JPH0776596A - ペプチド、融合ペプチド、発現ベクター及び組換えタンパク質の製造方法 - Google Patents
ペプチド、融合ペプチド、発現ベクター及び組換えタンパク質の製造方法Info
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- JPH0776596A JPH0776596A JP5274163A JP27416393A JPH0776596A JP H0776596 A JPH0776596 A JP H0776596A JP 5274163 A JP5274163 A JP 5274163A JP 27416393 A JP27416393 A JP 27416393A JP H0776596 A JPH0776596 A JP H0776596A
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- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/22—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a Strep-tag
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 新規のペプチドを開発する。
【構成】 該ペプチドは、次のアミノ酸配列：
Ｔｒｐ−Ｘ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｙ−Ｚ
［ここでＸは任意のアミノ酸を表わし、Ｙ及びＺは２つ
ともＧｌｙを表わすか又はＹはＧｌｕを表わし、ＺはＡ
ｒｇ又はＬｙｓを表わす］を有する。また本発明によ
り、前記ペプチド配列を含む融合タンパク質が得られ
る。該融合タンパク質は、該タンパク質をコードするＤ
ＮＡ配列を宿主細胞で発現させ、発現産物をストレプト
アビジンアフィニティークロマトグラフィーによって分
離することによって製造することができる。
ともＧｌｙを表わすか又はＹはＧｌｕを表わし、ＺはＡ
ｒｇ又はＬｙｓを表わす］を有する。また本発明によ
り、前記ペプチド配列を含む融合タンパク質が得られ
る。該融合タンパク質は、該タンパク質をコードするＤ
ＮＡ配列を宿主細胞で発現させ、発現産物をストレプト
アビジンアフィニティークロマトグラフィーによって分
離することによって製造することができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、該ペプチドに融合され
ているタンパク質にストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔ
ａｖｉｄｉｎ）結合親和性を付与するペプチド、このよ
うなペプチドを含む融合タンパク質及びこのような組換
えタンパク質をコードするＤＮＡ配列を自体公知の方法
で適当な宿主細胞で発現させることによって該組換えタ
ンパク質を製造する方法に関する。
ているタンパク質にストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔ
ａｖｉｄｉｎ）結合親和性を付与するペプチド、このよ
うなペプチドを含む融合タンパク質及びこのような組換
えタンパク質をコードするＤＮＡ配列を自体公知の方法
で適当な宿主細胞で発現させることによって該組換えタ
ンパク質を製造する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】多数の種々の宿主細胞において外来タン
パク質を効率的に発現させる系は十分に確立されている
けれども、遺伝子工学的タンパク質製造の際の組換え遺
伝子産物の検出及び精製は依然として問題である。この
ことは、特に重要な天然タンパク質が予め単離されてお
らず、その結果該タンパク質の生化学的特性について確
認することもできないし、また該タンパク質に対する特
異的抗血清又はモノクロナール抗体も得られていない場
合に該当する。このような状況は、最近複製連鎖反応が
開発されたために頻繁に起っている［Ｂｌｏｃｈ Ｗ．
（１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０、２７
３６−２７４７］。それというのもこのような開発によ
って、精製された天然タンパク質そのものよりも、該タ
ンパク質をコードする遺伝子に関する情報を得ることの
方がしばしば容易であるからである。
パク質を効率的に発現させる系は十分に確立されている
けれども、遺伝子工学的タンパク質製造の際の組換え遺
伝子産物の検出及び精製は依然として問題である。この
ことは、特に重要な天然タンパク質が予め単離されてお
らず、その結果該タンパク質の生化学的特性について確
認することもできないし、また該タンパク質に対する特
異的抗血清又はモノクロナール抗体も得られていない場
合に該当する。このような状況は、最近複製連鎖反応が
開発されたために頻繁に起っている［Ｂｌｏｃｈ Ｗ．
（１９９１） Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０、２７
３６−２７４７］。それというのもこのような開発によ
って、精製された天然タンパク質そのものよりも、該タ
ンパク質をコードする遺伝子に関する情報を得ることの
方がしばしば容易であるからである。
【０００３】該タンパク質に対する特異的免疫試薬が使
用できないような場合に、組換え遺伝子産物の検出を可
能にするためには、組換えタンパク質に融合される短い
ペプチド先端部（ペプチドタグ＝Ｐｅｐｔｉｄ−ｔａｇ
ｓ）が使用された。このような融合ペプチド配列がタン
パク質配列のアミノ−又はカルボキシ末端で結合される
場合には、該ペプチド配列は特異的抗体によって認識さ
れる。このようなペプチド先端部の例は、Ｍｙｃタグ
（Ｍｙｃ−ｔａｇ）［Ｍｕｎｒｏ及びＰｅｌｈａｍ（１
９８６） Ｃｅｌｌ ４６、２９１−３００；Ｗａｒｄ
等、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１、５４４−５４
６］、フラッグペプチド（Ｆｌａｇ−Ｐｅｐｔｉｄ）
［Ｈｏｐｐ等、（１９８８） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ ６、１２０４−１２１０］、ＫＴ3−エピト−
プペプチド（ＫＴ3−Ｅｐｉｔｏｐ−Ｐｅｐｔｉｄ）
［Ｍａｒｔｉｎ等 （１９９０） Ｃｅｌｌ ６３、８
４３−８４９；Ｍａｒｔｉｎ等 （１９９２） Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２５５、１９２−１９４］、α−チューブリ
ンエピト−プペプチド（α−Ｔｕｂｕｌｉｎｅｐｉｔｏ
ｐＰｅｐｔｉｄ［Ｓｋｉｎｎｅｒ等 （１９９１）
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６、１４１６３−１４１
６６］及びＴ７遺伝子 １０−タンパク質−ペプチド−
タグ（Ｔ７ Ｇｅｎ １０−Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｅｐｔ
ｉｄ−Ｔａｇ）［Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈ等
（１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ ８７、６３９３−６３９７］であり、こ
れらのペプチドは、組換え遺伝子産物の検出のために、
また若干の場合にはその精製のためにも有効に使用され
た。さらに前記例の大部分において、これらの短いペプ
チド先端部（通常アミノ酸の長さ３〜１２個）はタンパ
ク質の生物学的機能を阻害せず、従って発現後に必ずし
も分離しなくてもよいことも確認された。
用できないような場合に、組換え遺伝子産物の検出を可
能にするためには、組換えタンパク質に融合される短い
ペプチド先端部（ペプチドタグ＝Ｐｅｐｔｉｄ−ｔａｇ
ｓ）が使用された。このような融合ペプチド配列がタン
パク質配列のアミノ−又はカルボキシ末端で結合される
場合には、該ペプチド配列は特異的抗体によって認識さ
れる。このようなペプチド先端部の例は、Ｍｙｃタグ
（Ｍｙｃ−ｔａｇ）［Ｍｕｎｒｏ及びＰｅｌｈａｍ（１
９８６） Ｃｅｌｌ ４６、２９１−３００；Ｗａｒｄ
等、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１、５４４−５４
６］、フラッグペプチド（Ｆｌａｇ−Ｐｅｐｔｉｄ）
［Ｈｏｐｐ等、（１９８８） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ ６、１２０４−１２１０］、ＫＴ3−エピト−
プペプチド（ＫＴ3−Ｅｐｉｔｏｐ−Ｐｅｐｔｉｄ）
［Ｍａｒｔｉｎ等 （１９９０） Ｃｅｌｌ ６３、８
４３−８４９；Ｍａｒｔｉｎ等 （１９９２） Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２５５、１９２−１９４］、α−チューブリ
ンエピト−プペプチド（α−Ｔｕｂｕｌｉｎｅｐｉｔｏ
ｐＰｅｐｔｉｄ［Ｓｋｉｎｎｅｒ等 （１９９１）
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６、１４１６３−１４１
６６］及びＴ７遺伝子 １０−タンパク質−ペプチド−
タグ（Ｔ７ Ｇｅｎ １０−Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｐｅｐｔ
ｉｄ−Ｔａｇ）［Ｌｕｔｚ−Ｆｒｅｙｅｒｍｕｔｈ等
（１９９０） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ ８７、６３９３−６３９７］であり、こ
れらのペプチドは、組換え遺伝子産物の検出のために、
また若干の場合にはその精製のためにも有効に使用され
た。さらに前記例の大部分において、これらの短いペプ
チド先端部（通常アミノ酸の長さ３〜１２個）はタンパ
ク質の生物学的機能を阻害せず、従って発現後に必ずし
も分離しなくてもよいことも確認された。
【０００４】これらの融合ペプチドは特にタンパク質の
検出のために適しており、従って発現収量及び精製プロ
トコルの最適化のための重要な補助作用物質であるけれ
ども、精製工程順序において該ペプチドの有する親和性
を適用する範囲は限定されている。この理由は、従来記
載されたペプチドの有利な特性がこれらのペプチドの抗
体に対する強い結合に基いていることである。従って、
タンパク質がペプチド先端部を介して、固定化抗体を有
するアフィニティーカラムに結合されている場合、この
タンパク質を再び同カラムから溶離するためには、かな
