CZ302366B6

CZ302366B6 - Zpusob rekombinantní produkce heterologního polypeptidu pomocí peptidu s autoproteolytickou aktivitou

Info

Publication number: CZ302366B6
Application number: CZ20020481A
Authority: CZ
Inventors: Stempfer@Günter; Windisch@Jörg; Knauseder@Franz
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1999-08-09
Filing date: 2000-08-07
Publication date: 2011-04-13
Also published as: CA2379571C; SK287488B6; PL353101A1; WO2001011057A1; NO20020633L; EP1200604B1; HUP0202519A2; MXPA02001424A; PL200225B1; SK1852002A3; NZ516869A; NO20020633D0; DE60029968T2; TR200200253T2; US20050186564A1; HK1047128A1; KR20020026366A; HU230231B1; JP4820512B2; ATE335826T1

Abstract

Rešení se týká zpusobu rekombinantní produkce požadovaného s jasne definovaným homogenním N-koncem v bakteiálním hostiteli, kdy fúzní protein obsahující peptid s autoproteolytickou aktivitou autoproteázy N.sup.pro .n.z pestiviru a heterologní polypeptid vytvárí cytoplazmatická inkluzní telíska v hostitelských bunkách, tato inkluzivní telíska jsou pak izolována a ošetrena tak, aby se požadovaný heterologní polypeptid vyštepil z fúzního proteinu autoproteolyticky pusobením N.sup.pro .n.aktivity.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu rekombinantní výroby požadovaného heterologního polypeptidu s jasně definovaným homogenním N-koncem v bakteriální hostitelské buňce, přičemž nejdříve exprimovaný fuzní protein, který obsahuje peptid mající autoproteolytickou aktivitu io autoproteázy N^pro pestiviru a heterologní polypeptid, se tvoří ve formě inkluzních tělísek v cyzoplazmě, tato inkluzní tělíska se pak izolují a ošetří tak, že požadovaný polypeptid je vyštěpen z fúzního proteinu působením autoproteolytické aktivity N^pr0.

i 5 Dosavadní stav techniky

Při přípravě rekombinantních proteinů v heterologních organismech jako např. při expresi humánní nebo jiných eukaryotických proteinů v bakteriálních buňkách je často obtížné získat jasně definovaná N-konec, který by byl pokud možno 100% homogenní, až se týká především rekombinantních farmaceutických proteinů, jejichž aminokyselinovou sekvencí proteinů přirozeně se vyskytujících u člověka/zvířat.

Při normální, přirozené expresi, např. u člověka, mnohé farmaceutické proteiny, které se užívají, jsou transportovány do extracelulámího prostoru, přičemž štěpení signální sekvence přítomné v prekurzorovém proteinu právě pro tento účel vede ke vzniku jasně definovaného N-konce. Takový homogenní N-konec není vždy snadné připravit, např. při expresi v bakteriálních buňkách, a až z několika důvodů.

K produkci v průmyslovém měřítku jsou mnohé farmaceutické proteiny produkovány v cytoplaz30 mě bakteriálních buněk (např. Escherichia coli}, jelikož je zde možné dosáhnout akumulace v požadovaném množství, a kromě toho se často tvoří nerozpustná inkluzní tělíska (IB), která jsou velmi výhodná pro další zpracování a purifikaci. Navíc protein exprimovaný ve formě 1B je chráněn intracelulámími proteázami proti degradaci proteázami (R. Rudolph, in: Protein Engineering: Principies and Practices. Eds. Jeffrey L., Cleland and Charles S. Craik, Joh Wiley &

Sons lne., (1995), ISBN 0-471-10354-3).

Avšak produkce materiálu ve formě IB vyžaduje in vitro nové svinutí („refolding“) exprimovaného proteinu. To lze provést vmnoha případech metodami, které jsou odborníkům známy (R. Rudolph et aL, (1996), in: Protein Function: A Practical Approach, Ed.: Creighton, T.E., 140 39). Při těchto postupech se protein ve formě IB solubilizuje přidáním silného denaturačního činidla v redukujících podmínkách a pak se renaturuje.

Jen ve výjimečných případech je možný export do bakteriálního periplazmatického prostoru pomocí eukaryotické nebo prokaryotické signální sekvence, protože se zde může akumulovat jen velmi malé množství produktu z důvodu nízké transportní kapacity bakteriálního exportního mechanismu.

Bakteriální cytoplazma se výrazně liší od extracelulámího prostoru eukaryot. Na jedné straně jsou zde redukující podmínky, na druhé straně zde není žádný mechanismus pro odštěpení N50 koncové vedoucí („leader“) sekvence z maturovaného (zralého) proteinu. Syntéza všech cytoplazmatických proteinů začíná methioninem, který je kódován příslušným iniciačním (startovním) kodonem (ATG = iniciace translace). Tento N-koncový methionin je u mnoha proteinů zachován, zatímco u jiných je odštěpen methioninaminopeptidázou (MAP), která je přítomna v cytoplazmě a je vlastní hostiteli.

-1 CZ 302366 B6

Účinnost štěpení závisí v podstatě na dvou parametrech:

1. povaha následující aminokyseliny a

2. Lokalizace N-konce v trojrozměrné struktuře proteinu

S

N-koncový methionin je přednostně odstraněn, když následující aminokyselinou je serin, alanín, glycin, methionin nebo valin a když N-konec je exponován, tzn. Když není „ukryt“ uvnitř proteinu. Na druhé straně, když je následující aminokyselina jiná, především nabitá aminokyselina (kyselina glutamová, kyselina asparagová, lysin, arginin), nebo když je N-konec lokalizován io uvnitř proteinu, ve většině případů k odštěpení Nkoncového methioninu nedojde (Knippers,

Rolf (1995) Molekulare Genetik, 6th editíon, Georg ThiemeVerlag, Stuttgart, New York. ISBN

3-13-103916-7).

Dokonce i když aminokyselina podporující štěpení je přítomna v poloze 2, štěpení je zřídkakdy 15 úplné. Obvykle významné množství (1 až 50 %) zůstane neovlivněno MAP.

V minulosti produkce rekombínantních farmaceutických proteinů v bakteriálních buňkách se jednoduše vkládal methionin-kódující ATG startovní kodon před otevřený čtecí rámec (ORF) pro maturovaný protein (tj. bez signální sekvence nebo jiných extenzí N-konce). Exprimovaný pro20 tein pak měl sekvenci „FLN-Met-cílový protein“. Pouze v několika případech bylo možné dosáhnout úplného odštěpené N-koncového methioninu MAP hostitele. Většina proteinů připravovaných tímto způsobem byla tudíž buďto nehomogenní na svém N-konci (jednalo se o směs Met-formy a formy bez Met), nebo měly všechny molekuly dodatečnou cizorodou aminokyselinu (Met) na svém N-konci (pouze Met-forma).

Tato nehomogenita nebo odchylka od přírodní sekvence je vsak v mnoha případech nepřijatelná, neboť takové produkty často vykazují odlišné imunologické (např. indukce protilátek) a farmakologické vlastnosti (biologický poločas, farmakok i netiká). Z těchto důvodů je nyní nutné produkovat většinu přírodně identické produkty (homogenní a bez cizorodé aminokyseliny na N—konci).

3<i V případě cytoplazmatické exprese je nápravou zpravidla fúze štěpné sekvence („leader“ sekvence) pro specifickou endopeptidázu (např. Faktor Xa, enterokináza, KEX endopeptídázy, IgA proteáza) nebo aminopeptidázu (např. dipeptidylaminopeptidáza) na N-konec cílového proteinu. Avšak až představuje další krok a vynaložení dalších nákladů a materiálu při následném (tzv. downstream) zpracování produktu. Navíc v přítomnost 1B v mnoha případech vedoucí sekvence narušuje a někdy zcela zabraňuje svinutí proteinu.

Takže existuje stálá potřeba nových způsobů přípravy požadovaného heterologního cílového proteinu, který je exprimován v bakteriálních buňkách ve formě inkluzních tělísek, ze kterých pak může být připraven cílový protein s požadovaným uniformním N-koncem. Takový způsob přípravy požadovaného cílového proteinu z inkluzních tělísek užitím virové autoproteázy N^pniz pestiviru je předmětem předkládaného vynálezu.

