DK175525B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af fusionsproteiner, genstruktur, vektor indeholdende genstrukturen, streptomycetcelle indeholdende vektoren, fusionsprotein og anvendelse deraf - Google Patents

Description

i DK 175525 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstiling af fusionsproteiner, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del angivne. En foretrukken udførelsesform for fremgangs -5 måden er angivet i krav 2. Opfindelsen angår også en genstruktur som angivet i krav 3-4, en vektor som angivet i krav 5, en streptomycetcelle som angivet i krav 6, et fusionsprotein som angivet i krav 7 og en anvendelse af dette fusionsprotein som angivet i krav 8.

10 Det er kendt fra EP patentansøgning med offent- liggørelsesnr. (EP-A) 0.161.629 eller fra sydafrikansk patentskrift nr. 85/3672 at udnytte det DNA, der koder for alfa-åmylaseinhibitoren tendamistats signalpeptid (præpeptid), til at udskille et polypeptid, især tendami-I 15 stat, fra en streptomycetcelle. Det tilsvarende DNA kan I principielt udvindes af enhver tendamistat-producerende I stamme, men fortrinsvis anvendes dog det ifølge eksempel 3 I i DE offentliggørelsesskrift nr. 3.331.860 fremstillede I DNA.

I 20 I DE patentansøgning nr. P 37 07 150.5 fra I 6. marts 1987 foreslås allerede en fremgangsmåde til ud- I skillelse af fusionsproteiner fra streptomyceter, der er I ejendommelig ved, at den sekvens, der koder for det ønr I skede protein, indbygges i det eventuelt modificerede I 25 tendamistat-gen, og det rekombinante gen udtrykkes i en I streptomycetcelle. Her anvendes altså tendamistat-struk- I turgenet som "bærer" for et andet gen, hvorved man får I fusionsproteinér, hvor et andet proteins aminosyrese- I kvens er anbragt inde i tendamistat-aminosyresekvensen.

I ,30 Ved kemisk eller enzymatisk spaltning af. dette fusions- I protein til frigørelse af det andet protein fås derfor I to delsekvenser af tendamistat. Den nævnte DE an- I søgning omhandler også tendamistat-derivater, hvorved I bl.a. også skal forstås sådanne med klart forkortet I 35 aminosyrekæde. Sådanne derivater kan på reversibel må- I de reagere med de specifikke receptorer i form af en I konkurrerende hæmningsmekanisme.

