JPH02437A - Ｅ・コリーの配列特異的酸性プロテアーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野］ 本発明は、タンパクの切断に使用するための新規なＥ・
コリー（Ｅ、ｃｏｌｉ）プロテアーゼに関する。

〔従来の技術〕

プロテアーゼは、食品加工業および洗浄産業でタンパク
の一般的な分解の促進に使用することが知られている。

さらに、それらは医薬および化学工業、クローン化前駆
体からポリペプチドの生成、廃棄物の分解ならびに血液
凝固物の可溶化のための触媒として使用することができ
る。

Ｅ・コリーは、何等かのタンパク分解活性を存する多様
なタンパクを発現することが知られている。

〔発明が解決しようとする課題〕

文献によれば、現在までに特徴づけられているＥ・コリ
ープロテアーゼの大部分は、アルカリプロテアーゼであ
る。一般に、Ｅ・コリープロテアーゼは、タンパク全体
をその構成アミノ酸に分解する。かかるプロテアーゼの
例は、米国特許筒４．３９０，６２９号明！ｌＩ書に記
載されている。ところで、かかるプロテアーゼを用いて
も、特異的なアミノ酸配列においてタンパクを切断する
ことはできない。

〔課題を解決するための手段〕

（１）プロテアーゼ 本発明は、タンパクのａ）隣接リジン配列、ｂ）隣接ア
ルギニン配列、Ｃ）リジン−アルギニン配列およびｄ）
アルギニン−リジン配列間の切断を特異的に触媒するＥ
・コリーの酸性プロテアーゼを提供する。このＥ・コリ
ーのプロテアーゼは、（ａ）（ｉ）　　シトクロームＣ
ペルオキシダーゼ遺伝子（ＣＣＰ）、 （ｉｉ）Ｅ・コリーのプロモーター （ｉｉｉ）Ｅ・コリーの複製超厚、および（ｉｖ）Ｅ・
コリーの薬剤耐性遺伝子 の操作可能な連鎖遺伝子成分を含んでなるタンパク発現
ベクターを提供し、 （ｂ）（ａ）によりＥ・コリーを形質転換し、ならびに （ｃ）Ｅ・コリーを培養してシトクロームＣペルオキシ
ダーゼを過剰に発現する方法に従う形質軸ＩＡＥ・コリ
ーにより産生される。

新規なプロテアーゼは、タンパク・シトクロームＣペル
オキシダーゼの過剰発現に帰因して、Ｅ。

コリー系に提起される代謝ストレスの結果としてＥ・コ
リーによって生産されると信じられる。

以下余白 （２）タンパクのＴ　ヒ　法 本発明は、（ａ）プロテアーゼ分解性の分解にかけ分解
に供する配列を同定し、次いで（ｂ）部位特異的変異誘
発によりプロテアーゼ分解性の分解に抵抗性を有する他
の配列にその配列を変化せしめることにより、Ｅ・コリ
ーの細胞溶解物における異種タンパクの特異的なアミノ
酸配列のプロテアーゼ分解性の分解に対する安定化方法
を提供する。

（３）プロテアーゼ　゛　法 本発明は、プロテアーゼの配列特異性を測定し、そして
測定された配列に調和するポリ−Ｌ−アミノ酸重合体ま
たは合成ペプチドを添加することを含んでなるプロテア
ーゼ活性の阻害方法をも提供する。このポリ−Ｌ−アミ
ノ酸またはペプチドは、前記プロテアーゼの阻害剤とし
て作用する。

以下余白 〔操作方法〕 （１）林料 （ａ）跋果皿 すべての試薬類は、標準的な市販光から購入した。ｃｃ
ｐに対する抗血清（Ｒ−抗ＣＣＰ）は、発明者等の研究
室のダイス博士（叶、Ｊ、Ｄａｉｓｓ）から入手した。

オリゴヌクレオチドは、ロッチェスター大学（ｔｈｅ　
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）の
カルシロ氏（Ｍｒ、Ｔ、Ｃａｒｄｉｌｌｏ）　、イース
トマン・コダック（Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ）社の
ジャイヤーマン博士（叶、Ｋ。

Ｊａｙａｒａｍａｎ）またはウェーバ−博士（Ｄｒ、Ｓ
、ｌ＋１ｅｂｅｒ）により合成された。

（ｂ）　　　、プラスミドおよびファージ前記カルシ０
氏から入手したＥ・コリー（Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｋ１２．　
ＪＭ１０３株（Δｌａｃ　−■上、　ト伊Ｅ、　Ｌｈｉ
、　５ｔｒＡ＋艇Ａ、與Ｂ１５／Ｆ　’勺１Ｄ３６．胆
ＡＢ、　　ｆ肛１°ＺΔｈ１５゜Ｐ１溶原性）が、形質
転換宿主としてプラスミドの増殖に使用された。Ｅ・コ
リーＴＢＩ株（Ｊｌ。

ΔＩ！、ａｃ、　幻ＩＡＢ、　」臣り、　ｈｓｄＲ，Φ
８０１　ａｃＺΔ旧５）は、イリノイ大学（ｔｈｅ　Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ）のスラ
イジャー博士（叶、Ｓ、Ｓｌｉｇｅｒ）から入手し、タ
ンパクの生産に使用された。ファージｒ１の変種である
バクテリオファージＩＲＩは、前記カルシロ氏から入手
した。ｐＥＭＢＬＹｉ３２は、ヨーロピアン・モレキュ
ラー・バイオロジイー研（ＥｕｒｏｐｅａｎＭｏｌｅｃ
ｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌａｂ、）のセザレニ教授
（Ｐｒｏｆ。

