T2/xx unknown
- 2000-08-07 WO PCT/EP2000/007643 patent/WO2001011057A1/en active IP Right Grant
- 2000-08-07 NZ NZ516869A patent/NZ516869A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-08-07 US US10/048,882 patent/US6936455B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-07 MX MXPA02001424A patent/MXPA02001424A/es unknown
- 2000-08-07 DE DE60029968T patent/DE60029968T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-07 IL IL14745600A patent/IL147456A0/xx unknown
- 2000-08-07 KR KR1020027001666A patent/KR20020026366A/ko not_active Application Discontinuation
- 2000-08-07 ES ES00958389T patent/ES2269173T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-07 CN CNB008114595A patent/CN1230543C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-07 CZ CZ20020481A patent/CZ302366B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-08-07 AU AU69933/00A patent/AU775662B2/en not_active Expired
- 2000-08-07 EP EP00958389A patent/EP1200604B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-07 HU HU0202519A patent/HU230231B1/hu unknown
- 2000-08-07 PL PL353101A patent/PL200225B1/pl unknown
- 2000-08-07 AT AT00958389T patent/ATE335826T1/de active
- 2000-08-07 JP JP2001515842A patent/JP4820512B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2000-08-07 SK SK185-2002A patent/SK287488B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-08-07 CA CA2379571A patent/CA2379571C/en not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-02-08 NO NO20020633A patent/NO328339B1/no not_active IP Right Cessation
- 2002-09-25 HK HK02107014.5A patent/HK1047128B/zh not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-04-05 US US11/099,302 patent/US20050186564A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20050186564A1 (en) | Production of proteins | |
| JP2521413B2 (ja) | シグナル配列をコ―ドしているｄｎａと直接結合しているヒト成長ホルモンをコ―ドしているｄｎａ | |
| JP5909172B2 (ja) | 融合タンパク質の自己タンパク質分解切断による組換えタンパク質の産生 | |
| EP1200603B1 (en) | Production of proteins by autoproteolytic cleavage | |
| EP0422049A4 (en) | Vector for secretion of proteins directly into periplasm or culture medium | |
| US20070099283A1 (en) | Recombinant proteinase k | |
| KR100714116B1 (ko) | 췌장의 프로카복시펩티다제 ｂ를 사용한 인슐린의 제조 | |
| WO2012098009A1 (en) | Chimeric polypeptide comprising a membrane protein and an insulin precursor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20200807 |