I DK 175525 B1

I I

I Det har nu vist sig, at fremmede proteiner i I

streptomyceter også kan fremstilles ved, at der konstru- I

eres gener for fusionsproteiner, hvor strukturgenet for I

det ønskede protein kobles på det eventuelt modificerede I

B 5 tendamistat-gens 3'-ende (af den kodende streng). Modi- I

fikationen af tendamistat-genet kan især være en I

forkortelse ved 3'-enden. I

Det DNA, der koder for tendamistat, er gengivet I

B i EP-A 0 161 629 (dér som DNA-sekvens C og i den medføl- I

B 10 gende tabel I). I dette strukturgen findes flere skære- I

steder for restriktionsenzymer, som kan udnyttes til I

modifikation af den indkodede aminosyresekvens. Egnede I

B er skærestederne for BstEII i tripletområdet 31 og 32, I

B Stul i tripletområdet 43 og 44 samt Sau3A i triplet- I

B 15 området 52 og 53. Ved indbygning af tilsvarende for- I

B bindelsesstykker kan man på disse steder indskyde en I

B eller flere yderligere aminosyrer, man kan eliminere I

I DNA-segmenter mellem disse skæresteder, eller man kan I

B kode for forkortede aminosyresekvenser ved indbygning I

I 20 af stopcodoner. Desuden kan der ved stedspecifik mu- I

I tagenese indføjes, udskiftes eller elimineres aminosy- I

I rer efter ønske. Der fås således proteiner, der udvi- I

I ser alfa-amylase-inhibitorvirkning, eller proteiner u- I

I den denne aktivitet, men som dog sliadig reagerer med I

B 25 de tilsvarende receptorer. I

Opfindelsen angår som nævnt ud over fremgangs- I

B måden desuden tilsvarende genstrukturer, vektorer, der I

B indeholder disse genstrukturer, streptomycetceller, der I

B er transformeret med disse vektorer, de udskilte fusions- I

B 30 proteiner og deres anvendelse til fremstilling af fremmede I

proteiner og tandamistat-derivater. Foretrukne udførelses- I

former for opfindelsen vil blive nærmere forklaret i det I

følgende og defineret i patentkravene. I

Opfindelsen vil i det følgende blive forklaret ' I

35 under henvisning til tegningen, på hvilken I

fig. 1-4 gengiver nogle plasmidkonstruktioner I

ifølge opfindelsen, idet I

3 DK 175525 B1 fig. 1 viser fremstillingen af hybridplasmidet pKK310, som koder for et fusionsprotein, i hvilket der efter en del af aminosyresekvensen for tendamistat følger et broled af syv aminosyrer og herefter aminosyresekven-5 sen i abeproinsulin, fig. 2 viser plasmidet pKK310's overførsel i ekspressionsplasmidet pTFl, fig. 3 viser konstruktionen af plasmidet pRSlO, i hvilket polyforbindelsesstykket fra pUC18 følger efter .10 en del af tendamistatgenet, samt dettes overføring til ekspressionsplasmidet pTFlO. "mes" betyder polyforbin-delsestykkeregionen (multiple cloning site) fra pUC18, og fig. 4 endelig viser konstruktionen af plasmidet pKK400, som koder for et fusionsprotein, i hvilket .15 der efter tendamistats hele aminosyresekvens følger et broled af 11 aminosyrer og herefter aminosyresekvensen fra abeproinsulin, samt dettes overføring til ekspressionsplasmidet pGFl.

Figurerne er ikke tegnet i korrekt målestok.

20 De ifølge opfindelsen udvundne, fra cellen udfør te fusionsproteiner indebærer den fordel, at de let kan isleres fra kulturfiltratet. Isoleringen kan ske på kendt måde, fortrinsvis ved adsorptions- eller ionbytter-chromatografi og/eller gelfiltrering.

.25 Frigørelsen af det ønskede fremmede protein (fusionspartner) sker ved enzymatisk eller kemisk fra-spaltning på i og for sig kendt måde.

Fraspaltningsmåden retter sig frem for alt efter det ønskede proteins aminosyresekvens. I mange til-3.0 fælde kan det være formålstjenligt at indbygge et bindeeller broled i spaltningsstedet mellem det ønskede proteins tendamistat-sekvens og aminosyresekvens. Når det ønskede protein f.eks. ikke indeholder methionin, kan bindeleddet betyde Met, hvorefter der sker en kemisk spalt-35 ning med chlor- eller bromcyan. Hvis der i bindeleddet ved carboxyendestillingen står cystein, eller hvis bindeleddet står for Cys, så kan der ske en enzymatisk cyste- I DK 175525 B1