Ｇ、Ｃｅ５ａｒｅｎｉ）から贈与された。ＹＥｐ１３Ｃ
ＣＰは、イリノイ大学のカプト博士（Ｄｒ、Ｊ、Ｋａｐ
ｕｔ）から入手した。

すべての菌株は、アンピシリンを添加した（１００ｕｇ
／滅）ＬＢ培地で３７°Ｃにて増殖された。

（２）タンパク　　ベクター（ＫＨＩＯＩ）本発明のタ
ンパク発現ベクターは、以下の操作可能な連鎖遺伝子成
分を有するＥ・コリー中で使用することにより本発明の
プロテアーゼ産生を誘導するＥ・コリープラスミドであ
る。次の各成分の括弧内の頭文字または名称は、第１図
における各成分について使用されている記号である。

Ａ、シトクロームＣペルオキシダーゼに対する遺伝子（
ＣＣＰ）。

Ｂ、プロモーターおよびオペレーターを含んでなるｌａ
ｃ遺伝子配列（ＬＡＣ）。また、当該技術分野で既知の
Ｅ・コリーのプロモーターおよびオペレーターのすべて
が有用であろう。他のＥ・コリーのプロモーターＤＮＡ
配列の広範な一覧は、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ、ｖｏｌ、１５．Ｎα５　（１９８７）
を参照のこと。ｐＫｌｌｌｏｌに使用されるｆｆ１ａｃ
遺伝子が有するＤＮＡ配列は、第２ｇ図に示した。Ｌａ
ｃ（Ｐ）プロモーターおよびオペレーター（０）は、Ｅ
・コリーがＣＣＰを認識しそしてＣＣＰを発現するに必
要なすべての情報を含む調節ＤＮＡ配列である。プロモ
ーターは、タンパクの生産の開始をＥ・コリーに命する
転写制御’Ｒシグナルを含む。

ＣＣＰのｍＲＮＡが転写され、Ｅ・コリーのリポソーム
が適切な配列における個々のＣＣＰコドンを翻訳する場
合には、究極的にＣＣＰのＤＮＡ配列およびプロモータ
ーのＤＮＡ配列は、ある程度相互に関連をもって並ぶ。

Ｃ，Ｅ・コリーの複製起原（ＯＲＩ）。

Ｄ、Ｅ・コリーにアンピシリン耐性を付与するβ−ラク
タマーゼ遺伝子（ｂｌａ）。当該技術分野で既知のすべ
てのＥ・コリー薬剤耐性遺伝子もまた有用であろう。

Ｅ、ファージの複製起原（ｆｌ）。ファージの複製起原
は、−本ｔＵ　Ｄ　Ｎ　Ａプラスミドをｇｍ製するのに
使用される。

（３）ｑの−法 タンパク発現ベクターｐＫＩ＋１０１は、部位特異的変
異誘発および標準的な組換えＤＮＡ方法を組み合わせて
使用することにより調製した。ｐ　Ｋ　＋１１０１およ
びそれらの変異体は、２種の現存するプラスミド（ＣＣ
Ｐ遺伝子を含有する酵母由来のＹＥｐ　１３ｃｃＰおよ
び他の列挙した遺伝子成分を含有するｐＥＭＢＬＹｉ３
２）から構築した。

第１図および第２図は、ｐＫＨｌｏｌを調製するために
実施した方法の各工程を図式的に示したものである。一
般に本発明の方法は、 （ａ）出発原料プラスミドから所望の遺伝子成分（ｐＥ
ＭＢＬＹｉ３２およびＹＥｌ１１３ＣＣＰ）を取り出し
、（ｂ）これらの成分を単一の中間的なプラスミド（ｐ
Ｋ！１５９）に結合し、 （ｃ　）　ｐＫＩＩ５９について部位特異的変異誘発処
理を施して酵母ＣＣＰ遺伝子の前駆体部分を除去し、そ
して中間的なプラスミドｐＫＨ６３を提供し、（ｄ）Ｃ
ＣＰ遺伝子のＤＮＡ配列がＣＣＰを発現できるように修
正する目的でその遺伝（ρＫ１１６３）の百方向合わせ
をし、そして中間的なプラスミドｐＫ）１７４を提供し
、 （ｅ）ＣＣＰ遺伝子を有する適当な配列中に翻訳開始コ
ドンを挿入する中間的な工程として、プロモーターおよ
びＣＣＰ遺伝子間のＤＮＡ配列の一部を制限酵素消化さ
らに連結反応により欠失せしめ、そして中間的なプラス
ミドｐＫｌ＋９６を提供し、（ｆ　）　ｐＫＨ９６中の
プロモーターとＣＣＰ遺伝子との間に未だ残存するＤＮ
Ａ配列を部位特異的変異誘発により除去して中間的なプ
ラスミドｐＫＨ９８を提供し、次いで （ｇ）Ｅ・コリーによるＣＣＰの発現を増強するために
、ｐＫＩＩ９８のプロモーター中のＤＮＡ配列を部位特
異的変異誘発により変化せしめてｐＫＨｌｏｌを提供す
る、ことを包含する。

このタンパク発現ヘクターｐＫＨ１０１は、昭和６２（
１９８７）年１０月１３日にアメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　
Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に国際寄託のた
めに送付した。そして、昭和６２（１９８７）年１０月
１４日付で受託され、受託番号６７５４１号で国際寄託
されている。

（４）ＰＫ１１１０１工１！のｉ　な　法（ａ）バ門り
亘椹築（第１図および第２ａ図、工程１） ＹＥｐ１３ＣＣＰを制限酵素εｃｏＲ１を用いる消化に
かけてＣＣＰ遺伝子を取り出した。酵母のこの遺伝子は
、６８個のアミノ酸前駆体を含有する３６２個のアミノ
酸からなるプレ・アポタンパクについてコードする。こ
の完全な遺伝子は、ａ）Ｅ・コリー中でＹＩＥｐ１３Ｃ
ＣＰを増殖、ｂ）巳・コリーの細胞熔解、ｃ）該プラス
ミドの単離、次いでｄ）Ｅ・コリーによるプラスミドの
消化、により採取した。ＥｃｏＲｌは、第１図のＹＥｐ
ｌａＣＣＰ中に「Ｅ」によって示した特異的なヌクレオ
チド配列（ＧＡＡＴＴＣ）において、該プラスミドを切
断して大きいＤＮＡ断片と小さなりＮＡ断片を与えた。

