NO328339B1 - Fremgangsmate for rekombinant fremstilling av heterologt polypeptid. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for rekombinant fremstilling av et ønsket heterologt polypeptid med en klart definert homogen N-terminal ende i en bakterie vertscelle, hvori det først fremstilles et fusjonsprotein som omfatter et peptid som har den autoproteolytiske aktiviteten til en autoprotease N<pro> i et pestivirus, og det heterologe polypeptidet fremstilles i form av cytoplasmiske inklusjonslegemer i vertscellen, og deretter isoleres inklusjonslegemene og behandles på en slik måte at det ønskede heterologe polypeptidet spaltes fra fusjonsproteinet ved den N<pro> autoproteolytiske aktiviteten.

I fremstillingen av rekombinante proteiner i heterologe organismer, slik som ekspresjonen av humane eller andre eukaryote proteiner i bakterieceller, er det ofte vanskelig å oppnå en klart definert N-terminal ende som er så nær 100% homogen som mulig. Dette gjelder særlig rekombinante farmasøytiske proteiner, hvis aminosyresekvens i mange tilfeller burde være identisk med aminosyresekvensen som er naturlig forekommende i mennesker/dyr.

Ved naturlig ekspresjon i for eksempel mennesker, transporteres mange farmasøytiske proteiner som er i bruk, inn i det ekstracellulære rommet, og spalting av signalsekven-sen som er tilstede i forløperproteinet til dette formålet, resulterer i en klart definert N-terminal ende. En slik homogen N-terminal ende er av flere grunner ikke alltid enkel å fremstille i for eksempel bakterieceller.

Ved fremstilling i industriell skala, fremstilles mange farmasøytiske proteiner i cytoplasmaet til bakterieceller (for eksempel Escherichia coli) fordi akkumulering derav i tilstrekkelige mengder er mulig, og dessuten dannes ofte inklusjonslegemer (IBer) som er fordelaktige i opparbeidelse og rensing. I tillegg er proteinene som ekspresseres i fonn av IBer beskyttet mot protease-nedbryting av intracellulære proteaser (R. Rudolph, i: Protein Engineering: Principles and Practices. Eds. Jeffrey L. Cleland og Charles S. Craik, John Wiley & Sons Inc., (1995), ISBN 0-471-10354-3).

Fremstilling av IB-materiale krever imidlertid //; vitro refolding av det ekspresserte proteinet. Dette kan i mange tilfeller skje ved fremgangsmåter som i seg selv er kjent (R. Rudolph et. al. (1996), i: Protein Function: A Practical Approach, Ed.: Creighton, T. E., 1-39). For å gjøre dette, løses proteinene som er i form av IBer, ved å tilsette sterke de-natureringsmidler under reduserende betingelser, og renatureres deretter.

Kun i sjeldne tilfeller er eksport inn i bakterie-periplasmaet ved hjelp av en pro- eller eukaryot signalsekvens egnet, fordi det vanligvis kun er mulig å akkumulere svært små mengder av produkt her på grunn av den lave transportkapasiteten til det bakterielle eksportmaskineriet.

Bakterie-cytoplasmaet skiller seg imidlertid betydelig fra det ekstracellulære rommet i eukaryoter. På en side er reduserende betingelser tilstede deri, og på den annen side er det ingen mekanisme for å spalte N-terminal ledersekvenser for å danne modne proteiner. Syntesen av alle cytoplasmiske proteiner begynner med et metionin som er spesifi-sert av den riktige startkodon (ATG = initiering av translasjon). Dette N-terminale metioninet er beholdt i mange proteiner, mens i andre spaltes den av metionin aminopeptidasen (MAP) som er tilstede i cytoplasmaet og er i det indre ("intrinsic") av verten. Ef-fektiviteten av spaltingen avhenger vesentlig av to parametere: 1. egenskapene til de følgende aminosyrene og 2. lokaliseringen av N-terminalen i den tredimensjonale struk-turen til proteinet. Det N-terminale metioninet deleteres fortrinnsvis når den følgende aminosyren er serin, alanin, glycin, metionin eller valin og når N-terminalen er eksponert, dvs. ikke "gjemt" inni proteinet. På den annen side, dersom den følgende aminosyren er en annen, spesielt en ladet en (glutaminsyre, asparaginsyre, lysin, arginin) eller dersom N-terminalen er lokalisert inni proteinet, forekommer i de fleste tilfeller ikke spalting av det N-terminale metioninet (Knippers, Rolf (1995) Molekulare Genetik., 6th edition, Georg Thieme Verlag. Stuttgart, New York. ISBN 3-13-103916-7).

Og til og med dersom en aminosyre som fremmer spaltingen er tilstede i posisjon 2, er spaltingen sjelden fullstendig. Det er vanlig for en ikke ubetydelig del (1-50%) å være uberørt av MAP.

I de tidlige tidene av fremstilling av rekombinante farmasøytiske proteiner i bakterieceller, var fremgangsmåten ganske enkelt å sette en metioninkodende ATG-startkodon foran en åpen leseramme (ORF) for det modne (dvs. uten signalsekvens eller annen N-terminal forlengelse) proteinet. Det uttrykte proteinet hadde da sekvensen fyN-Met-målprotein. Det var kun i noen få tilfeller mulig å oppnå fullstendig spalting av det N-terminale metioninet med MAP i vertens indre. Mesteparten av proteinene som fremstilles på denne måten er derfor enten inhomogene i forhold til deres N-terminale ende (blanding av Met-form og Met-fri form) eller de har alle en ytterligere fremmed aminosyre (Met) ved N-terminalen (kun Met-form).

Denne inhomogeniteten eller avvik fra den naturlige sekvensen er imidlertid uaksepta-bel i mange tilfeller, fordi disse produktene ofte viser forskjellige immunologiske (for

eksempel induksjon av antistoffdannelse) og farmakologiske (halveringstid, farmakoki-netiske) egenskaper. Av denne grunn er det nå nødvendig i de fleste tilfeller å fremstille et produkt som er identisk med det naturlig forekommende (homogent og uten fremmede aminosyrer ved N-terminalen). I tilfellet med cytoplasmisk ekspresjon, er middelet

her i de fleste tilfeller å fusere en spaltingssekvens (leder) for en spesifikk endopeptidase (for eksempel faktor Xa, enterokinase, KEX endopeptidase, IgA protease) eller aminopeptidase (for eksempel dipeptidyl aminopeptidase) til N-terminalen i målproteinet. Dette utgjør imidlertid et ekstra trinn med forbruk av kostnader og materialer, som er nødvendig iløpet av videre opparbeidelse, den såkalte nedstrøms prosesseringen av pro-duktet. I tillegg er det, i nærvær av IBer, i mange tilfeller interferens med, eller til og med fullstendig forhindring av refoldingen av ledersekvensen.

Det er derfor behov for en fremgangsmåte til fremstilling av et ønsket heterologt målprotein som uttrykkes i form av inklusjonslegemer i bakterieceller, fra hvilke målproteinet da kan fremstilles med en uniform, ønsket N-terminal ende. En slik fremgangsmåte til fremstilling av et ønsket målprotein fra inklusjonslegemer, som anvender den virale autoproteasen N<pr0> fra pestivirus, er utviklet innen omfanget av foreliggende oppfinnelse.