I I

I in-specifik spaltning eller en kemisk spaltning, f.eks. I

efter specifik S-cyanylering. Dersom der i broleddet I

I ved carboxyendestiliingen findes tryptophan, eller bin- I

deleddet står for Trp, kan der ske en kemisk spaltning I

5 med N-bromsuccinimid. I

I Ønskede proteiner, som i deres aminosyrese- I

I kvens ikke indeholder Asp - Pro, og som er tilstrække- I

I lig syrestabile, kan som fusionsproteiner med dette bro- I

I led spaltes proteolytisk på i og for sig kendt måde. I

I 10 Herved fås proteiner, som indeholder N-endestillet pro- I

I lin eller C-endestillet asparaginsyre. På denne måde I

I kan også modificerede proteiner syntetiseres. I

I Asp - Pro-bindingen kan yderligere udformes mere I

syrelabil, når dette broled betyder (Asp)n~Pro eller I

I 15 er Glu-(Asp)n~Pro, idet n er 1-3. I

Eksempler på enzymatiske spaltninger er lige- I

I lede kendt, idet der også kan anvendes modificerede en- I

I zymer med forbedret specificitet (jf. C.S. Craik m.fl., I

I Science 228, 291-297 (1985). Hvis det ønskede eukaryo- I

I 20 tiske peptid er proinsulin, vælges der fortrinsvis en I

peptidsekvens, hvor en ved hjælp af trypsin fraspalte- I

lig aminosyre (Arg, Lys) er bundet til den N-endestil- I

lede aminosyre (Phe) i proinsulinet, f.eks. Ala-Ser- I

-Met-. I

25 Hvis det ønskede protein ikke indeholder ami- I

nosyresekvensen I

Ile-Glu-Gly-Arg, I

kan fusionsproteinet med det tilsvarende broled spaltes I

30 med faktor Xa (EP-A 0 025 190 og 0 161 973). I

Isoleringen af fraspaltningsprodukterne retter I

sig efter disse proteiners egenskaber. Med hensyn til I

isoleringen af tendamistat og dets derivater kan der hen- I

vises til den i DE offentliggørelsesskrift nr. 3.331.860 I

35 anførte litteratur. I

I de følgende eksempler vil opfindelsen blive I

nærmere forklaret. Når der ikke er anført andet, er pro- I

centangivelserne efter vægt. I

5 DK 175525 B1

Eksemplerne illustreres ved hjælp af tegningens figurer med samme nummer. I figurerne er plasmider og genfragmenter ikke fremstillet efter korrekt målestok; især i polyforbindelsessekvenseme er målestokken udvidet.

• 5

Eksempel 1

Plasmid pKAI650, der er beskrevet i DE offentliggørelsesskrift nr. 3.536.182 og i EP-A 0.218.204, tjener som udgangsmateriale. Dette plasmid er tilgængeligt fra 10 det i DE offentliggørelsesskrift nr. 3.331.860 beskrevne plasmid pKAIl ved isolering·.af HincII-Sstl-fragmentet på 650 bp og kloning i det med disse enzymer åbnede plasmid pUC19. I dette plasmid fjernes det eneste Hindlll-skære-sted (ved skæring.med dette enzym, opfyldning af de frem-15 stikkende ender og ligatering), og således fås plasmidet pAKI650a (1).

2^ug ved CsCl-gradientcentrifugering renset DNA fra (1) fordøjes fuldstændig i 2 timer i en 50^,uli-ter reaktionsblanding med Stui ifølge leverandørens angi-20 velser, og enzymet fjernes ved phenolekstraktion. Det lineariserede DNA fældes med ethanol, opløses igen og anbringes i en ligateringsblanding, hvortil der som yderligere reaktionsdeltager sættes 0,l^ug af det kemisk syntetiserede, i 5'-enden phosphorylerede,dobbelstrengede oli-25 gonucleotid (2)

HindiII

5' CCCAAGCTTGGG 3' (2) 3' G G G T T C G A A C C C 5' 1 2 3 4 5 6

Efter transformation af ligateringsblandingen 2 i E.coli JM 109 isoleres de kloner, som bærer det re- 3 kombinante plasmid pKK3aT3). Det isolerede plasmid-DNA er 4 ejendommeligt ved et skærested for restriktionsenzymet 5

Hindlll, som tillader en karakterising ved hjælp af re- 6 striktionsanalyse. pKK3a (3) er 12 bp større end pKAI650a (1) og har en nucleotidsekvens, hvorved aminosyresekvensen I DK 175525 B1