小さな断片が、ＣＣＰ遺伝子を含んでいた。

第２ａ図によれば、この時点での構築物では、オペレー
ター（０）、プロモーター（Ｐ）、ｆａｃＺ（α−Ｚ）
に由来するα−断片を含んでなるＩ！、ａｃ遺伝子のｐ
ＥＭＢＬＹｉ３２を部分切断する。α−Ｚ断片内には、
多重クローニング部位（ＭＣ３）が存在する。ここでは
、開環したものの中に多重クローニング部位（ＭＣ３）
が含まれるようにプラスミドを切断した。次に、ＣＣＰ
遺伝子をαＺ断片内のＭＣ３に連結せしめた（第２ｂ図
）。

さらに、消化および連結反応でｐ　Ｋ　１１５９とした
（第１図および第２ｂ図）。

（ｂ）ＫＨ５９からＫＩ＋６３の　　（工程２）この工
程では、ｐＫＨ５９におけるＣＣＰ遺伝子上の前駆体Ｄ
ＮＡ配列を部位特異的変異誘発により欠失せしめてｐＫ
Ｉ＋６３を調製した（第１図および第２Ｃ図）。まず最
初にｐＫＨ５９を一本鎖とした。

ｐＫｌ＋５９によりＥ・コリー（ＪＭ１０３）株を形質
転換した。次に、５１０３株をヘルパー・ファージＩＲ
Ｉで感染してｐＫＩ＋５９を一本鎖ファージ状粒子に調
製した。Ｅ・コリーを連続的に一夜増殖せしめた後、細
胞を遠心により採取した。５ｓＤＮＡ　（−本ｔｉｐＫ
Ｈ５９）を含有する細胞外ファージ状粒子を沈殿させそ
して精製し、次いでメッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）　（
’クローニング用新規ＭＰベクター」、２０〜７８頁、
Ｍｅ　ｔｈｏｄｔｎ　ＩＥｎｚ　５ｏｌｏ　　、ｖｏｌ
、１０１．Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙ
ｏｒｋ。

参照）に従い保存した。

欠失のために識別される前駆体ＣＣＰ配列に隣接する領
域の一末鎖ρＫＨ５９に、５ｓＤＮＡの合成断片をアニ
ールせしめた。このプライマーは、ａ）５０塩基長を有
し、ｂ）欠失部位に隣接するＤＮＡ配列に相補性であり
そしてＣ）欠失するＣＣＰ遺伝子の前駆体ＤＮＡ配列に
相補性でない。このことが、欠失される前駆体配列（第
２ｂ図、前駆体ＣＣＰ）を含んでなるアニールしないル
ープをもたらした。ＤＮＡポリメラーゼの大きな断片を
用いるプライマー伸長反応は、−本積プライマーを用い
るシラー（Ｚｏｌｌａｒ）法によって実施した（Ｚｏｌ
ｌｅｒ等、Ｏｌｉｇｏｎａｃｌｅｏｔｉｄｅ−Ｄｉｒｅ
ｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、ＤＮＡ３：４７９
〜４８８頁）。部位特異的変異誘発を用い、成熟タンパ
クの開始コドンＡＴＧとアミノ末ｇＩＡＴＧとの間の２
０１ｂｐを除去し、そして２）タンパク翻訳開始点の８
ヌクレオチド上流部のＸｈｏｌ酵素制限部位に挿入した
。

マニアタス（Ｍａｎ　ｉａ　ｔｕｓ）等の方法（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒＬａｂｓ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｓ、Ｎｅｗ
　Ｙｏｒｋ）に従うアルカリ抽出により、８個のコロニ
ーに由来するプラスミドを単離した。各コロニーは、２
種類のプラスミドを与えた〔１つは、もとの酵母ＣＣＰ
遺伝子（ｐＫｌ＋５９、第２ｂ図）を含む、他のプラス
ミドは、適切に欠失した前駆体ＣＣＰ遺伝子（ｐＫＨ６
３、第２ｃ図〕〕。前駆体ペプチドの遺伝子セグメント
の適切な欠失は、２．１ｋｂおよび６ｏｏｂｐのＥｃｏ
ＲＩＸｌ＋ｏｌ断片として識別された。制限酵素分析に
より示されるところでは、ρＫｌ＋５９はＸｈｏ１部位
を含まない。一方、ｐＫ１１６３はＸｈｏ１部位を含む
ので、ｐＫＨ５９から識別することが可能である。適切
に欠失したプラスミド（ｐＫＩ＋６３、第２Ｃ図）は、
Ｅ・コリーＪＭ１０３株の形質転換により精製され、Ｘ
ｈｏ１部位の存在により同定された。適切な欠失がなさ
れていることをＤＮＡシークエンジングにより確認した
。

（Ｃ）　　旧（６３からＫＩ＋７４の　−（工程３）ｐ
Ｋ１１５９を調製したときに、多重クローニング部位に
ＣＣＰ遺伝を誤った方向性で挿入した。なお、このこと
はＤＮＡシークエンシングにより確認された。この不適
切な方向性を第２ｂ図および第２ｃ図にｒｐｃｃ、とし
て示している。

