NO178036B - Fremgangsmåte for fremstilling av fusjonsproteiner, genstruktur, vektorer streptomycetceller og fusjonsproteinene - Google Patents
Fremgangsmåte for fremstilling av fusjonsproteiner, genstruktur, vektorer streptomycetceller og fusjonsproteinene Download PDFInfo
- Publication number
- NO178036B NO178036B NO881942A NO881942A NO178036B NO 178036 B NO178036 B NO 178036B NO 881942 A NO881942 A NO 881942A NO 881942 A NO881942 A NO 881942A NO 178036 B NO178036 B NO 178036B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- plasmid
- gene
- proinsulin
- ser
- ala
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 81
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims description 29
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 13
- 241001655322 Streptomycetales Species 0.000 title claims description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 76
- 229950001790 tendamistat Drugs 0.000 claims description 43
- 108010037401 tendamistate Proteins 0.000 claims description 43
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 claims description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 27
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 25
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 12
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 241000828254 Streptomyces lividans TK24 Species 0.000 description 5
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- NSFFHOGKXHRQEW-UHFFFAOYSA-N Thiostrepton B Natural products N1C(=O)C(C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(C(C)CC)NC(C(C2=N3)O)C=CC2=C(C(C)O)C=C3C(=O)OC(C)C(C=2SC=C(N=2)C2N=3)NC(=O)C(N=4)=CSC=4C(C(C)(O)C(C)O)NC(=O)C(N=4)CSC=4C(=CC)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(N=4)=CSC=4C21CCC=3C1=NC(C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(N)=O)=CS1 NSFFHOGKXHRQEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 229930188070 thiostrepton Natural products 0.000 description 3
- NSFFHOGKXHRQEW-AIHSUZKVSA-N thiostrepton Chemical compound C([C@]12C=3SC=C(N=3)C(=O)N[C@H](C(=O)NC(/C=3SC[C@@H](N=3)C(=O)N[C@H](C=3SC=C(N=3)C(=O)N[C@H](C=3SC=C(N=3)[C@H]1N=1)[C@@H](C)OC(=O)C3=CC(=C4C=C[C@H]([C@@H](C4=N3)O)N[C@H](C(N[C@@H](C)C(=O)NC(=C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N2)=O)[C@@H](C)CC)[C@H](C)O)[C@](C)(O)[C@@H](C)O)=C\C)[C@@H](C)O)CC=1C1=NC(C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(N)=O)=CS1 NSFFHOGKXHRQEW-AIHSUZKVSA-N 0.000 description 3
- 229940063214 thiostrepton Drugs 0.000 description 3
- NSFFHOGKXHRQEW-OFMUQYBVSA-N thiostrepton A Natural products CC[C@H](C)[C@@H]1N[C@@H]2C=Cc3c(cc(nc3[C@H]2O)C(=O)O[C@H](C)[C@@H]4NC(=O)c5csc(n5)[C@@H](NC(=O)[C@H]6CSC(=N6)C(=CC)NC(=O)[C@@H](NC(=O)c7csc(n7)[C@]8(CCC(=N[C@@H]8c9csc4n9)c%10nc(cs%10)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(=C)C(=O)N)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@H](C)NC1=O)[C@@H](C)O)[C@](C)(O)[C@@H](C)O)[C@H](C)O NSFFHOGKXHRQEW-OFMUQYBVSA-N 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N N-bromosuccinimide Chemical compound BrN1C(=O)CCC1=O PCLIMKBDDGJMGD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N (+)-Galactose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-SVZMEOIVSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- OMCKWYSDUQBYCN-FXQIFTODSA-N Ala-Ser-Met Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O OMCKWYSDUQBYCN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000005377 adsorption chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av fusjonsproteiner, vektor, streptomycetceller og fusjonsproteinene.
I europeisk patentsøknad med offentlighetsnummer (EP-A) 0 161 629, henholdsvis i det sydafrikanske patentskrift 85/3672, er det kjent at man kan benytte tendamistatkodende DNA, for å få et polypeptid, spesielt tendamistat, til å bli skilt ut av streptomycetceller. Dette DNA kan tilslutt bli utvunnet fra hver tendamistatproduserende stamme, fortrinnsvis blir et ifølge eksempel 3 i det tyske utlegningsskrift 3 331 860 inneholdende DNA, satt inn.