Pešti viry tvoří skupinu patogenů, které způsobují značné ekonomické ztráty v chovech prasat a přežvýkavců po celém světě. Zvláště významným patogenem je klasický virus horečky prasat (CSFV, „Clasical swine fever virus“), který způsobuje přenosné onemocnění a podléhá tudíž ohlašovací povinnosti. Ztráty způsobené virem průjmu hovězího dobytka (BVDV, „bovine viral diarrhoea virus“) jsou také značné, zejména z důvodu pravidelného výskytu intrauterinní infekce plodů.

Pestiviry jsou malé obalové viry, jejichž genom velikosti 12,3 kb působí přímo jako mRNA, ze které jsou v cytoplazmě transkribovány virové produkty. K tomu dochází ve formě jediného polyproteinu, který obsahuje přibližně 4000 aminokyselin a který je naštěpen virovým a buněčnými proteázami na 12 zralých proteinů.

Do nynějška byly identifikovány dvě virově kódované proteázy u pestivirů. a sice autoproteáza N^pro a serinová proteáza NS3. N-koncová proteáza N^pro je lokalizována na N-konci polyproteinu a má zjevnou molekulovou hmotnost 2300 (D). Katalyzuje štěpení, ke kterému dochází mezí jejím vlastním C-koncem (Cys 168) a N-koncem (Ser 169) nukleokapsidového proteinu C (R. Stark et al., J. Virol. 67 (1993), 7088-7095). Navíc duplikace genu N^pr*’ byly popsány u cytopatogenních virů BVDV. V nich je druhá kopie N^pro na N-konci podobně duplikované NS3 proteázy. Autoproteolytické štěpení proteinu N^pro-NS3 bylo pozorováno i v tomto případě (R. Stark et al., viz výše).

N^prc je autoproteáza délky 168 aminokyselin a zjevnou M_r 2000 (Dalton, D), (in vivo). Je prvním proteinem v polyproteinu pestivirů (CSFV, BVDV nebo VDV („border disease virus“·)) a podléhá autoproteolytickému odštěpení do následujícího nukleokapsidového proteinu C (M. Wiskerchen et al., J. Virol. 65 (1991), 4508-4514; Stark et al., J. Virol. 67 (1993), 7088-7095). Toto štěpení se uskutečňuje za poslední aminokyselinou sekvence N^pro, tj. Cys 168.

Podstata vynálezu

Nyní bylo překvapivě zjištěno, že autoproteolytická funkce autoproteázy N^pro může být využita k vyštěpení heterologního polypeptidu z ťúzního proteinu, který byl exprimován ve tormě inkluzních tělísek v bakteriálním expresním systému a který obsahuje autoproteázu N^pro z pestivirů a heterologní polypeptid. Takže neštěpený N^pro fúzní protein je izolován zinkluzních tělísek, solubilizován a pak štěpen v průběhu „znovusvinutí“ („refolding“).

Jeden aspekt předkládaného vynálezu se týká způsobu rekombinantní produkce heterologního polypeptidu, který obsahuje kroky, kdy (I) kultivují se bakteriální hostitelské buňky, které jsou transformované expresním vektorem obsahujícím molekulu nukleové kyseliny, která kóduje fúzní protein, přičemž fúzní protein obsahuje první polypeptid, který má auto proteolytickou funkci autoproteázy N^pro z pestivirů, a druhý polypeptid, který je navázán na první polypeptid na C-konci prvního polypeptidu takovým způsobem, že druhý polypeptid může být vyštěpen z fúzního proteinu autoproteolytickou aktivitou prvního polypeptidu, a druhý polypeptid je heterologní polypeptid, přičemž kultivace probíhá za podmínek, které vedou k expresi fúzního proteinu a k vytváření odpovídajících cytoplazmatických inkluzních tělísek, (II) izolují se inkluzní tělíska z hostitelských buněk, (III) izolované inkluzní tělíska se solubilizují, (IV) solubilizát se naředí tak, aby vznikl reakční roztok, ve kterém proběhne autoproteolytické vyštěpení heterologního polypeptidu z fúzního proteinu a (V) izoluje se vyštěpený heterologní polypeptid.

Polypeptid s autoproteolytickou funkcí autoproteázy N^pro pestivirů je především autoproteáza N^propestivirů, nebo její derivát s autoproteolytickou aktivitou.

V popisu předkládaného vynálezu termín „heterologní polypeptid“ znamená polypeptid, který není v přírodě odštěpován autoproteázou N^pro pestivirů z přírodně se vyskytujícího fúzního proteinu nebo polyproteinu. K příkladům heterologních póly peptidů patří průmyslové enzymy nebo póly peptidy s farmaceutickou aktivitou, především farmaceutickou aktivitou u člověka.

K příkladům výhodných póly peptidů s humánní farmaceutickou aktivitou patří cytokiny jako jsou interleukiny, např. IL-6, interferony jako jsou leukocytární interferony, např. interferon

-3 CZ 302366 B6 α2Β, růstové faktory, především růstové faktory účastnící se hematopoezy hojení poranění, jakou jsou např. G-CSF, erythropoetin nebo IGF, hormony jako je např. humánní růstový hormon (hGH), protilátky anebo vakcíny.

Ve způsobu podle vynálezu je pestivirus výhodně vybrán ze skupiny obsahující CSFV, BDV a BVDV, zvláště výhodně je pestivirus CSFV.

Výhodný způsob podle předkládaného vynálezu je takový, kdy první polypeptid fúzního proteinu obsahuje následující aminokyselinovou sekvenci autoproteázy N^prH z CSFV (viz také sekvence io s přístupovým číslem X87939 v databázi EMBL) (aminokyseliny 1 až 168, čteno ve směru od Nkonce do Ckonce) {1) -MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTT LRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVT GSDGKLYHIYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC- (168) , nebo aminokyselinovou sekvenci jejího derivátu, který má autoproteolytickou aktivitu.

Polypeptidy s autoproteolytickou aktivitou autoproteázy N^pro pestiviru mohou být deriváty autoproteázy N^pro pestiviru, získané z autoproteázy N^pru pestiviru mutagenezí, zejména užitím substitucí, delecí, adicí a/nebo inzercí aminokyselin, pokud je uchována požadovaná autoproteolytické aktivita, především pro vytváření požadovaných heterologních polypeptídů s homogenním Nkoncem. Způsoby přípravy takových derivátů mutagenezí jsou odborníkům známy. Takovými mutacemi je možné optimalizovat aktivitu autoproteázy N^pro vzhledem k různým heterologním proteinům které mají být vyštěpeny z fúzního proteinu. Po přípravě nukleové kyseliny, která kóduje fúzní protein, který kromě požadovaného heterologního proteinu obsahuje derivát auto25 proteázy N^pro vykazující jednu nebo více mutací vzhledem k přírodě se vyskytující autoproteáze

N^prt\ se určí, zdaje požadovaná funkce přítomna stanovením autoproteolytické aktivity.

Autoproteolytická aktivita může být např. detekována nejdříve solubilizací izotovaných/purifikovaných IB v roztoku 7M guandin/HCI a pak naředěním 1:100 v reakčním pufru. Po inkubaci m 24 hodin se reakční roztok vyšetří SDS-PAGE, zda došlo ke štěpení. Pro identifikaci podílu naštěpených a nenaštěpených molekul se provede western přenos (Western blot). Podíl naštěpeného materiálu se stanoví denzitometrickou analýzou SDS-PAGE gelů obarvených Coomassie modří.

Výhodný způsob podle předkládaného vynálezu je např. takový, kdy expresní vektor obsahuje nukleovou kyselinu, která kóduje fúzní protein, který má N-koncový úsek, kde byla jedna nebo několik aminokyselin deletováno nebo substituováno v úsek aminokyselin 2 až 21, pokud vzniklý derivát nadále vykazuje autokatalytickou funkci autoproteázy N^pro v požadovaném rozsahu. Podle vynálezu výhodný derivát autoproteázy N^pro ve fúzním proteinu obsahuje např. aminokyselinoví vou sekvenci autoproteázy N^pro z CSFV s delecí aminokyselin 2 až 16 nebo 2 až 21. Je také možné prostřednictvím substituce nebo adice aminokyselin změnit nebo vložit aminokyselinovou sekvenci, např. se vnese aminokyselinová sekvence, která napomáhá při purifikaci.

Molekula nukleové kyseliny, která je zvláště výhodná ve způsobu podle vynálezu kóduje takový fúzní protein, kde první polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci Glu22 až Cys 168 aktivitou, přičemž první polypeptid dále má Met jakožto N-konec a heterologní polypeptid je napojen přímo na aminokyselinu Cys 168 autoproteázy N^pr0 z CSFV.