従って、ＭＣＳのｐＫＨ６３をＥｃｏＲｌで切断し、Ｒ
ａｃＺ中に逆向きにＣＣＰ遺伝子を連結する必要性があ
った。これを工程１に示すように実施した。

ＣＣＰ遺伝子が正しい方向性をもつようになったことを
、ＤＮＡシークエンシングにより確認した。

こうしてプラスミドｐＫ１１７４（第１図および第２ｄ
図）を得た。

（ｄ）５か゛　Ｋ　Ｉ＋　９６の　り　（工程４）ｐＫ
１１７４は、Ｅ・コリーのプロモーターに由来する適切
な発現のための正しい方向性のＣＣＰｉｉ伝子を有して
いる。次に、ＣＣＰ遺伝子をプロモーターに融合するこ
とが必要であった。プロモーターとＣＣＰ遺伝子の翻訳
開始点との間の不要なりＮＡ配列の殆んどを、Ａｓｐ７
１８およびＸｈｏｌを用いるｐＫＨ７４の制限酵素切断
により除去した（第１図および第２ｅ図）。

得られた断片の両切断末端をＤＮＡポリメラーゼにより
うめ合わせた。残存するα−Ｚ　ＤＮＡ配列およびＣＣ
Ｐ遺伝子を、ＤＮＡリガーゼにより一緒に融合した。か
くしてｐＫＨ９６（第１図、第２ｅ図および第３図）を
得た。ｐＫＨ９６上のプロモーターおよびＣＣＰ遺伝子
の融合ＤＮＡ配列は、第２ｅ図および第３図に示されて
いる。ｐＫＨ９６がＸｈｏ１部位を含むことに注目して
ほしい。

（ｅ）Ｋ１１９６からＫＨ９８の　−（工程５）ｐ　Ｋ
　１１９６では、ｃｃｐ遺伝子のＡＴＧとプロモーター
のＡＴＣは、６３個の塩基により別々に離されていた。

α−Ｚの６番目のヌクレオチドからＣＣＰの６番目のヌ
クレオチドまでを正確に除去するために、５０塩基のオ
リゴスクレオチドを用いる部位特異的変異誘発により前
記の残存する不要な塩基を除去してρに１１９８を得た
（第２ｆ図および第４図）。変異誘発後、Ｘｈｏ１部位
の存在について８個のコロニーに由来するプラスミドを
分析したところ、プロモーターおよびＣＣＰ遺伝子の適
切な融合体では、Ｘｈｏ１部位が除去されていた。これ
らの１つを中間的なプラスミドｐＫＩ＋９８として採取
した。

第４図は、ｐ　Ｋ　＋１９８の適切なりＮＡ配列を示す
。

ＣＣＰ遺伝子のＤＮＡ配列は、第３図、第４図および第
５図の下線部に示した。ｐＫＨ９８は、成ＷＩＣＣＰ遺
伝子の第１のアミノ酸コドン（ＡＣＴ）を伴う配列中に
、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を含んでいる。ＡＣＴは、
スレオニンに対するコドンである。ｐＫＨ９６（第３図
）では、ＣＣＰ遺伝子配列はＡＴＧＡＣＣ・・・によっ
て始まっている。ｐＫｌ＋９８（第４図）では、ＡＣＴ
がＡＣＣに置き換っている。いずれもスレオニンに対す
るコドンである。ｐＫＨ９８（第４図）は、ｃｃｐ遺伝
子のＡＴＧＡＣＣをプロモーターのＡＴＧＡＣＴで置き
換えた構造を有している。このプラスミドは、Ｅ・コリ
ーＪＭ１０３株を形質転換するのに通するサイズおよび
配列のＣＣＰを提供する。

（ｆ　）　ｐＫＨ９８からｐＫｌｌｌｏｌの構築（工程
６）タンパクの発現を増強する目的で、ｐＫ）１９８の
プロモーター領域を部位特異的変異誘発を用いて変化せ
しめた。Ｅ・コリーの共通塩基配列に対する１０塩基の
プロモーター領域を変化（ＴＡＴＧＴＴからＴＡＴＡＡ
Ｔへ）せしめることにより、ＣＣＰの増大した発現が達
成された。

（５）Ｅ・コリーにおけるＣＣＰの Ｅ・コリーＴＢＩ株（イリノイ大学のＳｔｅνｅＳｌｉ
ｇｅｒ教授より人手した）を、ρＫＨＩＯＩにより形質
転換した。正しいサイズおよび配列のＣＣＰの発現は、
タンパクの配列分析、ＥＬＩＳＡ　、酵素活性およびＳ
ＤＳゲルのウェスタンプロットにより確認された。

形質転換したＴＢＩ株は、ルリア・ベルタニ（Ｌｕｒｉ
ａ　Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）　、アンピシリン（ａｍ
ｐ）および２％のグルコースプレート上で増殖しそして
維持された。次に、培養株の１白金耳を用いて、ＬＢお
よびａｍｐを有する種母培地に接種した。

５〜６時間後、この培養物を用いて５１の発酵槽（３Ｘ
ＬＢおよびａｍｐならびにプロリン）または振盪フラス
コに接種した。発酵を３７°Ｃ１一定のｐＨ７にて一夜
実施した。

得られたＥ・コリー細胞を採取し、遠心によりペレット
化した。上澄は廃棄した。ＣＣＰおよびプロテアーゼ活
性物は、次の精製方法により得た。

（６）発　したｃｃｐの°　１１ ＣＣＰを単離するために２種の精製方法（ｐＨ５におけ
るＡ法およびｐｌ＋８におけるＢ法）を実施した。

（ａ）２〜法（ｐＨ５） この方法では、すべての工程を氷上で実施した。

各ペレットを次の組成を有する細胞溶解性緩衝液１０〜
Ｌ５ｍｌに再懸濁した： ５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐｌ＋５）０．１ｍＭのエ
チレンジアミン四酢酸塩（ＮａｚＥＤＴＡ）０．５ｍＭ
のジチオスレイトール（ＤＴＴ）０．２ｍＭのフェニル
メチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＰ）。