I kjent teknikk er det også beskrevet andre systemer for spalting av polypeptider:

EP 0 321 973 beskriver anvendelse av virale proteaser, spesielt proteasen P2A fra en Picornavirus (HRV2), for spalting av visse fusjonsproteiner.

WO 99/10503 beskriver zymogene proteaseforløpere som aktiveres autokatalytisk og deres anvendelse.

Rumenaph et al., Journal of Virology, vol. 73, nr. 3, 1998, s. 2544-2547 beskriver in vitro eksperimenter som viser den autoproteolytiske aktivitet av N<pro->polypeptidet som spalter av det virale kappeprotein C, som er den naturlig forekommende nabo til N<pi>° i et viralt polyprotein.

Pestivirus utgjør en gruppe patogener som forårsaker alvorlige økonomiske tap i griser og drøvtyggere over hele verden. Som patogenet til en meldepliktig overførbar sykdom, er det klassiske svinefeberviruset (CSFV) spesielt viktig. Tapene som er forårsaket av bovint viralt diarrhoea virus (BVDV) er også betydelige, særlig gjennom den vanlige forekomsten i intrauterine infeksjoner hos fostre.

Pestivirus er små innhyllet virus med et genom som virker direkte som mRNA og er av 12.3 kb størrelse, og fra hvilket de virale genproduktene transkriberes i cytoplasmaet. Dette foregår i form av et enkelt polyprotein som omfatter omkring 4000 aminosyrer og som brytes ned både av virale og av cellulære proteaser til omkring 12 modne proteiner.

Hittil er to viruskodede proteaser påvist i pestivirus, autoprotease N<pro> og serinprotease NS3. Den N-terminale proteasen N<pr0> er lokalisert ved N-terminalen til polyproteinet og har en tydelig molekylærmasse på 23 kd. Den katalyserer en spalting som foregår mellom dens egen C-terminale ende (Cysl68) og N-terminalen (Serl69) i nukleokapsel protein C (R. Stark et al., J. Virol. 67 (1993), 7088-7095). I tillegg er det beskrevet dup-likeringer av N<pi0->genet i cytopatogent BVDV virus. I disse er det en andre kopi av N<p>'° ved N-terminalen til den likeledes duplikerte NS3 proteasen. En aiitoproteolytisk spalting av N<pr0->NS3 proteinet er observert i dette tilfellet også (R. Stark et al., se over).

N<pro> er en autoprotease med en lengde på 168 aminosyrer og en tydelig Mr på omkring 20 000 d ( in vivo). Det er det første proteinet i polyproteinet til pestivirus (CSF, BDV (border disease virus) eller BVDV) og undergår autoproteolytisk spalting fra det føl-gende nukleokapsel protein C (M. Wiskerchen et al., J. Virol. 65 (1991), 4508-4514, Stark et al., J. Virol. 67 (1993), 7088-7095). Denne spaltingen foregår etter den siste aminosyren i sekvensen til N<pro>, Cysl68.

Det er nå overraskende funnet innen omfanget av foreliggende oppfinnelse, at den autoproteolytiske funksjonen til autoproteasen N<pro> kan utnyttes til spalting av et heterologt polypeptid fra et fusjonsprotein som er uttrykt i fonn av inklusjonslegemer i et bak-terielt ekspresjonssystem og som omfatter en autoprotease N<pr0> fra et pestivirus samt det heterologe polypeptidet. Dette fastsetter uspaltet N<p>,° fusjonsprotein som er isolert fra inklusjonslegemer, oppløst og spaltet iløpet av refolding.

I et aspekt angår derfor foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for rekombinant fremstilling av et heterologt polypeptid som omfatter

(i) dyrking av en bakterievertcelle som er transformert med en ekspresjonsvektor som omfatter et nukleinsyremolekyl som koder for et fusjonsprotein, fusjonsproteinet omfatter et første polypeptid som har den autoproteolytiske funksjonen til en autoprotease N<pro> fra et pestivirus, og et andre polypeptid som er forbundet med det første polypeptidet i C-terminalen til det første polypeptidet på en måte slik at det andre polypeptidet er istand til å bli spaltet fra fusjonsproteinet av den autoproteolytiske aktiviteten til det første polypeptidet, og det andre polypeptidet er et heterologt polypeptid, hvori dyrking foregår under betingelser som forårsaker ekspresjon av fusjonsproteinet og dannelse av korresponderende cytoplasmiske inklusjonslegemer,

(ii) isolering av inklusjonslegemet fra vertscellen,

(iii) oppløsning av de isolerte inklusjonslegemene,

(iv) fortynning av oppløsningen for å gi en reaksjonsløsning hvori den autoproteolytiske spaltingen av det heterologe polypeptidet fra fusjonsproteinet er utført, og (v) isolering av det spaltede heterologe polypeptidet.

Et polypeptid med den autoproteolytiske funksjonen til en autoprotease N<pro> fra et pestivirus er særlig en autoprotease N<pro> fra et pestivirus eller et derivat derav med autoproteolytisk aktivitet.

Betegnelsen "heterologt polypeptid" betyr i foreliggende oppfinnelse et polypeptid som ikke naturlig spaltes av en autoprotease N<pro> i et pestivirus, fra et naturlig forekommende fusjonsprotein eller polyprotein. Eksempler på heterologe polypeptider er industrielle enzymer (prosessenzymer) eller polypeptider med farmasøytisk, spesielt human farma-søytisk aktivitet.

Eksempler på foretrukne polypeptider med human farmasøytisk aktivitet er cytokiner, slike som interleukiner, for eksempel IL-6, interferoner, slike som leukocyttinterferoner, for eksempel interferon ot2B, vekstfaktorer, særlig haemopoietiske eller sårhelende vekstfaktorer, slik som G-CSF, erytropoietin eller IGF, hormoner slike som humant veksthormon (hGH), antistoffer eller vaksiner.

I fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er pestiviruset fortrinnsvis valgt fra gruppen av CSFV, BDV og BVDV, hvor CSFV er spesielt foretrukket.

Videre preferanse er gitt til en fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse, hvori det første polypeptidet i fusjonsproteinet omfatter følgende aminosyresekvens til autoproteasen N<pro> fra CSFV (se også EMBL database tilgangsnummer X87939) (aminosyrer 1 til 168, lest i N-terminal til C-terminal retning)

eller aminosyresekvensen til et derivat derav med autoproteolytisk aktivitet.