Molekula nukleové kyseliny, která je podobně výhodná ve způsobu podle vynálezu, kóduje fúzní so protein, kde první polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci Prol7 až Cysl68 autoproteázy N^pro z CSFV nebo její derivát s autoproteolytickou aktivitou, přičemž první polypeptid dále

-4CZ 302366 B6 má Met jakožto N-konec a heteroíogni polypeptid je napojen přímo na aminokyselinu CysióS autoproteázy N^pro z CSFV.

Molekula nukleové kyseliny ve způsobu podle vynálezu je především ve formě molekuly DNA.

Expresní vektor pro způsob podle předkládaného vynálezu výhodně obsahuje alespoň jednu sekvenci pro kontrolu exprese. Sekvence pro kontrolu exprese jsou především promotory (např. lac, tac, T3, T7, trp, gac, vhb, Lambda pL nebo phoA), vazebná místa ribozomů (např. přirozená vazebná místa ribozomů patřící kvýše zmíněným promotorům, cro nebo syntetická vazebná místa ribozomů), nebo terminátory transkripce (např. rmB T1T2 nebo bia). Zmíněné hostitelské buňky jsou výhodně bakteriální buňky rodu Escherichia, především E. coli. Avšak mohou být užity i jiné bakteriální buňky. Ve výhodném provedení vynálezu je expresním vektorem plazmid.

Bakteriální hostitelské buňky pro způsob podle předkládaného vynálezu mohou být vybrány ze skupiny obsahující následující mikroorganismy: Gram-negativní baktérie rodu Escherichia. např. E. coli, nebo jiné Gram-negativní bakterie, např. Pseudomonas sp., jako je např. Pseudomonas aeruginosa, nebo Caulobacter sp., jako je např. Caulobacter crescentus, nebo Gram-pozítivní baktérie jako jsou baktérie rodu Bacillus sp., především Bacillus subtilis. Zvláště výhodné hostitelské buňky jsou E. coli.

Bakteriální hostitelské buňky, tj. expresní kmen těchto buněk, se kultivuje obvyklým mikrobiologickým způsobem, který je odborníkovi znám. Kmen je kultivován z jedné výchozí kolonie na živném médiu, ale je také možné jako výchozího materiálu užít kryoprezervovanou suspenzi buněk (buněčné banky). Kmen se obecně kultivuje v několika stupňovém procesu, aby byla získána dostatečná biomasa pro další zpracování.

V malém měřítku probíhá kultivace v prostřepávaných kultivačních lahvích, ve většině případů je možné užít úplné médium (např. LB živné médium). Avšak může se užít také specificky definované médium (např. citrátové médium). Pro kultivaci se připraví maloobjemová prekultura hostitelského kmenu (inokulovaná jedinou kolonií nebo kry oprezervo vanou buněčnou suspenzí), teplota při této kultivaci obvykle není kritická pro pozdější výsledky exprese, takže se rutinně provádí při vyšších teplotách (např. 30 nebo 37 °C). Hlavní kultura se nasadí ve větším (např. 500 ml), kde je především nutné zajistit dobré provzdušnění (velký objem kultivační nádoby proti objemu obsahuje, vysoká rychlost rotace). Jelikož je úmyslem dosáhnout exprese ve formě nerozpustných inkluzních tělísek, hlavní kultura se ve většině případů provádí při relativně vysokých teplotách (např. 30 nebo 37 °C). lndukovatelné systémy jsou zvláště vhodné k produkci inkluzních tělísek (např. užitím promotorů trp, lac, tac nebo phoA). Poté, co bylo dosaženo pozdní logaritmické fáze (obvykle při optické hustotě 0,5 až 1,0 v třepaných lahvích) se v těchto systémech přidá induktor (např. indolylakrylová kyselina, Ísopropyl β-D-thiogalaktopyranosid = IPTG) a inkubace pokračuje dále 1 až 5 hodin, V průběhu této doby se většina N^pro fúzního proteinu deponuje v bakteriální cytoplazmě ve formě inkluzních tělísek. Buňky je pak možné sklidit a dále zpracovat.

Ve větším měřítku vícestupňový kultivační proces probíhá v řadě bioreaktorů (fermentorů), přičemž je výhodné užít definovaná živná média, aby bylo možné zlepšit ovládání a kontrolu procesu. Kromě toho je možné významně zvýšit nárůst biomasy a tvorbu produktu dávkováním určitých živin („živná dávka“). Jinak je proces analogický proces v malém měřítku v třepaných lahvích. Tak např. se užije fermentor pro předběžnou fázi a fermentor pro hlavní fází a zvolí se kultivační teploty shodné s teplotami při kultivaci v lahvích. Fermentor pro předběžnou fázi je inokulován inokulem, které se vypěstuje z jediné kolonie nebo zkryokultury v kultivační lahvi. Ve fermentorů je také třeba zajistit dobré provzdušňování a přítomnost dostatečné koncentrace induktoru, zejména pak v hlavní fázi. Indukční fáze však musí být někdy jinak dlouhá než indukce v kultivační lahvi. Výsledné buňky se pak užijí pro další zpracování.

-5CZ 302366 B6

Ve způsobu podle předkládaného vynálezu se inkluzní tělíska izolují z hostitelských buněk způsobem, který je odborníkům znám a byl popsán např. v publikacích: R. Rudolph et al., in: Creighton, Τ. E. (Ed.), Protein Function, A Practical Approach, 1RL Press, (1996), 1 až 39; R. Rudolph, in: H. Tschesche (Ed.), Modem Methods in Protein and Nucleic Acid Research,

DeGruyter, Berlin, (1990), 149 až 171; R. Rudolph, in: J. L. Cleland & C. S. Craik(Eds.), Protein Engineering: Principles and Practices, Wiley-Liss lne., (1995), 283 až 298.

Tak například po ukončení fermentace se buňky sklidí centrifugaci. Inkluzní tělíska (IB) přítomná v buňkách se získají po rozrušení buněk např. vysokotlakou disperzí jednoduše centrifugaci io při nízkých otáčkách rotoru. Čistota z hlediska požadovaného cílového proteinu se může zlepšit opakovaným resuspendováním IB v různých pufrech, např. sNaCl (např. 0,5 až 1,0 M) a/nebo sdetergenty (např. Triton X-100). To obvykle vede k odstranění většiny cizorodých proteinů z IB. Zbytky cizorodých proteinů obvykle nenarušují autoproteolytické štěpení.

i? Solubilizace se rutinně provádí rozpuštěním IB např. v pufru obsahujícím guanidin (např. 0,1 M tris/HCI, 6,0M guanidin/HCl, 5 mM EDTA, 50 mM DTT) (viz např. R. Rudolph et al., (1996); R. Rudolph (1990), R. Rudolph (1995), cit. výše). Po odstranění nerozpustného materiálu např. centrifugaci lze v supematantu provést stanovení koncentrace proteinu.

io Autoproteolytického vyštěpení heterologního polypeptidu z fúzního proteinu se dosáhne naředěním solubílizátu štěpícím pufrem (např. v poměru 1 ml solubilizátu + 99 ml Štěpícího pufru), např. pufrem obsahujícím Tris, výhodně v koncentraci 0,8 až LOM, nebo štěpícím pufrem obsahujícím arginin, výhodně s 0,4 až 0,6M argininem, např. při neutrálním pH, výhodně při pH 7,0 až 7,5, a při teplotě např. nižší než 30 °C, výhodně 10 až 20 °C, Čímž se vytvoří reakční roztok (viz také R. Rudolph (1996), cit. výše). Štěpící roztok se pak inkubuje po určitou dobu, např. 12 hodin, a míra štěpení N^pro pak může být analyzována např. pomocí SDS-PAGE.

Ve výhodném provedení je solubilizát naředěn pufrem obsahujícím arginin tak, aby výsledná koncentrace argininu byla do 1,0 M, výhodně 0,4 až 0,6 M. Alternativně se naředění provede dialýzou solubilizovaných inkluzních tělísek proti vhodnému štěpícímu pufru obsahujícímu arginin.

Teplota reakčního pufru pro štěpení je v rozmezí 0 až 30 °C, výhodná teplota je 10 až 20 °C.

pH reakčního pufru je např. v rozmezí 5,0 až 9,0. pH je výhodně 7,0 až 8,0, zvláště výhodně 7,0 až 7.5.