I patentsøknad 88 09 52 (angående den tyske patentmelding P 37 07 150.5 fra 6. mars 1987) ble det foreslått en fremgangsmåte for utskilling av fusjonsproteiner fra streptomyceter, som er kjennetegnet ved at den setter inn de kodende sekvensene for det ønskede proteinet i det eventuelt modifiserte tendamistatgenet og at det rekombinante genet * uttrykkes i en streptomycetcelle. Her blir altså tendamistat strukturgenet benyttet som "bærer" for et annet gen, som medfører at man oppnår fusjonsproteiner, hvor en aminosyre-sekvens til et annet protein er innenfor tendamistatamino-syresekvensen. Ved kjemisk eller enzymatisk spalting av disse fusjonsproteinene for å frigjøre de andre proteinene, får man dermed to delsekvenser av tendamistatene. Den tidligere ovenfornevnte søknaden vedrører også tendsami-statderivater, som også kan innbefatte de som har tydelig forkortede aminosyrekjeder. Slike derivater kan reagere reversibelt med den spesifikke reseptoren i form av en konkurrerende hemmemekanisme.
Det ble nå oppdaget at fremmede proteiner i streptomyceter også kan bli fremstilt ved at man konstruerer genet for fusjonsproteinene på en slik måte at strukturgenet for det ønskede proteinet, ved 3'-enden (av den kodende tråden) av eventuelt modifiserte tendamistatgener, blir koblet. Modifikasjon av tendamistatgenene kan spesielt innbefatte en forkorting av 3'-enden.
Tendamistatkodende DNA er gjengitt i EP-A 0 161 629 (i denne som DNA-sekvens C og i tillegg som tabell 1). I dette strukturgenet finnes det flere spaltningsseter for restrik-sjonsenzymer som kan bli benyttet for å modifisere den kodede aminosyrerekkefølgen. Egnede spaltningsseter for BstEII er i området av triplettene 31 og 32, Stul i området til triplettene 43 og 44 og Sau3A i området til triplettene 52 og 53. Ved innsetting av riktig linker kan man på disse stedene sette inn en eller flere aminosyrer i tillegg, og DNA-segmenter mellom disse spaltningssetene kan bli eliminert eller forkortede aminosyresekvenser kan bli kodet ved å sette inn stoppkodoner. Man kan dermed sette inn bestemte aminosyrer, bytte ut eller eliminere noen ved bruk av setespesifikk mutagenese. Man tilveiebringer dermed proteiner, som utviser cx-amylaseinhibitorvirkning, eller bare proteiner uten denne virkningen, som enda reagerer med den riktige reseptoren.
Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en fremgangsmåte for fremstilling av følgende fusjonsproteiner bestående av tendamistat ifølge tabell 1 og proinsulin forbundet med en aminosyre-spacer,
(Aspl til Gly43 fra tab. 1 )-Pro-Ser-Leu-Gly-Leu44 til Leu 74 fra tab. 1 )-proinsulin;
kodet av gensekvens inneholdt i plasmid pKK3a,
(Aspl til Gly43)-Pro-Ser-Leu-Met-Ala-Asn-Ser-Proinsulin-(Leu44 til Leu74);
kodet av gensekvens inneholdt i plasmid pKK31,
(Aspl til Gly43)-Pro-Ser-Leu-Met-Ala-Asn-Ser-Proinsulin; kodet av gensekvens inneholdt i plasmid pKK310,
(Aspl til Gly43)-Pro-Ser-Leu-Asn-Phe-Ala-Arg-Proinsulin; kodet av gensekvens inneholdt i plasmid pKK32,
(Aspl til Leu74 )-Phe-Asn-Ala-Met-Ala-Thr-Gly-Asn-Ser-Ala-Arg-Proinsulin,
kodet av gensekvens inneholdt i plasmid pKK400, kjennetegnet ved at man kobler strukturgenet for proinsulin C-terminalt til det eventuelt modifiserte tendamistatgenet ifølge tabell 1, tilveiebringer ekspresjon av denne genstrukturen i en streptomycet-vertscelle og isolerer det utskilte fusjonsproteinet fra supernatanten, og anvender dette for fremstilling av de eventuelt modifiserte tendamistat og/eller fusj onspartnerne.
Genstruktur derav kjennetegnet ved at den innbefatter det eventuelt modifiserte tendamistat-genet, og at det C-terminalt er koblet et strukturgen for et proinsulin, er også beskrevet.
Oppfinnelsen vedrører også en vektor som er kjennetegnet ved at den inneholder en genstruktur ifølge krav 3 eller 4 og er i stand til å uttrykke det gitte genet. Videre er en streptomycetcelle som er kjennetegnet ved at den inneholder pTHl, pTFlO, pTF2 og pGFl og er i stand til å uttrykke det gitte genet, beskrevet. Oppfinnelsen vedrører også fusjonsproteiner som er kjennetegnet ved at de blir fremstilt ved hjelp av ovennevnte fremgangsmåte.
Foretrukne utføringer av oppfinnelsen vil i det følgende bli nærmere forklart og er i patentkravene definert.