Et polypeptid som har den autoproteolytiske aktiviteten til en autoprotease N<pro> kan og-så være et derivat av en autoprotease N<pro> fra et pestivirus som er avledet fra denne autoproteasen N<pro> fra et pestivirus ved mutagenese, særlig aminosyre substitusjon, dele-sjon, addisjon og/eller aminosyreinnskudd, så lenge den nødvendige autoproteolytiske aktiviteten, spesielt for dannelse av et ønsket heterologt polypeptid med homogen N-terminal ende, er beholdt. Fremgangsmåter for å danne slike derivater ved mutagenese er kjent for fagmannen. Det er mulig ved slike mutasjoner å optimalisere aktiviteten til autoproteasen N<pr0> i forhold til forskjellige heterologe proteiner som skal spaltes fra fusjonsproteinet. Etter fremstilling av en nukleinsyre som koder for et fusjonsprotein som, i tillegg til det ønskede heterologe proteinet, omfatter et autoprotease N<pr0> derivat som har en eller flere mutasjoner, ved sammenligning med en naturlig forekommende autoprotease N<pro>, er det påvist om den påkrevde funksjonen er tilstede ved å bestemme den autoproteolytiske aktiviteten.

Den autoproteolytiske aktiviteten kan påvises for eksempel ved initielt å løse de isoler-te/rensede IBenei 7M guanidin/HCl løsning og deretter fortynne 1:100 i reaksjonsløs-ning. Etter inkubering i omkring 24 timer, undersøkes reaksjonsløsningen på SDS-PAGE for om spalting har funnet sted. Et Western blot utføres for å påvise proporsjonen prosessert og uprosessert. Proporsjonen av spaltet materiale bestemmes ved densitomet-risk analyse av den Coomassie-fargede SDS-PAGE gelen.

En foretrukket fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse er for eksempel en hvor ekspresjonsvektoren omfatter et nukleinsyremolekyl som koder for et fusjonsprotein som har en N-terminal område, hvor en eller flere aminosyrer er deletert eller substituert i området til aminosyrene 2 til 21, så lenge det resulterende derivatet fortsetter å ha den autokatalytiske funksjonen til autoproteasen N<pro> i ønsket grad. Til formålet i foreliggende oppfinnelse, omfatter autoprotease N<pro> derivater som er foretrukket i fusjonsproteinet, for eksempel aminosyresekvensen til autoproteasen N<pr0> fra CSFV med en dele-sjon av aminosyre 2 til 16 eller 2 til 21. Det er også mulig ved aminosyresubstitusjon eller addisjon, å bytte eller innføre aminosyresekvenser for eksempel for å introdusere en aminosyresekvens som assisterer rensing.

Et nukleinsyremolekyl som er spesielt foretrukket i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, koder for et fusjonsprotein hvori det første polypeptidet omfatter aminosyresekvensen Glu22 til Cysl68 i autoproteasen N<pro> fra CSFV eller et derivat derav med autoproteolytisk aktivitet, det første polypeptidet har dessuten et Met som N-terminal, og det heterologe polypeptidet er direkte forbundet med aminosyren Cysl68 i autoproteasen N<pro> fra CSFV.

Et nukleinsyremolekyl som er like foretrukket i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, koder for et fusjonsprotein, hvori det første polypeptidet omfatter aminosyresekvensen Prol7 til Cysl68 i autoprotease N<p>'° fra CSFV eller et derivat derav med autoproteolytisk aktivitet, det første polypeptidet har dessuten et Met som N-terminal, og det heterologe polypeptidet er direkte bundet til aminosyre Cysl68 i autoprotease N<pro> fra CSFV.

Nevnte nukleinsyremolekyl er, særlig, i form av et DNA molekyl i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.

En ekspresjonsvektor som benyttes i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter fortrinnsvis minst en ekspresjonskontrollsekvens. Ekspresjonskontrollsekven-ser er spesielt promotere (slik som lac, tac, T3, T7, trp, gac, vhb, lambda pL eller phoA), ribosombindingsseter (for eksempel naturlige ribosombindingsseter som tilhører til de ovenfor nevnte promotere, cro eller syntetiske ribosombindingsseter) eller tran-skripsjonsterminatorer (for eksempel rrnB T1T2 eller bla). Den ovenfor nevnte vertscellen er fortrinnsvis en bakteriecelle av arten Escherichia, særlig E. coli. Imidlertid er det også mulig å anvende andre bakterieceller (se nedenfor). I en foretrukket utførelses-form er ekspresjonsvektoren et plasmid.

En bakterievertcelle som benyttes i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse

kan velges for eksempel fra gruppen av følgende mikroorganismer: Gram-negative bakterier, slik som Escherichia arter, for eksempel E. coli eller andre gram-negative bakterier, for eksempel Pseudomonas sp., slik som Pseudomonas aeruginosa eller Caulobacter sp., slik som Caulobacter crescentus eller gram-positive bakterier slik som Bacillus sp., spesielt Bacillus subtilis. E. coli er spesielt foretrukket som vertscelle.

Bakterievertcellen, dvs. ekspresjonsstammen, dyrkes i overensstemmelse med mikrobi-ologisk praksis som i seg selv er kjent. Stammen fremstilles stort sett ved å starte fra en enkelt koloni i et næringsmedium, men det er også mulig å benytte cryopreserverte cel-lesuspensjoner (cellebanker). Stammen dyrkes stort sett i en multitrinns-prosess for å oppnå tilstrekkelig biomasse til videre anvendelse.

I liten skala kan dette foregå i ristekolber, hvor det i de fleste tilfeller er mulig å benytte et komplekst medium (for eksempel LB broth). Det er imidlertid også mulig å anvende definert medium (for eksempel citratmedium). Til kultivering dyrkes et lite volum forkultur av vertscellen (inokkulert med en enkelt koloni eller med cellesuspensjon fra en cryokultur), temperaturen i denne kultiveringen er stort sett ikke kritisk for det senere ekspresjonsresultatet, slik at det rutinemessig er mulig å operere under relativt høye temperaturer (for eksempel 30°C eller 37°C). Hovedkulturen settes opp i et større volum (for eksempel 500 ml), hvor det er spesielt nødvendig å sikre god luftgjennomstrømning (stort kolbevolum sammenlignet med volumet av innhold, høy rotasjonshastighet). Da det er tenkt at ekspresjonen skal foregå i form av uløselige inklusjonslegemer, vil hovedkulturen i de fleste tilfeller også gjennomføres ved relativt høye temperaturer (for eksempel 30°C eller 37°C). Induserbare systemer er spesielt egnet til fremstilling av inklusjonslegemer (for eksempel med trp, lac, tac eller phoA promoter). Etter at den sene logaritmefasen er nådd (vanligvis ved en optisk tetthet på 0.5 til 1.0 i ristede kolber), tilsettes i disse tilfellene induserer-substansen (for eksempel indolakrylsyre, iso-propyl (3-D-tiogalaktopyranosid = IPTG) og inkuberingen fortsetter i 1 til 5 timer. Iløpet av denne tiden deponeres mesteparten av N<pro> fusjonsproteinet som inklusjonslegemer i bakterie-cytoplasmaet. De resulterende cellene kan høstes og ytterligere prosesseres.