Tam, kde je to vhodné, reakční pufr obsahuje také DTT v koncentraci 0,5 až lOOmM. DDT koncentrace je výhodně přibližně 5,5mM.

Koncentrace proteinu v reakčním roztoku pro Štěpení je např. v rozmezí 20 až 150 gg/ml. Koncentrace proteinu je výhodně nižší než 40 μg/ml.

Reakční pufr při štěpení může obsahovat Tris/HCI v koncentraci např. do l,0M. Koncentrace

Tris/HCI je výhodně 0,8 až l,0M.

Místo pufru obsahujícího arginin nebo Tris/HCI pufru je možné užít i jiný pufrovací systém.

Ve zvláště výhodném provedení vynálezu je pH štěpícího pufru 7,0 až 7,5, teplota při štěpení je

10 až 20 °C, koncentrace proteinu nepřesahuje 40 až 50 μg/ml, a přitom štěpící pufr obsahuje jakožto redukční činidlo 5mM DTT.

A nakonec, heterologní polypeptid, který byl vyštěpen z fúzního proteinu, je izolován způsobem, který je odborníkům znám (viz např. Μ. P. Deutscher, in: Methods in Enzymology: Guide to

Protein Purification, Academie Press lne., (1990), 309 až 392).

-6CZ 302366 B6

Následující příklady slouží k ilustraci a předkládaného vynálezu, aniž by jakkoliv omezovaly jeho rozsah.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Exprese a in vitro štěpení N^pro-hGH (humánní růstový hormon)

Fúzní proteiny jsou produkovány heterologní expresí v bakteriálním expresním systému Escherichia coli (vektor plóOTPl s hostitelem W3110). Všechny elementy pro konstrukci vektoru tohoto systému pocházejí z genomu E. coli.

plóOTPl je vektor odvozený z pBR322, ve kterém je exprese řízena modifikovaným E. coli trp promotorem s deletovaným atenuátorem. Sekvence Shine-Dalgamova v atenuátorovém peptidu ze stejného operonu byla užita jako vazebné místo ribozomů (RBS). Dvojitý terminátor T1T2 z genu E. coli rrnB zajišťuje, společně s terminátorem genu bia ponechaným v konstruktu, účinnou terminaci transkripce.

Expresní kazeta byla vložena do místa EcoRI v pBR322 v opačném směru (proti směru hodinových ručiček, tj, opačně orientovaná než je gen rezistence k tetracyklinu). Gen pro β-Iaktamázu {bia) byl de letován společně s promotorem. Strukturní geny pro heterologní proteiny, které mají být exprimovány, jsou vloženy (obecně jako PCR fragmenty přiměřeně naštěpené) prostřednictvím štěpného místa Xbal v poloze 3506.

Expresní plazmid (NPH-pET) sloužil jako zdroj strukturního genu N^pro-hGH. Plazmid obsahuje známý expresní vektor pETl la (F. W. Studier et ak, Methods. Enzymol. 185 (1990), 60 až 89). Nejdříve byl fúzní protein sestávající zN^pro a CSFV nukleokapsidového proteinu klonován do expresního vektoru. To umožnilo prvních 16 aminokyselin (aa) přírodní sekvence N^pr° (MELNHFELLYKTSKQK) nahradit 10 aa dlouhou oligo-histidinovou sekvencí (MASHHHHHHH) napomáhající puriflkaci. Štěpené místo Spěl bylo vneseno do výsledného expresního plazmidu v místě spojení mezi N^pro a nukleokapsidovým proteinem cílenou mutagenezí. To umožnilo deletovat strukturní gen pro nukleokapsidový protein z vektoru restrikcí Spěl (na 5'-konci) a Xhol (na 3 konci). Odpovídající linearizovaný vektor N^pro-pETlla byl oddělen od fragmentu nukleokapsidového genu preparativní gelovou elektroforézou. Pak bylo možné vložit strukturní gen hGh prostřednictvím „lepivých“ konců Spěl a Xhol.

Byly potřebné následující přípravné práce. Strukturní gen byl amplifikován pomocí vysoce přesného systému PCR (například Pwo systém od firmy Roche Biochem icals, postup byl proveden podle pokynů výrobce) z DNA knihovny humánního mozku.

Pro tento účel byly použity následující oligonukleotidy:

Oligonukleotid 1 (N-koncový):

5- ATAATTACTA GTTGTTTCCC AACCATTCCC TTATCCAGGC C -3'

Oligonukleotid 2 (C-koncový):

5'- ATAATTGGAT CCTCGAGTTA TTAGAAGCCA CAGCTGCCCT CCAC -3

-7CZ 302366 B6

Pomocí těchto oligonukleotidů bylo vneseno štěpné místo Spěl na 5 -konec, a štěpné místo Xhol bylo vneseno na 3'~konec. Navíc byl na 3'-konec strukturního genu vložen dvojitý stop kodon ochre (TAATAA) kvůli účinné terminaci translace. Štěpné místo Spěl na předním konci dovoluje ligaci ve shodě se čtecím rámcem vektoru N^pra-pETl la popsaného výše. Štěpné místo Xhol na zadním konci umožňuje přímé klonování. Takto připravený plazmid byl nazván NPH-pET.

Tento plazmid NPH-pET byl, jak již bylo zmíněno, užit jako zdroj strukturního genu pro fúzní protein N^pro-hGH. Pro tento účel byla užita vysoce přesná PCR s Pwo polymerázou, kdy templátem byl plazmid NPH-pET linearizovaný Xhol. Pro přípravu fragmentu vhodného pro ίο klonování byly užity následující primery:

Přední konec (odpovídá N-konci proteinu) strukturního genu:

-AGGGTATCTA G&ATTCTA TG CCAGTGGGAG TGGAGGAACC G-3

Zadní konec (odpovídá C-konci proteinu) strukturního genu:

'-AGAATTAAGC TTCTAGATTA TTAGAAGCCA CAGCTGCCCT CCAC-3

2o Štěpná místa Xbal (přední a zadní) použitá pro následné klonování jsou vyznačena podtržením, a start-kodon (ATG) a stop-kodon (TAATAA) jsou vyznačeny většími typy.

Tyto dva oligonukleotidy vedly kamplifikaci strukturního genu s otevřeným čtecím rámcem (ORF) pro fúzní protein (FP), kde purifikační pomůcka His₇ a předcházející aminokyseliny (s výjimkou methioninu nezbytného pro zahájené translace) byly zcela odstraněny.

Sekvence PCR fragmentu (1072 bp), který obsahuje otevřený čtecí rámce pro fúzní protein N^prohGH je uveden níže. Start-kodon a dva stop-kodony jsou vyznačeny tučně a štěpná místa Xbal užitá pro klonování jsou vyznačena podtržením.

’ -AGGGTAICIAGAATTCTATGCCAGTGGGAGTGGAGGAACCGGTGTATGACACCGCGGGGA GACCACTATTTGGGAACCCAAGTGAGGTACACCCACAATCAACGCTGAAGCTGCCACACGACA GGGGGAGAGGAGATATCAGAACAACACTGAGGGACCTACCCAGGAAAGGTGACTGTAGGAGTO GCAACCATCTAGGCCCGGTTAGTGGGATATACATAAAGCCCGGCCCTGTCTACTATCAGGACT

ACACGGGCCCAGTCTATCACAGAGCTCCTTTAGAGTTCTTTGATGAGGCCCAGTTCTGCGAGG

TGACTAAGAGAATAGGCAGGGTCACGGGTAGTGATGGTAAGCTTTACCACATATATGTGTGCG

TCGATGGTTGCATACTGCTGAAATTAGCCAAAAGGGGCACACCCAGAACCCTAAAGTGGATTA

GGAACTTCACCAACTGTCCATTATGGGTAACTAGTTGTTTCCCAACCATTCCCTTATCCAGGC

CTTTTGACAACGCTATGCTCCGCGCCCATCGTCTGCACCAGCTGGCCTTTGACACCTACCAGG

AGTTTGAAGAAGCCTATATCCCAAAGGAACAGAAGTATTCATTCCTGCAGAACCCCCAGACCT

CCCTCTGTTTCTCAGAGTCTATTCCGACACCCTCCAACAGGGAGGAAACACAACAGAAATCCA

ACCTAGAGCTGCTCCGCATCTCCCTGCTGCTCATCCAGTCGTGGCTGGAGCCCGTGCAGTTCC

TCAGGAGTGTCTTCGCCAACAGCCTGGTGTACGGCGCCTCTGACAGCAACGTCTATGACCTCC

TAAAGGACCTAGAGGAAGGCATCCAAACGCTGATGGGGAGGCTGGAAGATGGCAGCCCCCGGA

CTGGGCAGATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACAAACTCACACAACGATGACGCAC

TACTCAAGAACTACGGGCTGCTCTACTGCTTCAGGAAGGACATGGACAAGGTCGAGACATTCC

TGCGCATCGTGCAGTGCCGCTCTGTGGAGGGCAGCTGTGGCTTCTAATAATCTAGAAGCTTAA

TTCT-3’

-8CZ 302366 B6 l ento OKF tedy kóduje fúzní protein znázorněný níže, kde proline v pozici 2 odpovídá prolinu v pozici 17 původního přírodního proteinu N^pro. Sekvence fúzního proteinu N^pro-hGH (344 aminokyselin, z toho 153 aminokyselin je N^pr a 191 aminokyselin je hGH)je následující (čteno ve směru od N-konce k C-konci), kde prolin 17 (pozice 2 fúzního proteinu) z přírodní sekvence

N^pro je uveden kurzívou a sekvence hGH je vyznačena tučně:

MPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPV

SGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYHIYVCVDGCILL

KLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSCFPTIPLSRPFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQBPEEAYI

PKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFAN

SLVYGASDSNVYDLXJCDLEEGIQTLMGRLEDG3PRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGL

LYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF

Fúzní protein má M_r 39316,92 (D) v redukovaném stavu, a po případném rozštěpení by část N^proio (redukovaná) měla M_r 17220,02 (D) a část hGh (redukovaný) by měla 22114,88 (D). N^prH obsahuje šest cysteinů a hGh čtyři. Je pravděpodobné, že v bakteriální cytoplazmě jsou tyto cysteiny většinou v redukované formě. V průběhu dalšího opracování dochází pravdě podobně alespoň k částečnému vytvoření disulfidických můstků. Je třeba předpokládat, že N-koncový methionin ve fúzním proteinu (nebo části N^pra) je většinou štěpen methioninaminopeptidázou (MAP) vlastní i? hostiteli, což by redukovalo M_r přibližně o 131 (D) na 39186 (D) (FP) a 17089 (D) (N^pro).

PCR fragment s popsaným strukturním genem pro FP byl purifikován a naštěpen Xbal, a dva produkty štěpení byly odděleny od cílového fragmentu. Tento fragment byl pak ligo ván do expresního vektoru pl60TPl.

Vektor byl nejdříve linearizován štěpením Xbal a na 5'-konci defosforylován působením telecí intestinální fosfatázy (CÍP). Pro ligaci byla užita T4 DNA ligáza. Ligovaná DNA byla vnesena elektroporací do buněk Escherichia coli K-12 DH10B a buňky pak byly naneseny na plotny s LB („Luria Broth“) agarem obsahujícím 15mg/l tetracyklinu. Z této transformace vznikly četné kolonie. Plazmidová DNA byla izolována z několika klonů a byla vyšetřena restrikění analýzou na přítomnost inzertu správné velikosti a orientace. Jeden klon byl vybrán a byla provedena jeho podrobná analýza a charakterizace restrikčními enzymy a sekvencováním. Plazmid odpovídal všem předchozím výpočtům a analýzám. Tento plazmid byl nazván pNPHl a byl použit v další práci.

Sekvence N^pr0-hGH expresního plazmidů pNPHl (4840 bp) je uvedena níže. Start-kodon a stopkodon fúzního proteinu N^pro-hGH jsou podtrženy. Otevřený čtecí rámec probíhá v opačné orientaci než jak je znázorněno v této formě.

’ -GAATTCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGATAAGCTTTAATGCGGTAGTTTATCACAGTT AAATTGCTAACGCAGTCAGGCACCGTGTATGAAATCTAACAATGCGCTCATCGTCATCCTCGG CACCGTCACCCTGGATGCTGTAGGCATAGGCTTGGTTATGCCGGTACTGCCGGGCCTCTTGCG GGATATCGTCCATTCCGACAGCATCGCCAGTCACTATGGCGTGCTGCTAGCGCTATATGCGTT GATGCAATTTCTATGCGCACCCGTTCTCGGAGCACTGTCCGACCGCTTTGGCCGCCGCCCAGT CCTGCTCGCTTCGCTACTTGGAGCCACTATCGACTACGCGATCATGGCGACCACACCCGTCCT GTGGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGG CGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGC

-9CZ 302366 B6

TTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTT

GCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCT

AATGCAGGAGTCGCATAAGGGAGAGCGTCGACCGATGCCCTTGAGAGCCTTCAACCCAGTCAG

CTCCTTCCGGTGGGCGCGGGGCATGACTATCGTCGCCGCACTTATGACTGTCTTCTTTATCAT

GCAACTCGTAGGACAGGTGCCGGCAGCGCTCTGGGTCATTTTCGGCGAGGACCGCTTTCGCTG

GAGCGCGACGATGATCGGCCTGTCGCTTGCGGTATTCGGAATCTTGCACGCCCTCGCTCAAGC

CTTCGTCACTGGTCCCGCCACCAAACGTTTCGGCGAGAAGCAGGCCATTATCGCCGGCATGGC

GGCCGACGCGCTGGGCTACGTCTTGCTGGCGTTCGCGACGCGAGGCTGGATGGCCTTCCCCAT

TATGATTCTTCTCGCTTCCGGCGGCATCGGGATGCCCGCGTTGCAGGCCATGCTGTCCAGGCA

GGTAGATGACGACCATCAGGGACAGCTTCAAGGATCGCTCGCGGCTCTTACCAGCCTAACTTC

GATCACTGGACCGCTGATCGTCACGGCGATTTATGCCGCCTCGGCGAGCACATGGAACGGGTT

GGCATGGATTGTAGGCGCCGCCCTATACCTTGTCTGCCTCCCCGCGTTGCGTCGCGGTGCATG

GAGCCGGGCCACCTCGACCTGAATGGAAGCCGGCGGCACCTCGCTAACGGATTCACCACTCCA

AGAATTGGAGCCAATCAATTCTTGCGGAGAACTGTGAATGCGCAAACCAACCCTTGGCAGAAC

ATATCCATCGCGTCCGCCATCTCCAGCAGCCGCACGCGGCGCATCTCGGGCAGCGTTGGGTCC

TGGCCACGGGTGCGCATGATCGTGCTCCTGTCGTTGAGGACCCGGCTAGGCTGGCGGGGTTGC

CTTACTGGTTAGCAGAATGAATCACCGATACGCGAGCGAACGTGAAGCGACTGCTGCTGCAAA

ACGTCTGCGACCTGAGCAACAACATGAATGGTCTTCGGTTTCCGTGTTTCGTAAAGTCTGGAA

ACGCGGAAGTCAGCGCCCTGCACCATTATGTTCCGGATCTGCATCGCAGGATGCTGCTGGCTA

CCCTGTGGAACACCTACATCTGTATTAACGAAGCGCTGGCATTGACCCTGAGTGATTTTTCTC

TGGTCCCGCCGCATCCATACCGCCAGTTGTTTACCCTCACAACGTTCCAGTAACCGGGCATGT

TCATCATCAGTAACCCGTATCGTGAGCATCCTCTCTCGTTTCATCGGTATCATTACCCCCATG

AACAGAAATTCCCCCTTACACGGAGGCATCAAGTGACCAAACAGGAAAAAACCGCCCTTAACA

TGGCCCGCTTTATCAGAAGCCAGACATTAACGCTTCTGGAGAAACTCAACGAGCTGGACGCGG

ATGAACAGGCAGACATCTGTGAATCGCTTCACGACCACGCTGATGAGCTTTACCGCAGCTGCC

TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAG

CTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCG

GGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTA

TGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATG

CGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTC

GGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGA

ATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAA

AAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCG

ACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGG

AAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCT

CCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGT

- 10 C7 302366 B6 uGtTCGCTCCAAGCTGGGCTGŤGŤGCaCGaACcccClgttcagcccgaccoctGCGCCTTATC

CGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCAC

TGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCC

TAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTT

CGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTT

TGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTC

TACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATC

AAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTAT

ATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCTCGAGGCCATCCGTCAGGATGGCCTTCTGCTTAA

TTTGATGCCTGGCAGTTTATGGCGGGCGTCCTGCCCGCCACCCTCCGGGCCGTTGCTTCGCAA

CGTTCAAATCCGCTCCCGGCGGATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGA

TAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTCTAGATTATTAGAAGCCAC

AGCTGCCCTCCACAGAGCGGCACTGCACGATGCGCAGGAATGTCTCGACCTTGTCCATGTCCT

TCCTGAAGCAGTAGAGCAGCCCGTAGTTCTTGAGTAGTGCGTCATCGTTGTGTGAGTTTGTGT

CGAACTTGCTGTAGGTCTGCTTGAAGATCTGCCCAGTCCGGGGGCTGCCATCTTCCAGCCTCC

CCATCAGCGTTTGGATGCCTTCCTCTAGGTCCTTTAGGAGGTCATAGACGTTGCTGTCAGAGG

CGCCGTACACCAGGCTGTTGGCGAAGACACTCCTGAGGAACTGCACGGGCTCCAGCCACGACT

GGATGAGCAGCAGGGAGATGCGGAGCAGCTCTAGGTTGGATTTCTGTTGTGTTTCCTCCCTGT

TGGAGGGTGTCGGAATAGACTCTGAGAAACAGAGGGAGGTCTGGGGGTTCTGCAGGAATGAAT

ACTTCTGTTCCTTTGGGATATAGGCTTCTTCAAACTCCTGGTAGGTGTCAAAGGCCAGCTGGT

GCAGACGATGGGCGCGGAGCATAGCGTTGTCAAAAGGCCTGGATAAGGGAATGGTTGGGAAAC

AACTAGTTACCCATAATGGACAGTTGGTGAAGTTCCTAATCCACTTTAGGGTTCTGGGTGTGC

CCCTTTTGGCTAATTTCAGCAGTATGCAACCATCGACGCACACATATATGTGGTAAAGCTTAC

CATCACTACCCGTGACCCTGCCTATTCTCTTAGTCACCTCGCAGAACTGGGCCTCATCAAAGA

ACTCTAAAGGAGCTCTGTGATAGACTGGGCCCGTGTAGTCCTGATAGTAGACAGGGCCGGGCT

TTATGTATATCCCACTAACCGGGCCTAGATGGTTGCCACTCCTACAGTCACCTTTCCTGGGTA

GGTCCCTCAGTGTTGTTCTGATATCTCCTCTCCCCCTGTCGTGTGGCAGCTTCAGCGTTGATT

GTGGGTGTACCTCACTTGGGTTCCCAAATAGTGGTCTCCCCGCGGTGTCATACACCGGTTCCT

CCACTCCCACTGGCAXAGAATTCTAGATACCCTTTTTACGTGAACTTGCGTACTAGTTAACTA

GTTCGATGATTAATTGTCAACAGCTCATTTCAGAATATTTGCCAGAACCGTTATGATGTCGGC

GCAAAAAACATTATCCAGAACGGGAGTGCGCCTTGAGCGACACGAATTATGCAGTGATTTACG

ACCTGCACAGCCATACCACAGCTTCCGATTGGCTGCCTGACGCCAGAAGCATTGGTGCACCGT GCAGTCGAGATGCGCGTCGGCACCCTGGCGATCACCGACCATGACACCACAGCAT-3¹

Hostitelský kmen Escherichia coli pro expresi fúzního proteinu N^pr0-hGH byl vybrán na základě 5 zvážení produktivity a biologické bezpečnosti. Kmen Escherichia coli K-12 je nejlépe charakterizovaná linie druhu E. coli (viz B. J. Bac hm ann; in; J. L. Ingraham et al., (Ed.) Escherichia coli

- 11 CZ 302366 B6 and Salmonella typhimurium\ cellular and molecular biology. American Society for Microbiology, Washington D. C. (1987a), pp. 1191 až 1219; B. J. Bachmann 1987b; Barbara J. (1987b) Linkage map of Escherichia coli K-12, edition 7. In: Escherichia coli and Salmonella typhimurium, Vol. 2. Ed.: F. C. Neidhard. Am. Soc. Microbiol., Washington DC (1987b), 807 až

876; K. F. Jensen, J. Bacteriol. 175 (1993), 3401 až 3407) a je obecně považována za bezpečnou.

Escherichia coli K-12 W3110 (ATCC 27325) je prototropní derivát silně příbuzný s divokým typem Escherichia coli K-12 a je často využíván jako hostitelský kmen pro expresi heterologních proteinu. Byl uložen v Americké sbírce mikroorganismů (American Type Culture Collection, io ATCC) a má následující genotyp:

[F mcrA mcrB \N(rrnD-rrnE) \ lambda J

Kmen byl zakoupen ze sbírky ATCC. Jeho růst byl vynikající na plně syntetickém médiu bez komplexního zdroje dusíku a účinné řízení růstového procesu při průmyslovém zpracování je proto možné.

Expresní kmen W3110 [pNPHl] byl připraven transformací již popsaného expresního plazmidu pNPHl do W3110. Transformace byla provedena elektroporací užitím 10% glycerolu jako média pro resuspendování. 50 ng(1 μΐ) roztoku pNPHl ve vodě bylo smícháno se 30 μΙ suspenze buněk W3110 a pak podrobeno pulzu 1800 V v Imm kyvetě (Eppendorf Electroporator 2510). Buňky pak byly resuspendovány v médiu SOC, třepány 1 hodinu ve 37 °C a pak vysety na plotny s LB (Luria broth) agarem a 15 mg/l tetracyklinu. Z této transformace po inkubaci ve 37 °C (přes noc) vznikly četné klony.

Středně velké kolonie s odlišitelnými okraji byly odebrány a staly se základem pro expresní kmen W3110 [pNPHl], Klon byl kultivován a pak konzervován v kryoampulích v teplotě —80 °C (hlavní buněčná banka, MCB, „master cell bank“). Pro běžnou denní práci byl kmen vždy nanesen na plotnu s LB agarem obsahujícím tetracyklin.

Kmen W3110 [pNPHl] zjediné kolonie na agarové plotně byl použit pro inokulaci předkultury v LB médiu s tetracyklinem 15 mg/l (200 ml v 11 kultivační láhvi s míchacími přepážkami). Předkultura byla třepána při 250 rpm ve 30 °C po dobu 14 hodin, kdy dosáhla OD_óoo přibližně 1,0. lOml alikvot předkultury byl užit k inokulaci hlavní kultury (v 330 ml citrátového média v 11

3? kultivační láhvi s míchacími přepážkami) (3% inokulum). Hlavní kultura pak byla kultivována ve 37 °C (250 rpm) až do dosažení OD₆oo 0,8, kdy byla indukována produkce fúzního proteinu přidáním 50 μg indolylakrylové kyseliny na 1 ml kultury (výsledná koncentrace, zásobná roztok byl 5 mg/ml ve 100 % ethanolu analytické čistoty). Kultury byly dále kultivovány 4 hodiny, ve 37 °C při 250 rpm dokud nebylo dosaženo OD₆oo 1,5 až 3,0.

Kultury pak byly přeneseny do sterilních 500 ml centrifugačních lahví a centrifugovány 30 minut při 10,000 g. Supernatant po centrifugaci byl odstraněn a pelety byly zamraženy v -80 °C až do dalšího zpracování.

Přibližně 12 g (čerstvá hmotnost) peletu buněk BL12 1(DE3) bylo resuspendováno ve 30 ml 50 mM Tris/HCI, 5mM benzamidinu, pH 8,0 a homogenizováno užitím mixéru Ultraturrax. Po přidání 0,5 mM EDTA a 0,1 % (hmot./obj.) lysozymu, byla buněčná suspenze inkubována 30 minut v ledové lázni. Následné ošetření ultrazvukem (7 x 20 sekund, s 20 přestávkami po 20 sekundách) vedlo k úplnému rozpadu buněk. Pak bylo k suspenzi přidáno 10 mM MgCl₂ a 0,006 % (hmot./obj.) DNázy a suspenze se inkubovala ve 4 °C po 30 minut. Nerozpustné a rozpustné složky byly pak odděleny centrifugaci (JA 20; 7700g). Pelet byl suspendován ve 40 ml 50mM Tris/HCI, 5mM benzamidinu, 5 mM EDTA, pH 8,0 a znovu centrifugován (JA 20; 7700g). Tento krok byl opakován ještě dvakrát a vzniklý pelet byl suspendován ve 40 ml 20mM Tris/HCI, pH 7,0. K suspenzi bylo přidáno 20 mL 1,5 M NaCl, 60 mM EDTA, pH 7,0 a suspenze se inkubovala 30 minut v ledové lázni. Nakonec byla provedena další centrifugace (JA 20;

- 12 CZ 302366 Β6

7/00g) a promytí vodou. Vzniklý peiet představuje materiál inkluzních tělisek N^-hUH (IB N^pro-hGH).