ペレットを再懸濁しそしてプールした。

このプールしたペレットを、ビーズ・ビータ−中でガラ
スピーズ（０，１５卿）の当量を用いて細胞溶解した。

得られた細胞溶解物を、核酸を沈殿せしめる目的でプロ
タミ、ン硫酸塩（１〜２■／　ｍｌ　）で処理した。こ
のものをＥＬＩＳＡにより測定したところ溶液からは、
まった＜ｃｃｐが検出できなかった。次に、砕片および
核酸を遠心によりペレット化した。得られた可溶性タン
パク画分（上澄）は、アポ−ＣＣＰを含み、このものは
ヘムを伴う成熟タンパクを構成していた。

次に、この可溶性タンパク画分を３０分間氷上に静置し
た後、３０，０００Ｘｇで２０分間遠心した。

次いで、得られた澄明な上澄を、５０ｍＭの酢酸ナトリ
ウムおよび０．２ａ＋ＨのＰＭＳＰ　（ｐＨ５，０）で
平衡化したＱ−セファロースカラム（ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ）にかけた。その後、装填したカラムを５０ｍＭの酢
酸ナトリウム（ｐＨ５）で洗浄した。ｐ１１５における
酢酸ナトリウムのグラジェントによりカラムから不純な
混合物としてＣＣＰを？８出した。

この混合物を含有する両分を合わせ、濃縮、次いで脱塩
した。脱塩溶液を、５０ｍＭのリン酸緩衝液（ｐｉ（６
）で平衡化したバイオゲルＨＴ　（Ｂｉｏｒａｄ）にか
けた。

このカラムを１００１のリン酸緩衝液（ｐｉ（６）で洗
浄した。ＣＣＰを直線的なリン酸緩衝液グラジェントに
よりカラムから溶出した。

ＣＣＰをプールし、次いで濃縮した。純度を５ＤＳ−電
気泳動、ＵＶ−可視スペクトロスコピ、等重点電気泳動
および酵素学により確認した。

（ｂ）１広（ｐＨ１８） Ｂ法は、以下に記載する点を除き方法Ａに類似する。

発酵後、細胞を以下の組成を有するｐＨ８の細胞溶解性
緩衝液（リゾチーム）に再懸濁した：５０１ＩＩＭのト
リス−酢酸緩衝液（ρＩＩ　８．０　）１０ｍＭのＮａ
ｚＥＤＴＡ ０１５１１１ＭのＤＴＴ ０．２ｍＭのＰＭＳＦ リゾチーム　にワトリの卵白）５ｍｇ／ｍｌ。

再懸濁した細胞を、氷上に２０〜３０分間（粘稠になる
まで）静置した。核酸を沈殿せしめた。タンパク細胞溶
解物をＡ法と同様に調製した。カラムを予め５０ｍＭの
トリス−酢酸緩衝液（ｐＨ８）で平衡にすること以外は
Ａ法と同様に該溶解物をＱ−セファロースカラムにかけ
た。

このカラムも、前記と同じ緩衝液で洗浄した。

ＣＣＰを、トリス−酢酸緩衝液（ｐＨ８）における直線
的ＨａＣｌグラジェントで溶出した。この不純なＣＣＰ
混合物を、ｐＨ５の方法で記載したのと同様に処理した
。

（７）７″ロテアーゼパ　生の ｒｐＨ５法」は、定常的に２種類のＣＣＰ　（予測値３
４ｋｄＭ−の未変性型および２６ｋｄＭＷの断片）を与
えた。精製をｐｉ（８で実施した場合は、３４ｋｄの未
変性型だけが観察された。

３４ｋｄ型も２６ｋｄ型も抗−ＣＣＰ抗体により認識さ
れた。ｐ１１５において活性であるがｐｌ＋８では活性
でないＥ・コリーのプロテアーゼは、３４ｋｄの未変性
タンパクから２６ｋｄの断片を生ずる原因であった。

放射性炭素１４で標識した未変性のＣＣＰを、Ｅ・コＩ
Ｊ−（ＴＢＩ株）の粗細胞溶解物で処理した。Ｅ・コリ
ーＴＢＩ株は、ｐＫＩｌｌｏｌで形質転換しない限りＣ
ＣＰ遺伝子をもたない。合わせた細胞溶解物（ρ１１５
）およびＣＣＰを、電気泳動にかけ次いでフルオログラ
フィーで確認した。３４ｋｄのＣＣＰだけが観察された
（タンパク分解性の活性なし） ｐＫｌｌｌｏｌで形質転換したＥ・コリーＴＢＩ株を増
殖し、次いで細胞溶解物を調製した（ｐＨ５）。この粗
溶解物を未変性の放射性標識ＣＣＰに添加した。電気泳
動後、３４ｋｄ型も２６ｋｄ型も観察された（タンパク
分解性の活性あり）。

このプロテアーゼを、 ａ）５０ｍＭのヘベス（ｈｅｐｓ）緩衝液（ｐ）１７）
中、４°Ｃにて０．５〜１．０％のＬＤＳによるＥ・コ
リー膜の抽出、 ｂ）超遠心（１５０，０００Ｘ　ｇ、９０分、４°Ｃ）
による膜質物質の除去、 Ｃ）洗浄剤トリトン（Ｔｒｉ　ｔｏｎ）　Ｘ−１００を
用いる陰イオン交換クロマトグラフィー（Ｑ−セファロ
ース）およびＬｉＣｊ！グラジェント　（５０〜５００
ｍＭ）、ならびに ｄ）１％の洗浄剤ＳＤＳを用いるゲル排除クロマトグラ
フィー〔スーパーロース（ｓｕｐｅｒｏｓｅ）　１２Ｐ
ＰＬＣ）により精製した。