I figurene 1 til 4 er noen plasmidkonstruksjoner ifølge oppfinnelsen ført opp. Fig. 1 viser fremstilling av hybridplasmidene pKK310, som koder for et fusjonsprotein, hvori en flerleddet sekvens på syv aminosyrer følger etter en del av aminosyresekvensen for tendamistat og hvor aminosyresekvensen for ape-proinsulin følger deretter. Fig. 2 viser overføring av plasmidene pKK310 til ekspresjonsplasmid pTFl. Fig. 3 viser konstruksjonen av plasmidene pRSlO, hvori polylinkeren til pUC18 følger etter en del av tendamistatgenene, og overføring av dette plasmidet til ekspresjonsplasmid pTFlO. "mcs" betyr polylinkerregionen (multippelklonings-sete) til pUC18. Fig. 4 viser til slutt konstruksjonen av plasmidene pKK400, som koder for et fusjonsprotein, hvori en flerleddet sekvens bestående av 11 aminosyrer følger etter den samme aminosyresekvensen til tendamistat og hvor aminosyresekvensen til ape-proinsulin følger deretter, og overføring av dette plasmidet til ekspresjonsplasmid pGFl.
Figurene er ikke tegnet i riktig målestokk.
Fordelene ifølge oppfinnelsen innbefatter at fusjonsproteinene som blir eksportert ut av cellen lett kan bli isolert ut av kulturf iltratet. Isoleringen kan bli utført ved bruk av kjent fremgangsmåte, fortrinnsvis ved adsorpsjons- eller ionebyttekromatografi og/eller gelfiltrering.
Frigjøring av de ønskede fremmede proteinene (fusjonspartne-re) ved enzymatiske eller kjemiske spaltinger utføres ved bruk av kjente fremgangsmåter.
Innenfor dette fagområdet avhenger spaltingen av aminosyresekvensen til de ønskede proteinene. I mange tilfeller er det hensiktsmessig å sette inn et bindeledd, eventuelt en flerleddet sekvens, i spaltningssetet mellom tendamistatsekvensen og aminosyresekvensen til de ønskede proteinene. Når det ønskede proteinet f.eks. ikke inneholder metionin, kan bindeleddet inneholde met, hvorpå det er mulig å utføre en kjemisk spalting med klor eller bromcyan. Hvis det i bindeleddet er cystein i karboksyterminus eller hvis bindeleddet står for cys, så kan man utføre en enzymatisk cysteinspesifikk spalting eller en kjemisk spalting, f.eks. etter spesifikk S-cyanylering. Hvis det i karboksyterminus til den flerleddede sekvensen står tryptofan, eller hvis bindeleddet står for Trp, kan man utføre en kjemisk spalting med N-bromsuksinimid.
Ønskede proteiner som ikke inneholder Åsp-Pro i aminosyresekvensen og som er tilstrekkelig syrestabile, kan som fusjonsproteinet med denne flerleddede sekvensen bli spaltet proteolytisk ved bruk av kjente fremgangsmåter. På denne måten tilveiebringer man proteiner som inneholder henholdsvis N-terminal prolin eller C-terminal asparginsyre. På denne måten kan dermed også modifiserte proteiner bli fremstilt.
Asp-Pro-bindingen kan gjøres enda mere syrelabil når den flerleddede sekvensen (Asp)n-Pro innbefatter henholdsvis Glu-(Asp)n-Pro, hvor n er 1 til 3.
Forslag til enzymatisk spalting er også kjente, hvor modifiserte enzymer med forbedret spesifisitet kan bli satt inn (jfr. C.S. Craik et al., Science 228 (1985) 291-297). Hvis det ønskede eukariote peptidet er proinsulin så velger man en hensiktsmessig peptidsekvens som har en trypsin avspaltbar aminosyre (Arg, Lys) festet til den N-terminale aminosyren (Phe) på proinsulin, f.eks. Ala-Ser-Met.
Innholder det ønskede proteinet ikke aminosyresekvensen
kan fusjonsproteinet med den passende flerleddede sekvensen bli spaltet med faktor Xa (EP-A 0 025 190 og 0 161 973).
Isolering av spalteproduktet avhenger av egenskapene til disse proteinene. Med hensyn på isolering av tendamistat og derivatene derav kan man henvise til den siterte litteraturen i det tyske utleggsskrift 3 331 860.
I de følgende eksemplene vil oppfinnelsen bli nærmere forklart. Hvis ikke noe annet er angitt, står prosentanvis-ningen for vekt.
Eksemplene blir forklart ved bruk av de samme tallene som på figurene. I figurene er ikke plasmidene og genfragmentene tegnet opp i riktig målestokk; spesielt er målestokken til polylinkersekvensene ikke riktige.
