JP2003506093A

JP2003506093A - タンパク質の製造

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Publication number: JP2003506093A
Application number: JP2001515842A
Authority: JP
Inventors: シユテンフエル，ギユンター; ビンデイシユ，イエルク; クナオゼデル，フランツ
Original assignee: バイオケミ・ゲゼルシヤフト・エム・ベー・ハー
Priority date: 1999-08-09
Filing date: 2000-08-07
Publication date: 2003-02-18
Anticipated expiration: 2020-08-07
Also published as: CA2379571C; SK287488B6; PL353101A1; WO2001011057A1; NO20020633L; EP1200604B1; HUP0202519A2; MXPA02001424A; PL200225B1; SK1852002A3; NZ516869A; NO20020633D0; DE60029968T2; TR200200253T2; US20050186564A1; HK1047128A1; KR20020026366A; HU230231B1; JP4820512B2; ATE335826T1

Abstract

(57)【要約】本発明は、明らかに定められた均一なＮ末端を有する所望の異種ポリペプチドの、細菌宿主細胞内での組換え製造方法であって、まず、ペスチウイルスの自己プロテアーゼＮ^ｐｒｏの自己タンパク質分解活性を有するペプチドと該異種ポリペプチドとを含む融合タンパク質を該宿主細胞内で細胞質封入体の形態で生成させ、ついで該封入体を単離し、所望の異種ポリペプチドがＮ^ｐｒｏ活性により該融合タンパク質から自己タンパク質分解的に切断されるように処理することを特徴とする製造方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、明らかに定められた均一なＮ末端を有する所望の異種ポリペプチド
の、細菌宿主細胞内での組換え製造方法であって、まず、ペスチウイルスの自己
プロテアーゼ（ａｕｔｏｐｒｏｔｅａｓｅ）Ｎ^ｐｒｏの自己タンパク質分解活性
を有するペプチドと該異種ポリペプチドとを含む融合タンパク質を該宿主細胞内
で細胞質封入体の形態で産生させ、ついで該封入体を単離し、所望の異種ポリペ
プチドが該Ｎ^ｐｒｏ自己タンパク質分解活性により該融合タンパク質から切断さ
れるように処理することを特徴とする製造方法に関する。

【０００２】異種生物における組換えタンパク質の製造、例えば、細菌細胞内でのヒトまた
は他の真核生物のタンパク質の発現においては、１００％に可能な限り近く均一
な明らかに定められたＮ末端を得ることは困難な場合が多い。これは、ヒト／動
物に天然で存在するアミノ酸配列と多くの場合に同一であるべきアミノ酸配列を
有する組換え医薬タンパク質の場合に特に言えることである。

【０００３】例えばヒトにおける天然発現に際しては、用いられた多数の医薬タンパク質は
細胞外腔内に輸送され、この目的のために前駆体タンパク質内に存在するシグナ
ル配列の切断は、明らかに定められたＮ末端を与える。いくつかの理由により、
そのような均一なＮ末端は、例えば細菌細胞内では常に容易に生成されるわけで
はない。

【０００４】産業規模の製造では、細菌細胞（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ））の細胞質内で多数の医薬タンパク質が製造される。なぜなら、適量
のその蓄積が可能であり、さらに、後処理および精製における大きな利点を有す
る不溶性封入体（ＩＢ）がしばしば生成するからである。また、ＩＢの形態で発
現されたタンパク質は、細胞内プロテアーゼによるプロテアーゼ分解から防御さ
れる（Ｒ．Ｒｕｄｏｌｐｈ，ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉ
ｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｓ．ＪｅｆｆｒｅｙＬ．Ｃｌｅｌ
ａｎｄおよびＣｈａｒｌｅｓＳ．Ｃｒａｉｋ編，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆
ＳｏｎｓＩｎｃ．，（１９９５），ＩＳＢＮ０−４７１−１０３５４−３）
。

【０００５】しかし、ＩＢ物質の製造は、発現されたタンパク質のインビトロでのリフォー
ルディングを要する。これは、多くの場合、自体公知の方法により行うことがで
きる（Ｒ．Ｒｕｄｏｌｐｈら（１９９６），ＰｒｏｔｅｉｎＦｕｎｃｔｉｏｎ
：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ：Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．
編，１−３９）。これを行うためには、ＩＢ形態のタンパク質を、還元条件下、
強力な変性剤を加えることにより可溶化し、ついで再生させる。

【０００６】原核性または真核性シグナル配列による細菌ペリプラズム内への輸出が適当な
のは、稀な場合にすぎない。なぜなら、細菌輸出装置の低い輸送能のため、通常
は、この場合には非常に少量の産物だけしか蓄積することができないからである
。

【０００７】しかし、該細菌細胞質は真核生物の細胞外腔とはかなり異なる。一方において
は、そこには還元条件が存在し、他方においては、Ｎ末端リーダー配列を切断し
て成熟タンパク質を形成するメカニズムが存在しない。すべての細胞質タンパク
質の合成は、適当な開始コドン（ＡＴＧ＝翻訳の開始）により特定されるメチオ
ニンから開始する。このＮ末端メチオニンは多数のタンパク質内に保持されてい
るが、他のタンパク質においては、それは、細胞質内に存在する該宿主に固有の
メチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）により切断される。該切断の効率は、
以下の２つのパラメーターに実質的に左右される：１．後続のアミノ酸の性質、
および２．該タンパク質の三次元構造におけるＮ末端の位置。Ｎ末端メチオニン
は、後続のアミノ酸がセリン、アラニン、グリシン、メチオニンまたはバリンで
ある場合、およびＮ末端が露出している場合（すなわち、該タンパク質内に「隠
れて」いない場合）に優先的に欠失する。一方、後続のアミノ酸が、異なるアミ
ノ酸、特に荷電アミノ酸（グルタミン酸、アスパラギン酸、リシン、アルギニン
）である場合、またはＮ末端が該タンパク質の内部に位置する場合には、ほとん
どの場合、Ｎ末端メチオニンの切断は生じない（Ｋｎｉｐｐｅｒｓ，Ｒｏｌｆ（
１９９５）ＭｏｌｅｋｕｌａｒｅＧｅｎｅｔｉｋ，第６版，ＧｅｏｒｇＴｈ
ｉｅｍｅＶｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，ＮｅｗＹｏｒｋ．ＩＳＢＮ
３−１３−１０３９１６−７）。

【０００８】該切断を促進するアミノ酸が２位に存在する場合であっても、該切断はめった
に完全ではない。かなりの割合（１〜５０％）がＭＡＰにより影響されないまま
であるのが普通である。

【０００９】細菌細胞内での組換え医薬タンパク質の製造の初期においては、その方法は、
単に、メチオニンコード化ＡＴＧ開始コドンを成熟（すなわち、シグナル配列も
他のＮ末端伸長も有さない）タンパク質のオープンリーディングフレーム（ＯＲ
Ｆ）の前に配置するだけであった。したがって、発現されるタンパク質は配列Ｈ _２Ｎ−Ｍｅｔ−標的タンパク質を有していた。該宿主に固有のＭＡＰによるＮ末
端メチオニンの完全な切断が達成されうるのは、少数の場合にすぎない。したが
って、このようにして製造されたタンパク質のほとんどはＮ末端に関して不均一
であるか（Ｍｅｔ形態と無Ｍｅｔ形態との混合物）、またはそれらのすべてはＮ
末端に追加的な外来アミノ酸（Ｍｅｔ）を有する（Ｍｅｔ形態のみ）。