り極端な、従ってほとんど保護的でない条件（すなわち
非生理学的ｐＨ値又はカオトロピック試薬）を適用しな
ければならない。しかし組換えタンパク質が機能的な形
で生産された場合には、精製の間に変性条件を可及的に
回避するのが望ましい。もっとも前記例の３つ［Ｈｏｐ
ｐ等（１９８８）；Ｍａｒｔｉｎ等（１９９０）；Ｓｋ
ｉｎｎｅｒ等（１９９１）］に関してのみ、タンパク質
ペプチド融合物を比較的緩和された条件を用いて、つま
り例えば合成ペプチドと競合的に溶離できることが判明
したにしぎない。しかしこられの場合にも欠点が残って
いる、それというのもペプチド先端部を標的とするモノ
クローナル抗体は高価であるか又は十分な量で得ること
は困難であるからである。
検出のために適しており、従って発現収量及び精製プロ
トコルの最適化のための重要な補助作用物質であるけれ
ども、精製工程順序において該ペプチドの有する親和性
を適用する範囲は限定されている。この理由は、従来記
載されたペプチドの有利な特性がこれらのペプチドの抗
体に対する強い結合に基いていることである。従って、
タンパク質がペプチド先端部を介して、固定化抗体を有
するアフィニティーカラムに結合されている場合、この
タンパク質を再び同カラムから溶離するためには、かな
り極端な、従ってほとんど保護的でない条件（すなわち
非生理学的ｐＨ値又はカオトロピック試薬）を適用しな
ければならない。しかし組換えタンパク質が機能的な形
で生産された場合には、精製の間に変性条件を可及的に
回避するのが望ましい。もっとも前記例の３つ［Ｈｏｐ
ｐ等（１９８８）；Ｍａｒｔｉｎ等（１９９０）；Ｓｋ
ｉｎｎｅｒ等（１９９１）］に関してのみ、タンパク質
ペプチド融合物を比較的緩和された条件を用いて、つま
り例えば合成ペプチドと競合的に溶離できることが判明
したにしぎない。しかしこられの場合にも欠点が残って
いる、それというのもペプチド先端部を標的とするモノ
クローナル抗体は高価であるか又は十分な量で得ること
は困難であるからである。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従って本発明の課題
は、 ｉ）組換えタンパク質の機能を阻害することなくこのタ
ンパク質と結合することができ、 ｉｉ）容易に使用できる試薬での検出を可能にしかつ ｉｉｉ）容易に制御できる検出特性を示す短いペプチド
配列を開発することであった。
は、 ｉ）組換えタンパク質の機能を阻害することなくこのタ
ンパク質と結合することができ、 ｉｉ）容易に使用できる試薬での検出を可能にしかつ ｉｉｉ）容易に制御できる検出特性を示す短いペプチド
配列を開発することであった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】前記課題は、本発明によ
り、次のアミノ酸配列・Ｔｒｐ−Ｘ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−
Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｙ−Ｚ［前記配列中Ｘは任意のアミノ
酸を表わし、Ｙ及びＺは両方Ｇｌｙを表わすか又はＹは
Ｇｌｕを表わし、ＺはＡｒｇ又はＬｙｓを表わす］を包
含するペプチドによって解決される。つまり本発明の範
囲では、前記のペプチド配列がストレプトアビジン、も
しくは“核”−ストレプトアビジン（ストレプトアビジ
ンのタンパク質分解による生成物）［Ｂａｙｅｒ、Ｅ．
Ａ．、Ｂｅｎ−Ｈｕｒ、Ｈ．、Ｈｉｌｌｅｒ、Ｙ．及び
Ｗｉｌｃｈｅｋ、Ｍ． （１９８９） Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｊ． ２５９、３６９−３７６］に対する高い結合
親和性を有することが確認された。
り、次のアミノ酸配列・Ｔｒｐ−Ｘ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−
Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｙ−Ｚ［前記配列中Ｘは任意のアミノ
酸を表わし、Ｙ及びＺは両方Ｇｌｙを表わすか又はＹは
Ｇｌｕを表わし、ＺはＡｒｇ又はＬｙｓを表わす］を包
含するペプチドによって解決される。つまり本発明の範
囲では、前記のペプチド配列がストレプトアビジン、も
しくは“核”−ストレプトアビジン（ストレプトアビジ
ンのタンパク質分解による生成物）［Ｂａｙｅｒ、Ｅ．
Ａ．、Ｂｅｎ−Ｈｕｒ、Ｈ．、Ｈｉｌｌｅｒ、Ｙ．及び
Ｗｉｌｃｈｅｋ、Ｍ． （１９８９） Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｊ． ２５９、３６９−３７６］に対する高い結合
親和性を有することが確認された。
【０００７】従って前記配列が融合タンパク質中に存在
する場合には、この融合タンパク質も高いストレプトア
ビジン親和性を有する。従って相応の融合タンパク質も
同様に本発明の対象である。この場合、ペプチド配列は
融合タンパク質のカルボキシ末端に存在していてもよい
が、理論的にはまた該タンパク質のアミノ末端又はアミ
ノ酸配列内部にあってもよいが、これは不利な特性、例
えば生物学的特性の阻害又は破壊等を伴わない場合に限
る。
する場合には、この融合タンパク質も高いストレプトア
ビジン親和性を有する。従って相応の融合タンパク質も
同様に本発明の対象である。この場合、ペプチド配列は
融合タンパク質のカルボキシ末端に存在していてもよい
が、理論的にはまた該タンパク質のアミノ末端又はアミ
ノ酸配列内部にあってもよいが、これは不利な特性、例
えば生物学的特性の阻害又は破壊等を伴わない場合に限
る。
【０００８】融合タンパク質中に存在するタンパク質
は、完全タンパク質ならびにタンパク質の突然変異体、
例えば欠落突然変異体又は置換突然変異体であってもよ
く、最後にまた、本発明の融合タンパク質と結合された
タンパク質の関心部分のみを得ることも可能である。
は、完全タンパク質ならびにタンパク質の突然変異体、
例えば欠落突然変異体又は置換突然変異体であってもよ
く、最後にまた、本発明の融合タンパク質と結合された
タンパク質の関心部分のみを得ることも可能である。
【０００９】本発明による融合タンパク質は、ストレプ
トアビジンと標識とから成る複合体と結合させることに
よって容易に検出することができ、この際標識としては
当業者に周知のすべての標識を使用することができる。
このようなタンパク質検出のその他の経過も当業者に周
知の条件下で行うことができる。
トアビジンと標識とから成る複合体と結合させることに
よって容易に検出することができ、この際標識としては
当業者に周知のすべての標識を使用することができる。
このようなタンパク質検出のその他の経過も当業者に周
知の条件下で行うことができる。
【００１０】本発明の他の対象は、適当なプロモーター
及びオペレーターの制御下に発現可能に配置された、本
発明のペプチドをコードするＤＮＡ配列を有しかつこの
ＤＮＡ配列に続く５′−方向に、発現すべきタンパク質
又はタンパク質部分をコードする他のＤＮＡ配列の導入
を許す数個の制限切断位置を有する発現ベクター、特
に、細菌発現ベクターである。
及びオペレーターの制御下に発現可能に配置された、本
発明のペプチドをコードするＤＮＡ配列を有しかつこの
ＤＮＡ配列に続く５′−方向に、発現すべきタンパク質
又はタンパク質部分をコードする他のＤＮＡ配列の導入
を許す数個の制限切断位置を有する発現ベクター、特
に、細菌発現ベクターである。
【００１１】本発明の発現ベクターによって、関心のあ
るタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、本発明のペプ
チドをコードするＤＮＡ配列の前により容易に配置しか
つ例えばエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）での発現後に本発明の融合タンパク質を得
ることができる。ペプチド配列の５′−方向の制限切断
位置に、関心のあるタンパク質をコードするＤＮＡ配列
を挿入する（これは本発明の発現ベクターを作成する他
の方法手段のように当業者の常用の手段である）と、カ
ルボキシ末端にストレプトアビジン親和性をもたらす本
発明のペプチドを有する融合タンパク質が得られる。
るタンパク質をコードするＤＮＡ配列を、本発明のペプ
チドをコードするＤＮＡ配列の前により容易に配置しか
つ例えばエシエリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ）での発現後に本発明の融合タンパク質を得
ることができる。ペプチド配列の５′−方向の制限切断
位置に、関心のあるタンパク質をコードするＤＮＡ配列
を挿入する（これは本発明の発現ベクターを作成する他
の方法手段のように当業者の常用の手段である）と、カ
ルボキシ末端にストレプトアビジン親和性をもたらす本
発明のペプチドを有する融合タンパク質が得られる。
【００１２】本発明の発現ベクターにおいて、制限切断
位置は、必ずしも該ペプチドをコードするＤＮＡ配列の
最初の塩基又は最終塩基の直ぐ隣りになくてもよい。し
かし好ましくは制限切断位置は、転写の際に読み枠が損
われずかつペプチドと該タンパク質のアミノ酸配列との
間に少数の、好ましくはせいぜい１０個の付加的アミノ
酸の結合が生じるように存在すべきである。
位置は、必ずしも該ペプチドをコードするＤＮＡ配列の
最初の塩基又は最終塩基の直ぐ隣りになくてもよい。し
かし好ましくは制限切断位置は、転写の際に読み枠が損
われずかつペプチドと該タンパク質のアミノ酸配列との
間に少数の、好ましくはせいぜい１０個の付加的アミノ
酸の結合が生じるように存在すべきである。
【００１３】本発明の他の対象は、組換えタンパク質を
コードするＤＮＡ配列を、適当な宿主細胞で本発明の融
合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を発現させる自体
公知の方法により発現させることによって、前記組換え
タンパク質を製造する方法である。本発明の方法の利点
は、発現産物の存在をストレプトアビジンと標識との複
合体により容易に検出することができ又は／及び融合タ
ンパク質としての所望のタンパク質を精製するための分
離をストレプトアビジンアフィニティクロマトグラフィ
ーにより行いうる点にある。
コードするＤＮＡ配列を、適当な宿主細胞で本発明の融
合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を発現させる自体
公知の方法により発現させることによって、前記組換え
タンパク質を製造する方法である。本発明の方法の利点
は、発現産物の存在をストレプトアビジンと標識との複