I stor skala består multitrinn-systmet av flere bioreaktorer (fermentorer), det er foretrukket å benytte definert næringsmedium i disse tilfellene, for å være istand til å forbedre prosesskontrollen i fremstillingen. I tillegg er det mulig å øke biomassen og produkt-dannelsen svært ved spesielt å måle næringsstoffer (fed batch). Ellers er fremgangsmåten analog med ristekolben. For eksempel anvendes en preliminærtriiins-fermentor og en hovedtrinns-fermentor, kultiveringstemperaturen velges tilsvarende den i den ristekolben. Preliminærtrinns-fermentoren inokkuleres med et såkalt inokkulum som er stort sett dyrket fra en enkelt koloni, eller en kryokultur i en ristekolbe. God luftgjennom-strømning og en tilstrekkelig induser-konsentrasjon må også være sikret i fermentoren - og spesielt i hovedtrinnet derav. Induksjonsfasen må imidlertid i noen tilfeller bli gjort merkbart lenger sammenlignet med ristekolben. De resulterende cellene leveres nok engang til videre prosessering.

I fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse, isoleres inklusjonslegemene fra vertscellen på en kjent måte, som beskrevet for eksempel i R. Rudolph et al., i: Creighton, T. E. (Ed.), Protein Function, A Practical Approach, IRL Press (1996), 1-39, R. Rudolph, i: H. Tschesche (Ed.), Modern Methods in Protein and Nucleic Acid Research, De Gruyter, Berlin, (1990), 149-171, R. Rudolph, i: J. L. Cleland & C. S. Craik (Eds.), Protein Engineering: Principles and Practices, Wiley-Liss mc, (1995), 283-298.

For eksempel høstes cellene ved sentrifugering, etter at fermenteringen er avsluttet. Inklusjonslegemene som er tilstede deri kan oppnås etter nedbrytelse av cellene, for eksempel ved hjelp av høytrykksdispersjon ved en enkel sentrifugering ved lav rotor-hastighet. Renheten i forbindelse med det ønskede målproteinet kan deretter forbedres ved multippel resuspensjon av IBene i ulike buffere, for eksempel i nærvær av NaCl (for eksempel 0.5 - 1.0 M) og /eller detergent (for eksempel Triton X-100). Dette fører vanligvis til at mesteparten av de fremmede proteinene i IBene fjernes. Eventuelle resterende fremmedproteiner interfererer vanligvis ikke med den autoproteolytiske spaltingen.

Oppløsningen foregår rutinemessig ved å oppløse IBene, for eksempel i en guanidin-inneholdende buffer (for eksempel 0.1 M Tris/HCl, 6.0 M guanidin/HCl, 5mM EDTA, 50 mM DTT) (se for eksempel R. Rudolph et al., (1996), R. Rudolph (1990), R. Rudolph (1995), over). Etter fjerning av uløselig materiale, for eksempel ved sentrifugering, kan en proteinbestemmelse utføres på supernatanten.

Den autoproteolytiske spaltingen av det heterologe polypeptidet fra fusjonsproteinet oppnås ved å fortynne solubilisatet med en spaltingsbuffer (for eksempel 1 ml solubili-sat + 99 ml spaltingsbuffer), for eksempel med en Tris-inneholdende spaltingsbuffer, foretrukket konsentrasjon 0.8 - LOM eller med en arginin-inneholdende spaltingsbuffer, fortrinnsvis med 0.4 - 0.6 M arginin, for eksempel ved nøytral pH, fortrinnsvis pH 7.0 - 7.5 og ved en temperatur på for eksempel mindre enn 30°C, fortrinnsvis 10-20°C, og på denne måten lage reaksjonsblandingen (se også R. Rudolph (1996), over). Spaltingsblandingen inkuberes deretter i en spesiell periode, for eksempel i 12 timer, og gra-den av N<pro> spalting kan analyseres med SDS-PAGE.

I en foretrukket utførelses form fortynnes solubilisatet med en arginin-inneholdende buffer slik at sluttkonsentrasjonen av arginin er opp til 1.0 M, fortrinnsvis 0.4 - 0.6 M. Al-ternativt er fortynning også mulig ved dialysering av solubiliserte inklusjonslegemer mot en egnet arginin-inneholdende spaltingsbuffer.

Temperaturen i reaksjonsblandingen for spaltingen er for eksempel mellom 0°C og 30°C. Temperaturen kan fortrinnsvis være 10°C - 20°C.

pH i reaksjonsblandingen er for eksempel 5.0 - 9.0. pH er fortrinnsvis 7.0 - 8.0, spesielt 7.0-7.5.

Når det er hensiktsmessig, inneholder reaksjonsblandingen DTT i en konsentrasjon på 0.5-100 mM. DTT-konsentrasjonen er fortrinnsvis omkring 5.5 mM.

Proteinkonsentrasjonen i reaksjonsblandingen under spaltingen kan for eksempel være i området 20-150 (ig/ml. Proteinkonsentrasjonen er fortrinnsvis mindre enn 40 ug/ml.

Reaksjonsblandingen kan inneholde Tris/HCl i en konsentrasjon på for eksempel opp til 1.0 M under spaltingen. Tris/HCl-konsentrasjonen er fortrinnsvis mellom 0.8 M og 1.0

M.

Andre buffersystemer er også mulige i stedet for arginin-inneholdende og/eller Tris/HCl-inneholdende buffere.

I en spesielt foretrukket utførelsesform, er pH i spaltingsbufferen 7.0 - 7.5, temperaturen under spaltingen er 10°C - 20°C, proteinkonsentrasjonen overstiger ikke 40 - 50 Hg/ml og spaltingsbufferen inneholder omkring 5 mM DTT som reduserende middel. Til slutt isoleres det heterologe polypeptidet som er spaltet fra fusjonsproteinet på en måte som er kjent i seg selv (se for eksempel M. P. Deutscher i: Methods in Enzymolo-gy: Guide to Protein Purification, Academic Press Inc., (1990), 309-392).

Følgende eksempler illustrerer foreliggende oppfinnelse.

Eksempler

Eksempel 1: Ekspresjon og in v/ fro- spalting av Npro- hGH ( humant veksthormon) Fusjonsproteinet fremstilles ved heterolog ekspresjon i Escherichia coli i et ekspresjonssystem (vektor pl60TP1 med vert W3110). Alle elementer i dette systemet for konst-ruksjon av vektoren har sin opprinnelse fra E. coli genomet.

pl60TPl er en pBR322-avledet vektor, i hvilken ekspresjonen er under kontroll av en modifisert E. coli trp-promoter med deletert attenuator. Shine-Dalgarno sekvensen til attenuatorpeptidet fra samme operon er anvendt som ribosombindingssete (RBS). Dob-

belterminatoren T1T2 fra E. coli rrnB-genet sikrer, sammen med bla-genterminatoren som forblir i konstruksjonen, effektiv terminering av transkripsjonen. Ekspresjonskas-setten settes inn og starter fra pBR322 EcoRI-kuttesetet i retningen mot klokka (dvs. motsatt til orienteringen av tetrasyklinresistensgenet). P-laktamase genet (bla) deleteres sammen med promoteren. De strukturelle genene til de heterologe proteinene som skal uttrykkes, introduseres (stort sett som PCR-fragment kuttet i størrelse) via Xbal-kuttesetet i posisjon 3506.