【００１０】しかし、この不均一性または天然配列からの逸脱は、多くの場合には許容され
ない。なぜなら、これらの産物は、しばしば、異なる免疫学的（例えば、抗体生
成の誘導）および薬理学的（半減期、薬物動力学）特性を示すからである。これ
らの理由により、ほとんどの場合には、天然と同一の産物（Ｎ末端において均一
であり外来アミノ酸を有さないもの）を製造することが現在必要とされている。
細胞質発現の場合には、ここでのほとんどの場合の対処法は、特異的エンドペプ
チドダーゼ（例えば、因子Ｘａ、エンテロキナーゼ、ＫＥＸエンドペプチダーゼ
、ＩｇＡプロテアーゼ）またはアミノペプチダーゼ（例えば、ジペプチジルアミ
ノペプチダーゼ）の切断配列（リーダー）を標的タンパク質のＮ末端に融合させ
ることである。しかし、これは、経費および材料の出費を伴う、該産物の更なる
後処理（いわゆる下流プロセシング）中の追加的な工程を必要とする。また、Ｉ
Ｂの存在下では、多くの場合、該リーダー配列によるリフォールディングの妨害
または更には完全な阻止が生じる。

【００１１】したがって、細菌細胞内で封入体の形態で発現され、ついでそれから、均一な
所望のＮ末端を有する標的タンパク質が製造されうる、所望の異種標的タンパク
質の製造方法が必要とされている。ペスチウイルス由来のウイルス自己プロテア
ーゼＮ^ｐｒｏを使用して封入体から所望の標的タンパク質を製造するためのその
ような方法を、本発明の範囲内で開発した。

【００１２】ペスチウイルスは、世界中でブタおよび反芻動物において深刻な経済的損失を
引き起こす一群の病原体を構成する。届出伝染病の病原体として、古典的豚コレ
ラウイルス（ＣＳＦＶ）は特に重要である。牛ウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶ
ＤＶ）により引き起こされる損害（特に、胎仔の子宮内感染の定常的発生による
もの）も著しい。

【００１３】ペスチウイルスは、ｍＲＮＡとして直接作用する１２．３ｋｂのサイズのゲノ
ムを有する、エンベロープを有する小さなウイルスであり、該ウイルス遺伝子産
物は細胞質内で該ゲノムから転写される。これは、約４０００アミノ酸を含みウ
イルスプロテアーゼおよび細胞プロテアーゼの両方により約１２個の成熟タンパ
ク質に分解される単一のポリタンパク質の形態で生じる。

【００１４】現在までに、ペスチウイルスにおいては２つのウイルスコード化プロテアーゼ
（自己プロテアーゼＮ^ｐｒｏおよびセリンプロテアーゼＮＳ３）が同定されてい
る。Ｎ末端プロテアーゼＮ^ｐｒｏは該ポリタンパク質のＮ末端に位置し、２３ｋ
ｄの見掛け分子量を有する。それは、それ自身のＣ末端（Ｃｙｓ１６８）とヌク
レオカプシドプロテインＣのＮ末端（Ｓｅｒ１６９）との間で生じる切断を触媒
する（Ｒ．Ｓｔａｒｋら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７（１９９３），７０８８−７０
９５）。また、細胞病原性ＢＶＤＶウイルスにおけるＮ^ｐｒｏ遺伝子の重複が記
載されている。これらにおいては、同様に重複したＮＳ３プロテアーゼのＮ末端
にＮ^ｐｒｏの第２のコピーが存在する。この場合にも、該Ｎ^ｐｒｏ‐ＮＳ３タン
パク質の自己タンパク質分解切断が観察される（Ｒ．Ｓｔａｒｋら，前記を参照
されたい）。

【００１５】Ｎ^ｐｒｏは、１６８アミノ酸の長さおよび約２０，０００ｄの見掛けＭ_ｒ（イ
ンビボ）を有する自己プロテアーゼである。それはペスチウイルス（例えば、Ｃ
ＳＦＶ、ＢＤＶ（ボーダー病ウイルス）またはＢＶＤＶ）のポリタンパク質にお
ける最初のタンパク質であり、後続のヌクレオカプシドプロテインＣからの自己
タンパク質分解切断を受ける（Ｍ．Ｗｉｓｋｅｒｃｈｅｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
６５（１９９１），４５０８−４５１４；Ｓｔａｒｋら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７
（１９９３），７０８８−７０９５）。この切断は、Ｎ^ｐｒｏの配列内の最後の
アミノ酸Ｃｙｓ１６８の後で生じる。

【００１６】驚くべきことに、本発明において、細菌発現系内で封入体の形態で発現されペ
スチウイルスの自己プロテアーゼＮ^ｐｒｏと異種ポリペプチドとを含む融合タン
パク質から該異種ポリペプチドを切断するために、自己プロテアーゼＮ^ｐｒｏの
自己タンパク質分解機能が利用可能であることが、本発明の範囲内で見出された
。これは、未切断Ｎ^ｐｒｏ融合タンパク質が封入体から単離され可溶化されリフ
ォールディング中に切断されることを含む。

【００１７】したがって、１つの態様において、本発明は、（ｉ）融合タンパク質（該融合タンパク質は、ペスチウイルスの自己プロテアー
ゼＮ^ｐｒｏの自己タンパク質分解機能を示す第１ポリペプチドと該第１ポリペプ
チドのＣ末端において該第１ポリペプチドに結合した第２ポリペプチドとを含み
、該第２ポリペプチドは、該第１ポリペプチドの自己タンパク質分解活性により
該融合タンパク質から切断されることが可能であり、該第２ポリペプチドは異種
ポリペプチドである）をコードする核酸分子を含む発現ベクターで形質転換され
た細菌宿主細胞を培養し（該培養は、該融合タンパク質の発現および対応する細
胞質封入体の形成を引き起こす条件下で行う）、（ｉｉ）該宿主細胞から該封入体を単離し、（ｉｉｉ）単離された封入体を可溶化し、（ｉｖ）該可溶化物を希釈して、該融合タンパク質からの該異種ポリペプチドの
自己タンパク質分解が行われる反応溶液を得、（ｖ）切断された異種ポリペプチドを単離することを含んでなる、異種ポリペプ
チドの組換え製造方法に関する。

【００１８】ペスチウイルスの自己プロテアーゼＮ^ｐｒｏの自己タンパク質分解活性を有す
るポリペプチドは、特に、ペスチウイルスの自己プロテアーゼＮ^ｐｒｏ、または
自己タンパク質分解活性を有するその誘導体である。

【００１９】本発明の目的においては、「異種ポリペプチド」なる語は、天然に生じる融合
タンパク質またはポリタンパク質からペスチウイルスの自己プロテアーゼＮ^ｐｒ ^ｏにより天然では切断されないポリペプチドを意味する。異種ポリペプチドの具
体例としては、産業用酵素（プロセス酵素）、または医薬活性、特にヒト用医薬
活性を有するポリペプチドである。

【００２０】ヒト用医薬活性を有する好ましいポリペプチドの具体例としては、サイトカイ
ン、例えばインターロイキン、例えばＩＬ−６、インターフェロン、例えば白血
球インターフェロン、例えばインターフェロンα２Ｂ、増殖因子、特に造血系ま
たは創傷治癒増殖因子、例えばＧ−ＣＳＦ、エリトロポエチンまたはＩＧＦ、ホ
ルモン、例えばヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、抗体またはワクチンが挙げられる
。

【００２１】本発明の方法においては、該ペスチウイルスは、好ましくは、ＣＳＦＶ、ＢＤ
ＶおよびＢＶＤＶよりなる群から選ばれ、ＣＳＦＶが特に好ましい。

【００２２】さらに好ましい本発明方法は、該融合タンパク質の第１ポリペプチドがＣＳＦ
Ｖの自己プロテアーゼＮ^ｐｒｏのアミノ酸配列：

【化２】または自己タンパク質分解活性を有するその誘導体のアミノ酸配列を含むもので
ある（ＥＭＢＯデータベースアクセッション番号Ｘ８７９３９も参照されたい）
（Ｎ末端からＣ末端への方向に読み取った場合にアミノ酸１−１６８）。