合体により容易に検出することができ又は／及び融合タ
ンパク質としての所望のタンパク質を精製するための分
離をストレプトアビジンアフィニティクロマトグラフィ
ーにより行いうる点にある。
【００１４】前記のように、発現産物、つまり融合タン
パク質の存在を検出するためには、ストレプトアビジン
を任意の標識との複合体として使用することができ、こ
の際本発明の範囲では酵素標識が好ましい。この場合さ
らにタンパク質を検出するための自体公知の方法、例え
ばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウェスターン法等も用いること
ができる。
パク質の存在を検出するためには、ストレプトアビジン
を任意の標識との複合体として使用することができ、こ
の際本発明の範囲では酵素標識が好ましい。この場合さ
らにタンパク質を検出するための自体公知の方法、例え
ばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ウェスターン法等も用いること
ができる。
【００１５】本発明方法の他の利点は、発現された融合
タンパク質の精製を、固定化ストレプトアビジンを有す
るカラムによるアフィニティ−クロマトグラフィーによ
って容易に行うことができることである。この場合溶出
は、極めて緩和された条件下で、例えばビオチン又はビ
オチン類似化合物を加えて、又はペプチド合成によって
得られたストレプトアビジン親和性ペプチドを用いて有
利に行うことができる。
タンパク質の精製を、固定化ストレプトアビジンを有す
るカラムによるアフィニティ−クロマトグラフィーによ
って容易に行うことができることである。この場合溶出
は、極めて緩和された条件下で、例えばビオチン又はビ
オチン類似化合物を加えて、又はペプチド合成によって
得られたストレプトアビジン親和性ペプチドを用いて有
利に行うことができる。
【００１６】本発明の範囲では、ビオチンを用いる溶出
が好ましい。またアフィニティ−クロマトグラフィーの
ためには、好ましくは、ストレプトアビジン−アガロー
ス基質又はオイペルギット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）TMＣに
結合されたストレプトアビジンの充填されたカラムを使
用する。
が好ましい。またアフィニティ−クロマトグラフィーの
ためには、好ましくは、ストレプトアビジン−アガロー
ス基質又はオイペルギット（Ｅｕｐｅｒｇｉｔ）TMＣに
結合されたストレプトアビジンの充填されたカラムを使
用する。
【００１７】本発明の上記説明から、本発明によるペプ
チド及び該ペプチドを有する融合タンパク質に、発現産
物、すなわち融合タンパク質の迅速にして信頼できる検
出が可能になる場合には、いかなる優れた利点が備わっ
ているかを見てとることができる。この際ストレプトア
ビジンは、蛍光標識又は酵素標識のような標識と結合し
ても得られる。安価で容易に使用できる試薬であると、
いえる。さらに発現された融合タンパク質は、本発明に
よるペプチドの存在による、容易に制御可能のストレプ
トアビジン結合特性を示すので、発現産物の容易な精製
が可能になり、これはまた工業的規模でも実施可能であ
る。
チド及び該ペプチドを有する融合タンパク質に、発現産
物、すなわち融合タンパク質の迅速にして信頼できる検
出が可能になる場合には、いかなる優れた利点が備わっ
ているかを見てとることができる。この際ストレプトア
ビジンは、蛍光標識又は酵素標識のような標識と結合し
ても得られる。安価で容易に使用できる試薬であると、
いえる。さらに発現された融合タンパク質は、本発明に
よるペプチドの存在による、容易に制御可能のストレプ
トアビジン結合特性を示すので、発現産物の容易な精製
が可能になり、これはまた工業的規模でも実施可能であ
る。
【００１８】本発明の融合タンパク質の発現は、本発明
による発現ベクターを用いることによって容易になり、
このような発現ベクターは発現すべきすべてのタンパク
質に関して一般的に適用することができる。本発明のペ
プチドは融合タンパク質において残りのタンパク質部分
の生物学的活性を阻害せず、従って必ずしもさらに使用
する前に分解しなくてもよい。しかしなんらかの理由か
ら万一分解が望ましい場合には、本発明による発現ベク
ターは、該タンパク質に対するＤＮＡ配列を導入するた
めの制限切断位置とペプチドをコードする配列との間
に、さらに特異的プロテアーゼ切断部位をコードするＤ
ＮＡ配列を有するようにも形成されていてよい。従って
発現産物の発現後、場合によっては同産物の精製又は検
出後には、ペプチド配列の分解を容易に行うことができ
る。
による発現ベクターを用いることによって容易になり、
このような発現ベクターは発現すべきすべてのタンパク
質に関して一般的に適用することができる。本発明のペ
プチドは融合タンパク質において残りのタンパク質部分
の生物学的活性を阻害せず、従って必ずしもさらに使用
する前に分解しなくてもよい。しかしなんらかの理由か
ら万一分解が望ましい場合には、本発明による発現ベク
ターは、該タンパク質に対するＤＮＡ配列を導入するた
めの制限切断位置とペプチドをコードする配列との間
に、さらに特異的プロテアーゼ切断部位をコードするＤ
ＮＡ配列を有するようにも形成されていてよい。従って
発現産物の発現後、場合によっては同産物の精製又は検
出後には、ペプチド配列の分解を容易に行うことができ
る。
【００１９】次に図面を用いながら実施例により本発明
を詳述する。
を詳述する。
【００２０】一般的技術 Ａ） 遺伝子工学的方法、試薬 ＤＮＡ操作は、常用の遺伝子工学的方法［Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋ Ｊ．、Ｆｒｉｔｉｓｃｈ、 Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉ
ａｔｉｓ Ｔ．（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ，ＮＹ］により行った。クローニング及び発現
のためには、菌種エシエリヒア・コリＫ１２ ＴＧ１
（ｓｕｐＥ、ｈｓｄ△５、ｔｈｉ、△（ｌａｃ−ｐｒｏ
ＡＢ）［Ｆ´、ｔｒａＤ３６、ｐｒｏＡＢ、ｌａｃＩq
Ｚ△Ｍ１５］）［Ｇｉｂｓｏｎ、Ｔ．Ｔ． （１９８
４） Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｉｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｅｎｇｌａｎｄ］及びエシエリヒ
ア・コリＫ１２ ＪＭ８３（ａｒａ、△（ｌａｃ−ｐｒ
ｏＡＢ）、ｒｐｓＬ（＝ｓｔｒＡ）、φ８０、ＬａｃＺ
△Ｍ１５）［Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、Ｃ．、Ｖ
ｉｅｉｒａ、Ｊ．及びＭｅｓｓｉｎｇ、Ｊ．（１９８
５）、Ｇｅｎｅ ３３、１０３−１１９］を使用した。
制限酵素はベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社、ニュー・イングランド
・バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｂｓ）社及びギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ社で入取し、
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼはプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ）社で入手した。制限消化及び複製連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）はメーカーによって推奨される条件下で行った。特
定部位の突然変異誘発のためには、クンケル（Ｋｕｎｋ
ｅｌ）による改良規定を用いた［Ｇｅｉｓｓｅｌｓｏｄ
ｅｒ、Ｊ．、Ｗｉｔｎｅｙ、Ｆ．及びＹｕｃｋｅｎｂｅ
ｒｇ、Ｐ．（１９８７）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
５、７８６−７９１］。オリゴデスオキシヌクレオチ
ド合成は、応用生物装置・ＤＮＡ自動合成装置を使用し
て行った。共有ストレプトアビジン−アルカリ性ホスフ
ァターゼ複合体はアメルスハム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社
で入取し、ストレプトアビジン−アガロースはビオモー
ル（Ｂｉｏｍｏｌ）社又はシグマ（Ｓｉｇｍａ）社産で
ある。これらすべての試薬は、該ストレプトアビジン、
タンパク質分解により短縮されたタンパク質の形を含有
している［Ｂａｙｅｒ、Ｅ．Ａ．、Ｂｅｎ−Ｈｕｒ、
Ｈ．、Ｈｉｌｌｅｒ、Ｙ．及びＷｉｌｃｈｅｋ、Ｍ．
（１９８９） Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５９、３６９−
３７６］。
ｏｋ Ｊ．、Ｆｒｉｔｉｓｃｈ、 Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉ
ａｔｉｓ Ｔ．（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａ
ｒｂｏｒ，ＮＹ］により行った。クローニング及び発現
のためには、菌種エシエリヒア・コリＫ１２ ＴＧ１
（ｓｕｐＥ、ｈｓｄ△５、ｔｈｉ、△（ｌａｃ−ｐｒｏ
ＡＢ）［Ｆ´、ｔｒａＤ３６、ｐｒｏＡＢ、ｌａｃＩq
Ｚ△Ｍ１５］）［Ｇｉｂｓｏｎ、Ｔ．Ｔ． （１９８
４） Ｐｈ．Ｄ．Ｔｈｅｉｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｕ
ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、Ｅｎｇｌａｎｄ］及びエシエリヒ
ア・コリＫ１２ ＪＭ８３（ａｒａ、△（ｌａｃ−ｐｒ
ｏＡＢ）、ｒｐｓＬ（＝ｓｔｒＡ）、φ８０、ＬａｃＺ
△Ｍ１５）［Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、Ｃ．、Ｖ
ｉｅｉｒａ、Ｊ．及びＭｅｓｓｉｎｇ、Ｊ．（１９８
５）、Ｇｅｎｅ ３３、１０３−１１９］を使用した。
制限酵素はベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎ
ｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）社、ニュー・イングランド
・バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａ
ｂｓ）社及びギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ社で入取し、
Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼはプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇ
ａ）社で入手した。制限消化及び複製連鎖反応（ＰＣ
Ｒ）はメーカーによって推奨される条件下で行った。特
定部位の突然変異誘発のためには、クンケル（Ｋｕｎｋ
ｅｌ）による改良規定を用いた［Ｇｅｉｓｓｅｌｓｏｄ
ｅｒ、Ｊ．、Ｗｉｔｎｅｙ、Ｆ．及びＹｕｃｋｅｎｂｅ
ｒｇ、Ｐ．（１９８７）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ
５、７８６−７９１］。オリゴデスオキシヌクレオチ
ド合成は、応用生物装置・ＤＮＡ自動合成装置を使用し
て行った。共有ストレプトアビジン−アルカリ性ホスフ
ァターゼ複合体はアメルスハム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社
で入取し、ストレプトアビジン−アガロースはビオモー
ル（Ｂｉｏｍｏｌ）社又はシグマ（Ｓｉｇｍａ）社産で
ある。これらすべての試薬は、該ストレプトアビジン、
タンパク質分解により短縮されたタンパク質の形を含有
している［Ｂａｙｅｒ、Ｅ．Ａ．、Ｂｅｎ−Ｈｕｒ、
Ｈ．、Ｈｉｌｌｅｒ、Ｙ．及びＷｉｌｃｈｅｋ、Ｍ．
（１９８９） Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２５９、３６９−
３７６］。
【００２１】Ｂ） プラスミド構造 本願で使用されたプラスミドｐＡＳＫ４６は、Ｄ１．３
Ｆｖ断片のＥ．ｃｏｌｉにおける発現をコードする古い
遺伝子構造［Ｗａｒｄ Ｅ．Ｓ．、Ｇｕｅｓｓｏｗ、
Ｄ．、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ、Ａ．Ｄ．、Ｊｏｎｅｓ、Ｐ．
Ｔ．及びＷｉｎｔｅｒ、Ｇ．（１９８９） Ｎａｔｕｒ
ｅ ３４１、５４４−５４６］及びｐＡＳＫ４０［Ｓｋ
ｅｒｒａ、Ａ．、Ｐｆｉｔｚｉｎｇｅｒ、Ｉ．及びＰｌ
ｕｅｅｃｋｔｈｕｎ、Ａ．（１９９１） Ｂｉｏ／Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ、９、２７３−２７８］から構成され
た。
Ｆｖ断片のＥ．ｃｏｌｉにおける発現をコードする古い
遺伝子構造［Ｗａｒｄ Ｅ．Ｓ．、Ｇｕｅｓｓｏｗ、
Ｄ．、Ｇｒｉｆｆｉｔｈ、Ａ．Ｄ．、Ｊｏｎｅｓ、Ｐ．
Ｔ．及びＷｉｎｔｅｒ、Ｇ．（１９８９） Ｎａｔｕｒ
ｅ ３４１、５４４−５４６］及びｐＡＳＫ４０［Ｓｋ
ｅｒｒａ、Ａ．、Ｐｆｉｔｚｉｎｇｅｒ、Ｉ．及びＰｌ
ｕｅｅｃｋｔｈｕｎ、Ａ．（１９９１） Ｂｉｏ／Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ、９、２７３−２７８］から構成され
た。
【００２２】ｐＡＳＫ４６の完全なＤＮＡ配列は図１〜
１１に示してある。同プラスミドの制限酵素切断地図は
図１２に示す。
１１に示してある。同プラスミドの制限酵素切断地図は
図１２に示す。
【００２３】Ｄ１．３Ｆｖ断片のＶＨのＣ末端の４種の
ペプチド及びＶＬのＣ末端の２種のペプチド［Ｂｏｕｌ
ｏｔ、Ｇ．、Ｅｉｓｅｌｅ、Ｊ．−Ｌ．、Ｂｅｎｔｌｅ
ｙ、Ｇ．Ａ．、Ｂｈａｔ、Ｔ．Ｎ．、Ｗａｒｄ、Ｅ．
Ｓ．、Ｗｉｎｔｅｒ、Ｇ．及びＰｏｌｊａｋ、Ｒ．Ｊ．
（１９９０）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１３、６１
７−６１９］をコードする、ｐＡＳＫ４６の６種の誘導
プラスミドを調製した。 ＶＨにペプチド先端部を有する構造物 塩基対６８６−７０６を含む、ｐＡＳＫ４６上のＤＮＡ
配列を、ノナペプチドをコードするそれぞれ長さ３０塩
基対の下記の配列と置換した。
ペプチド及びＶＬのＣ末端の２種のペプチド［Ｂｏｕｌ
ｏｔ、Ｇ．、Ｅｉｓｅｌｅ、Ｊ．−Ｌ．、Ｂｅｎｔｌｅ
ｙ、Ｇ．Ａ．、Ｂｈａｔ、Ｔ．Ｎ．、Ｗａｒｄ、Ｅ．
Ｓ．、Ｗｉｎｔｅｒ、Ｇ．及びＰｏｌｊａｋ、Ｒ．Ｊ．
（１９９０）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１３、６１
７−６１９］をコードする、ｐＡＳＫ４６の６種の誘導
プラスミドを調製した。 ＶＨにペプチド先端部を有する構造物 塩基対６８６−７０６を含む、ｐＡＳＫ４６上のＤＮＡ
配列を、ノナペプチドをコードするそれぞれ長さ３０塩
基対の下記の配列と置換した。
【００２４】
【化１】
【００２５】ＶＬにペプチド先端部を有する構造物 塩基対１１２７−１１６９を含む、ｐＡＳＫ４６上のＤ
ＮＡ配列を、長さ３６及び４４塩基対の下記の配列と置
換した。
ＮＡ配列を、長さ３６及び４４塩基対の下記の配列と置
換した。
【００２６】
【化２】
【００２７】Ｃ） 細胞増殖、誘導及び細胞分解 組換えタンパク質を生産するためには、対応する発現プ
ラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞を、２２℃
でアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有するＬＢ培地
で、０．５のＯＤ550が得られるまでインキュベートし
た。最終濃度１ｍＭを有するＩＰＴＧを加え、温度を場
合により２０℃に下げ、タンパク質発現の誘導を３時間
続けた。次に細胞を遠心分離し、適当な緩衝液中で再懸
濁した。周縁細胞質フラクションの調製のためには、培
養細胞１ｌを５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）１０ｍｌ、
５００ｍＭサッカロース、１ｍ ＭＥＤＴＡ中で氷上で
インキュベートした。スフェロプラストを遠心分離によ
って沈降させ、上澄みを引続き使用する前に滅菌濾過し
た。この溶液をストレプトアビジン−アガロースカラム
による精製のために使用する場合には、遊離ビオチン群
を複合化するために、アビジンを４０μｇ／ｍｌの最終
濃度まで加えた。タンパク質溶液を限外濾過によって濃
縮して約１ｍｌの最終容積となし、５０ｍＭトリス（ｐ
Ｈ８．０）１ｌに対して一晩中透析した。少量の沈殿物
を、カラムクロマトグラフィー前に遠心分離［ミクロフ
ュージ（Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）、１４０００ｒｐｍ、１
０分、４℃］又はスピン−Ｘ−濾過装置（ｓｐｉｎ−Ｘ
−Ｆｉｌｔｒｉｅｒｅｉｎｈｅｉｔ、Ｃｏｓｔａｒ社
製）による濾過によって除去した。全細胞タンパク質の
溶解部分を調製するためには、培養細胞１ｌを５０ｍＭ
トリス（ｐＨ８．０）中に再懸濁し、高圧ホモジナイザ
ー（フレンチプレスセル）を用いて１８０００ｐｓｉで
破解した。ホモジネートを遠心分離し（４５０００ｇ、
３０分、４℃）、遊離ビオチン群の複合化のために上澄
みにアビジンを４０μｇ／ｍｌの濃度まで加えた。４℃
で３０分インキュベートした後、タンパク質溶液を滅菌
濾過し、ストレプトアビジン−アガロースカラム上に施
した。全細胞タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥのために、
Ｅ．ｃｏｌｉ培養細胞４ｍｌを５０ｍＭトリス（ｐＨ
８．０）４００μｌ中で再懸濁し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ適
用緩衝液１００μｌ×５を加えた（下記参照）。染色体
ＤＮＡをゲル電気泳動前に超音波処理によって切断し
た。
ラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞を、２２℃
でアンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有するＬＢ培地
で、０．５のＯＤ550が得られるまでインキュベートし
た。最終濃度１ｍＭを有するＩＰＴＧを加え、温度を場
合により２０℃に下げ、タンパク質発現の誘導を３時間
続けた。次に細胞を遠心分離し、適当な緩衝液中で再懸
濁した。周縁細胞質フラクションの調製のためには、培
養細胞１ｌを５０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）１０ｍｌ、
５００ｍＭサッカロース、１ｍ ＭＥＤＴＡ中で氷上で
インキュベートした。スフェロプラストを遠心分離によ
って沈降させ、上澄みを引続き使用する前に滅菌濾過し
た。この溶液をストレプトアビジン−アガロースカラム
による精製のために使用する場合には、遊離ビオチン群
を複合化するために、アビジンを４０μｇ／ｍｌの最終
濃度まで加えた。タンパク質溶液を限外濾過によって濃
縮して約１ｍｌの最終容積となし、５０ｍＭトリス（ｐ
Ｈ８．０）１ｌに対して一晩中透析した。少量の沈殿物
を、カラムクロマトグラフィー前に遠心分離［ミクロフ
ュージ（Ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ）、１４０００ｒｐｍ、１
０分、４℃］又はスピン−Ｘ−濾過装置（ｓｐｉｎ−Ｘ
−Ｆｉｌｔｒｉｅｒｅｉｎｈｅｉｔ、Ｃｏｓｔａｒ社
製）による濾過によって除去した。全細胞タンパク質の
溶解部分を調製するためには、培養細胞１ｌを５０ｍＭ
トリス（ｐＨ８．０）中に再懸濁し、高圧ホモジナイザ
ー（フレンチプレスセル）を用いて１８０００ｐｓｉで
破解した。ホモジネートを遠心分離し（４５０００ｇ、
３０分、４℃）、遊離ビオチン群の複合化のために上澄
みにアビジンを４０μｇ／ｍｌの濃度まで加えた。４℃
で３０分インキュベートした後、タンパク質溶液を滅菌
濾過し、ストレプトアビジン−アガロースカラム上に施
した。全細胞タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥのために、
Ｅ．ｃｏｌｉ培養細胞４ｍｌを５０ｍＭトリス（ｐＨ
８．０）４００μｌ中で再懸濁し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ適
用緩衝液１００μｌ×５を加えた（下記参照）。染色体
ＤＮＡをゲル電気泳動前に超音波処理によって切断し
た。
【００２８】
例 １ フィルター−サンドイッチ試験 フィルター−サンドイッチ試験は、Ｓｋｅｒｒａ等［Ｓ
ｋｅｒｒａ、Ａ．、Ｄｒｅｈｅｒ、Ｍ．Ｌ．及びＷｉｎ
ｔｅｒ、Ｇ．(１９９１） Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
１９６、１５１−１５５］によって記載された戦略によ