工程ｄ）に由来する両分は、約５０．　ＯＯＯＭＷの純
粋なプロテアーゼであり、そして以下に記載される配列
特異的プロテアーゼ活性のすべてを含む。

精製方法は、次のように実施した。

ＣＣＰ発現プラスミドｐＫＨ１０１を含有する１１のＥ
・コリーを、振盪フラスコ中でプロリンを補足したＬＢ
／アンピリン培地により３７“Ｃで１６時間増殖せしめ
た。細胞を、５０００Ｘｇの遠心により採取した。これ
らを細胞溶解緩衝液（５０１１１Ｍの酢酸リチウム、０
．５ｍＭのＤＴＴ、ＩＩＩＩＭのＥＤＴＡ、０．２ａ＋
ＰのＰＭＳＦ、　ｐｕ　５　）に懸濁した。懸濁細胞を
Ｏ″Ｃで音波処理により細胞溶解した。膜会合性プロテ
アーゼを含有する細胞性砕片を、４°Ｃにおける３０．
０００ｘ　ｇによる細胞溶解物からペレット化した。

このペレットを、０．５（ｗ／ｖ）％のラウリル硫酸塩
洗浄剤（ナトリウム塩、ＳＤＳ　；またはリチウム塩、
ＬＤＳ）を含有する細胞溶解緩衝液に再懸濁した。この
懸濁液を、６０分間撹拌した。次に、洗浄剤可溶性粗プ
ロテアーゼ画分を、超遠心（６０分、１５０．０００　
Ｘ　Ｇ　）により膜質をペレット化することにより調製
した。非イオン性洗浄剤トリトンＸ−１００を、０．５
％になるまで添加した。

この両分を、５０ｍＭのｈｅｐｅｓ　Ｍ街液（ｐｌ＋７
）中の０．５％トリトンＸ−１００に対して１２時間透
析した。透析した溶液を３０，０ＯＯＸ　ｇで遠心した
。遠心？８液をｐ１１７で陰イオン交換カラム（Ｑ−セ
ファロース、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかけた。カラムを
直線的塩グラジェント（５０ｍＭのｈｅｐｅｓ　、０．
５％のトリトンＸ　−１００，５０〜５００ｍＦＩのＬ
ｉＣｊｌ！　、　ｐＨ７）を用いて溶出した。約４００
ｍＭのＬｉ（Ｊにおいて部分的に純粋なプロテアーゼが
、このカラムから溶出した。

このプロテアーゼを含有する両分を集め、５０ｍとの酢
酸ナトリウムに０．０５％のトリトンＸ−１００を加え
た溶液（ｐＨ５）に対して透析した（４８時間中、溶液
を何度も替えた）。プロテアーゼをアミコン（Ａｍｉｃ
ｏｎ）限外濾過セルを用いて１０倍濃縮した。プロテア
ーゼを、５３ｍＨの酢酸ナトリウムおよび１．０％ＳＤ
Ｓの存在下でスーパーロース（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）１２
　ＦＰＬＣによるゲル濾過クロマトグラフィーにより均
一化するまで精製した。約５０，０００ＭＷ（ＳＤＳゲ
ル電気泳動により測定した場合）の得られたタンパクを
透析し次いで一２０°Ｃに保存した。配列特異的プロテ
アーゼ活性は、以下のアッセイにより基質としてＣＣＰ
を用いる本方法の最初から最後までモニターした。

プロテアーゼアッセイ：プロテアーゼは、１．５成のマ
イクロ試験管中で、プロテアーゼ画分６４、ＣＣＰ　（
５ｍｇ／ａｉり　３　Ｊ、　　５００ｍＭの酢酸ナトリ
ウム（ｐＨ５）３μｌを合わせ、次いで３７°Ｃで３０
分間インキュベーションすることによりアッセイした。

この混合物を１２．５％のアクリルアミドＳＤＳゲル上
で電気泳動し、次いでタンパク分解性活性を未変性のＣ
ＣＰから特異的な２６ｋｄの分解生成物の出現で確認し
た。

〔実施の態様〕

（１）配置、、ｔ、１ ＣＣＰにおけるタンパク分解の配列特異性を同定する目
的で、疎水性相互作用クロマトグラフィー　（ＦＰＬＣ
−フェニル・スーパーロース・カラム）を用いて３４ｋ
ｄの断片から２６ｋｄの断片を分離した。

Ｎ−末端の配列決定のために、２６ｋｄの断片と３４ｋ
ｄの未変性タンパクとをカリフォルニア大学（Ｓａｎ　
Ｆｒａｎｃｒｓｃｏ）に送付した。未変性の配列を対照
にすると、本発明のプロテアーゼは７４位（Ｌｙｓ）と
７５位（Ｌｙｓ）との間（すなわち、隣接リジン間）で
ＣＣＰを切断することが示された。ＣＣＰは、唯一のＬ
ｙｓ　−Ｌｙｓ配列を有する。

タンパクのアミノ酸配列における特異的な単一の変化を
行う部位特異的変異誘発を用いて、ＣＣＰのＬｙｓ７４
−　Ｌｙｓ７５部位の変異体を調製した。

ｐ１１５では、１のリジンがスレオニンに変化するかま
たは２つのリジンともスレオニンに変化したこれらの変
異体は、ゲル電気泳動およびウェスタン・プロントによ
り測定した場合、本発明のプロテアーゼにより切断され
ない新規なＣＣＰの構造を示した。このプロテアーゼは
、その標的認識配列におけるｌまたは２つのリジンがス
レオニンに変化した場合には切断されない。各種の変異
体をＤＮＡ配列分析により確認した。

ＣＣＰのＬｙｓ７４　　Ｌｙｓ７５部位のアミノ酸配列
における他の変異体を調製した。本発明のプロテアーゼ
は、ＣＣＰにおける次のアミノ酸配列間で特異的に切断
することがわかった： アルギニン７４−アルギニン７５； アルギニン７４−リジン７５；および リジン７４−アルギニン７５゜ 本発明のプロテアーゼは、０．５％以下のＳＯＳ　。

ＬＤＳおよびトリトン（Ｔｒｉ　ｔｏｎ）　Ｘ　　１０
０　　（オクチルフェニルポリ（エチレングリコールエ
ーテル）ｎについてのローム・アンド・ハース社の商標
］中、ｐｌ＋範囲４〜６および４〜３７°Ｃの温度にて
活性である。