Et ekspresjonsplasmid (NPH-pET) tjener som kilde til det N<pro->hGH strukturelle genet. Plasmidet omfatter den kjente ekspresjonsvektoren pETl la (F.W. Studier et al., Methods. Enzymol. 185 (1990), 60-89). Først klones et fusjonsprotein som består av N<p>ro og CSFV nukleokapselprotein inn i ekspresjonsvektoren. Dette fastsetter de første 16 aminosyrene i den nøytrale N<pro> sekvensen (MELNHFELLYKTSKQK) som erstattes med en 10 aminosyrer-lang oligo-histidin rense-hjelp (MASHHHHHHH). Et Spel-kuttesete introduseres i overgangen mellom N<pro> og nukleokapselprotein i det resulterende ekspresjonsplasmidet med en målrettet mutagenese. Dette gjør det mulig å deletere det strukturelle genet til nukleokapselproteinet fra vektoren ved restriksjoner med Spel (ved 5'-enden) og Xhol (ved 3'-enden). Den korresponderende lineariserte Npro-pETl la vektoren fjernes ved preparativ gelelektroforese fra nukleokapsel-genfragmentet. Det er da mulig å innføre det hGH strukturelle genet via de "overhengende" Spel og Xhol-endene.

I denne sammenheng er det følgende preparatoriske arbeidet på hGH-genet nødvendig. Det strukturelle genet amplifiseres fra en cDNA-bank av human hjerne, som kan bear-beides (Clontech) ved anvendelse av PCR med høy presisjon (for eksempel Pwo-polymerase fra Roche Biochemicals, fremgangsmåte slik som angitt av produsenten). Følgende oligonukleotider benyttes til dette formålet:

Oligonukleotid 1 ("N-terminal"):

Oligonukleotid 2 ("C-terminal"):

Et Spel-kuttesete settes inn ved 5'-enden, og et Xhol-kuttesete innføres ved 3'-enden via oligonukleotidet som anvendes. I tillegg innføres den doble ochre-stoppkodon (TAATAA) ved enden av det strukturelle genet, for effektiv terminering av translasjon. Spel-kuttesetet i front-enden tillater ligering i leseramme med Npr0-pETl la vektoren som er beskrevet over. Xhol-kuttesetet i bak-enden muliggjør dirigert kloning-inn. Plasmidet som er fremstilt på denne måten kalles NPH-pET.

Dette plasmidet NPH-pET er det som anvendes, slik som allerede nevnt, som kilde til det strukturelle genet av N<pro->hGH fusjonsproteinet. Til dette formålet benyttes nok engang PCR med høy presisjon med Pwo-polymerase, ved anvendelse av plasmidet NPH-pET som er linearisert med Xhol som templat. De følgende primerene anvendes for å fremstille et klonbart fragment:

Front-enden (som korresponderer til den N-terminale-enden av proteinet) til det strukturelle genet:

Bak-ende (som korresponderer til den C-terminale-enden av proteinet) til det strukturelle genet:

Xbal-kuttesetet som anvendes senere til kloning (front og bak) er vist understreket, og start (ATG) og stopp (TAATAA) kodonene er skrevet med større bokstaver.

Disse to oligonukleotidene resulterer i amplifisering av et strukturelt gen med en åpen leseramme (ORF) for et fusjonsprotein (FP), hvori Hisyrensehjelpen og de foregående aminosyrene (med unntak av metioninet som er nødvendig for starten av translasjon) er fullstendig deletert.

Sekvensen til PCR-fragmentet (1072 bp) som inneholder den åpne leserammen for N<pro->hGH fusjonsproteinet er angitt nedenfor. Startkodonet og de to stoppkodonene er angitt i tykk skrift og Xbal-kuttesetene som anvendes i kloningen er vist understreket.

Denne ORF koder derfor for fusjonsproteinet som er vist nedenfor, prolin i posisjon to korresponderer til prolinet i posisjon 17 i det naturlige N<pr0> proteinet. Sekvensen til N<pro >hGH fusjonsproteinet (344 aminosyrer, hvorav 153 N<pro> og 191 hGH) er derfor slik som følger (les i N-terminal til C-terminal retning), med prolin 17 (posisjon 2 i fusjonsproteinet) fra den naturlige N<pro> sekvensen som er vist i italics, og hGH sekvensen som er angitt i tykk:

FP i den reduserte formen har en Mr på 39 316.92 d, og Mr etter en mulig spalting vil

være 17 220.02 d for N<pro> delen (redusert) og 22 114.88 d for hGH delen (redusert). N<pro >har seks cysteiner og hGH fire. I det bakterielle cytoplasmaet er sannsynligvis mesteparten av disse cysteinene i den reduserte formen. Iløpet av den etterfølgende prosesseringen er det antagelig minst delvis dannelse av disulfidbroer. Det må forventes at metioninet ved N-terminalen i fusjonsproteinet (eller N<p>'° delen) vil for det meste være spaltet

av aminopeptidasen (MAP) inne i verten, som vil redusere Mr med, i hvert tilfelle, henholdsvis 131 d til 39 186 d (FP) og 17 089 d (N<pr0>).

PCR-fragmentet med det strukturelle genet til FP som er beskrevet, renses og kuttes med Xbal og de to søkte kutte-produktene fjernes fra målfragmentet. Dette fragmentet ligeres til ekspresjonsvektoren pl60TP1 slik som beskrevet.

Til dette formålet lineariseres vektoren først med Xbal og S^-defosforyleres med kalvetarm fosfatase (CIP). T4 ligase anvendes til ligering. Ligert DNA innføres ved elektroporering i Escherichia coli K-12 DH10B og plates ut på Luria broth (LB) agarskåler med 15 mg/l tertrasyklin. Uttallige klonale kolonier resulterer fra denne transformasjonen. Plasmid DNA isoleres fra flere kloner og undersøkes ved restriksjonsanalyse for tilstedeværelsen av et innskudd med riktig størrelse og orientering. En klon selekteres og undergår detaljert kartlegging med restriksjonsanalyse og DNA-sekvensering. Plasmidet oppfører seg i overensstemmelse med beregningene i alle undersøkelsene. Dette plasmidet kalles pNPHl og anvendes i det etterfølgende arbeidet.

Sekvensen til N<pro->hGH ekspresjonsplasmidet pNPHl (4840 bp) er vist nedenfor. Startkodonet og stoppkodonet til N<pro->hGH fusjonsprotein er streket under. Den åpne leserammen går i motsatt retning når den vises på denne formen. Escherichia coli vertsstammen til ekspresjon av N<pro->hGH fusjonsproteinet er selektert på bakgrunn av betraktninger om produktivitet og biologisk sikkerhet. Escherichia coli K-12 er den best kartlagte linjen av arten E. coli (B. J. Bachmann i: J. L. Ingraham et al., (Ed.) Escherichia coli og Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology. American Society for Microbiology, Washington D. C. (1987a), ss. 1191-1219, B. J. Bachmann 1987b, Barbara J. (1987b) Linkage map of Escherichia coli K-12, edition 7. I: Escherichia coli og Salmonella typhimurium, Vol 2. Ed.: F. C. Neidhard. Am. Soc. Microbiol., Washington DC (1987b), 807-876, K. F. Jensen, J. Bacteriol. 175 (1993), 3401-3407) og dets representanter betraktes stort sett som sikre.