り行った。形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、ニトロセルロ
ース−フィルター膜（直径８２ｍｍ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈ
ｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ社）上に塗布するか又は点状に
施した。この膜は、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ及び
グルコース１０ｍｇ／ｍｌを含有するＬＢ培地寒天平板
上にあった。この寒天平板を、小さなコロニーが見える
まで３７℃で約８時間インキュベートした。これと平行
に、２番目のニトロセルロース−フィルター膜に、ＰＢ
Ｓ緩衝液(４ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、１６ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ
4、１１５ｍＭ ＮａＣｌ)中のヒューナータンパク質リ
ゾチーム（Ｓｉｇｍａ社）（Ｄ１．３抗体の抗原）５ｍ
ｇ／ｍｌを６時間負荷し、次にＰＢＳ緩衝液中でＢＳＡ
（Ｓｉｇｍａ社、フラクションＶ）３％ｗ／ｖ及びツィ
ーン２０（Ｓｉｇｍａ社）０．５％ｖ／ｖで２時間遮断
した。この“抗体固定膜”を２回ＰＢＳで洗浄し、アン
ピシリン１００μｇ／ｍｌ及び１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソ
プロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド、Ｂｉｏｍｏ
ｌ社）を含有する液状ＬＢ培地を含浸させ、同じ培地組
成を有する寒天平板上に施し、Ｅ．ｃｏｌｉコロニーを
有する１番目のフィルター膜でおおった。このフィルタ
ー積層物上の細胞を室温で一晩中（１４時間）インキュ
ベートとしてＣ末端ペプチド先端部を有するＦｖ断片を
発現させた。次に上部フィルター膜を分離し、アンピシ
リン１００μｇ／ｍｌ及びグルコース１０ｍｇ／ｍｌを
含有する新しいＬＢ寒天平板上に置いて、Ｅ．ｃｏｌｉ
コロニーを後で増殖するために４℃で保存した。“固定
膜”を寒天から分離し、ＰＢＳ／ツィーン（ツィーン
０．１％ｖ／ｖを含有するＰＢＳ）で３回洗浄した。ス
トレプトアビジン結合活性を有するペプチドを含む固定
化Ｆｖ断片の検出は、予め１０分間添加しておいたアビ
ジン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社）２μｇ／ｍｌの存在
でストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ複合
体（ＰＢＳ／ツィーン中で１：２０００に希釈）と一緒
に１時間インキュベートすることによって達成した。該
固定膜は、十分に洗浄した（３×ＰＢＳ／ツィーン；２
×ＰＢＳ）後、ＡＰ緩衝液（１００ｍＭトリス（ｐＨ
８．８）；１００ｍＭ ＮａＣｌ；５ｍＭ ＭｇＣｌ2)
１０ｍｌ中でインキュベートした。この緩衝液にはＢＣ
ＩＰ母液［ジメチルホルムアミド中の５−ブロム−４−
クロル−３−インドリル−ホスフェート−４−トルイジ
ン塩（Ｂｉｏｍｏｌ社）５０ｍｇ／ｍｌ］３０μｌ及び
ＮＢＴ母液［ジメチルホルムアミド７０％ｖ／ｖ中のニ
トロ−ブル−テトラゾリウム（Ｂｉｏｍｏｌ社）７５ｍ
ｇ／ｍｌ］５μｌを加えておいた［Ｂｌａｋｅ、Ｍ．
Ｓ．、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、Ｋ．Ｈ．Ｒｕｓｓｅｌ−Ｊｏ
ｎｅｓ、Ｇ．Ｊ．及びＧｏｔｓｃｈｌｉｃｈ、Ｅ．Ｃ．
（１９８４） Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３６、
１７５−１７９］。３０〜６０分後に、発色反応を蒸留
水中で数回洗浄することによって停止し、フィルターを
空気乾燥した。
ｋｅｒｒａ、Ａ．、Ｄｒｅｈｅｒ、Ｍ．Ｌ．及びＷｉｎ
ｔｅｒ、Ｇ．(１９９１） Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
１９６、１５１−１５５］によって記載された戦略によ
り行った。形質転換Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、ニトロセルロ
ース−フィルター膜（直径８２ｍｍ、Ｓｃｈｌｅｉｃｈ
ｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ社）上に塗布するか又は点状に
施した。この膜は、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ及び
グルコース１０ｍｇ／ｍｌを含有するＬＢ培地寒天平板
上にあった。この寒天平板を、小さなコロニーが見える
まで３７℃で約８時間インキュベートした。これと平行
に、２番目のニトロセルロース−フィルター膜に、ＰＢ
Ｓ緩衝液(４ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、１６ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ
4、１１５ｍＭ ＮａＣｌ)中のヒューナータンパク質リ
ゾチーム（Ｓｉｇｍａ社）（Ｄ１．３抗体の抗原）５ｍ
ｇ／ｍｌを６時間負荷し、次にＰＢＳ緩衝液中でＢＳＡ
（Ｓｉｇｍａ社、フラクションＶ）３％ｗ／ｖ及びツィ
ーン２０（Ｓｉｇｍａ社）０．５％ｖ／ｖで２時間遮断
した。この“抗体固定膜”を２回ＰＢＳで洗浄し、アン
ピシリン１００μｇ／ｍｌ及び１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソ
プロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド、Ｂｉｏｍｏ
ｌ社）を含有する液状ＬＢ培地を含浸させ、同じ培地組
成を有する寒天平板上に施し、Ｅ．ｃｏｌｉコロニーを
有する１番目のフィルター膜でおおった。このフィルタ
ー積層物上の細胞を室温で一晩中（１４時間）インキュ
ベートとしてＣ末端ペプチド先端部を有するＦｖ断片を
発現させた。次に上部フィルター膜を分離し、アンピシ
リン１００μｇ／ｍｌ及びグルコース１０ｍｇ／ｍｌを
含有する新しいＬＢ寒天平板上に置いて、Ｅ．ｃｏｌｉ
コロニーを後で増殖するために４℃で保存した。“固定
膜”を寒天から分離し、ＰＢＳ／ツィーン（ツィーン
０．１％ｖ／ｖを含有するＰＢＳ）で３回洗浄した。ス
トレプトアビジン結合活性を有するペプチドを含む固定
化Ｆｖ断片の検出は、予め１０分間添加しておいたアビ
ジン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社）２μｇ／ｍｌの存在
でストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼ複合
体（ＰＢＳ／ツィーン中で１：２０００に希釈）と一緒
に１時間インキュベートすることによって達成した。該
固定膜は、十分に洗浄した（３×ＰＢＳ／ツィーン；２
×ＰＢＳ）後、ＡＰ緩衝液（１００ｍＭトリス（ｐＨ
８．８）；１００ｍＭ ＮａＣｌ；５ｍＭ ＭｇＣｌ2)
１０ｍｌ中でインキュベートした。この緩衝液にはＢＣ
ＩＰ母液［ジメチルホルムアミド中の５−ブロム−４−
クロル−３−インドリル−ホスフェート−４−トルイジ
ン塩（Ｂｉｏｍｏｌ社）５０ｍｇ／ｍｌ］３０μｌ及び
ＮＢＴ母液［ジメチルホルムアミド７０％ｖ／ｖ中のニ
トロ−ブル−テトラゾリウム（Ｂｉｏｍｏｌ社）７５ｍ
ｇ／ｍｌ］５μｌを加えておいた［Ｂｌａｋｅ、Ｍ．
Ｓ．、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ、Ｋ．Ｈ．Ｒｕｓｓｅｌ−Ｊｏ
ｎｅｓ、Ｇ．Ｊ．及びＧｏｔｓｃｈｌｉｃｈ、Ｅ．Ｃ．
（１９８４） Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１３６、
１７５−１７９］。３０〜６０分後に、発色反応を蒸留
水中で数回洗浄することによって停止し、フィルターを
空気乾燥した。
【００２９】図１３は、プラスミドｐＡＳＫ４６−ｐ１
４１Ｈ（１）、ｐＡＳＫ４６−ｐ１１１Ｈ（２）、ｐＡ
ＳＫ４６（３）（負の対照として）及びｐＡＳＫ４６−
ｐ１１１Ｌ（４）で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ
１の４種類のコロニーを示す。負の対照を別とすれば、
他のどの場合にもストレプトアビジン複合体に対する強
い結合シグナルが観察される。これよりも若干弱い結合
シグナルは、プラスミドｐＡＳＫ４６−ｐ１１ＸＨ、ｐ
ＡＳＫ４６−ｐ１１ＸＬ及びｐＡＳＫ４６−ｐ１４ＸＨ
に関して検出された（図示してない）。
４１Ｈ（１）、ｐＡＳＫ４６−ｐ１１１Ｈ（２）、ｐＡ
ＳＫ４６（３）（負の対照として）及びｐＡＳＫ４６−
ｐ１１１Ｌ（４）で形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ
１の４種類のコロニーを示す。負の対照を別とすれば、
他のどの場合にもストレプトアビジン複合体に対する強
い結合シグナルが観察される。これよりも若干弱い結合
シグナルは、プラスミドｐＡＳＫ４６−ｐ１１ＸＨ、ｐ
ＡＳＫ４６−ｐ１１ＸＬ及びｐＡＳＫ４６−ｐ１４ＸＨ
に関して検出された（図示してない）。
【００３０】例 ２ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット法 ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、垂直平面ゲル室でＦｌｉｎｇ、
Ｓ．Ｐ．及びＧｒｅｇｅｒｓｏｎ、Ｄ．Ｓ．［（１９８
６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１５５、８３−８
８］の緩衝系を用いて行った。ウエスタンブロット法の
ために電気泳動後のゲルをトランスファー緩衝液（メタ
ノール２０％（ｖ／ｖ）を含有する電気泳動用移動緩衝
液）中に浸漬した。タンパク質を“半乾燥”法でインモ
ビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒ
ｅ社）上に、４℃で一定の電流強さ１ｍＡ／ｃｍ2で１
時間の間に移した。次に該膜を、ツィーン０．５％ｖ／
ｖ及びＢＳＡ３％ｗ／ｖを含有するＰＢＳで室温で１時
間遮断した。該膜をＰＢＳ／ツィーンで３回洗浄した
後、ビオチンカルボキシル−担体タンパク質を複合化す
るためにアビジン（ＰＢＳ／ツィーン中２μｇ／ｍｌ）