Po té následovalo rutinní resuspendování přibližně 100 mg IB materiálu ve 2 ml 6,0M guanidinhydrochloridu, 0,1 M Tris, 5 mM EDTA, 50 mM DTT, pH 9,0 po 30 minut při teplotě místnosti. Nerozpustné složky pak byly odstraněny centrifugací (10 minut/30000 g). Stanovení proteinu se pak provedlo v získaném supematantu (koncentrace proteinu přibližně 20 mg/ml). Solubilizát takto připravený byl buďto ihned použit k testům štěpení, nebo byl uschován při teplotě -20 °C (nejdéle po 7 dnů).

Příklad 2

Štěpení inkluzních tělísek fúzních proteinů v různých podmínkách

Odštěpení části N^pro bylo umožněno v principu naředěním solubilizátu 1:100 (nebo větším) ve štěpícím pufru (reziduální koncentrace guanidinhydrochloridu < 0,06 M). Koncentrace proteinu byla rutinně 20 μg/ml (případně výjimky jsou zvýrazněny).

Dále bylo možné dosáhnout štěpení části N^pro dialýzou (1:100) solubilizovaného materiálu proti štěpícímu pufru.

Rozsah odštěpení N^pr0 částí může být určen detekcí produktů štěpení užitím SDS-PAGE. Po ukončení SDS-PAGE je gel fotografován a měří se intenzita příslušných pásů. Příslušné pásy se identifikují pomocí Western blotu v předběžných testech.

Příklad 2.1

In vitro štěpení N^pTO-hGH argininem

Štěpení probíhalo při ředění (1:100) solubilizátu ve štěpícím pufru (20 mM tris/HCI, 2 mM EDTA, 5mM DTT, pH 7,0 a určitá koncentrace argininu) při teplotě místnosti. Koncentrace proteinu ve štěpné směsi byla 20 μg/ml. Rozsah štěpení byl stanoven po 24 hodinách detekcí štěpných produktů užitím SDS-PAGE.

Ukázalo se, že účinnost štěpení N^pro může být významně zvýšena přídavkem argininu do štěpícího pufru. Maximum štěpení probíhalo při koncentraci argininu 0,4 až 0,6 M.

Příklad 2.2

Vyštěpení N^pro z N^pro-hGH argininem při různých teplotách

Štěpení probíhalo při ředění (1:100) solubilizátu ve štěpícím pufru (20 mM Tris/HCI, 2 mM EDTA, 5mM DTT, pH 7,0, 0 až 1,OM arginin) vždy při dané teplotě. Koncentrace proteinu ve štěpné směsi byla 20 μg/ml. Rozsah štěpení byl stanoven po 24 hodinách detekcí štěpných produktů užitím SDS-PAGE.

Ukázalo se, že největší štěpení probíhalo při teplotách mezi 10 a 20 °C.

- 13 CZ 302366 B6

Příklad 2.3

Míra vyštěpení N^pro z N^pro-hGH jako funkce pH při různých teplotách

Štěpení probíhalo při ředění (1:100) solubilizátu ve štěpícím pufru (20 mM tris/HCI, 2 mM EDTA, 5mM DTT, pH 7,0, 0,5M arginin) vždy při daném pH. Koncentrace proteinu ve štěpné směsi byla 20 pg/ml. Rozsah štěpení byl stanoven po 24 hodinách detekcí štěpných produktů užitím SDS-PAGE.

pH štěpícího pufru se systematicky měnilo od 5,0 do 9,0. Ukázalo se, že při použité koncentraci argininu bylo optimum pH pro štěpení fúzního proteinu N^pro~hGH 7,0 až 7,5.

Příklad 2.4

Vyštěpení N^pro z N^pro-hGH při různých koncentracích DTT V tomto pokuse se zkoumala závislost účinnosti štěpení na koncentraci DTT.

Štěpení probíhalo při ředění (1:100) solubilizátu ve štěpícím pufru (20 mM tris/HCI, 2 mM EDTA, pH 7,0, 0,5M arginin, 0 až 100 mM DTT, 15 °C). Vzhledem k přítomnosti DTT v solubilizátu i varianta „0 DTT“ obsahovala 0,5mM DTT. Koncentrace proteinu ve štěpné směsi byla 20 pg/ml. Rozsah štěpení byl stanoven po 24 hodinách detekcí štěpných produktů užitím SDS25 PAGE.

Maximálního štěpení bylo dosaženo při koncentraci 5,5M DTT.

.to Příklad 2.5

Vliv různého pH solubilizátu na štěpení N^pro-hGH

Štěpení probíhalo při ředění (1:100) solubilizátu při různých pH (pH 6,0, pH 7,0, pH 8,0, pH 9,0) 35 ve štěpícím pufru (20 mM tris/HCI, 2 mM EDTA, 5mM DTT, pH 7,0, 0 až 0,8M arginin, 15 °C).

Hodnoty pH byly upraveny titrací solubilizačního pufru na požadované pH před smícháním s IB. Koncentrace proteinu ve štěpní směsi byla 20 pg/ml. Rozsah štěpení byl stanoven po 24 hodinách detekcí štěpných produktů užitím SDS-PAGE.

Ukázalo se, že pH optimum solubilizátu je 7,0 až 8,0.

Příklad 2.6

Kinetika vyštěpení N^pro z N^pro-hGH

Reaktivace denaturovaného N^pro-hGH byla zahájena naředěním (1:100) v 20 mM Tris/HCI, 0,5M arginin, 2 mM EDTA, 1 OmM DTT, pH 7,0, při 15 °C.

Ukázalo se, že konce štěpení bylo dosaženo po 24 hodinách.

- 14CZ 302366 B6

Příklad 2.7

Vyštěpení N^pro z N^pro~hGH ředěním při různých koncentracích proteinu

Štěpení probíhalo naředěním (1: í 00) solubilizátu ve štěpícím pufru (20 mM Tris/HCl, 0,5M arginin, 2 mM EDTA, 5mM DTT, pH 7,0, 15 °C). Kontrola štěpení byla provedena po 24 hodinách detekcí štěpných produktů užitím SDS-PAGE.

io Ukázalo se, že koncentrace protein vyšší > 40 gg/ml vedla k významnému snížení účinnosti štěpení. Další testy ukázaly, že optimální koncentrace proteinu je 20 až 40 pg/ml.

Příklad 2.8 i 5

Vyštěpení N^pro z N^pro-hGH dialýzou v závislosti na koncentraci proteinu

Ze solubilizovaného N^pro-hGH IB materiálu byl odstraněn guanidinhydrochlorid dialýzou (1:100) proti pufru (20 mM Tris/HCl, 0,5M arginin, 2 mM EDTA, 5mM DTT. pH 7,0. 4 °C) a tím bylo

2o zahájeno štěpení. Po 24 hodinách bylo detekcí štěpných produktů užitím SDS-PAGE stanoveno, zda došlo ke štěpení.

Ukázalo se, že odštěpení části N^pro lze dosáhnout nejen naředěním, ale také dialýzou solubilizovaného materiálu.

Příklad 2.9

Účinnost vyštěpení N^pro z N^pro-hGH v závislosti na koncentraci Tris/HCl

Štěpení probíhalo ředěním (1:100) solubilizátu ve štěpícím pufru (2 mM EDTA, 20 mM DTT, pH 7.0, 0,1 až 1,0 M Tris/HCl, 15 °C). Kontrola Štěpení byla provedena po 24 hodinách detekcí produktů pomocí SDS-PAGE.

Ukázalo se že zvyšující se koncentrace Tris/HCl v pufru až do 0,8 M zlepšovala výtěžek štěpení N^pro z fúzního proteinu. Zvýšení nad tuto hodnotu nevedlo k žádnému měřitelnému zlepšení N^propro štěpení.

Je proto výhodné, aby reakce probíhala při koncentraci Tris/HCl 0,8 až 1,0 M.