Escherichia coli K-12 W3110 (ATCC 27325) er et proteolytisk derivat, som er svært nær villtypen av Escherichia coli K-12, og benyttes ofte som vertstamme til ekspresjon av heterologe proteiner. Den er deponert ved American Type Culture Collection (ATCC) og har følgende genotype:

[F" mcrA mcrB iN(rrnD-rrnE)l lambda"]

Stammen kan kjøpes fra ATCC. Den vokser utmerket på fullstendig syntetisk medium uten kompleks nitrogen kilder og prosesskontroll derav er mulig svært effektivt.

Ekspresjonsstammen W3110[pNPHl] fremstilles ved transformasjon av W3110 med ekspresjonsplasmidet pNPHl som er beskrevet. Transformasjonen foregår ved elektroporering ved anvendelse av 10% glycerol som suspensjonsmedium. 50 ng (1 ul) av en pNPHl-løsning i vann ble blandet med 30 ul W3110 celle-suspensjon og eksponert for en 1800 V puls i en 1 mm kyvette (Eppendorf Electroporator 2510). Cellene resuspen-deres i SOC-medium, ristes ved 30°C i 1 time og plates deretter ut på Luria broth agarskåler med 15 mg/l tertrasyklin. Uttallige kloner resulterer fra denne transformasjonen etter inkubering ved 37°C (over natt).

En koloni av medium størrelse som er tydelig avgrenset, ble plukket og danner grunnlaget for ekspresjonsstammen W31 lOfpNPHl]. Klonen ble kultivert og oppbevares i kryoampuller ved -80°C (master cell bank MCB). Til daglig anvendelse, strykes stammen ut på LB-tetrasyklin agarskåler.

Det lages subkulturer av stammen W3110[pNPHl] fra en enkelt koloni på en agarskål og denne anvendes til å inokkulere en forkultur i Luria broth + 15 mg/l tetrasyklin (200 ml i en 11 "baffle"-kolbe). Forkulturen ristes ved 250 rpm ved 30°C i 14 timer og når iløpet denne tiden en ODéoo på omkring 1.0. 10 ml-deler av forkulturen anvendes deretter for å inokkulere hovedkulturene (i hvert tilfelle 330 ml citratmedium i 11 "baffle"-kolber) (3% inokkulum). Hovedkulturene dyrkes ved 37°C (250 rpm) til OD600 er 0.8, og så induseres produksjon av fusjonsproteinet med 50 ug indolakrylsyre pr. ml kultur (sluttkonsentrasjon: stock-løsning 5 mg/ml i 100% analytisk-kvalitet EtOH). Kulturene kultiveres videre ved 37°C og 250 rpm i 4 timer, iløpet av denne tiden når OD6oo omkring 1.5 til 3.0.

Kulturene overføres til sterile 500 ml sentrifuge-kolber, og sentrifugeres ved 10 000 g i 30 min. Supernatanten kastes fullstendig og pelletene fryses ned ved -80°C til de skal behandles videre.

Omkring 12 g (våtvekt) BL12I(DE3) cellepellet suspenderes deretter i 30 ml 50 mM Tris/HCl, 5 mM benzamidin, pH 8.0 og homogeniseres ved anvendelse av en Ultratur-rax. Etter tilsetting av 0.5 mM EDTA og 0.1% (w/v) lysozym, inkuberes cellesuspen-sjonen på isbad i 30 min. Påfølgende ultralydbehandling (7 x 20 sek med 20 sek pause i hvert tilfelle) fører til en fullstendig nedbryting av cellene. Deretter settes 10 mM MgCb og 0.006% (w/v) DNase til den nedbrutte suspensjonen og inkuberes ved 4°C i 30 min. Uløselige og løselige bestanddeler separeres deretter ved sentrifugering (JA 20, 7700g). Pelleten suspenderes i 40 ml av 50 mM Tris/HCl, 5 mM benzamidin, 5 mM EDTA, pH 8.0 og sentrifugeres igjen (JA 20, 7700g). Dette trinnet gjentas to ganger til og de resulterende pelletene suspenderes i 40 ml av 20 mM Tris/HCl, pH 7.0. 20 ml av 1.5 M NaCl, 60 mM EDTA, pH 7.0 settes til suspensjonen og inkuberes på isbad i 30 min. Til slutt utføres en ytterligere sentrifugering (JA 20, 7700g) samt et H2O-vasketrinn. Den resulterende pelleten representerer N<pro->hGH IB (inklusjonslegeme) materialet.

Dette etterfølges rutinemessig med suspendering av omkring 100 mg IB materiale i 2 ml 6.0 M guanidin hydroklorid, 0.1 M Tris, 5 mM EDTA, 50 mM DTT, pH 9.0 ved RT i 30 min. Uløselige bestanddeler fjernes påfølgende ved sentrifugering (10 min/3000 g). En proteinbestemmelse utføres på denne supernatanten (proteinkonsentrasjon omkring 20 mg/ml). Solubilisatet som produseres på denne måten benyttes enten straks i spalt-ningstester eller oppbevares ved -20°C (max 7 dager).

Eksempel 2: Kutting av inklusjonslegeme- fusionsproteiner under ulike betin<g>elser Spalting av N<pro> delen gjøres i prinsippet mulig av en 1:100 (eller større) fortynning av solubilisatet (se over) i spaltingsbuffer (resterende konsentrasjon av guanidin hydroklorid < 0.06 M). Proteinkonsentrasjonen iløpet av dette er rutinemessig 20 ug/ml (i unn-takstilfeller er dette oppgitt heretter).

Det er dessuten mulig å oppnå spalting av N<pr0> delen ved dialyse (1:100) av det oppløste materialet mot spaltingsbuffer.

Omfanget av spaltingen av N<pro> delen kan måles ved å påvise spaltningsproduktene etter SDS-PAGE. Dette fastsetter polyakrylamidgelen som fotograferes etter SDS-PAGE har funnet sted, og intensiteten til det riktige båndet måles. De riktige båndene påvises med Western blot i preliminære tester.

Eksempel 2. 1: In v/ Yro- spalting av Npr0- hGH med arginin

Spaltingen foregår ved fortynning (1:100) av solubilisatet i spaltingsbufferen (20 mM Tris/HCl, 2 mM EDTA, 5 mM DTT, pH 7.0 og de bestemte arginin konsentrasjonene) ved RT. Proteinkonsentrasjonen i spaltingsblandingen er 20 ug/ml. Omfanget av spaltingen måles etter 24 timer ved påvisning av spaltningsproduktene etter SDS-PAGE.

Det fremgår at N<pr0> spaltningseffektiviteten klart kan økes ved tilsetting av arginin i spaltingsbufferen. Maksimum spaltning foregår ved en konsentrasjon på 0.4 - 0.6 M arginin.

Eksempel 2. 2: Spalting av N<pro> fra Npro- hGH med arginin ved ulike temperaturer Spaltingen foregår ved fortynning (1:100) av solubilisatet i spaltingsbuffer (20 mM Tris/HCl, 2 mM EDTA, 5 mM DTT, pH 7.0, 0 - 1.0 M arginin) ved de bestemte tempe-raturene. Proteinkonsentrasjonen i spaltingsblandingen er 20 ug/ml. Omfanget av spaltingen måles etter 24 timer ved påvisning av spaltningsproduktene etter SDS-PAGE.