【００２３】また、自己プロテアーゼＮ^ｐｒｏの自己タンパク質分解活性を示すポリペプチ
ドは、突然変異誘発、特にアミノ酸の置換、欠失、付加および／またはアミノ酸
の挿入によりペスチウイルスのこの自己プロテアーゼＮ^ｐｒｏから誘導されたペ
スチウイルスの自己プロテアーゼＮ^ｐｒｏの誘導体でありうる。ただし、これは
、特に、均一なＮ末端を有する所望の異種ポリペプチドの生成に要求される自己
タンパク質分解活性が保有されている場合に限られる。突然変異誘発によりその
ような誘導体を得るための方法は当業者によく知られている。自己プロテアーゼ
Ｎ^ｐｒｏの活性を、該融合タンパク質から切断される種々の異種タンパク質に関
して最適化することは、そのような突然変異により可能である。天然に存在する
自己プロテアーゼＮ^ｐｒｏと比較して１以上の突然変異を示す自己プロテアーゼ
Ｎ^ｐｒｏ誘導体を所望の異種タンパク質の他に含む融合タンパク質をコードする
核酸の製造後、該自己タンパク質分解活性を測定することにより、その要求され
る機能が存在するか否かを確認する。

【００２４】該自己タンパク質分解活性は、例えば、まず、単離された／精製されたＩＢを
７Ｍグアニジン／ＨＣｌ溶液中に可溶化し次いで反応溶液中で１：１００希釈
することにより検出することができる。約２４時間のインキュベーションの後、
切断が生じたことに関して、該反応溶液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検査する。プ
ロセシング体および未プロセシング体の比率を同定するために、ウエスタンブロ
ットを行う。切断された物質の比率を、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの
デンシトメトリー分析により測定する。

【００２５】本発明の好ましい方法は、例えば、アミノ酸２−２１の領域内の１以上のアミ
ノ酸が欠失した又は置換されたＮ末端領域を有する融合タンパク質（得られた誘
導体は、自己プロテアーゼＮ^ｐｒｏの自己触媒機能を望ましい程度で示し続けて
いる）をコードする核酸分子を該発現ベクターが含むものである。本発明の目的
においては、該融合タンパク質において好ましい自己プロテアーゼＮ^ｐｒｏ誘導
体は、例えば、アミノ酸２−１６または２−２１の欠失を有するＣＳＦＶの自己
プロテアーゼＮ^ｐｒｏのアミノ酸配列を含む。また、例えば、精製を補助するア
ミノ酸配列を導入するために、アミノ酸配列を交換または導入することがアミノ
酸の置換または付加により可能である。

【００２６】本発明の方法において特に好ましい核酸分子は、該第１ポリペプチドがＣＳＦ
Ｖの自己プロテアーゼＮ^ｐｒｏのアミノ酸配列Ｇｌｕ２２−Ｃｙｓ１６８または
自己タンパク質分解活性を有するその誘導体を含む融合タンパク質（該第１ポリ
ペプチドは更にＭｅｔをＮ末端として有し、該異種ポリペプチドはＣＳＦＶの自
己プロテアーゼＮ^ｐｒｏのアミノ酸Ｃｙｓ１６８に直接的に結合している）をコ
ードしているものである。

【００２７】本発明の方法において同様に好ましい核酸分子は、該第１ポリペプチドがＣＳ
ＦＶの自己プロテアーゼＮ^ｐｒｏのアミノ酸配列Ｐｒｏ１７−Ｃｙｓ１６８また
は自己タンパク質分解活性を有するその誘導体を含む融合タンパク質（該第１ポ
リペプチドは更にＭｅｔをＮ末端として有し、該異種ポリペプチドはＣＳＦＶの
自己プロテアーゼＮ^ｐｒｏのアミノ酸Ｃｙｓ１６８に直接的に結合している）を
コードしているものである。

【００２８】特に、前記核酸分子は、本発明の方法においてはＤＮＡ分子の形態である。

【００２９】本発明の方法で使用する発現ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの発現
制御配列を含む。発現制御配列としては、特に、プロモーター（例えば、ｌａｃ
、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７、ｔｒｐ、ｇａｃ、ｖｈｂ、ラムダｐＬまたはｐｈｏＡ）
、リボソーム結合部位（例えば、前記プロモーターに属する天然リボソーム結合
部位、ｃｒｏ、または合成リボソーム結合部位）、または転写ターミネーター（
例えば、ｒｒｎＢＴ１Ｔ２またはｂｌａ）が挙げられる。前記宿主細胞は、好
ましくは、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の細菌細胞、特に大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。しかし、他の細菌細胞を使用することも可能である（
後記を参照されたい）。好ましい実施形態においては、該発現ベクターはプラス
ミドである。

【００３０】本発明の方法で使用する細菌宿主細胞は、例えば、以下の微生物の群から選ば
れうる：グラム陰性菌、例えばエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）種、例
えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、または他のグラム陰性菌、例えばシュードモナス
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種、例えばシュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、またはカウロバクター（Ｃａｕｌ
ｏｂａｃｔｅｒ）種、例えばカウロバクター・クレセンツス（Ｃａｕｌｏｂａｃ
ｔｅｒｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）、あるいはグラム陽性菌、例えばバシラス（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ）種、特にバシラス・サチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉ
ｌｉｓ）。宿主細胞としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が特に好ましい。

【００３１】該細菌宿主細胞、すなわち、該発現株は、自体公知の微生物学的慣例に従い培
養する。該株は、一般には、栄養培地上で単コロニーから成長させるが、凍結保
存細胞懸濁液（細胞バンク）を使用することも可能である。更なる使用のための
十分なバイオマスを得るために、一般には、該株を多段階方法で培養する。

【００３２】小規模の場合には、これを振とうフラスコ内で行い、ほとんどの場合には、複
合培地（例えばＬＢブロス）を使用することが可能である。しかし、規定培地（
例えばクエン酸培地）を使用することも可能である。該培養のために、該宿主株
（単コロニーまたは凍結培養由来の細胞懸濁液で接種されたもの）の小容積の予
備培養を成長させる。この培養の温度は、一般には、後続の発現結果に対して決
定的なものではなく、通常は、比較的高い温度（例えば３０℃または３７℃）で
実施することが可能である。主培養は、大容積（例えば５００ｍｌ）で準備し、
この場合、良好な通気（内容物の容積と比較して大きな容積のフラスコ、高速の
回転）を確保することが特に必要である。発現は可溶性封入体の形態で生じると
意図されるため、該主培養は、ほとんどの場合、それよりいくらか高い温度（例
えば３０または３７℃）で行われるであろう。封入体の製造には、誘導系（例え
ば、ｔｒｐ、ｌａｃ、ｔａｃまたはｐｈｏＡプロモーターによるもの）が特に適
している。後期対数期（通常は振とうフラスコ内で０．５〜１．０の光学密度）
に達した後、これらの場合には誘導物質（例えばインドールアクリル酸、イソプ
ロピルβ‐Ｄ‐チオガラクトピラノシド＝ＩＰＴＧ）を加え、インキュベーショ
ンを１〜５時間継続する。この時間中に、該Ｎ^ｐｒｏ−標的タンパク質融合タン
パク質のほとんどが該細菌細胞質中で封入体として析出する。得られた細胞を集
め、更に加工することができる。

【００３３】大規模の場合には、該多段階系は、複数のバイオリアクター（発酵槽）よりな
り、この場合には、該方法のプロセス工学制御を改善するために、規定栄養培地
を使用することが好ましい。また、特に栄養を計量供給することにより（フェド
・バッチ）、著しくバイオマスおよび産物の生成を増加させることが可能である
。その他の点では、該方法は該振とうフラスコの場合と同様である。例えば、予
備段階の発酵槽および主段階の発酵槽を使用し、該培養温度は該振とうフラスコ
の場合と同様に選択する。該予備段階の発酵槽には、振とうフラスコ内の凍結培
養または単コロニーから一般に増殖させたいわゆる接種物を接種する。該発酵槽
においては及び特にその主段階においては、良好な通気および十分な誘導物質濃
度も確保されなければならない。しかし、いくつかの場合には、該誘導期を、該
振とうフラスコの場合より著しく長く行わなければならない。得られた細胞をも
う一度、更なる加工に付す。