Příklad 3

Exprese a in vitro štěpení N^pro-pGH (prasečí růstový hormon)

Příprava expresního vektoru N^pr0-pGH začala od pNPHl (viz Příklad 1). Plazmid byl linearizován BglII a amplifikován pomocí PCR. Tím bylo možné amplifikovat celý plazmid kromě úseku strukturního genu hGH (od kodonu pro Phel ke kodonu pro Phel91) užitím Pwo polymerázy a oligonukleotidových primerů bez 5'fosfátu. Purifikovaný PCR fragment byl užit jako vektor pro ligaci se strukturním genem pGH. Odstranění 5'-fosfátu (například užitím telecí intestinální fosfatázy nebo alkalické fosfatázy arktických garnátů) zabraňuje cirkularizaci šelf-1 igací.

Strukturní gen pGH byl podobně připraven PCR amplifikací. Jako templát byla použita cDNA knihovna prasete (např. ,,5'-stretch“ cDNA knihovna z prasečích jater od firmy Clontech nebo

- 15 CZ 302366 B6 cDNA knihovna z prasečího mozku nebo štítné žlázy). Pro amplifikaci byly užity následující prímery, které byly v průběhu syntézy opatřeny 5'—fosfátovou skupinou:

Přední konec (odpovídající N-konci proteinu) strukturního genu (Phet až Ser7):

S

5'- TTC CCA GCC ATG CCC TTG TCC -3

Zadní konec (odpovídající C-konci proteinu) strukturního genu (Phel90 to Val 184):

_|() 5^Z- GAA GGC ACA GCT GCT CTC CAC -3

PCR fragment obsahuje pouze ORF (strukturní gen) zralého pGH. Ligací (užitím T4 DNA ligázy) se vytvořil ORF pro N^pr°-pGH analogický výše popsanému pNPHl. Fúzní protein dále popsaný je kódován tímto ORF. Ligovaná DNA byla vložena elektroporací do buněk Escherichia coli K-12 DH10B (elektrokompetentní buňky od firmy Life Technologies, genotyp Escherichia coli K-12 F” mcrA A{mrr-hsdRMS-mcrRC) φ80/«οΖΔΜ 15 A/c/cX74 deoXC recAA endAl t/raD139 Δ (ara, leu} Ί&9Ί galY] galK λ- rpsL nupG), které byly vysety na LB agarové plotny s 15 mg/l tetracyklinu. Tato transformace poskytla mnoho klonálních kolonií. Z několika klonů byla izolována plazmidová DNA a vyšetřena restrikční analýzou na přítomnost inzertu správné velikosti a orientace. Jeden klon byl vybrán a podrobně charakterizován restrikční analýzou a sekvencováním DNA. Plazmid odpovídal očekávání. Byl označen pNPPl a použit pro další práci.

V následující aminokyselinové sekvenci (čtena ve směru od N—konce k C-konci) fúzního protei25 nu N^pm-pGH (celkem 342 aminokyselin, z toho 153 aminokyselin odpovídá N^pro a 189 aminokyselin odpovídá pGH) je prolin 17 (poloha 2 ve fúzním proteinu) z přírodní sekvence N^pro vyznačen kurzívou a sekvence pGH je vyznačena tučně.

MFVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDLPRKGDCRSGNHLGPV

SGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYHIYVCVDGCILL

KLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSCFPAMPLSSLPANAVLRAQHLHQLAADTYKEFBRAYI

PEGQRYSIQNAQAAFCFSETIPAPTGKDKAQQRSVELLRFSLLLIQSWLGPVQFL9RVFTNSL

VFGTSDRVYEKLKDLEEGIQAIiMRELEDGSPRAGQILKQTYDKFDTNLRSDDALLKNYGLLSC

FKKDLHKAETYLRVMKCRRFVESSCAF

FP v redukovaném stavu má M_r 38819,82 (D), a po případném rozštěpení by část N^pro (redukovaná) měla ΜΓ 17220,02 (D) a část pGh (redukovaná) by měla 21617,79 (D). N^pro obsahuje šest cysteinů a pGh čtyři. Je pravděpodobné, že v bakteriální cytoplazmě jsou tyto cysteiny většinou v redukované formě. V průběhu dalšího opracování dochází pravděpodobně alespoň k Částečné35 mu vytvoření disulfidických můstků. Je třeba předpokládat, že N-koncový methionin ve fúzním proteinu (nebo části N^pro) je většinou štěpen methioninaminopeptidázou (MAP) vlastní hostiteli, což by redukovalo Mr přibližně o 131 (D) na 38689 (D) (FP) a 17089 (D) (N^pro).

Expresní kmen W3110 [pNPPl] byl připraven jak bylo popsáno v Příkladu 1 transformací (elek40 troporací) expresního plazmidu pNPPl do Escherichia coli K-12 W3110. Ani v tomto případě detailní charakterizace neodhalila žádné odchylky od očekávaného restrikčního profilu.

Středně velká kolonie s odlišitelnými okraji byla odebrána a stala se základem pro expresní kmen W3110 [pNPHl]. Klon byl kultivován a pak konzervován v kryoampulích v teplotě -80 °C (hlavní buněčná banka, MCB, „master cell bank“). Pro běžnou denní práci byl kmen vždy nanesen na plotnu s LB agarem obsahujícím tetracyklin.

- 16CZ 302366 B6

Exprese fúzního proteinu Ν^ρΓύ-ρϋΗ probíhala stejně jak bylo popsáno v Přikladu I pro túzni protein N^pro-hGH.

Příprava N^pro-pGH IB se prováděla stejně jak bylo popsáno v Příkladu 1 pro fúzní protein N^prohGH.

Příklad 4

In-vitro vyštěpení N^pro z N^pro-pGH

SolubilizaČní a renaturační testy odpovídající testům popsaným výše pro N^pro—hGH byly provedeny také pro fúzní protein N^pro-pGH. Po variaci různých parametrů (jak bylo výše popsáno) bylo zjištěno, že in-vitro odštěpení části N^pr° z fúzního proteinu N^pro-pGH bylo i v tomto případě možné po solubilizaci a renaturaci.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob rekombinantní produkce heterologního polypeptidu, vyznačující se tím, že obsahuje kroky, kdy (I) kultivují se buňky bakteriálního hostitelského kmene, který je transformován expresním vektorem obsahujícím molekulu nukleové kyseliny, která kóduje fúzní protein, který obsahuje první polypeptid, který má autoproteolyrickou funkci autoproteázy N^pro z pestiviru, a druhý polypeptid, který je navázán na první polypeptid na C-konci prvního polypeptidu takovým způsobem, že druhý polypeptid může být odštěpen z fúzního proteinu autoproteolytickou aktivitou prvního polypeptidu, přičemž druhý polypeptid je heterologní polypeptid, a kultivace probíhá v takových podmínkách, které vedou k expresi fúzního proteinu a vytvoření odpovídajících cytoplazmatíckých inkluzních tělísek, (II) izolují se inkluzní tělíska z hostitelských buněk, (III) solubilizují se izolovaná inkluzní tělíska, (IV) solubilizát se naredí, čímž vznikne reakční roztok, ve kterém dojde k autoproteolytickému vyštěpení heterologního polypeptidu z fúzního proteinu, a (V) izoluje se vyštěpený heterologní polypeptid.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že pěsti virus je vybrán ze skupiny obsahující CSFV, BDV a BVDV.
3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že pestivirus je CSFV.
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že první polypeptid obsahuje následující aminokyselinovou sekvenci:

- 17 CZ 302366 B6 (1 ΐ -MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPOSTLKLPHDRGRGDIRTT LRDLPRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVT GSDGKLYHIYVCVDGCILLKIAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC- (168) , nebo její derivát s autoproteolytickou aktivitou.
5 5. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že první polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci od GJu22 do CysióS z autoproteázy N^p™ z CSFV nebo její derivát s autoproteolytickou aktivitou, přičemž první polypeptid má Met jako N-konec, a heterologní polypeptid je přímo navázán na aminokyselinu Cys 168 autoproteázy N^pro z CSFV.

io
6. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že první polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci od Prol
7 do Cys 168 z autoproteázy N^pro z CSFV nebo její derivát s autoproteolytickou aktivitou, přičemž první polypeptid má Met jako N-konec, a heterologní polypeptid je přímo navázán na aminokyselinu Cys 168 autoproteázy N^prt’ z CSFV.

is 7. Způsob podle kteréhokoliv z nároků laž6, vyznačující se tím, že molekula nukleové kyseliny je molekula DNA.
8. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že expresní vektor je plazmid.
9. Způsob podle kteréhokoliv z nároků Iaž8, vyznačující se tím, že bakteriální hostitelské buňky jsou buňky E. coli.