と一緒に１０分間インキュベートした。次に、ＰＢＳ／
ツィーン中の１：４０００に希釈したストレプトアビジ
ン−アルカリ性ホスファターゼ複合体と一緒に１時間イ
ンキュベートした。十分に洗浄した（３×ＰＢＳ／ツィ
ーン；２×ＰＢＳ）後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴプロトコル
（例１参照）を用いてウエスタンブロット法を行った。
Ｓ．Ｐ．及びＧｒｅｇｅｒｓｏｎ、Ｄ．Ｓ．［（１９８
６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１５５、８３−８
８］の緩衝系を用いて行った。ウエスタンブロット法の
ために電気泳動後のゲルをトランスファー緩衝液（メタ
ノール２０％（ｖ／ｖ）を含有する電気泳動用移動緩衝
液）中に浸漬した。タンパク質を“半乾燥”法でインモ
ビロン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）Ｐ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒ
ｅ社）上に、４℃で一定の電流強さ１ｍＡ／ｃｍ2で１
時間の間に移した。次に該膜を、ツィーン０．５％ｖ／
ｖ及びＢＳＡ３％ｗ／ｖを含有するＰＢＳで室温で１時
間遮断した。該膜をＰＢＳ／ツィーンで３回洗浄した
後、ビオチンカルボキシル−担体タンパク質を複合化す
るためにアビジン（ＰＢＳ／ツィーン中２μｇ／ｍｌ）
と一緒に１０分間インキュベートした。次に、ＰＢＳ／
ツィーン中の１：４０００に希釈したストレプトアビジ
ン−アルカリ性ホスファターゼ複合体と一緒に１時間イ
ンキュベートした。十分に洗浄した（３×ＰＢＳ／ツィ
ーン；２×ＰＢＳ）後、ＢＣＩＰ／ＮＢＴプロトコル
（例１参照）を用いてウエスタンブロット法を行った。
【００３１】図１４は、ウエスタンブロット法における
相応のタンパク質−ペプチド融合物の検出を示す。プラ
スミドｐＡＳＫ４６−ｐ１４１Ｈ（１）、ｐＡＳＫ４６
−ｐ１１１Ｈ（２）、ｐＡＳＫ４６−ｐ１１１Ｌ（３）
及びｐＡＳＫ４６（４）で形質転換した、誘導Ｅ．ｃｏ
ｌｉ ＴＧ１細胞の周縁細胞質フラクションの同じアリ
コートをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。タンパク
質をインモビロンＰ膜に移した後、相応のペプチド−タ
ンパク質融合物がストレプトアビジン複合体によって検
出された。同様な実験においてプラスミドｐＡＳＫ４６
−ｐ１１ＸＨは、ｐＡＳＫ４６−ｐ１１ＸＬ及びｐＡＳ
Ｋ４６−ｐ１４ＸＨは少し弱いシグナルを示した。全細
胞タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離する場合にも、
比較できる結果が得られた。
相応のタンパク質−ペプチド融合物の検出を示す。プラ
スミドｐＡＳＫ４６−ｐ１４１Ｈ（１）、ｐＡＳＫ４６
−ｐ１１１Ｈ（２）、ｐＡＳＫ４６−ｐ１１１Ｌ（３）
及びｐＡＳＫ４６（４）で形質転換した、誘導Ｅ．ｃｏ
ｌｉ ＴＧ１細胞の周縁細胞質フラクションの同じアリ
コートをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。タンパク
質をインモビロンＰ膜に移した後、相応のペプチド−タ
ンパク質融合物がストレプトアビジン複合体によって検
出された。同様な実験においてプラスミドｐＡＳＫ４６
−ｐ１１ＸＨは、ｐＡＳＫ４６−ｐ１１ＸＬ及びｐＡＳ
Ｋ４６−ｐ１４ＸＨは少し弱いシグナルを示した。全細
胞タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離する場合にも、
比較できる結果が得られた。
【００３２】例 ３ ＥＬＩＳＡ ９６穴を有する微量滴定板（Ｆａｌｃｏｎ＃３９１２）
６列に、５０ｍＭ ＮａＨＣＯ3(ｐＨ９．６）中のリゾ
チーム３ｍｇ／ｍｌの溶液１００μｌを４℃で一晩中負
荷させた。次に室温でＰＢＳ中の脱脂粉乳（ＢｉｏＲａ
ｄ社）２％ｗ／ｖで２時間遮断した。洗浄(３×ＰＢＳ
／ツィーン)後に、相応のコロニーの周縁細胞質細胞フ
ラクション各５０μｌを、ＰＢＳ／ツィーン中の希釈度
列としてピペットで加え、１時間インキュベートした。
未希釈フラクション中のＦｖ断片の濃度は約５０〜１０
０μｇ／ｍｌであった［ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評
価］。洗浄（３×ＰＢＳツィーン）後、ＰＢＳ／ツィー
ン中の希釈度１：１０００のストレプトアビジン−アル
カリ性ホスファターゼ複合体５０μｌを加え、１時間イ
ンキュベートした。未結合複合体をＰＢＳ／ツィーン及
びＰＢＳでそれぞれ２回洗浄することによって除去し、
ＮＰＰ溶液（ｐ−ニトロフェニルホスフェート０．５ｍ
ｇ／ｍｌ；０．９Ｍジエタノールアミン、ｐＨ９．６；
１ｍＭ ＭｇＣｌ2）１００μｌをピペットで加えた。
呈色シグナルを５〜１０分間発生させ、１０ｍＭ ＥＤ
ＴＡ（ｐＨ８．０）１００μｌを加えて停止した。吸収
値を微量滴定板光度計を用いて測定し、測定値を各希釈
度に対する空値を差引いた後の差値Ａ405−Ａ450として
記録した。空値は、ペプチド先端部を有しないＤ１．３
Ｆｖ断片を含有する周縁細胞質細胞フラクションの希釈
度列によって測定し、全希釈度範囲に亙って一定である
ことが判明した（Ａ405−Ａ450＝０．１９９±０．００
９）。
６列に、５０ｍＭ ＮａＨＣＯ3(ｐＨ９．６）中のリゾ
チーム３ｍｇ／ｍｌの溶液１００μｌを４℃で一晩中負
荷させた。次に室温でＰＢＳ中の脱脂粉乳（ＢｉｏＲａ
ｄ社）２％ｗ／ｖで２時間遮断した。洗浄(３×ＰＢＳ
／ツィーン)後に、相応のコロニーの周縁細胞質細胞フ
ラクション各５０μｌを、ＰＢＳ／ツィーン中の希釈度
列としてピペットで加え、１時間インキュベートした。
未希釈フラクション中のＦｖ断片の濃度は約５０〜１０
０μｇ／ｍｌであった［ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評
価］。洗浄（３×ＰＢＳツィーン）後、ＰＢＳ／ツィー
ン中の希釈度１：１０００のストレプトアビジン−アル
カリ性ホスファターゼ複合体５０μｌを加え、１時間イ
ンキュベートした。未結合複合体をＰＢＳ／ツィーン及
びＰＢＳでそれぞれ２回洗浄することによって除去し、
ＮＰＰ溶液（ｐ−ニトロフェニルホスフェート０．５ｍ
ｇ／ｍｌ；０．９Ｍジエタノールアミン、ｐＨ９．６；
１ｍＭ ＭｇＣｌ2）１００μｌをピペットで加えた。
呈色シグナルを５〜１０分間発生させ、１０ｍＭ ＥＤ
ＴＡ（ｐＨ８．０）１００μｌを加えて停止した。吸収
値を微量滴定板光度計を用いて測定し、測定値を各希釈
度に対する空値を差引いた後の差値Ａ405−Ａ450として
記録した。空値は、ペプチド先端部を有しないＤ１．３
Ｆｖ断片を含有する周縁細胞質細胞フラクションの希釈
度列によって測定し、全希釈度範囲に亙って一定である
ことが判明した（Ａ405−Ａ450＝０．１９９±０．００
９）。
【００３３】図１５は、相応のプラスミドで形質転換さ
れた誘導Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１細胞の周縁細胞質フラク
ションの希釈度列に伴う、ストレプトアビジン複合体の
観察された結合シグナルを示す。
れた誘導Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１細胞の周縁細胞質フラク
ションの希釈度列に伴う、ストレプトアビジン複合体の
観察された結合シグナルを示す。
【００３４】例 ４ ストレプトアビジンアフィニテイークロマトグラフィー
によるタンパク質精製 ストレプトアビジン−アガロース（ゲル１ｍｌ当り約１
ｍｇのストレプトアビジン）の充填されたカラムを、５
０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）１０容で平衡化した。相応
のプラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞の周縁
細胞質細胞フラクション０．５ｌを前記カラムに塗布
し、引続きトリス緩衝液で洗浄した。次にハイブリッド
Ｄ１．３Ｆｖ断片を、１ｍＭイミノビオチン（Ｓｉｇｍ
ａ社）又は５ｍＭリポン酸（Ｓｉｇｍａ社）を同じ緩衝
液に溶かした溶液で特異的に溶出させた。このビオチン
類似化合物はビオチンそのものよりもはるかに弱くスト
レプトアビジンに結合するので、該カラムをトリス緩衝
液１０容で単に洗浄することによって再生させることが
できる。すべてのクロマトグラフィー段階を４℃の温度
で３０ｍｌ／ｈの流量で行った。全細胞タンパク質の可
溶部分のストレプトアビジンアフィニティークロマトグ
ラフィーを、約２０ｍｌ／ｈの流量でその他は同一条件
下で行った。精製されたハイブリッドＦｖ断片の収量は
通常０．５ｍｇ／Ｌ・ＯＤ550 Ｅ．ｃｏｌｉ培養物の範
囲内にあった。Ｄ１．３Ｆｖ−リゾチーム複合体のスト
レプトアビジンアフィニティー精製のために、Ｄ１．３
Ｆｖ（ｐ１１１Ｌ）断片を含有しかつ５０ｍＭ Ｎａ2
Ｈ2ＰＯ4（ｐＨ７．０）、１１５ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡに対して透析しておいた周縁細胞質細胞フ
ラクションに、約３倍モル量のリゾチームを加えた。４
℃で１時間インキュベートとし、次に遠心分離した後、
生じるタンパク質溶液を、ストレプトアビジン−アガロ
ースアフィニティークロマトグラフィーにかけ（上
記）、この際最後に挙げた緩衝液を使用した。
によるタンパク質精製 ストレプトアビジン−アガロース（ゲル１ｍｌ当り約１
ｍｇのストレプトアビジン）の充填されたカラムを、５
０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）１０容で平衡化した。相応
のプラスミドで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞の周縁
細胞質細胞フラクション０．５ｌを前記カラムに塗布
し、引続きトリス緩衝液で洗浄した。次にハイブリッド
Ｄ１．３Ｆｖ断片を、１ｍＭイミノビオチン（Ｓｉｇｍ
ａ社）又は５ｍＭリポン酸（Ｓｉｇｍａ社）を同じ緩衝
液に溶かした溶液で特異的に溶出させた。このビオチン
類似化合物はビオチンそのものよりもはるかに弱くスト
レプトアビジンに結合するので、該カラムをトリス緩衝
液１０容で単に洗浄することによって再生させることが
できる。すべてのクロマトグラフィー段階を４℃の温度
で３０ｍｌ／ｈの流量で行った。全細胞タンパク質の可
溶部分のストレプトアビジンアフィニティークロマトグ