【００３４】本発明の方法においては、例えば、Ｒ．Ｒｕｄｏｌｐｈら（１９９６）：Ｃｒ
ｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔ．Ｅ．（編），ＰｒｏｔｅｉｎＦｕｎｃｔｉｏｎ，ＡＰ
ｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，（１９９６），１
−３９；Ｒ．Ｒｕｄｏｌｐｈ：Ｈ．Ｔｓｃｈｅｓｃｈｅ（編），Ｍｏｄｅｒｎ
ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＰｒｏｔｅｉｎａｎｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ＤｅＧｒｕｙｔｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ，（１９９０），１４
９−１７１；Ｒ．Ｒｕｄｏｌｐｈ：Ｊ．Ｌ．Ｃｌｅｌａｎｄ＆Ｃ．Ｓ．Ｃｒ
ａｉｋ（編），ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ
ｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅｓ．Ｗｉｌｅｙ−ＬｉｓｓＩｎｃ．，（１９９
５），２８３−２９８に記載の公知方法により、該封入体を該宿主細胞から単離
する。

【００３５】例えば、該発酵を行った後、該細胞を遠心分離により集める。例えば低い回転
速度での単純な遠心分離による高圧分散により該細胞を破裂させた後、その中に
存在する封入体（ＩＢ）を得ることができる。ついで、例えばＮａＣｌ（例えば
０．５〜１．０Ｍ）および／または界面活性剤（例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１０
０）の存在下で該ＩＢを種々のバッファーに複数回再懸濁させることにより、所
望の標的タンパク質に関する純度を向上させることができる。通常、これにより
、該ＩＢ中の外来タンパク質のほとんどが除去される。残留外来タンパク質は、
通常、該自己タンパク質分解切断を妨げない。

【００３６】該可溶化は、通常、該ＩＢを例えばグアニジン含有バッファー（例えば０．１
Ｍトリス／ＨＣｌ、６．０Ｍグアニジン／ＨＣｌ、５ｍＭＥＤＴＡ、５０
ｍＭＤＴＴ）に溶解することにより行う（例えば、Ｒ．Ｒｕｄｏｌｐｈら，（
１９９６）；Ｒ．Ｒｕｄｏｌｐｈ（１９９０）、Ｒ．Ｒｕｄｏｌｐｈ（１９９５
），前掲を参照されたい）。不溶性物質を例えば遠心分離により除去した後、該
上清に関してタンパク質測定を行うことができる。

【００３７】該融合タンパク質からの該異種ポリペプチドの自己タンパク質分解切断は、該
可溶化物を切断バッファー（例えば１ｍｌの可溶化物＋９９ｍｌの切断バッファ
ー）、例えばトリス含有切断バッファー（好ましい濃度は０．８〜１．０Ｍ）ま
たはアルギニン含有切断バッファー（好ましくは、０．４〜０．６Ｍアルギニ
ンを含有する）で例えば中性ｐＨ、好ましくはｐＨ７．０〜７．５および例えば
３０℃未満の温度、好ましくは１０〜２０℃で希釈して該反応溶液を生成させる
ことにより行う（Ｒ．Ｒｕｄｏｌｐｈら，（１９９６），前掲も参照されたい）
。ついで該切断溶液を特定の時間、例えば１２時間インキュベートし、該Ｎ^ｐｒ ^ｏ切断の程度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析することができる。

【００３８】好ましい実施形態においては、該可溶化物をアルギニン含有バッファーで希釈
して、アルギニンの最終濃度を１．０Ｍまで、好ましくは０．４〜０．６Ｍとな
るようにする。あるいは、希釈は、適当なアルギニン含有切断バッファーに対し
て該可溶化封入体を透析することによっても可能である。

【００３９】該切断のための反応溶液の温度は、例えば、０℃〜３０℃である。該温度は、
好ましくは１０℃〜２０℃でありうる。

【００４０】該反応溶液のｐＨは、例えば、５．０〜９．０である。該ｐＨは、好ましくは
、７．０〜８．０、特に、７．０〜７．５である。

【００４１】適宜、該反応溶液は、０．５〜１００ｍＭの濃度のＤＴＴを含有する。該ＤＤ
Ｔ濃度は、好ましくは、約５．５ｍＭである。

【００４２】該切断中の該反応溶液中のタンパク質濃度は、例えば、２０〜１５０μｇ／ｍ
ｌの領域内でありうる。該タンパク質濃度は、好ましくは、４０μｇ／ｍｌ未満
である。

【００４３】該反応溶液は、該切断中に例えば１．０Ｍまでの濃度のトリス／ＨＣｌを含有
しうる。該トリス／ＨＣｌ濃度は、好ましくは、０．８Ｍ〜１．０Ｍである。

【００４４】アルギニン含有および／またはトリスＨＣｌ含有バッファーの代わりに、他の
緩衝系も可能である。

【００４５】特に好ましい実施形態においては、該切断バッファーのｐＨは７．０〜７．５
であり、該切断中の温度は１０℃〜２０℃であり、該タンパク質濃度は４０〜５
０μｇ／ｍｌを超えず、該切断バッファーは還元剤として約５ｍＭＤＴＴを含
有する。

【００４６】最後に、該融合タンパク質から切断された異種ポリペプチド質を、自体公知の
方法により単離する（例えば、Ｍ．Ｐ．Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ
ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＧｕｉｄｅｔｏＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆ
ｉｃａｔｉｏｎ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＩｎｃ．，（１９９０），３
０９−３９２）を参照されたい）。

【００４７】以下の実施例は本発明を例示するものであり、本発明の範囲を何ら限定するも
のではない。

【００４８】（実施例）実施例１：Ｎ^ｐｒｏ−ｈＧＨ（ヒト成長ホルモン）の発現およびインビトロ切断該融合タンパク質を、発現系（ベクターｐ１６０ＴＰ１および宿主Ｗ３１１０
）における大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）内での異種発現により
産生させる。該ベクターを構築するためのこの系内のすべての要素は、該大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノムに由来する。

【００４９】ｐ１６０ＴＰ１は、欠失したアテニュエーターを有する修飾大腸菌（Ｅ．ｃｏ
ｌｉ）ｔｒｐプロモーターの制御下で発現が生じるｐＢＲ３２２由来ベクターで
ある。同じオペロンからのアテニュエーターペプチドのシャイン・ダルガルノ配
列を、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）として使用する。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）
ｒｒｎＢ遺伝子由来の二重ターミネーターＴ１Ｔ２は、該構築物中に残存するｂ
ｌａ遺伝子ターミネーターと共に、該転写の効率的な終結を保証する。反時計回
り（すなわち、テトラサイクリン耐性遺伝子の配向の反対）の方向に、ｐＢＲ３
２２ＥｃｏＲＩ切断部位から、該発現カセットを挿入する。βラクタマーゼ遺
伝子（ｂｌａ）を該プロモーターと共に欠失させる。発現させる異種タンパク質
の構造遺伝子を、３５０６位のＸｂａＩ切断部位を介して（一般には、所望のサ
イズに切断されたＰＣＲ断片として）導入する。

【００５０】発現プラスミド（ＮＰＨ−ｐＥＴ）は、Ｎ^ｐｒｏ−ｈＧＨ構造遺伝子源として
働く。該プラスミドは、公知発現ベクターｐＥ１１ａ（Ｆ．Ｗ．Ｓｔｕｄｉｅｒ
ら，Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５（１９９０），６０−８９）を含
む。まず、Ｎ^ｐｒｏとＣＳＦＶヌクレオカプシドタンパク質とから構成される融
合タンパク質を、発現ベクター内にクローニングする。これにより、天然Ｎ^ｐｒ ^ｏ配列の最初の１６アミノ酸（ＭＥＬＮＨＦＥＬＬＹＫＴＳＫＱＫ）が１０アミ
ノ酸長のオリゴ−ヒスチジン精製補助体（ＭＡＳＨＨＨＨＨＨＨ）により置換さ
れる。ＳｐｅＩ切断部位を、標的化突然変異誘発により、Ｎ^ｐｒｏとヌクレオカ
プシドタンパク質との結合部において、得られた発現プラスミド内に導入する。
これは、ＳｐｅＩ（５’末端において）およびＸｈｏＩ（３’末端において）で
の制限酵素処理により該ベクターから該ヌクレオカプシドタンパク質の構造遺伝
子を欠失させうる。対応する線状化Ｎ^ｐｒｏ−ｐＥＴ１１ａベクターを、該ヌク
レオカプシド遺伝子断片から、分取ゲル電気泳動により取り出す。ついで、「付
着」ＳｐｅＩおよびＸｈｏＩ末端を介してｈＧＨ構造遺伝子を導入することが可
能である。