Eksempel 1
Som utgangsmateriale benyttes plasmid pKAI650, som er beskrevet i tysk utleggsskrift 3 536 182 og henholdsvis i EP-A 0 218 204. Dette plasmidet er også tilgjengelig ved det 1 det tyske utleggskrift 3 331 860 beskrevne plasmid pKAIl ved isolering av de 650 bp HincII-Sstl-f ragmentene og kloning i plasmid pUC19 som er åpnet med dette enzymet. I dette plasmid blir de enkeltvise Hindlll-spaltingssetene fjernet (ved spalting med dette enzymet, og utfylling av den overhengende enden og ligering) slik at plasmid pKAI650a (1) blir tilveiebragt.
2 ug DNA som er renset ved CsCl-gradientsentrifugering fra (1) blir fullstendig spaltet ifølge forhandlerne i løpet av 2 timer i en 50 ul reaksjonsoppløsning med Stul og enzymet blir fjernet ved fenolekstrahering. Linearisert DNA blir fjernet med etanol, igjen oppløst og tilsatt en ligerings-blanding, hvor man i tillegg tilsetter 0,1 ug reaksjonspart-ner av den kjemisk syntetiserte, 5'-ende fosforylerte, dobbelttrådede oligonukleotider (2)
Etter transformering av ligeringsblandingene~i E.coli JM 109 blir slike kloner isolert, som inneholder det rekombinante plasmid pKK3a (3). Det isolerte plasmid-DNA er kjennetegnet ved et spaltingssete for restriksjonsenzymet Hindlll, som dermed tillater karakterisering ved restriksjonsanalyse. pKK3a (3) er 12 basepar større enn pKAI650a (1) og tilveiebringer en nukleotidsekvens, hvorpå aminosyresekvensen som følger derav er utvidet med 4 aminosyrer:
Deretter tjener plasmid pYE24 som utgangsmateriale (4). Dette plasmidet blir tilveiebragt ved at vektor pUC8 blir åpnet med EcoRI og Hindlll og at man i dette lineæriserte plasmidet ligerer inn ape-proinsulingenet (tabell 2; iflg. Wetekam et al., Gene 19 (1982) 179-183).
2 jjg av plasmidene pYE24 (4) blir behandlet med restriksjons-enzymene EcoRI og Hindlll, og ape-proinsulingenet blir isolert ved elektroeluering og blir etter rensing og konsentrering ved etanolfelling ligert med den syntetiske DNA-linken (5)
Ligeringsprodukt (6) blir deretter satt inn i plasmid pKK3a (3) som er blitt åpnet med Hindlll, hvorved plasmid pKK31 (7) blir tilveiebragt. Ved denne konstruksjonen blir under henvisning til kodonet for aminosyre Gly 43 til tendamistatgenene følgende flerleddede sekvens tilveiebragt:
"B 1" betyr her - som i tabell 2 - begynnelsen på B-kjeden til ape-proinsulin.
I plasmid (7) befinner proinsulinsekvensen seg innenfor tendamistatgenet. For å overføre dette plasmidet i et plasmid ifølge oppfinnelsen, blir (7) spaltet med SphI og Sali) og fragment (8) blir isolert. Vektor pUC19 blir åpnet med SphI og Sali og det lineaeriserte plasmid blir med fragment (8) ligert. Det slik tilveiebragte plasmid pKK310 (9) koder for et fusjonsprotein, hvorpå bare proinsulinsekvensen følger etter den forkortede tendamistatsekvensen og den foranstående innsatte linker.
Den samme konstruksjonen er beskrevet i figur 1.
Eksempel 2
For å overføre plasmid pKK310 (9) til et ekspresjonsplasmid, blir (9) spaltet med Sstl og SphI og fragment (10) blir isolert.
Ekspresjonsvektor pIJ702 (11) (som kan kjøpes fra John Innes Foundation, Norwich, England) blir åpnet med SphI og Sstl og det lineaeriserte plasmid (12) blir ligert med fragment (10). Etter transformering av stammen streptomyces lividans TK 24 (John Innes Foundation) blir de ønskede klonene tilveiebragt ved seleksjon for resistens til tiostrepton. Plasmid-DNA fra tiostreptonresistente kloner blir isolert og verifisert ved restriksjonsanalyse. Plasmid som har den ønskede orientering av genene får betegnelsen pTFl (13). Kloner r som inneholder dette rekombinante plasmidet utskiller et protein med en molekylvekt på 16 kD i kulturmediumet. Dette proteinet reagerer med insulin-antistoffer i "Immunoblot" positiv (jfr. eksempel 5).
Konstruksjonen av pTFl (13) er beskrevet i figur 2.