I I

I udvides som følger med 4 aminosyrer I

I 42 43 (44) I

I Glu Gly Pro Ser Leu Gly Leu I

I 5 5' GAA GG C CCA AGO TTG GG C CTG' 3’ . I

I 3* CTT CC G GGT TCG AAC CC G GAC 5’ I

I HindiII I

I Som yderligere udgangsmateriale anvendes plas- I

I 10 midet pYE24 (4). Dette plasmid fås ved, at vektoren pUC8 I

I åbnes med EcoRI og Hindlll, og at man i dette linearisere- I

de plasmid indligaterer abe-proinsulin-genet (tabel II,. I

I jfr. Wetekam m.fl., Gene 19, 179-183 (1982). I

I 2^ug af plasmidet pYE24 (4) omsættes med restrik- I

I 15 tionsenzymerne EcoRI og Hindlll, abe-proinsulin-genet iso- I

I leres ved elektroeluering og ligateres efter rensning og I

I koncentrering ved ethanolfældning med det syntetiske I

I DNA-forbindelsesstykke I

I 20 5’ AGC TTG ATG GCG '3' I

I 3’ AC TAC CGC TTA A 5’ (5) I

I (Hindlll) (EcoRI) I

I Ligateringsproduktet (6) indføjes nu i det med Hindlll I

I 25 åbnede plasmid pKK3å (3), hvorved fås plasmidet pKK31 I

I (7). Ved denne konstruktion dannes i tilslutning til I

codonet for aminosyren Gly 43 i tendamistat-genet føl- I

gende broled: I

30 43 B 1 I

Gly Pro Ser Leu Met Ala Asn Ser Phe I

GGC CCA AGC TTG ATG GCG AAT TCT TTT I

CCG GGT TCG AAC TAC CGC TTA AGA AAA I

Hindlll EcoRI. I

35 I

"B 1" betegner her - som i tabel II - begyn-

delsen af B-kæden i abeproinsulinet. I

DK 175525 B1 I

I plasmidet (7) findes proinsulin-sekvensen I

i tendamistat-genet. Til overføring af dette plasmid I

I til et plasmid ifølge opfindelsen fordøjes plasmidet (7) I

I med Sphl og Sall, og fragmentet (8) isoleres. Vektoren I

I 5 pUC19 åbnes med Sphl og Sall, og det lineariserede plas- I

I mid ligateres med fragmentet (8) . Det således opnåede I

I plasmid pKK310 (9) koder for et fusionsprotein, hvori I

I kun proinsulinsekvensen følger efter den forkortede ten- I

I damistat-sekvens og det ovenfor fremstillede forbindel- I

I 10 sesstykke. Hele konstruktionen er vist i tegningens fi- I

I gur 1. I

I Eksempel 2 I

I Véd overføring af plasmidet pKK310 (9) til et I

I 15 ekspressionsplasmid omsættes plasmidet (9) med S sti og I

I Sphl, og fragmentet (10) isoleres. I

I Ekspressionsvektoren pIJ702 (11) , der fås på mar- I

I kedet (hos John Innes Foundation, Norwich, England), I

I åbnes med Sphl og SstI, og det lineariserede plasmid (12) I

I 20 ligateres med fragmentet (10). Efter transformation af I

I stammen Streptomyces lividans TK 24 (John Innes Founda- I

I tion) fås de ønskede kloner ved udvælgelse med hensyn til I

I resistens over for thiostrepton. Plasmid-DNA'et isole- I res fra thiostrepton-resistente kloner og kontrolleres I 25 ved restriktionsanalyse. .Plasmider, hvor genet har den I ønskede orientering, får betegnelsen pTFl (13). Kloner, I som indeholder dette rekombinante_plasmid, udskiller.et I protein med molekylvægt 16 kD i kulturmediet. Dette pro- I tein reagerer positivt med insulin-antistoffer ved "immun- I 30 blot" (jfr. eksempel 5) .

I Konstruktionen af pTFl (13) er gengivet i teg- I ningens fig. 2.

I Eksempel 3 I 35 Plasmidet pKK3a (3) og vektoren pUC18 åbnes I hver med Hindlll og ligateres sammen. Med ligaterings- I DK 175525 B1

blandingen transformeres E.coli-stammen JM 109, som viser I

den heldige kloning i nærvær af isopropyl-beta-thiogalac- topyranosid (IPTG) og 5-brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-ga-

lactopyranosid (X-Gal) ved dannelse af ufarvede kolonier. I

5 Det opståede rekombinerede plasmid pRSl (14) isoleres på I

i og for sig kendt måde. Ved fordøjelse af l^ug af plas- I

midet med restriktionsenzymet SstI og efterfølgende reli- I

gatering bliver pUC18-delen indtil polymellemstykkesekven- I

sen (mes) samt resten af tendamistat-genet udeladt. Der I

10 fås plasmidet pRSlO (15). I

Plasmidet (15) egner sig på grund af sin poly- I

forbindelsésdel til kloning af struktur-gener efter ønske, I

hvorved der fås plasmider, som koder for de tilsvarende I

fusionsproteiner med den forkortede tendamistat-sekvens. I

15 Hvis pRS10.(15) fordøjes med Sphl og SstI, og I

H det mindste fragment isoleres, så kan dette analogt med I

H eksempel 2 ligateres til ekspressionsvektoren pIJ702. I

Derved fås ekspressionsvektoren pTFlO (16), der ligele- I

des på grund af sin polyforbindelsesdel tillader mange- I

20 artede konstruktioner. I

Konstruktionen af pTFlO (16) ses i tegningens I

I fig. 3. I

Eksempel 4 I

I 25 Plasmidet pYE24 (4) åbnes med EcoRI, og mellem- I

I stykket I

I 5’ AAT TCA ÅGC TTG 3* I 3' GT TCG AAC TTA A 5’ I „ (EcoRI) Hind III (EcoRI)