【００５１】この目的には、ｈＧＨ遺伝子に関する以下の予備的研究が必要である。高精度
ＰＣＲ（例えば、ＲｏｃｈｅＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓのＰｗｏポリメラーゼ
；手順は該製造業者により記載されているとおり）を用いて加工（プロセッシン
グ）されうる（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ヒト脳由来のｃＤＮＡバンクから該構造遺
伝子を増幅する。この目的には、以下のオリゴヌクレオチドを使用する：オリゴヌクレオチド１（「Ｎ末端」）：

【化３】オリゴヌクレオチド２（「Ｃ末端」）：

【化４】

【００５２】ＳｐｅＩ切断部位を５’末端に、ＸｈｏＩ切断部位を３’末端に、使用するオ
リゴヌクレオチドを介して導入する。また、翻訳の効率的な終結のために、二重
ｏｃｈｒｅ終結コドン（ＴＡＡＴＡＡ）を該構造遺伝子の末端に導入する。前端
のＳｐｅＩ切断部位は、前記のＮ^ｐｒｏ−ｐＥＴ１１ａベクターとリーディング
フレームが合った連結を可能にする。後端のＸｈｏＩ切断部位は定方向のクロー
ニングを可能にする。このようにして得られるプラスミドはＮＰＨ−ｐＥＴと称
される。

【００５３】このプラスミドＮＰＨ−ｐＥＴが、既に記載されているとおり、Ｎ^ｐｒｏ−ｈ
ＧＨ融合タンパク質の構造遺伝子源として使用するプラスミドである。この目的
のために、ＸｈｏＩで線状化されたプラスミドＮＰＨ−ｐＥＴを鋳型として使用
して、Ｐｗｏポリメラーゼによる高精度ＰＣＲを再び用いる。クローニング可能
な断片を得るために、以下のプライマーを使用する。該構造遺伝子の前端（該タンパク質のＮ末端に対応する）：

【化５】該構造遺伝子の後端（該タンパク質のＣ末端に対応する）：

【化６】

【００５４】後でクローニング（前および後）のために使用するＸｂａＩ切断部位は下線で
示されており、開始（ＡＴＧ）および終結（ＴＡＡＴＡＡ）コドンは大文字で示
されている。

【００５５】これらの２つのオリゴヌクレオチドは、Ｈｉｓ_７精製補助体および先行アミノ
酸（翻訳の開始に必要なメチオニンは例外である）が完全に欠失した融合タンパ
ク質（ＦＰ）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する構造遺伝子の
増幅をもたらす。

【００５６】Ｎ^ｐｒｏ−ｈＧＨ融合タンパク質のオープンリーディングフレームを含有する
ＰＣＲ断片の配列（１０７２ｂｐ）を以下に示す。開始コドンおよび２つの終結
コドンは太字で示されており、該クローニングに用いられるＸｂａＩ切断部位は
下線で示されている。

【００５７】

【化７】

【００５８】したがって、このＯＲＦは、以下に示す融合タンパク質をコードしており、そ
の２位のプロリンは天然Ｎ^ｐｒｏタンパク質の１７位のプロリンに対応する。し
たがって、Ｎ^ｐｒｏｈＧＨ融合タンパク質の配列（３４４アミノ酸であり、その
うちの１５３アミノ酸はＮ^ｐｒｏであり、１９１アミノ酸はｈＧＨである）は、
以下のとおりであり（Ｎ末端からＣ末端の方向に読取られる）、天然Ｎ^ｐｒｏ配
列からのプロリン１７（該融合タンパク質の２位）は斜体で示されており、該ｈ
ＧＨ配列は太字で示されている。

【００５９】

【化８】

【００６０】還元状態のＦＰは３９３１６．９２ｄのＭ_ｒを有し、可能な切断の後のＭ_ｒは、Ｎ^ｐｒｏ部分（還元型）に関しては１７２２０．０２ｄおよびｈＧＨ部分
（還元型）に関しては２２１１４．８８ｄであろう。Ｎ^ｐｒｏは６個のシステ
インを有し、ｈＧＨは４個のシステインを有する。細菌細胞質内では、これらの
システインの大部分は還元型であると考えられる。後続のプロセシング中に、お
そらく、ジスルフィド架橋の少なくとも部分的な形成が生じるのであろう。該融
合タンパク質内（またはＮ^ｐｒｏ部分内）のＮ末端メチオニンは、主として、該
宿主に固有のメチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）により切断され、それは
各場合においてＭ_ｒを約１３１ｄ減少させてそれぞれ３９１８６ｄ（ＦＰ）お
よび１７０８９ｄ（Ｎ^ｐｒｏ）にすると予想されるに違いない。

【００６１】記載されているＦＰの構造遺伝子を有するＰＣＲ断片を精製し、ＸｂａＩで切
断し、所望の２つの切断産物を該標的断片から取り出す。この断片を、記載され
ているとおりに発現ベクターｐ１６０ＴＰ１に連結する。

【００６２】この目的のために、該ベクターを、まず、ＸｂａＩで線状化し、仔ウシ腸ホス
ファターゼ（ＣＩＰ）で５’脱リン酸化する。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを連結に使
用する。該連結ＤＮＡをエレクトロポレーションにより大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ−１２ＤＨ１０Ｂ内に導入し、１５ｍｇ／Ｌテトラ
サイクリンを含有するルリア（Ｌｕｒｉａ）ブロス（ＬＢ）寒天プレート上でプ
レーティングする。この形質転換から多数のクローンコロニーが生じる。プラス
ミドＤＮＡをいくつかのクローンから単離し、正しいサイズと配向とを有するイ
ンサートの存在に関して制限酵素分析により検査する。１個のクローンを選択し
、制限酵素分析およびＤＮＡ配列決定による詳細な特徴づけに付す。該プラスミ
ドは、すべての研究における予測に従った挙動をする。このプラスミドはｐＮＰ
Ｈ１と称され、それを後続の研究に使用する。

【００６３】Ｎ^ｐｒｏ−ｈＧＨ発現プラスミドｐＮＰＨ１の配列（４８４０ｂｐ）を以下に
示す。該Ｎ^ｐｒｏ−ｈＧＨ融合タンパク質の開始コドンおよび終結コドンは下線
で示されている。この形態で示される場合、該オープンリーディングフレームは
逆方向に伸長する。

【００６４】

【化９】

【００６５】Ｎ^ｐｒｏ−ｈＧＨ融合タンパク質を発現させるための大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａｃｏｌｉ）宿主株は、生産性および生物学的安全性の考慮に基づき選
択される。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ−１２は、大腸菌（
Ｅ．ｃｏｌｉ）種の最も良く特徴づけられた系統であり（Ｂ．Ｊ．Ｂａｃｈｍａ
ｎｎ；ｉｎ：Ｊ．Ｌ．Ｉｎｇｒａｈａｍら，（編）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃ
ｏｌｉａｎｄＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ：ｃｅｌｌｕ
ｌａｒａｎｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｂｉｏｌｏｇｙ．ＡｍｅｒｉｃａｎＳ
ｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤ
．Ｃ．（１９８７ａ），ｐｐ．１１９１−１２１９；Ｂ．Ｊ．Ｂａｃｈｍａｎｎ
１９８７ｂ；ＢａｒｂａｒａＪ．（１９８７ｂ）Ｌｉｎｋａｇｅｍａｐ
ｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ−１２，第７版．Ｉｎ：Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｎｄＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒ
ｉｕｍ，Ｖｏｌ．２：Ｆ．Ｃ．Ｎｅｉｄｈａｒｄ編．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌ．，ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎＤＣ（１９８７ｂ），８０７−８７６；Ｋ
．Ｆ．Ｊｅｎｓｅｎ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７５（１９９３），３４０１
−３４０７）、その代表体は一般には安全であるとみなされている。