（２）プロテアーゼ　　ゞ　の 実験は、本発明のプロテアーゼ活性はＥＤＴＡ　。

ＰＭＳＦまたはＤＴＴにより阻害されないが、ポリ−Ｌ
−リジンおよびポリ−Ｌ−アルギニンにより阻害される
ことを示した。

ＣＣＰ発現Ｅ・コリーは、かなりの濃度のポリ−Ｌ−リ
ジンまたはポリ−Ｌ−アルギニンの存在下、ｐＨ５にて
細胞熔解した。すべてのプロテアーゼ活性は、ウェスタ
ン・プロントに対する２６ｋｄ断片の出現を根拠とした
。１ｍＭのポリ−Ｌ−リジンまたはポリ−Ｌ−アルギニ
ンは、本発明のプロテアーゼ活性を完全に阻害した。す
なわち、２６ｋｄの断片は全然現われなかった。ＤＴＴ
　、　ＰＭＳＦおよびＥＤＴＡは、本発明のプロテアー
ゼのりジン−リジン、リジン−アルギニン、アルギニン
−リジンまたはアルギニン−アルギニンに対してまった
く阻害作用を示さなかった。

以下余白 （３）　　　なアミノ　　　　　　る　ンパクの前述の
データは、ａ）プロテアーゼ分解性の分解に供するアミ
ノ酸配列を同定すること、およびｂ）その配列を部位特
異的変異誘発によりプロテアーゼ分解性の分解に抵抗性
を有する他の配列に変化せしめることによる、プロテア
ーゼ分解性の分解に対するＥ・コリー溶解物中の異種タ
ンパクにおける特異的アミノ酸配列の安定化方法をも開
示する。この方法は、本発明のプロテアーゼの配列特異
性の同定について記載した実験により確立される。

（４）プローアーゼの　　　　の プロテアーゼ活性を阻害するための方法は、プロテアー
ゼの配列特異性を測定すること、および測定された配列
に調和（ｍａｔｃｈ）するポリ−Ｌ−アミノ酸または合
成ペプチドを添加することを含んでなる。このポリ−Ｌ
−アミノ酸またはペプチドは、プロテアーゼ阻害剤とし
て作用する。

本発明のプロテアーゼは、ヨーロッパ特許出願第０１５
０１２６号公報に１９８５年７月３１日付で公表されて
いるタンパクについてのアフィニティー精製工程で有用
である。この方法でのりガントは、形質転換宿主細胞に
より発現されるすべてのタンパク分子を実質的に単離し
、そして精製するために利用される。本方法を実験室的
な規模または大きな商業的な規模で使用して、組換えＤ
ＮＡ技術により生産されるすべてのタンパク分子を実質
的に精製することができる。

記載した方法におけるタンパクおよび確認または標識ペ
プチドからなるハイブソド分子は、Ｍｉ換えＤＮＡ技術
により生産される。理想的には、この確認ペプチドは、
２種の主要成分（高い抗原性のＮ−末端タンパクおよび
そのタンパクに関連する確認ペプチドの結合性タンパク
）を含む。

確認ペプチドの結合性タンパクは、配列特異性タンパク
分解性物質の使用により、該タンパク分子に対して隣接
した特異的アミノ酸残基において切断可能である。形質
転換した宿主細胞により発現されるハイブリット確認ペ
プチドおよびタンパク分子は、アフィニティークロマト
グラフィー技術により単離することができる。このこと
は、確認ペプチドの抗原性部位に特異的な固定化リガン
ドが、それによって発現ハイブリット確認ペプチドおよ
びタンパク分子にパインディングするアフィニティーカ
ラムを構築することにより達成される。

パインディングしたＴｉｆ！認ペプチドおよびタンパク
分子は、カラムから遊離することができ、次いで本発明
のプロテアーゼの如き適当なタンパク分解性物質でタン
パク分子から切断することができる。ｒ＋ｉｉ　ｔｖペ
プチドの結合部位は、前記タンパク分子に隣接する位置
の結合部位を切断する配列特異的タンパク分解性物質に
より認識されるアミノ酸からなる。理想的には、結合す
るタンパクのアミノ酸配列は個有のものであり、従って
、タンパク分解性物質がタンパク分子を切断しうる可能
性を極小化する。

本発明のプロテアーゼは、確認ペプチドおよびタンパク
の結合部位間のアミノ酸配列が該プロテアーゼにより認
識される配列であるような条件下で、本明細書に記載し
た方法にとって有用である。

タンパク分子は、形質転換宿主細胞において発現するこ
とができるいずれかのタンパク性物質からなっていても
よい。

ヨーロッパ特許出願第０１５０１２６号公報により考慮
されているタンパクとしては、酸化還元酵素、転移酵素
、加水分解酵素、細胞溶解酵素、異性化酵素もしくは連
結酵素であるか否かを問わない酵素類；フェリチンもし
くはオボアルブミンの如き貯蔵タンパクまたはヘモグロ
ビン、血清アルブミンもしくはセルロプラスミンの如き
運搬性タンパク類；あるいは収縮系および運動系で機能
的な、例えばアクチンおよびミオシンの如きタンパク類
；血？＆タンパクトロンビンおよびフィフ゛リノーゲン
の如き保護または防護を司るタンパク類；抗原にパイン
ディングしそして抗原を中和する抗体または免疫グロブ
リンの如きパインディングタンパク類；トウゴマ（ｃａ
ｓｔｏｒ　ｂｅａｎ）に由来するリシンまたはコドン・
リンシード（ｃｏｔｔｏｎ　１ｉｎｓｅｅｄ）に由来す
るグローシイパイン（ｇｒｏｓｓｙｐｉｎ）の如き毒性
タンパク；ならびにコラーゲン、エラスチン、α−ケラ
チン、糖タンパク、ウィルス−タンパクおよびムコタン
パクの如き構造要素として機能するタンパク類が挙げら
れる。