Det fremgår at en maksimum spaltning foregår ved temperaturer mellom 10 og 20°C.

Eksempel 2. 3: Omfanget av spalting av N<pro> fra Npro- hGH som funksjon av pH ved ulike temperaturer

Spaltingen foregår ved fortynning (1:100) av solubilisatet i spaltingsbuffer (20 mM Tris/HCl, 2 mM EDTA, 5 mM DTT, 0.5 M arginin) ved den bestemte pH. Proteinkonsentrasjonen i spaltingsblandingen er 20 ug/ml. Omfanget av spaltingen måles etter 24 timer ved påvisning av spaltningsproduktene etter SDS-PAGE.

En systematisk endring i pH i spaltingsbufferen fra pH 5.0 til 9.0 gjennomføres. Med den arginin-konsentrasjonen som benyttes, er en pH på 7.0 - 7.5 optimal for spalting av N<pro> fusjonsproteinet.

Eksempel 2. 4: Spalting av N<pr0> fra Npro- hGH ved ulike DTT- konsentrasioner Spaltingseffektivitetens avhengighet av DTT-konsentrasjon undersøkes.

Spaltingen foregår ved fortynning (1:100) av solubilisatet i spaltingsbufferen (20 mM Tris/HCl, 2 mM EDTA, pH 7.0, 0.5 M arginin, 0 -100 mM DTT ved 15°C). På grunn av DTT-konsentrasjonen i solubilisatet inneholder blandingen med "0 mM DTT" allikevel 0.5 mM DTT. Proteinkonsentrasjonen i spaltingsblandingen er 20 ug/ml. Omfanget av spaltingen måles etter 24 timer ved påvisning av spaltningsproduktene etter SDS-PAGE.

En maksimum spaltning av N<pr0> delen oppnås ved omkring 5.5 mM DTT.

Eksempel 2. 5: Variasjon av pH i solubilisatet for spalting av Npro- hGH

Spaltingen foregår ved fortynning (1:100) av solubilisatet ved ulike pH verdier (pH 6.0, pH 7.0, pH 8.0, pH 9.0) i spaltingsbufferen (20 mM Tris/HCl, 2 mM EDTA, 5 mM DTT, pH 7.0, 0 - 0.8 M arginin ved 15°C). pH-verdiene justeres ved titrering av sulubi-liseringsbufferen til riktig pH-verdier før blanding med IBene. Proteinkonsentrasjonen i spaltingsblandingen er 20 ug/ml. Omfanget av spaltingen måles etter 24 timer ved påvisning av spaltningsproduktene etter SDS-PAGE.

Det fremkommer at en pH på 7.0 - 8.0 i solubilisatet er optimalt.

Eksempel 2. 6: Kinetikk til N<pr0> spalting fra Npro- hGH

Reaktivering av denaturert N<pro->hGH startes ved fortynning (1:100) i 20 mM Tris/HCl, 0.5 M arginin, 2 mM EDTA, 10 mM DTT, pH 7.0 ved 15°C.

Det fremkommer at endepunktet for spaltingen nås etter omkring 24 timer.

Eksempel 2. 7: Spalting av N<pr0> fra Npro- hGH med fortynning ved ulike proteinkonsentrasjoner

Spaltingen foregår ved fortynning (1:100) av solubilisatet i spaltingsbufferen (20 mM Tris/HCl, 0.5 M arginin, 2 mM EDTA, 10 mM DTT, pH 7.0 ved 15°C). Det utføres en sjekk for å avgjøre om spaltingen har foregått etter omkring 24 timer, ved påvisning av spaltningsproduktene etter SDS-PAGE.

Det fremkommer at proteinkonsentrasjoner > 40 ug/ml fører til en tydelig nedgang i spaltingseffektiviteten. Ytterligere tester viser at den optimale proteinkonsentrasjonen er 20 - 40 ug/ml.

Eksempel 2. 8: N<pr0> spalting fra Npro- hGH ved dialyse som en funksjon av proteinkonsentrasjon

Guanidin hydroklorid fjernes fra oppløst N<pro->hGH IB-materiale ved dialyse (1:100) mot 20 mM Tris/HCl, 0.5 M arginin, 2 mM EDTA, 10 mM DTT, pH 7.0 ved 4°C og derfor initieres spaltingen. Etter omkring 24 timer anvendes SDS-PAGE for å analysere om N<pro> spalting har foregått. Det fremkommer at spalting av N<p>'° delen kan oppnås ikke bare ved fortynning, men også ved dialyse av det oppløste materialet.

Eksempel 2. 9: Effektivitet av spalting av N<pro> fra Npr0- hGH som en funksjon av Tris/ HCl konsentrasjonen

Spaltingen foregår ved fort<y>nning (1:100) av solubilisatet i spaltingsbufferen (2 mM EDTA, 20 mM DTT, pH 7.0, 0.1 - 1.0 M Tris/HCl ved 15°C). Spaltingen ble sjekket etter omkring 24 timer ved påvisning av spaltningsproduktene etter SDS-PAGE.

Det fremkommer at en økende Tris/HCl konsentrasjon opp til 0.8 m i bufferen forbedrer N<pro> fusjonsprotein spaltingsutbyttet. En økning over dette forårsaker ingen målbar for-sterkning av N<pro> spaltingen.

Reaksjonen bør derfor fortrinnsvis foregå ved Tris/HCl konsentrasjoner på 0.8 - 1.0 M.

Eksempel 3: Ekspresjon og in v// ro- spalting av Npro- pGH ( porcin veksthormon) Fremstilling av N<p>,<0->pGH ekspresjonsvektoren starter med pNPHl (se eksempel 1). Plasmidet lineariseres med Bglll og amplifiseres ved bruk av PCR. Dette medfører at hele plasmidet, bortsett fra området til det hGH strukturelle genet (fra kodonet for Phel til kodonet for Phel91), amplifisers med Pwo-polymerase og primere uten 5'-fosfat. Det rensede PCR-fragmentet benyttes som vektor i ligeringen med det pGH strukturelle genet. Fjerning av 5'-fosfater (for eksempel ved anvendelse av kalvetarm fosfatase, ar-tisk reke alkaliskfosfatase) forhindrer sirkularisering ved selv-ligering.