【００６６】大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ−１２Ｗ３１１０（ＡＴＣ
Ｃ２７３２５）は原栄養性（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｉｃ）誘導体であり、大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ−１２の野生型に非常に近く、異種タ
ンパク質を発現させるための宿主株としてしばしば使用される。それはＡｍｅｒ
ｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）に寄
託されており、以下の遺伝子型を有する：［Ｆ⁻ ｍｃｒＡｍｃｒＢＩＮ（ｒｒｎＤ−ｒｒｎＥ）１ラムダ⁻］。

【００６７】該株はＡＴＣＣから購入することができる。その増殖は、複合窒素源を含有し
ない完全合成培地上で優良であり、非常に有効なそのプロセス工学制御が可能で
ある。

【００６８】発現株Ｗ３１１０［ｐＮＰＨ１］は、前記発現プラスミドｐＮＰＨ１をＷ３１
１０内に形質転換することにより得られる。該形質転換は、１０％グリセロー
ルを懸濁媒体として使用するエレクトロポレーションにより行う。水中の５０ｎ
ｇ（１μＬ）のｐＮＰＨ１溶液を３０μＬのＷ３１１０細胞懸濁液と混合し、１
ｍｍキュベット（ＥｐｐｅｎｄｏｒｆＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｏｒ２５１
０）中で１８００Ｖのパルスに付す。該細胞をＳＯＣ培地に再懸濁させ、３７℃
で１時間振とうし、ついで１５ｍｇ／Ｌテトラサイクリンを含有するルリアブ
ロス寒天プレート上でプレーティングする。３７℃でのインキュベーション（一
晩）の後、この形質転換から多数のクローンが生じる。

【００６９】明瞭な縁を有する中等度のサイズのコロニーを拾う。それは適当な発現株Ｗ３
１１０［ｐＮＰＨ１］の基礎となる。該クローンを培養し、凍結アンプル内で−
８０℃で保存する（マスター細胞バンクＭＣＢ）。日常的な使用のために、該株
をＬＢ−テトラサイクリン寒天プレート上に画線する。

【００７０】株Ｗ３１１０［ｐＮＰＨ１］を寒天プレート上の単コロニーから継代培養し、
これを使用してルリアブロス＋１５ｍｇ／Ｌテトラサイクリン（１Ｌのバッフ
ルフラスコ内の２００ｍｌ）内の予備培養に接種する。該予備培養を２５０ｒｐ
ｍ、３０℃で１４時間振とうすると、この間に約１．０のＯＤ_６００に達する。
ついで予備培養の１０ｍｌ部分を使用して該主培養（各場合、１Ｌのバッフルフ
ラスコ内の３３０ｍｌのクエン酸培地）（３％接種物）に接種する。該ＯＤ_６ _００が０．８に増加するまで該主培養を３７℃（２５０ｒｐｍ）で成長させ、つ
いで該融合タンパク質の産生を培養１ｍＬ当たり５０μｇのインドールアクリル
酸で誘導する（最終濃度；１００％分析等級ＥｔＯＨ中のストック溶液５ｍｇ
／ｍＬ）。該培養物を更に、３７℃、２５０ｒｐｍで４時間培養すると、その間
に、該ＯＤ_６００は約１．５〜３．０に達する。

【００７１】該培養物を無菌５００ｍｌ遠心ボトルに移し、１０，０００ｇで３０分間遠心
分離する。該遠心分離上清を完全に廃棄し、該ペレットを更なる加工まで−８０
℃で凍結する。

【００７２】ついで約１２ｇ（湿潤重量）のＢＬ１２１（ＤＥ３）細胞ペレットを３０ｍ
Ｌの０．５ｍＭトリス／ＨＣｌ、５ｍＭベンズアミジン（ｐＨ８．０）に懸
濁させ、Ｕｌｔｒａｔｕｒｒａｘを使用してホモジナイズする。０．５ｍＭＥ
ＤＴＡおよび０．１（ｗ／ｖ）リゾチームの添加後、該細胞懸濁液を氷浴内で３
０分間インキュベートする。後続の超音波処理（各場合に２０秒間停止させて７
×２０秒間）は該細胞の完全な破壊を引き起こす。ついで１０ｍＭＭｇＣｌ_２および０．００６％（ｗ／ｖ）ＤＮアーゼを該破壊懸濁液に加え、４℃で３０分
間インキュベートする。ついで不溶性および可溶性構成成分を遠心分離（ＪＡ２
０；７７００ｇ）により分離する。該ペレットを４０ｍＬの５０ｍＭトリス／
ＨＣｌ、５ｍＭベンズアミジン、５ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）に懸濁させ
、再び遠心分離（ＪＡ２０；７７００ｇ）する。この工程を更に２回繰返し、得
られたペレットを４０ｍＬの２０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）に懸濁さ
せる。２０ｍＬの１．５ＭＮａＣｌ、６０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）を該
懸濁液に加え、氷浴内で３０分間インキュベートする。最後に、更なる遠心分離
（ＪＡ２０；７７００ｇ）およびＨ_２Ｏ洗浄工程を行う。得られたペレットはＮ ^ｐｒｏ −ｈＧＨＩＢ（封入体）物質に相当する。

【００７３】通常、この後、約１００ｍｇのＩＢ物質を２ｍＬの６．０Ｍ塩酸グアニジン
、０．１Ｍトリス、５ｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭＤＴＴ（ｐＨ９．０）に室
温で３０分間懸濁させる。ついで不溶性構成成分を遠心分離（１０分間／３００
００ｇ）により除去する。この上清に関してタンパク質測定を行う（タンパク質
濃度は約２０ｍｇ／ｍＬ）。このようにして得られた可溶化物は、切断試験で直
ちに使用するか又は−２０℃で保存する（最長７日間）。

【００７４】実施例２：種々の条件下での封入体融合タンパク質の切断Ｎ^ｐｒｏ部分の切断は、原則として、切断バッファー（塩酸グアニジンの残留
濃度＜０．０６Ｍ）中の１：１００（またはそれ以上の）の希釈度の該可溶化物
（前記を参照されたい）により可能である。この間のタンパク質濃度は、通常、
２０μｇ／ｍＬ（それ以外の場合には以下で指摘される）。

【００７５】さらに、切断バッファーに対する該可溶化物質の透析（１：１００）によりＮ ^ｐｒｏ部分の切断を達成することが可能である。

【００７６】該Ｎ^ｐｒｏ部分の切断の程度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより該切断産物を検出す
ることにより測定することができる。これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後で該
ポリアクリルアミドゲルを写真撮影し適当なバンドの強度を測定することを含む
。適当なバンドは、予備試験においてウエスタンブロットにより同定される。

【００７７】実施例２．１．アルギニンによるＮ^ｐｒｏ−ｈＧＨのインビトロ切断該切断は、切断バッファー（２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ、
５ｍＭＤＴＴ、ｐＨ７．０および特定のアルギニン濃度）中に該可溶化物を室
温で希釈（１：１００）することにより行う。該切断混合物中のタンパク質濃度
は２０μｇ／ｍＬである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に該切断産物を検出することによ
り、２４時間後の該切断の程度を測定する。

【００７８】アルギニンを該切断バッファーに加えることにより該Ｎ^ｐｒｏ切断効率が著し
く増加することが判明する。最大切断は０．４〜０．６Ｍアルギニンの濃度で
生じる。