Eksempel 3
Både plasmid pKK3a (3) på den ene siden og vektor pUC18 på den andre siden, blir begge åpnet med Hindlll og deretter ligert sammen. E. coli-stamme JM 109 blir transformert med ligeringsblandingen, hvor de riktige koloniene i nærvær av isopropyl-p<->tiogalaktopyranosid (IPTG) og 5-brom-4-klor-3-indolyl-p<->D-galaktopyranosid (X-Gal) tilveiebringer ufarvede kolonier. Det tilveiebragte rekombinante plasmid pRSl (14) blir isolert ved bruk av kjente fremgangsmåter. Ved spalting av 1 ug av plasmidene med restriksjonsenzym Sstl og etter-følgende religering blir pUC18-andelen helt til polylinker-sekvensen (mcs) og likeledes resten av tendamistatgenene deletert. Man tilveiebringer plasmid pRSlO (15).
Plasmid (15) egner seg på grunn av polylinkerandelen for kloning av forskjellige strukturgener, hvorved plasmid blir tilveiebragt som koder for de passende fusjonsproteinene med den forkortede tendamistatsekvensen.
Hvis man spalter pRSlO (15) med SphI og Sstl og isolerer det lille fragmentet, kan man ligere denne analog eksempel 2 i ekspresjonsvektor pIJ702. Man tilveiebringer dermed ekspresjonsvektor pTFlO (16), som på grunn av polylinkerandelene tillater mange forskjellige konstruksjoner.
Konstruksjon av pTFlO (16) er beskrevet i figur 3.
Eksempel 4
Man åpner plasmid pYE24 (4) med EcoRI og setter inn linker
og slik tilveiebringes plasmid pYE241. Ved spalting med Hindlll og ligering med pKK3a (3) som er spaltet med Hindlll tilveiebringer man analog som i eksempel 1 plasmid pKK32. Denne koder for et fusjonsprotein, hvor tendamistatsekvensen er knyttet til proinsulinsekvensen via den flerleddede sekvensen:
Analog til eksempel 1 blir pKK32 spaltet med SphI og Sstl og det ca. 650 bp store fragmentet i pUC19, som også er åpnet med disse enzymene, blir klonet om. Det resulterende plasmid pKK320 (9) svarer til plasmid pKK310 (9) helt til den foranstående flerleddede sekvensen (da de ved den linkerinn-førte sekvensen er skjøvet fremover ved "Fettdruck").
Analog til eksempel 2 blir Sstl-Sphl-fragmentet med det rekombinante genet fra pKK320 klonet om i pIJ702, hvorved ekspresjonsplasmid pTF2 blir tilveiebragt. I S. lividans TK 24 blir et 16 kd fusjonsprotein uttrykt og utskilt, som også reagerer med insulinantistoff (jfr. eksempel 5).
På grunn av likheten til konstruksjonen av pTF2 med pTFl (13), figurene 1 og 2, har man ikke utført en tegnet beskrivelse.
Eksempel 5 pKK310 (9) blir delvis spaltet med EcoRI, slik at bare en av de to EcoRI-spaltesetene blir åpnet. Etter innfylling av den overhengende enden ved bruk av klenowpolymerase blir plasmidet religert og verifisert ved restriksjonsanalyse. Det ønskede plasmidet som har fått fjernet EcoRI-setet i enden av proinsulingenet har fått betegnelsen pKK310a (17). Denne inneholder dermed et enkelt restriksjonssete for EcoRI i linkregionen mellom det forkortede tendamistatgenet og proinsulingenet.
For å konstruere et plasmid som koder for et fusjonsprotein som inneholder hele sekvensen til tendamistat blir det ført inn et enkelt spaltesete for Kpnl ved siden av kodonene for aminosyren 68/69 i den tendamistatkodende DNA-sekvensen (tabell 1). Deretter blir det isolerte DNA fra pKAI650 av (1) spaltet med Sst og SphI og det 650 bp store fragmentet blir klonet om i RF-DNA til fagen M13mpl8 som nettopp er blitt spaltet med de to enzymene og enkelttrådet DNA blir fremstilt ved bruk av kjent fremgangsmåte. 1 pg av dette ss DNA blir satt inn sammen med 0,1 jjg av mutagenet "Primere"
ved "site directed mutagenesis" (M.J. Zoller u. J. Smith, Nucleic Acid Res. 10 (1982) 6487-6500). Fra den isolerte M13-klonen med det muterte genet som lar seg selektere gjennom det tilsatte Kpnl-spaltesetet og baseut-byttingen (C mot G i den tredje posisjonen til kodonene for Arg<68>) blir verifisert ved sekvensering. Nukleotidutbyttet medfører dermed ingen forandring av aminosyresekvensen, men fører inn det ønskede nye enkelte spaltesetet i tendamistat-strukturgenet.