ラフィーを、約２０ｍｌ／ｈの流量でその他は同一条件
下で行った。精製されたハイブリッドＦｖ断片の収量は
通常０．５ｍｇ／Ｌ・ＯＤ550 Ｅ．ｃｏｌｉ培養物の範
囲内にあった。Ｄ１．３Ｆｖ−リゾチーム複合体のスト
レプトアビジンアフィニティー精製のために、Ｄ１．３
Ｆｖ（ｐ１１１Ｌ）断片を含有しかつ５０ｍＭ Ｎａ2
Ｈ2ＰＯ4（ｐＨ７．０）、１１５ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡに対して透析しておいた周縁細胞質細胞フ
ラクションに、約３倍モル量のリゾチームを加えた。４
℃で１時間インキュベートとし、次に遠心分離した後、
生じるタンパク質溶液を、ストレプトアビジン−アガロ
ースアフィニティークロマトグラフィーにかけ（上
記）、この際最後に挙げた緩衝液を使用した。
【００３５】図１６は、ｐＡＳＫ４６−ｐ１１１Ｈ及び
ｐＡＳＫ４６−ｐ１１１Ｌで形質転換されたＥ．ｃｏｌ
ｉ ＴＧ１細胞の周縁細胞質フラクションについて行っ
たストレプトアビジンアフィニティークロマトグラフィ
ーの溶出プロフィル（２８０ｎｍで吸収）を示す。この
中に、クーマシーブリリアントブルー（Ｓｅｒｖａ社）
で染色された、イミノビオチン溶液を適用して得られた
フラクションのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを図示
してある。該図から、ヘテロダイマータンパク質の各鎖
がストレプトアビジン親和性ペプチドに融合されていた
としても、Ｆｖ断片の２つのサブユニットが一緒に純粋
な形で特異的に溶出されたのを認めることができる。ｐ
ＡＳＫ４６−ｐ１１１Ｌの場合には、２個の鎖はＳＤＳ
−ＰＡＧＥで同じ移動度を有していた。従って精製され
たタンパク質の機能性もＥＬＩＳＡ実験（例３と同様）
によって検出された。ｐＡＳＫ４６−ｐ１１１Ｈで形質
転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１細胞の全細胞タンパク
質を施して、同様に行ったクロマトグラフィーの場合に
も、同様に組換えタンパク質が完全なヘテロダイマーと
して純粋な形で得られた。
ｐＡＳＫ４６−ｐ１１１Ｌで形質転換されたＥ．ｃｏｌ
ｉ ＴＧ１細胞の周縁細胞質フラクションについて行っ
たストレプトアビジンアフィニティークロマトグラフィ
ーの溶出プロフィル（２８０ｎｍで吸収）を示す。この
中に、クーマシーブリリアントブルー（Ｓｅｒｖａ社）
で染色された、イミノビオチン溶液を適用して得られた
フラクションのＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルを図示
してある。該図から、ヘテロダイマータンパク質の各鎖
がストレプトアビジン親和性ペプチドに融合されていた
としても、Ｆｖ断片の２つのサブユニットが一緒に純粋
な形で特異的に溶出されたのを認めることができる。ｐ
ＡＳＫ４６−ｐ１１１Ｌの場合には、２個の鎖はＳＤＳ
−ＰＡＧＥで同じ移動度を有していた。従って精製され
たタンパク質の機能性もＥＬＩＳＡ実験（例３と同様）
によって検出された。ｐＡＳＫ４６−ｐ１１１Ｈで形質
転換されたＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１細胞の全細胞タンパク
質を施して、同様に行ったクロマトグラフィーの場合に
も、同様に組換えタンパク質が完全なヘテロダイマーと
して純粋な形で得られた。
【００３６】図１７は、同様なストレプトアビジンアフ
ィニティークロマトグラフィーの溶出プロフィルを示す
が、この場合には、リゾチーム、つまりＤ１．３ Ｆｖ
断片の抗原を、ｐＡＳＫ４６−ｐ１１１Ｌで形質転換さ
れたＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１細胞の周縁細胞質フラクショ
ンに加えておいた。溶出プロフィルで図示した、クーマ
シーブリリアントブルー（Ｓｅｒｖａ社）で染色したＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルは、イミノビオチン溶液
で溶出して得られる産物フラクション（２）、比較的に
精製されたリゾチーム（３）及び別個に精製された組換
えＦｖ断片（４）を示す。痕跡（１）は分子量標準を表
わす。組換えＦｖ断片と抗原リゾチームとから成る免疫
複合体が特異的に精製されていることがわかる。
ィニティークロマトグラフィーの溶出プロフィルを示す
が、この場合には、リゾチーム、つまりＤ１．３ Ｆｖ
断片の抗原を、ｐＡＳＫ４６−ｐ１１１Ｌで形質転換さ
れたＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１細胞の周縁細胞質フラクショ
ンに加えておいた。溶出プロフィルで図示した、クーマ
シーブリリアントブルー（Ｓｅｒｖａ社）で染色したＳ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルは、イミノビオチン溶液
で溶出して得られる産物フラクション（２）、比較的に
精製されたリゾチーム（３）及び別個に精製された組換
えＦｖ断片（４）を示す。痕跡（１）は分子量標準を表
わす。組換えＦｖ断片と抗原リゾチームとから成る免疫
複合体が特異的に精製されていることがわかる。
【００３７】例 ５ ｐＡＳＫ６０−Ｓｔｒｅｐの構造及び使用 ｐＡＳＫ４０［Ｓｋｅｒｒａ、Ａ．、Ｐｆｉｔｚｉｎｇ
ｅｒ、Ｉ．及びＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、Ａ．（１９９
１） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９、２７３−２
７８］から出発して、特異的部位の突然変異誘発及びＰ
ＣＲを用いてｐＡＳＫ６０−Ｓｔｒｅｐを調製した。図
１８でｐＡＳＫ６０−Ｓｔｒｅｐの制限酵素切断地図を
示し、同プラスミドの全ＤＮＡ配列を図１９〜２９に示
してある。ｐＡＳＫ６０−Ｓｔｒｅｐ上のポリリンカー
は、ＯｍｐＡシグナルペプチドをコードする領域の３′
末端に直接存在する２つの制限位置を含む、改良された
一組の特異的制限切断位置を有し、その次にストレプト
アビジン−結合ペプチド“（Ｓｅｒ−Ａｌａ−）Ｔｒｐ
−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙ”をコードするＤＮＡ配列が続く（図３０参
照）。Ｅ．ｃｏｌｉにおける外来遺伝子の直接発現（す
なわちＯｍｐＡシグナル配列を使用しない）は、Ｘｂａ
Ｉ切断位置を使用しかつｌａｃＺミニシストロンの終止
コドンと構造遺伝子の開始コドンとの間の１６塩基対を
含む範囲を再構成して達成することができる。これに対
して、ｐＡＳＫ６０−Ｓｔｒｅｐ上にコードされている
ＯｍｐＡシグナル配列との融合をつくるためには、構造
遺伝子をＳｔｕＩ又はＢｓａＩ切断位置を使用してクロ
ーン化することができる。ＳｔｕＩ（認識配列“ＡＧＧ
ＣＣＴ”）は、シグナル配列の最終コドン（Ａｌａ）の
初めのヌクレオチドの後に平滑末端をつくる。従って精
密な融合は、適合しうる制限位置（例えばＳｔｕＩ、Ｐ
ｖｕＩＩ、ＮｒｕＩ）の助けによって構造遺伝子の直前
でつくることができる。ＢｓａＩはクラスＩＩａの制限
酵素であって、その切断位置は認識位置から離れている
（“ＧＡＧＡＣＣ”、図３０では下線をひいてある）。
この酵素で切断することによって、シグナル配列の最外
端の３′−末端にある５′−突出ＤＮＡ末端がつくられ
る（“ＧＧＣＣ”、図３０では小文字で表わしてあ
る）。この末端はクローン化すべき遺伝子の成熟部分の
コード領域中に突出しない。この付着末端は、制限酵素
ＥａｅＩ及びＥａｇＩによってつくられる末端に連結す
ることができる。また、例えばクローン化すべきＤＮＡ
断片を調製する場合ＰＣＲによって、適合しうる制限位
置を導入することもできる。このような制限位置は、Ｂ
ｓａＩ（又は他のＩＩａクラスの酵素、例えばＢｓｐＭ
Ｉ）の認識配列が、つくろうとする付着端の対向側に配
置される場合に、遺伝子のアミノ末端をコードする成熟
領域を損わない。ストレプトアビジン−結合ペプチドを
コードする領域への構造遺伝子の融合は、Ｅｃｏ４７Ｉ
ＩＩ−制限切断位置（認識配列“ＡＧＣＧＣＴ”）を使
用して達成することができる。これによって、請求項１
記載の実際のペプチド配列前に、Ｓｅｒコドン（“ＡＧ
Ｃ”、図３０では小文字で表わしてある）とＡｌａコド
ンとの間で直接平滑切断が起こる。Ｓｅｒコドンを再調
製しようとする場合には、適合する末端をつくるための
種々の制限位置（Ｅｃｏ４７ＩＩＩの他に例えばＳｃａ
Ｉ及びＮｒｕＩ）を利用することができる。
ｅｒ、Ｉ．及びＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ、Ａ．（１９９
１） Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９、２７３−２
７８］から出発して、特異的部位の突然変異誘発及びＰ
ＣＲを用いてｐＡＳＫ６０−Ｓｔｒｅｐを調製した。図
１８でｐＡＳＫ６０−Ｓｔｒｅｐの制限酵素切断地図を
示し、同プラスミドの全ＤＮＡ配列を図１９〜２９に示
してある。ｐＡＳＫ６０−Ｓｔｒｅｐ上のポリリンカー
は、ＯｍｐＡシグナルペプチドをコードする領域の３′
末端に直接存在する２つの制限位置を含む、改良された
一組の特異的制限切断位置を有し、その次にストレプト
アビジン−結合ペプチド“（Ｓｅｒ−Ａｌａ−）Ｔｒｐ
−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙ”をコードするＤＮＡ配列が続く（図３０参
照）。Ｅ．ｃｏｌｉにおける外来遺伝子の直接発現（す
なわちＯｍｐＡシグナル配列を使用しない）は、Ｘｂａ
Ｉ切断位置を使用しかつｌａｃＺミニシストロンの終止
コドンと構造遺伝子の開始コドンとの間の１６塩基対を
含む範囲を再構成して達成することができる。これに対
して、ｐＡＳＫ６０−Ｓｔｒｅｐ上にコードされている
ＯｍｐＡシグナル配列との融合をつくるためには、構造
遺伝子をＳｔｕＩ又はＢｓａＩ切断位置を使用してクロ
ーン化することができる。ＳｔｕＩ（認識配列“ＡＧＧ
ＣＣＴ”）は、シグナル配列の最終コドン（Ａｌａ）の
初めのヌクレオチドの後に平滑末端をつくる。従って精
密な融合は、適合しうる制限位置（例えばＳｔｕＩ、Ｐ
ｖｕＩＩ、ＮｒｕＩ）の助けによって構造遺伝子の直前
でつくることができる。ＢｓａＩはクラスＩＩａの制限
酵素であって、その切断位置は認識位置から離れている
（“ＧＡＧＡＣＣ”、図３０では下線をひいてある）。
この酵素で切断することによって、シグナル配列の最外
端の３′−末端にある５′−突出ＤＮＡ末端がつくられ