【００７９】実施例２．２種々の温度におけるアルギンによるＮ^ｐｒｏ−ｈＧＨからのＮ ^ｐｒｏの切断該切断は、切断バッファー（２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ、
５ｍＭＤＴＴ、ｐＨ７．０−１．０Ｍアルギニン）中に該可溶化物を特定の
温度で希釈（１：１００）することにより行う。該切断混合物中のタンパク質濃
度は２０μｇ／ｍＬである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に該切断産物を検出することに
より、２４時間後の該切断の程度を測定する。

【００８０】最大切断は１０〜２０℃の温度で生じることが判明する。

【００８１】実施例２．３種々の温度におけるｐＨの関数としてのＮ^ｐｒｏ−ｈＧＨからのＮ^ｐｒｏの切断の程度該切断は、切断バッファー（２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ、
５ｍＭＤＴＴ、０．５Ｍアルギニン）中に該可溶化物を特定のｐＨで希釈（
１：１００）することにより行う。該切断混合物中のタンパク質濃度は２０μｇ
／ｍＬである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に該切断産物を検出することにより、２４時
間後の該切断の程度を測定した。

【００８２】該切断バッファー中のｐＨをｐＨ５．０から９．０まで系統的に変化させる。
用いたアルギニン濃度の範囲内では、７．０〜７．５のｐＨが該Ｎ^ｐｒｏ融合タ
ンパク質の切断に最適である。

【００８３】実施例２．４：種々のＤＴＴ濃度におけるＮ^ｐｒｏ−ｈＧＨからのＮ^ｐｒｏの切断ＤＴＴ濃度に対する該切断効率の依存性を調べる。

【００８４】該切断は、切断バッファー（２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ、
ｐＨ７．０、０．５Ｍアルギニン、０〜１００ｍＭＤＴＴ（１５℃））中に
該可溶化物を希釈（１：１００）することにより行う。該可溶化物中のＤＴＴ濃
度のため、「０ｍＭＤＴＴ」の混合物は依然として０．５ｍＭＤＴＴを含有す
る。該切断混合物中のタンパク質濃度は２０μｇ／ｍＬである。ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ後に該切断産物を検出することにより、２４時間後の該切断の程度を測定する
。

【００８５】Ｎ^ｐｒｏ部分の最大切断は約５．５ｍＭＤＴＴで達せられる。

【００８６】実施例２．５Ｎ^ｐｒｏ−ｈＧＨの切断のための可溶化物中のｐＨの変化該切断は、切断バッファー（２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ、
５ｍＭＤＴＴ、ｐＨ７．０、０〜０．８Ｍアルギニン（１５℃））中に該可
溶化物を種々のｐＨ値（ｐＨ６．０、ｐＨ７．０、ｐＨ８．０、ｐＨ９．０）で
希釈（１：１００）することにより行う。ＩＢと混合する前に、該可溶化バッフ
ァーを適当なｐＨ値に滴定することにより、該ｐＨ値を調節する。該切断混合物
中のタンパク質濃度は２０μｇ／ｍＬである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に該切断産物
を検出することにより、２４時間後の該切断の程度を測定する。

【００８７】該可溶化物中の７．０〜８．０のｐＨが最適であることが判明する。

【００８８】実施例２．６：Ｎ^ｐｒｏ−ｈＧＨからのＮ^ｐｒｏの切断の速度論変性Ｎ^ｐｒｏ−ｈＧＨの再活性化を、２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、０．５Ｍ
アルギニン、２ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＤＴＴ、ｐＨ７．０中、１５℃での
希釈により開始する。

【００８９】約２４時間後に該切断の終点に達することが判明する。

【００９０】実施例２．７種々のタンパク質濃度での希釈によるＮ^ｐｒｏ−ｈＧＨからのＮ^ｐｒｏの切断該切断は、切断バッファー（２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、０．５Ｍアルギニ
ン、２ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭＤＴＴ、ｐＨ７．０（１５℃））中に該可溶
化物を希釈（１：１００）することにより行う。約２４時間後に該切断が生じた
か否かを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に該切断産物を検出することにより確認する。

【００９１】４０μｇ／ｍＬ以上のタンパク質濃度は該切断効率における顕著な減少を招く
ことが判明する。更なる試験は、最適タンパク質濃度が２０〜４０μｇ／ｍｌで
あることを示している。

【００９２】実施例２．８：タンパク質濃度の関数としての透析によるＮ^ｐｒｏ−ｈＧＨからのＮ^ｐｒｏの切断２０ｍＭトリス／ＨＣｌ、０．５Ｍアルギニン、２ｍＭＥＤＴＡ、１０
ｍＭＤＤＴ、ｐＨ７．０に対する４℃における透析（１：１００）により、塩
酸グアニジンを可溶化Ｎ^ｐｒｏ−ｈＧＨＩＢ物質から除去し、それにより該切
断を開始する。約２４時間後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて、Ｎ^ｐｒｏ−ｈＧＨの
切断が生じたことに関して分析する。該Ｎ^ｐｒｏ部分の切断は、該可溶化物質の
希釈だけではなくその透析によっても達成されうることが判明する。

【００９３】実施例２．９：トリス／ＨＣｌ濃度の関数としてのＮ^ｐｒｏ−ｈＧＨからのＮ ^ｐｒｏの切断の効率該切断は、切断バッファー（２ｍＭＥＤＴＡ、２０ｍＭＤＴＴ、ｐＨ７．
０、０．１〜１．０Ｍトリス／ＨＣｌ（１５℃））中に該可溶化物を希釈（１
：１００）することにより行う。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後に該切断産物を検出するこ
とにより、２４時間後の該切断を確認した。

【００９４】該バッファー中のトリス／ＨＣｌ濃度を０．８Ｍまで増加させると該Ｎ^ｐｒｏ融合タンパク質切断収率が向上することが判明する。これを上回る増加は、該Ｎ ^ｐｒｏ切断の測定可能な増強を引き起こさない。

【００９５】したがって、該反応は０．８〜１．０Ｍのトリス／ＨＣｌ濃度で好ましく生じ
るはずである。

【００９６】実施例３：Ｎ^ｐｒｏ−ｐＧＨ（ブタ成長ホルモン）の発現およびインビトロ切断Ｎ^ｐｒｏ−ｐＧＨ発現ベクターの産生をｐＮＰＨ１から開始させる（実施例１
を参照されたい）。該プラスミドをＢｇｌＩＩで線状化し、ＰＣＲにより増幅す
る。これは、ｈＧＨ構造遺伝子領域以外の全プラスミド（Ｐｈｅ１のコドン〜Ｐ
ｈｅ１９１のコドン）をＰｗｏポリメラーゼと５’−リン酸を有さないプライマ
ーとで増幅することを含む。精製されたＰＣＲ断片を、ｐＧＨ構造遺伝子との連
結におけるベクターとして使用する。５’−リン酸の除去（例えば、仔ウシ腸ホ
スファターゼ、北極シュリンプアルカリホスファターゼを使用するもの）は自己
連結による環化を防ぐ。

【００９７】同様にして、該ｐＧＨ構造遺伝子をＰＣＲ増幅により得る。使用する鋳型はブ
タｃＤＮＡバンク（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈからのブタ肝臓５’伸長ｃＤＮＡ
ライブラリーまたはブタ脳または下垂体ｃＤＮＡバンク）である。該増幅には以
下のプライマーを使用し、各場合において該合成中に５’−リン酸がそれらに付
与される：該構造遺伝子の前端（該タンパク質のＮ末端に対応する）（Ｐｈｅ１〜Ｓｅｒ７
）