Det pGH strukturelle genet fremstilles på tilsvarende måte ved PCR-amplifisering. Templatet som anvendes er et porcint cDNA bank (for eksempel porcin lever 5'-stykke cDNA fra Clontech eller porcin hjerne eller hypofyse cDNA bank). Følgende primere anvendes til amplifiseringen og er i hvert tilfelle utstyrt med en 5'-fosfat iløpet av syntesen:

Front-enden (tilsvarer N-terminalen til proteinet) til det strukturelle genet (Phel til Ser7):

Bak-enden (tilsvarer C-terminalen til proteinet) til det strukturelle genet (Phel90 til Val 184):

PCR-fragmentet inneholder utelukkende ORF (strukturelt gen) for modent pGH. Ligering (T4 DNA-ligase) resulterer i et ORF for N<pi0->pGH som er analogt med det for pNPHl. Fusjonsproteinet som er beskrevet heretter er kodet av denne ORF. Det ligerte DNA introduseres ved elektroporering i Escherichia coli K-12 DH10B (elektrokompe-tente celler er skaffet fra Life Technologies, genotype Escherichia coli K-12 F" mcrA A(mrr-hsdRMS-mcrBC) <|>801acZAM15 AlacX74 deoR recAl endAl araD139 A(ara, leu)7697 galU galK A.-rpsL nupG) og platet ut på Luria broth (LB) agarskåler med 15 mg/l tetrasyklin. Denne transformasjonen resulterer i uttallige klonale kolonier. Plasmid DNA isoleres fra flere kloner og undersøkes i en restriksjonsanalyse for tilstedeværelsen av et innskudd med riktig størrelse og orientering. En klon ble selektert og underlagt detaljert kartlegging med restriksjonsanalyse og DNA-sekvensering. Plasmidet oppførte seg i overensstemmelse med beregningene i alle undersøkelsene. Dette plasmidet kalles pNPPl og ble anvendt i det etterfølgende arbeidet.

I den følgende aminosyresekvensen (les i N-terminal til C-terminal retning) til N<pr0->pGH fusjonsprotein (342 aminosyrer, hvorav 153 er N<pro> og 189 er pGH), prolin 17 (posisjon 2 i fusjonsproteinet) fra den naturlig forekommende N<p>'° sekvensen er skrevet i italics, og pGH sekvensen er skrevet med tykk skrift.

FP i redusert tilstand har en Mr på 38 819.82 d og Mr etter en mulig spalting vil være 17 220.02 d for N<pr0> delen (redusert) og 21 617.79 d for pGH delen (redusert). N<pro> har seks cysteiner og pGH fire. I det bakterielle cytoplasmaet er sannsynligvis mesteparten av disse cysteinene i den reduserte formen. Iløpet av den etterfølgende prosesseringen er det antagelig minst delvis dannelse av disulfidbroer. Det må forventes at metioninet ved N-terminalen i fusjonsproteinet (eller N<pro> delen) vil for det meste være spaltet av aminopeptidasen (MAP) inne i verten, som vil redusere Mr med, i hvert tilfelle, henholdsvis 131 d til 38 689 d (FP) og 17 089 d (N<pro>).

Ekspresjonsstammen W3110[pNPPl] fremstilles slik som beskrevet i eksempel 1 ved transformering (elektroporering) med ekspresjonsplasmidet pNPPl i Escherichia coli K-12 W3110.1 dette tilfellet også, avslørte detaljert kartlegging ingen avvik fra det forven-tede restriksjonsmønsteret.

En tydelig avgrenset koloni av medium størrelse ble plukket fra transformasjonsskålen og dannet grunnlaget for ekspresjonsstammen W3110[pNPPl]. Klonen ble kultivert og oppbevares i kryoampuller ved -80°C (master cell bank MCB). Til daglig anvendelse strykes stammen ut på LB-tetrasyklin agarskåler.

Ekspresjon av N<pro->pGH fusjonsproteinet foregår slik som beskrevet i eksempel 1 for N<pro->hG<H><f>usjonsproteinet.

Fremstilling av N<pr0->pGH IBer foregår slik som beskrevet i eksempel 1 for et N<p>r0-hGH fusjonsprotein.

Eksempel 4: In v/ fr- o- spalting av N<pro> fra Npro- pGH

Oppløsnings- og renatureringstester tilsvarende de som er beskrevet over for N<p>ro-hGH ble utført for N<pro->pGH fusjonsproteinet. Etter variasjon av parametere som allerede er beskrevet (se over), viser det seg at in v/Y/-o-spalting av N<pro> delen er mulig etter oppløs-ning og renaturering også i tilfellet med N<pro->pGH fusj<o>nsproteinet.

Claims (9)

1. Fremgangsmåte for rekombinant fremstilling av et heterologt polypeptid, karakterisert ved at det omfatter å (i) dyrke en bakterievertcelle som er transformert med en ekspresjonsvektor som omfatter et nukleinsyremolekyl som koder for et fusjonsprotein, fusjonsproteinet omfatter et første polypeptid som har den autoproteolytiske funksjonen til en autoprotease N<p>ro fra et pestivirus, samt et andre polypeptid som er forbundet med det første polypeptidet i den C-terminale enden til det første polypeptidet på en måte slik at det andre polypeptidet er istand til spaltes fra fusjonsproteinet av den autoproteolytiske aktiviteten til det første polypeptidet, og det andre polypeptidet er et heterologt polypeptid, hvori dyrking foregår under forhold som forårsaker ekspresjon av fusjonsproteinet og dannelse av korresponderende cytoplasmiske inklusjonslegemer, (ii) isolering av inklusjonslegemene fra vertscellen, (iii) oppløsning av de isolerte inklusjonslegemene, (iv) fortynning av oppløsningen for å gi en reaksjonsblanding hvori den autoproteolytiske spaltingen av det heterologe polypeptidet fra fusjonsproteinet utføres, og (v) isolering av det spaltede heterologe polypeptidet.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at pestiviruset er selektert fra gruppen av CSFV, BDV og BVDV.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert ved at pestiviruset er CSFV.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at det første polypeptidet omfatter følgende aminosyresekvens:

(1) -MELNHFELLYKTSKQKPVGVEEPVYDTAGRPLFGNPSEVHPQSTLKLPHDRGRGDIRTTLRDL PRKGDCRSGNHLGPVSGIYIKPGPVYYQDYTGPVYHRAPLEFFDEAQFCEVTKRIGRVTGSDGKLYH IYVCVDGCILLKLAKRGTPRTLKWIRNFTNCPLWVTSC-(168), eller aminosyresekvensen til et derivat derav med autoproteolytisk aktivitet.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at det første polypeptidet omfatter aminosyresekvensen Glu22 til Cysl68 i autoproteasen N<pr0> fra CSFV eller et derivat derav med autoproteolytisk aktivitet, hvori det første polypeptidet har et Met som N-terminal ende, og hvori det heterologe polypeptidet er direkte forbundet med aminosyren Cysl68 i autoproteasen N<pr0> fra CSFV.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 3,karakterisert ved at det første polypeptidet omfatter aminosyresekvensen Prol7 til Cysl68 i autoproteasen N<pro> fra CSFV eller et derivat derav med autoproteolytisk aktivitet, hvori det første polypeptidet har et Met som N-terminal ende, og hvori det heterologe polypeptidet er direkte forbundet med aminosyren Cysl68 i autoproteasen N<pr0> fra CSFV.

7. Fremgangsmåte som angitt i hvilket som helst av kravene 1 til 6, karakterisert ved at nukleinsyremolekylet er et DNA molekyl.

8. Fremgangsmåte som angitt i hvilket som helst av kravene 1 til 7, karakterisert ved at ekspresjonsvektoren er et plasmid.

9. Fremgangsmåte som angitt i hvilket som helst av kravene 1 til 8, karakterisert ved at bakterievertcellen er en E. coli celle.