Den muterte sekvensen blir ett Sstl-Sphl-spalting fra M13mpl8-RF-DNA i plasmid pUC19 omklonet, hvorved plasmid pKAI651 (18) blir tilveiebragt.
Som en kontroll blir det 650 bp Sstl-Sphl-innskuddet fra (18) tilsvarende eksempel 2 satt inn i plasmid pIJ702, hvorved plasmid pAX651 blir tilveiebragt. Etter transformasjon av disse plasmidene i streptomyces lividans TK 24 oppnår man samme ekspresjonsgrad for tendamistat som i plasmid paX650 som inneholder uforandret tendamistatgen (tysk utleggsskrift
3 536 182, fig. 3). For fremstilling av plasmider ifølge oppfinnelsen for et fusjonsprotein med hele aminosyresekvensen til tendamistat blir plasmid pKAI651 (18) spaltet med SphI og Kpnl og det lille fragmentet med linker (19)
og med SphI og EcoRI åpent plasmid pKK310a (17) ligert.
E.coli JM 109 blir transformert med ligeringsblandingen, og plasmid-DNA blir isolert og riktig fusjon blir verifisert ved DNA-sekvensering. Plasmidet med den riktige sekvensen blir betegnet pKK400 (20).
Linker (19) koder ikke bare for resten av aminosyrene til tendamistat, men også for en del av en "Spacer" som skiller tendamistat og proinsulingenet fra hverandre og innbefatter også med 5'-enden til genene, se tabell 2 - kodonene for de følgende 11 aminosyrene:
Fusjonsproteinet inneholder dermed i denne "Spacer" blant andre aminosyrene metonin og arginin, som tillater spalting med halogencyan og henholdsvis trypsin.
Fra plasmid pKK400 (20) blir det etter dobbeltspalting med Sstl og SphI det omtrent 1090 bp innskuddet isolert og DNA blir ligert med plasmid pIJ702 (12) som er blitt åpnet med de samme enzymene. Dette resulterer i plasmid pGFl (21). Ligeringsblandingen blir transformert inn i S. lividans TK 24 og plasmid-DNA blir isolert ved tiostrepton-resistente trans-formanter som tyder på tendamistataktivitet. Alle positive kloner inneholder det 1090 bp store Sstl-Sphl-innskuddet fra pGFl.
Konstruksjonen av pGFl (21) er fremstilt i figur 4.
Tendamistat-aktiviteten blir formidlet ved platetesten som er beskrevet i EP-A1 0 161 629 i eksempel 3 og likeledes i det tyske utleggsskrift 3 536 182, eksempel 2.
Ekspresjon av pGFl-kodede funksjonsproteiner kan vises ved bruk av kjente fremgangsmåter. Hvis man inkuberer den transformerte stammen S. lividans TK 24 fire dager ved 28"C i rørekolber og deretter avskiller mycelet fra kulturoppløsnin-gen ved sentrifugering, kan man bevise fusjonsprotein i den klare oppløsningen som følger: 10 til 100 ul oppløsning blir satt til 20 til 200 >j1 15#-ig trikloreddiksyre, og det utfelte proteinet blir anriket ved sentrifugering, vasket og tatt opp i SDS-holdig probebuffer (U. Laemmli, Nature 227 (1970) 680-685). Etter 2 minutters inkubasjon ved 90°C adskilles proteinene ved elektroforese på en 10- til 17%- ig SDS-polyakrylamidgel. Ved å tilveiebringe et protein med molekylvekt på 19 kD, som dermed er i det ventede molekylvektsområdet for fusjonsproteinet bestående av tendamistat og proinsulin. Fusjonsproteinet reagerer både med antistoffer mot tendamistat og også med antistoffer mot insulin.
B 1, C 1 og A 1 betegner begynnelsen på B-, C- og A-kjeden til apeproinsulin.
Claims (7)
1.
Fremgangsmåte for fremstilling av følgende fusjonsproteiner bestående av tendamistat ifølge tabell 1 og proinsulin forbundet med en aminosyre-spacer,
(Aspl til Gly43 fra tab. 1 )-Pro-Ser-Leu-Gly-Leu44 til Leu 74 fra tab. 1 )-proinsulin;
kodet av gensekvens inneholdt i plasmid pKK3a,
(Aspl til Gly43)-Pro-Ser-Leu-Met-Ala-Asn-Ser-Proinsulin-(Leu44 til Leu74);
kodet av gensekvens inneholdt i plasmid pKK31,
(Aspl til Gly43)-Pro-Ser-Leu-Met-Ala-Asn-Ser-Proinsulin;
kodet av gensekvens inneholdt i plasmid pKK310,
(Aspl til Gly43)-Pro-Ser-Leu-Asn-Phe-Ala-Arg-Proinsulin;
kodet av gensekvens inneholdt i plasmid pKK32,
(Aspl til Leu74)-Phe-Asn-Ala-Met-Ala-Thr-Gly-Asn-Ser-Ala-Arg-Proinsulin,
kodet av gensekvens inneholdt i plasmid pKK400, karakterisert ved at man kobler strukturgenet for proinsulin C-terminalt til det eventuelt modifiserte tendamistatgenet ifølge tabell 1, tilveiebringer ekspresjon av denne genstrukturen i en streptomycet-vertscelle og isolerer det utskilte fusjonsproteinet fra supernatanten, og anvender dette for fremstilling av de eventuelt modifiserte tendamistat og/eller fusjonspartnerne.