前記天然起源のタンパクに加えて、天然に生じない何等
かのアミノ酸配列として一般に定義される合成タンパク
もまた考慮される。

の構築を含む各種の工程の代表例を図示したものであり
、第２ａ図〜第２ｇ図は、ｐＫＨｌｏｌに至るまでの中
間的なプラスミドのＥ・コリープロモーターに関連する
ＣＣＰ遺伝子を調製する上で実施した各構築操作を段階
的に略記したものであり、第３図〜第５図は、ｐＫＨ９
６、ｐＫＨ９８およびｐＫＨｌｏｌのプロモータ一部お
よびＤＮＡ配列をそれぞれ示したものである。

〔発明の効果〕

本発明のプロテアーゼは、先行技術のＥ・コリー　（Ｅ
、ｃｏＪｉ）プロテアーゼに比し、より高い配列特異性
を有する。その結果として、タンパクは、本発明の酵素
により概して分解されない。

また、プロテアーゼ分解に対する阻害およびタンパクの
安定化方法が提供される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＣＣＰを過剰発現しそして本発明のプロテア
ーゼの生産性をＥ・コリーにＦ２１Ｅするために使用す
る新規なりンバク発現ベクター（ρＫＨＩＯＩ）〔備　
考〕 従鷹省圓妃償１１様 ７、約２１１５で切断を生ずる請求項１記載のプロテア
ーゼ。 ８、　プロテアーゼの切断能がポリ−Ｌ−リジンまたは
ポリ−Ｌ−アルギニンにより阻害される請求項Ｉ記載の
プロテアーゼ。 ９、　プロテアーゼの切断能がフェニルメチルスルホニ
ルフルオライド（ＰＭＳＦ）、エチレンジアミン四酢酸
（ＥＤＴＡ）またはジチオスレイトール（ＤＴＴ）の存
在下では阻害されない請求項１記載のプロテアーゼ。 １０．０．５％以下のドデシル硫酸ナトリウム、ドデシ
ル硫酸リチウムまたはオクチルフェニルポリ〔エチレン
グリコールエーテル〕ｎの存在下で洗浄活性を有する請
求項■記載のプロテアーゼ。 １１６約５０．　ＯＯＯＭＨの純粋タンパクである請求
項１記載のプロテアーゼ。 １２、タンパク発現ベクターがＥ・コリーの４２ａＣプ
ロモーターを含み、かつ薬剤耐性遺伝子がβ−ラクタマ
ーゼである請求項３記載の方法。 １３、異種タンパクが隣接するりジン−リジン、アルギ
ニン−アルギニン、リジン−アルギニンまたはアルギニ
ン−リジンアミノ酸配列間のタンパク分解性の分解に感
受性であり、そしてリジンまたはアルギニンの１つかま
たは両者を他のアミノ酸に変化せしめる請求項５記載の
方法。 １４、プロテアーゼ活性がリジン−リジン、アルギニン
−アルギニン、リジン−アルギニンまタハアルギニンー
リジンアミノ酸配列に対して配列特異的であり、そして
かかる活性を阻害するためにポリ−Ｌ−リジンまたはポ
リ−Ｌ−アルギニンを添加する請求項５記載の方法。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、タンパクのａ）隣接リジン配列、ｂ）隣接アルギニ
   ン配列、ｃ）リジン−アルギニン配列およびｄ）アルギ
   ニン−リジン配列間の切断を特異的に触媒するＥ・コリ
   ー（￥Ｅ．ｃｏｌｉ￥）の酸性プロテアーゼ。 ２、請求項１記載の酸性プロテアーゼによりペプチドま
   たはタンパクを消化する工程を含んでなるａ）隣接リジ
   ン配列、ｂ）隣接アルギニン配列、ｃ）リジン−アルギ
   ニン配列およびｄ）アルギニン−リジン配列間でペプチ
   ドまたはタンパクを切断する方法。 ３、（ａ）（ｉ）シトクロームＣペルオキシダーゼ遺伝
   子、 （ｉｉ）Ｅ・コリーのプロモーター、 （ｉｉｉ）Ｅ・コリーの複製起原、および （ｉｖ）Ｅ・コリーの薬剤耐性遺伝子 の操作可能な連鎖遺伝子成分を含んでなるタンパク発現
   ベクターを提供し、 （ｂ）（ａ）によりＥ・コリーを形質転換し、ならびに （ｃ）Ｅ・コリーを培養してシトクロームＣペルオキシ
   ダーゼを発現する工程を含んでなるタンパクのａ）隣接
   リジン配列、ｂ）隣接アルギニン配列、ｃ）リジン−ア
   ルギニン配列およびｄ）アルギニン−リジン配列間の切
   断を特異的に触媒する酸性プロテアーゼを生産するＥ・
   コリーの創製方法。 ４、（ｉ）シトクロームＣペルオキシダーゼ遺伝子、 （ｉｉ）Ｅ・コリーのプロモーター、 （ｉｉｉ）Ｅ・コリーの複製起原、および （ｉｖ）Ｅ・コリーの薬剤耐性遺伝子 の操作可能な連鎖遺伝子成分を含んでなるＥ・コリーの
   タンパク発現ベクター。 ５、（ａ）タンパク分解性の分解に供する配列を同定し
   、次いで（ｂ）部位特異的変異誘発によりプロテアーゼ
   分解性の分解に抵抗性を有する他の配列にその配列を変
   化せしめることにより、Ｅ・コリーの細胞溶解物におけ
   る異種タンパクの特異的なアミノ酸配列のプロテアーゼ
   分解性の分解に対する安定化方法。 ６、プロテアーゼの配列特異性を測定し、そして測定さ
   れた配列に調和するポリ−Ｌ−アミノ酸重合体または合
   成ペプチドを添加することを含んでなるプロテアーゼ活
   性の阻害方法。