る（“ＧＧＣＣ”、図３０では小文字で表わしてあ
る）。この末端はクローン化すべき遺伝子の成熟部分の
コード領域中に突出しない。この付着末端は、制限酵素
ＥａｅＩ及びＥａｇＩによってつくられる末端に連結す
ることができる。また、例えばクローン化すべきＤＮＡ
断片を調製する場合ＰＣＲによって、適合しうる制限位
置を導入することもできる。このような制限位置は、Ｂ
ｓａＩ（又は他のＩＩａクラスの酵素、例えばＢｓｐＭ
Ｉ）の認識配列が、つくろうとする付着端の対向側に配
置される場合に、遺伝子のアミノ末端をコードする成熟
領域を損わない。ストレプトアビジン−結合ペプチドを
コードする領域への構造遺伝子の融合は、Ｅｃｏ４７Ｉ
ＩＩ−制限切断位置（認識配列“ＡＧＣＧＣＴ”）を使
用して達成することができる。これによって、請求項１
記載の実際のペプチド配列前に、Ｓｅｒコドン（“ＡＧ
Ｃ”、図３０では小文字で表わしてある）とＡｌａコド
ンとの間で直接平滑切断が起こる。Ｓｅｒコドンを再調
製しようとする場合には、適合する末端をつくるための
種々の制限位置（Ｅｃｏ４７ＩＩＩの他に例えばＳｃａ
Ｉ及びＮｒｕＩ）を利用することができる。
【００３８】例 ６ ｐＡＳＫ６０−ＳｔｒｅｐによるＬＤＬ受容体の可溶領
域の発現及び検出 ヒトの“低密度リポタンパク質”受容体は、成熟受容体
において分離されたＮ末端シグナル配列を別にすれば、
５つのタンパク質領域から成り、そのうちの第４番目は
トランスメンブラン部分である。アミノ酸１〜２９２個
を有する第１番目のＮ末端タンパク質領域のクローニン
グのためには、プラスミドｐＬＤＬＲ３（ＡＴＣＣ Ｎ
ｏ５７００４）［Ｙａｍａｍｏｔｏ、Ｔ．、Ｄａｖｉ
ｓ、Ｃ．Ｇ．、Ｂｒｏｗｎ、Ｍ．Ｓ．、Ｓｃｈｎｅｉｄ
ｅｒ、Ｗ．Ｊ．、Ｃａｓｅｙ、Ｍ．Ｌ．、Ｇｏｌｄｓｔ
ｅｉｎ、Ｊ．Ｌ．及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｄ．Ｗ． （１
９８４） Ｃｅｌｌ ３９、２７−３８］を使用した。
相応のＤＮＡ断片を、オリゴデスオキシヌクレオチド−
プライマー“５′−ＴＡＧ ＣＡＡ ＣＧＧ ＣＣＧＣ
ＡＧ ＴＧＧ ＧＣＧ ＡＣＡ ＧＡＴ ＧＴ”（Ｎ末
端について：制限切断位置ＥａｇＩを有する）及び
“５′−ＴＴＣ ＧＴＴ ＡＧＴ ＡＣＴ ＧＣＡ Ｃ
ＴＣ ＴＴＴ ＧＡＴ ＧＧＧ ＴＴＣ”（Ｎ末端につ
いて：制限切断位置ＳｃａＩを有する）を用いて、ＰＣ
Ｒによって増幅し、単離しかつ制限酵素ＢａｇＩ及びＳ
ｃａＩで切断する。このＤＮＡ断片を、ｐＡＳＫ６０−
Ｓｔｒｅｐにおいてその制限切断位置ＢｓａＩ及びＥｃ
ｏ４７ＩＩＩにより、Ｅ．ｃｏｌｉ菌種Ｋ１２ ＪＭ８
３を使ってクローン化した。得られたプラスミドを制限
分析及びＤＮＡ配列決定した後、クローンから培養物を
調製し、前記のようにタンパク質発現を誘導する。得ら
れた細胞の全細胞タンパク質は、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅで分離し、ウエスタンブロット法によってインモビロ
ンＰ膜上に移した。ストレプトアビジン−アルカリ性ホ
スファターゼ（例２参照）を用いて、約４０，０００ダ
ルトンの組換え受容体領域を検出することができた。
域の発現及び検出 ヒトの“低密度リポタンパク質”受容体は、成熟受容体
において分離されたＮ末端シグナル配列を別にすれば、
５つのタンパク質領域から成り、そのうちの第４番目は
トランスメンブラン部分である。アミノ酸１〜２９２個
を有する第１番目のＮ末端タンパク質領域のクローニン
グのためには、プラスミドｐＬＤＬＲ３（ＡＴＣＣ Ｎ
ｏ５７００４）［Ｙａｍａｍｏｔｏ、Ｔ．、Ｄａｖｉ
ｓ、Ｃ．Ｇ．、Ｂｒｏｗｎ、Ｍ．Ｓ．、Ｓｃｈｎｅｉｄ
ｅｒ、Ｗ．Ｊ．、Ｃａｓｅｙ、Ｍ．Ｌ．、Ｇｏｌｄｓｔ
ｅｉｎ、Ｊ．Ｌ．及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｄ．Ｗ． （１
９８４） Ｃｅｌｌ ３９、２７−３８］を使用した。
相応のＤＮＡ断片を、オリゴデスオキシヌクレオチド−
プライマー“５′−ＴＡＧ ＣＡＡ ＣＧＧ ＣＣＧＣ
ＡＧ ＴＧＧ ＧＣＧ ＡＣＡ ＧＡＴ ＧＴ”（Ｎ末
端について：制限切断位置ＥａｇＩを有する）及び
“５′−ＴＴＣ ＧＴＴ ＡＧＴ ＡＣＴ ＧＣＡ Ｃ
ＴＣ ＴＴＴ ＧＡＴ ＧＧＧ ＴＴＣ”（Ｎ末端につ
いて：制限切断位置ＳｃａＩを有する）を用いて、ＰＣ
Ｒによって増幅し、単離しかつ制限酵素ＢａｇＩ及びＳ
ｃａＩで切断する。このＤＮＡ断片を、ｐＡＳＫ６０−
Ｓｔｒｅｐにおいてその制限切断位置ＢｓａＩ及びＥｃ
ｏ４７ＩＩＩにより、Ｅ．ｃｏｌｉ菌種Ｋ１２ ＪＭ８
３を使ってクローン化した。得られたプラスミドを制限
分析及びＤＮＡ配列決定した後、クローンから培養物を
調製し、前記のようにタンパク質発現を誘導する。得ら
れた細胞の全細胞タンパク質は、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅで分離し、ウエスタンブロット法によってインモビロ
ンＰ膜上に移した。ストレプトアビジン−アルカリ性ホ
スファターゼ（例２参照）を用いて、約４０，０００ダ
ルトンの組換え受容体領域を検出することができた。
【図１】ｐＡＳＫ４６のＤＮＡ配列（切断位置ｍ示す）
及び同配列によってコードされた、３つの読み枠におけ
るアミノ酸配列を示す図である。
及び同配列によってコードされた、３つの読み枠におけ
るアミノ酸配列を示す図である。
【図２】図１の続きである。
【図３】図２の続きである。
【図４】図３の続きである。
【図５】図４の続きである。
【図６】図５の続きである。
【図７】図６の続きである。
【図８】図７の続きである。
【図９】図８の続きである。
【図１０】図９の続きである。
【図１１】図１０の続きである。
【図１２】ｐＡＳＫ４６の制限酵素切断地図を示す図で
ある。
ある。
【図１３】フィルター−サンドイッチ試験における本発
明のタンパク質−ペプチド融合物の検出（コロニー）を
示す図である。
明のタンパク質−ペプチド融合物の検出（コロニー）を
示す図である。
【図１４】ウエスタンブロット法における本発明のタン
パク質−ペプチド融合物の検出を示す図である。
パク質−ペプチド融合物の検出を示す図である。
【図１５】形質転換された誘導Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ１細
胞の周縁細胞質フラクションの希釈度に伴う、ストレプ
トアビジン複合体の結合シグナル（ＥＬＩＳＡで観察）
を示すグラフである。
胞の周縁細胞質フラクションの希釈度に伴う、ストレプ
トアビジン複合体の結合シグナル（ＥＬＩＳＡで観察）
を示すグラフである。
【図１６】図１５と同様な周縁細胞質フラクションにつ
いて行ったストレプトアビジンアフィニティークロマト
グラフィーの溶出プロフィルを示す図である。
いて行ったストレプトアビジンアフィニティークロマト
グラフィーの溶出プロフィルを示す図である。
【図１７】図１６と同様な周縁細胞質フラクションに抗
原（リゾチーム）を加えて行った、図１６と同様なクロ
マトグラフィーの溶出プロフィルを示す図である。
原（リゾチーム）を加えて行った、図１６と同様なクロ
マトグラフィーの溶出プロフィルを示す図である。
【図１８】ｐＡＳＫ６０−Ｓｔｒｅｐの制限酵素切断地
図を示す図である。
図を示す図である。
【図１９】ｐＡＳＫ６０−ＳｔｒｅｐのＤＮＡ配列（切
断位置も示す）及びこの配列によってコードされた、３
つの読み枠におけるアミノ酸配列を示す図である。
断位置も示す）及びこの配列によってコードされた、３
つの読み枠におけるアミノ酸配列を示す図である。
【図２０】図１９の続きである。
【図２１】図２０の続きである。
【図２２】図２１の続きである。
【図２３】図２２の続きである。
【図２４】図２３の続きである。
【図２５】図２４の続きである。
【図２６】図２５の続きである。
【図２７】図２６の続きである。
【図２８】図２７の続きである。
【図２９】図２８の続きである。
【図３０】ｐＡＳＫ６０−Ｓｔｒｅｐのポリリンカーの
配列の説明図である。
配列の説明図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (8)
- 【請求項１】 次のアミノ酸配列： Ｔｒｐ−Ｘ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｙ−Ｚ ［ここでＸは任意のアミノ酸を表わし、Ｙ及びＺは２つ
ともＧｌｙを表わすか又はＹはＧｌｕを表わし、ＺはＡ
ｒｇ又はＬｙｓを表わす］を包含するペプチド。 - 【請求項２】 請求項１記載のペプチドの配列に結合さ
れた、完全タンパク質のアミノ酸配列、タンパク質突然
変異体、すなわち欠失−又は置換突然変異体、又はタン
パク質部分から成ることを特徴とする融合タンパク質。 - 【請求項３】 請求項１記載のペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列を、適当なプロモーター及び場合によりオペレ
ーターの制御下に発現可能に有しかつこのＤＮＡ配列に
続く５′−又は／及び３′−方向に、発現すべきタンパ
ク質又はタンパク質部分をコードするもう１つのＤＮＡ
配列の導入を許す制限切断位置を有することを特徴とす
る、発現ベクター。 - 【請求項４】 組換えタンパク質をコードするＤＮＡ配
列を、適当な宿主細胞で自体公知の方法により発現させ
ることによって該組換えタンパク質を製造する方法にお
いて、請求項２記載の融合タンパク質をコードするＤＮ
Ａ配列を使用し、場合により発現産物の存在をストレプ
トアビジンと標識との複合体により検出しかつ融合タン
パク質としての所望のタンパク質の分離をストレプトア
ビジンアフィニティークロマトグラフィーにより行うこ
とを特徴とする、組換えタンパク質の製造方法。 - 【請求項５】 ストレプトアビジンと酵素標識とから成
る複合体を使用する、請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 酵素標識としてアルカリ性ホスファター
ゼを使用する、請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 アフィニティークロマトグラフィーのた
めにストレプトアビジン−アガロース基質を使用する、
請求項４記載の方法。 - 【請求項８】 アフィニティークロマトグラフィーの際
に、ストレプトアビジンの天然リガンド、特にビオチ
ン、その合成誘導体、特に２−イミノビオチン又はリポ
ン酸；あるいは請求項１記載の合成ペプチドを加えて融
合タンパク質を溶出する、請求項４記載の方法。
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