2.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at tendamistat-genet er forkortet ved 3'-enden.
3.
Genstruktur ifølge krav 1, karakterisert ved at den innbefatter det eventuelt modifiserte tendamistat-genet, og at det C-terminalt er koblet et strukturgen for et proinsulin.
4.
Genstruktur ifølge krav 3, karakterisert ved at tendamistatgenet er forkortet ved 3'-enden.
5.
Vektor, karakterisert ved at den inneholder en genstruktur ifølge krav 3 eller 4 og er i stand til å uttrykke det gitte genet.
6.
Streptomycetcelle, karakterisert ved at den inneholder pTHl, pTFlO, pTF2 og pGFl og er i stand til å uttrykke det gitte genet.
7.
Fusjonsprotein, bestående av tendamistat ifølge tabell 1 og proinsulin forbundet med en aminosyre-spacer,
(Aspl til Gly43 fra tab. 1 )-Pro-Ser-Leu-Gly-Leu44 til Leu 74 fra tab. 1 )-proinsulin;
kodet av gensekvens inneholdt i plasmid pKK3a,
(Aspl til Gly43 )-Pro-Ser-Leu-Met-Ala-Asn-Ser-Proinsulin-(Leu44 til Leu74);
kodet av gensekvens inneholdt i plasmid pKK31,
(Aspl til Gly43)-Pro-Ser-Leu-Met-Ala-Asn-Ser-Proinsulin; kodet av gensekvens inneholdt i plasmid pKK310,
(Aspl til Gly43)-Pro-Ser-Leu-Asn-Phe-Ala-Arg-Proinsulin; kodet av gensekvens inneholdt i plasmid pKK32,
(Aspl til Leu74)-Phe-Asn-Ala-Met-Ala-Thr-Gly-Asn-Ser-Ala-Arg-Proinsulin,
kodet av gensekvens inneholdt i plasmid pKK400, karakterisert ved at de blir fremstilt ved hjelp av en fremgangsmåte ifølge krav 1.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE19873714866 DE3714866A1 (de) | 1987-05-05 | 1987-05-05 | Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO881942D0 NO881942D0 (no) | 1988-05-04 |
NO881942L NO881942L (no) | 1988-11-07 |
NO178036B true NO178036B (no) | 1995-10-02 |
NO178036C NO178036C (no) | 1996-01-10 |
Family
ID=6326841
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO881942A NO178036C (no) | 1987-05-05 | 1988-05-04 | Fremgangsmåte for fremstilling av fusjonsproteiner, genstruktur, vektorer streptomycetceller og fusjonsproteinene |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0289936B1 (no) |
JP (1) | JP2671260B2 (no) |
KR (1) | KR970001235B1 (no) |
CN (1) | CN1029989C (no) |
AR (1) | AR241658A1 (no) |
AT (1) | ATE94905T1 (no) |
AU (1) | AU612144B2 (no) |
CA (1) | CA1338338C (no) |
DE (2) | DE3714866A1 (no) |
DK (1) | DK175525B1 (no) |
ES (1) | ES2045004T3 (no) |
FI (1) | FI97549C (no) |
HU (1) | HU204094B (no) |
IE (1) | IE62522B1 (no) |
IL (1) | IL86277A0 (no) |
NO (1) | NO178036C (no) |
NZ (1) | NZ224464A (no) |
PT (1) | PT87400B (no) |
ZA (1) | ZA883168B (no) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE4012818A1 (de) * | 1990-04-21 | 1991-10-24 | Hoechst Ag | Verfahren zur herstellung von fremdproteinen in streptomyceten |
US5426036A (en) * | 1987-05-05 | 1995-06-20 | Hoechst Aktiengesellschaft | Processes for the preparation of foreign proteins in streptomycetes |
EP0367163B1 (de) * | 1988-11-03 | 1996-01-03 | Hoechst Aktiengesellschaft | Verfahren zur Herstellung eines Insulin-Vorprodukts in Streptomyceten |
DE3844211A1 (de) * | 1988-12-29 | 1990-07-05 | Hoechst Ag | Neue insulinderivate, verfahren zu deren herstellung, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung |
DE3936876A1 (de) * | 1989-11-06 | 1991-05-23 | Hoechst Ag | Neue insulinderivate, verfahren zu deren herstellung, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3331860A1 (de) * | 1983-09-03 | 1985-03-21 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Verfahren zur herstellung von tendamistat |
DE3418274A1 (de) * | 1984-05-17 | 1985-11-21 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Signalpeptid fuer die exkretion von peptiden in streptomyceten |
EP0196056B1 (en) * | 1985-03-28 | 1991-05-22 | Chiron Corporation | Improved expression using fused genes providing for protein product |
DE3707150A1 (de) * | 1987-03-06 | 1988-09-15 | Hoechst Ag | Tendamistat-derivate |