【化１０】該構造遺伝子の後端（該タンパク質のＣ末端に対応する）（Ｐｈｅ１９０〜Ｖａ
ｌ１８４）

【化１１】

【００９８】該ＰＣＲ断片は、専ら、成熟ｐＧＨのＯＲＦ（構造遺伝子）を含有する。連結
（Ｔ４ＤＮＡリガーゼ）は、ｐＮＰＨ１のものに類似したＮ^ｐｒｏ−ｐＧＨの
ＯＲＦを与える。後記の融合タンパク質はこのＯＲＦによりコードされる。該連
結ＤＮＡをエレクトロポレーションにより大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃ
ｏｌｉ）Ｋ−１２ＤＨ１０Ｂ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから供給
されたエレクトロコンピテント細胞、遺伝子型Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌ
ｉＫ−１２Ｆ⁻ ｍｃｒＡ Δ（ｍｒｒ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｃｒＢＣ）φ８
０ｌａｃＺΔＭ１５ ΔｌａｃＸ７４ｄｅｏＲｒｅｃＡ１ｅｎｄＡ１ａ
ｒａＤ１３９Δ（ａｒａ，ｌｅｕ）７６９７ｇａｌＵｇａｌＫ λ−ｒｐｓ
ＬｎｕｐＧ）内に導入し、１５ｍｇ／Ｌテトラサイクリンを含有するルリア
ブロス（ＬＢ）寒天プレート上でプレーティングする。この形質転換は多数のク
ローンコロニーを与える。該プラスミドＤＮＡをいくつかのクローンから単離し
、正しいサイズと配向との存在に関して制限酵素分析により検査する。１個のク
ローンを選択し、制限酵素分析およびＤＮＡ配列決定による詳細な特徴づけに付
す。該プラスミドは、すべての研究における予測に従った挙動をする。このプラ
スミドはｐＮＰＰ１と称され、それを後続の研究に使用する。

【００９９】Ｎ^ｐｒｏ−ｐＧＨ融合タンパク質の以下のアミノ酸配列（Ｎ末端からＣ末端の
方向に読取られる）（３４２アミノ酸であり、そのうちの１５３アミノ酸はＮ^ｐ ^ｒｏであり、１８９アミノ酸はｐＧＨである）においては、天然Ｎ^ｐｒｏ配列か
らのプロリン１７（該融合タンパク質の２位）は斜体で示されており、該ｐＧＨ
配列は太字で示されている。

【０１００】

【化１２】

【０１０１】還元状態のＦＰは３８８１９．８２ｄのＭ_ｒを有し、可能な切断の後のＭ_ｒは、Ｎ^ｐｒｏ部分（還元型）に関しては１７２２０．０２ｄおよびｐＧＨ部分
（還元型）に関しては２１６１７．７９ｄであろう。Ｎ^ｐｒｏは６個のシステ
インを有し、ｐＧＨは４個のシステインを有する。細菌細胞質内では、これらの
システインの大部分は還元型であると考えられる。後続のプロセシング中に、お
そらく、ジスルフィド架橋の少なくとも部分的な形成が生じるのであろう。該融
合タンパク質内（またはＮ^ｐｒｏ部分内）のＮ末端メチオニンは、主として、該
宿主に固有のメチオニンアミノペプチダーゼ（ＭＡＰ）により切断され、それは
各場合においてＭ_ｒを約１３１ｄ減少させてそれぞれ３８６８９ｄ（ＦＰ）お
よび１７０８９ｄ（Ｎ^ｐｒｏ）にすると予想されるに違いない。

【０１０２】実施例１に記載のとおりに、発現プラスミドｐＮＰＰ１を大腸菌（Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ−１２Ｗ３１１０内に形質転換（エレクトロポレ
ーション）することにより、発現株Ｗ３１１０［ｐＮＰＨ１］を産生させる。こ
の場合にもまた、詳細な特徴づけさえも、予想される制限酵素処理パターンから
の逸脱を何ら示さなかった。

【０１０３】明瞭な縁を有する中等度のサイズのコロニーを該形質転換プレートから拾う。
それは発現株Ｗ３１１０［ｐＮＰＰ１］の基礎となる。該クローンを培養し、凍
結アンプル内で−８０℃で保存する（マスター細胞バンクＭＣＢ）。日常的な使
用のために、該株をＬＢ−テトラサイクリン寒天プレート上に画線する。

【０１０４】該Ｎ^ｐｒｏ−ｈＧＨ融合タンパク質に関して実施例１に記載されているとおり
に、該Ｎ^ｐｒｏ−ｐＧＨ融合タンパク質の発現を行う。

【０１０５】Ｎ^ｐｒｏ−ｈＧＨ融合タンパク質に関して実施例１に記載されているとおりに
、Ｎ^ｐｒｏ−ｐＧＨＩＢの調製を行う。

【０１０６】実施例４：Ｎ^ｐｒｏ−ｐＧＨからのＮ^ｐｒｏのインビトロ切断Ｎ^ｐｒｏ−ｈＧＨに関して前記したものに対応する可溶化および再生試験を、
Ｎ^ｐｒｏ−ｐＧＨ融合タンパク質に関して行う。既に記載されているパラメータ
ー（前記を参照されたい）を変化させた後、該Ｎ^ｐｒｏ−ｐＧＨ融合タンパク質
の場合においても可溶化および再生後にＮ^ｐｒｏ部分のインビトロ切断が可能で
あることが判明する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者クナオゼデル，フランツオーストリア国、アー−6322・キルヒビヒル、オーバーンドルフ・306 Ｆターム(参考） 4B064 AG13 CA02 CA19 CA21 CB06 CC24 DA01

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ｉ）融合タンパク質（該融合タンパク質は、ペスチウイル
スの自己プロテアーゼＮ^ｐｒｏの自己タンパク質分解機能を示す第１ポリペプチ
ドと該第１ポリペプチドのＣ末端において該第１ポリペプチドに結合した第２ポ
リペプチドとを含み、該第２ポリペプチドは、該第１ポリペプチドの自己タンパ
ク質分解活性により該融合タンパク質から切断されることが可能であり、該第２
ポリペプチドは異種ポリペプチドである）をコードする核酸分子を含む発現ベク
ターで形質転換された細菌宿主細胞を培養し（該培養は、該融合タンパク質の発
現および対応する細胞質封入体の形成を引き起こす条件下で行う）、（ｉｉ）該宿主細胞から該封入体を単離し、（ｉｉｉ）単離された封入体を可溶化し、（ｉｖ）該可溶化物を希釈して、該融合タンパク質からの該異種ポリペプチドの
自己タンパク質分解が行われる反応溶液を得、（ｖ）切断された異種ポリペプチドを単離することを含んでなる、異種ポリペプ
チドの組換え製造方法。
【請求項２】該ペスチウイルスが、ＣＳＦＶ、ＢＤＶおよびＢＶＤＶより
なる群から選ばれる、請求項１記載の製造方法。
【請求項３】該ペスチウイルスがＣＳＦＶである、請求項２記載の製造方
法。
【請求項４】該第１ポリペプチドがアミノ酸配列：【化１】または自己タンパク質分解活性を有するその誘導体のアミノ酸配列を含む、請求
項３記載の製造方法。
【請求項５】該第１ポリペプチドがＣＳＦＶの自己プロテアーゼＮ^ｐｒｏのアミノ酸配列Ｇｌｕ２２−Ｃｙｓ１６８または自己タンパク質分解活性を有す
るその誘導体を含み、該第１ポリペプチドが更にＭｅｔをＮ末端として有し、該
異種ポリペプチドがＣＳＦＶの自己プロテアーゼＮ^ｐｒｏのアミノ酸Ｃｙｓ１６
８に直接的に結合している、請求項３記載の製造方法。
【請求項６】該第１ポリペプチドがＣＳＦＶの自己プロテアーゼＮ^ｐｒｏのアミノ酸配列Ｐｒｏ１７−Ｃｙｓ１６８または自己タンパク質分解活性を有す
るその誘導体を含み、該第１ポリペプチドが更にＭｅｔをＮ末端として有し、該
異種ポリペプチドがＣＳＦＶの自己プロテアーゼＮ^ｐｒｏのアミノ酸Ｃｙｓ１６
８に直接的に結合している、請求項３記載の製造方法。
【請求項７】該核酸分子がＤＮＡ分子である、請求項１〜６のいずれか１
項記載の製造方法。
【請求項８】該発現ベクターがプラスミドである、請求項１〜７のいずれ
か１項記載の製造方法。
【請求項９】該細菌宿主細胞が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である、請求
項１〜８のいずれか１項記載の製造方法。