EP0367163B1 (de) * | 1988-11-03 | 1996-01-03 | Hoechst Aktiengesellschaft | Verfahren zur Herstellung eines Insulin-Vorprodukts in Streptomyceten |
-
1987
- 1987-05-05 DE DE19873714866 patent/DE3714866A1/de not_active Withdrawn
-
1988
- 1988-04-28 AT AT88106786T patent/ATE94905T1/de not_active IP Right Cessation
- 1988-04-28 ES ES88106786T patent/ES2045004T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-28 DE DE88106786T patent/DE3884261D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-04-28 EP EP88106786A patent/EP0289936B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1988-05-03 AR AR88310742A patent/AR241658A1/es active
- 1988-05-03 KR KR1019880005131A patent/KR970001235B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1988-05-03 FI FI882059A patent/FI97549C/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-05-03 NZ NZ224464A patent/NZ224464A/xx unknown
- 1988-05-04 ZA ZA883168A patent/ZA883168B/xx unknown
- 1988-05-04 CN CN88102568A patent/CN1029989C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1988-05-04 AU AU15559/88A patent/AU612144B2/en not_active Expired
- 1988-05-04 PT PT87400A patent/PT87400B/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-05-04 IL IL86277A patent/IL86277A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1988-05-04 IE IE133888A patent/IE62522B1/en not_active IP Right Cessation
- 1988-05-04 CA CA000565869A patent/CA1338338C/en not_active Expired - Lifetime
- 1988-05-04 NO NO881942A patent/NO178036C/no unknown
- 1988-05-04 DK DK198802416A patent/DK175525B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-05-04 HU HU882276A patent/HU204094B/hu unknown
- 1988-05-06 JP JP63110295A patent/JP2671260B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Bedouelle et al. | Mutations which alter the function of the signal sequence of the maltose binding protein of Escherichia coli | |
US5506121A (en) | Fusion peptides with binding activity for streptavidin | |
Karmazyn-Campelli et al. | Tandem genes encoding sigma-factors for consecutive steps of development in Bacillus subtilis. | |
Boulain et al. | Mutagenesis by random linker insertion into the lamB gene of Escherichia coli K12 | |
JP4243104B2 (ja) | 重要なタンパク質の細菌培養上清中への分泌のための融合タンパク質 | |
CA2122135C (en) | Recombinant core-streptavidin | |
US20060088878A1 (en) | Purification of recombinant proteins fused to multiple epitopes | |
NO175640B (no) | ||
Tan et al. | Efficient expression and secretion of recombinant hirudin III in E. coli using the L-asparaginase II signal sequence | |
AU673870B2 (en) | Hirudin mutant, production thereof, anticoagulant, secretory vector, and production of product from said microorganism | |
Betton et al. | In vivo assembly of active maltose binding protein from independently exported protein fragments. | |
KR100737189B1 (ko) | 배양 배지에서 대장균에 의한 분비를 통한 Leu-히루딘의 제조를 위한 시그날 서열 | |
Elzen et al. | Molecular structure of the immunity gene and immunity protein of the bacteriocinogenic plasmid Clo DF13 | |
NO331375B1 (no) | DNA-molekyl kodende for sekretérbare peptider, protein, mulitkopivektor, plasmid, vertscelle, fremgangsmate for fermentering av proteiner og fremstilling av insulin | |
NO178036B (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av fusjonsproteiner, genstruktur, vektorer streptomycetceller og fusjonsproteinene | |
Lepage et al. | Recombinant technology as an alternative to chemical peptide synthesis: Expression and characterization of HIV-1 Rev recombinant peptides | |
US5426036A (en) | Processes for the preparation of foreign proteins in streptomycetes | |
NO851308L (no) | Genetisk ekspresjon av somatostatin som hybridpolypeptid | |
Baek et al. | Construction of a new gene-fusion expression vector, pMONSTER | |
JPH0556793A (ja) | ミラクリンの製造方法 | |
expression using Gram-negative | Bibliography of the current world literature |