oU I

I indsættes, hvorved fås plasmidet pYE241. Ved at skære I

I med Hindlll og ligatering i med Hi’ndlll skåret pKK3a I

(3) fås analogt med eksempel 1"plasmidet pKK32. . I

I 35 Dette koder for et fusionsprotein, hvori tendamistat- I

I sekvensen via følgende broled er bundet til proinsulin- I

9 DK 175525 B1

sekvensen I

43

Gly Pro Ser Leu Asn Phe Ala Arg I

GGC CCA AGC TTG AAT TCT GCA AGA TTT I

5 CCC GGT TCG AAC TTA AGA CCT TCT AAA I

Analogt med eksempel 1 skæres pKK32 med SphI I

og SstI, og det 650 bp store fragment i pUC19, som er I

åbnet med disse enzymer, omklones. Det resulterende I

10 plasmid pKK320 svarer til plasmidet pKK310 (9) indtil I

det ovenstående broled (hvor den ved mellemleddet ind- I

førte sekvens er anført med fremhævet tryk). I

Analogt med eksempel 2 omklones Sstl-Sphl-frag- I

mentet med det rekombinante gen fra pKK320 til pIJ702, I

15 hvorved fås ekspressionsplasmidet pTF2. I S. lividans I

TK 24 udtrykkes og udskilles et fusionsprotein på 16 kd, I

I som reagerer med insulinantistoffer (jfr. eksempel 5).

I På grund af ligheden mellem konstruktionen I af pTF2 og pTFl (13), fig. 1 og 2, har man ikke frem- I 20 stillet nogen tegning.

I Eksempel 5 I pKK310 (9) fordøjes delvis med EcoRI, så at I kun ét af de to EcoRI-skæresteder åbnes. Efter udfyld- 25 ning af de fremstikkende ender ved hjælp af Klenow- I -polymerase religater.es plasmidet, og .resultatet kon- trolleres ved hjælp af restriktionsanalyse. Det ønske- I de plasmid, hvor det EcoRI-sted, der befinder sig for I enden af proinsulin-genet, er blevet elimineret, får I 30 betegnelsen pKK310a (17). Dette indeholder altså nu I et enkelt restriktionssted for EcoRI i mellemstykkere- I gionen mellem det forkortede tendamistat-gen og proin- sulin-genet.

Til konstruktion af et plasmid, som koder for I 35 et fusionsprotein med tendamistats komplette sekvens, I indføres der i den for tendamistat kodende DNA-sekvens I DK 175525 B1 I 10 (tabel I) i codonområdet for aminosyrerne 68/69 et en- kelt skærested for Kpnl. Herved fordøjes det isolerede

_ DNA fra pKAI650a (1) med Sst og. Sphl, og det 650 bp store I

fragment omklones til det ligeledes med disse enzymer I

5 dobbelt fordøjede RF-DNA i fagen M13mpl8, og det enkelt- I

strengede DNA fremstilles ved hjælp af kendte metoder. I

l^ug af dette ssDNA indsættes sammen med 0,l^,ug af den I

mutagene "primer" I

I 10 5' C GAG GTA CCG GGC GI 3'

ved "site directed mutagenesis" (M.J. Zoller og J. Smith, I

I Nucleic Acid Res. 10, 6487-6500 (1982). I

Fra de isolerede Ml3-kloner med det muterede I

I 15 gen, som kan udvælges ved hjælp af det yderligere Kpnl- I

I -skærested, isoleres RF-DNA, og baseudskiftningen . (C i I

^1 68 I

H stedet for G i tredje stilling i codonet for Arg ) kontrol- I

leres ved sekvensbestemmelse. Nucleotidudskiftningen I

H bevirker altså ingen ændring af aminosyresekvensen, men I

I 20 indføring af det ønskede nye eneste skærested i tendami- I

I stat-strukturgenet. I

66 67 68 69 70 I

I His Ala Arg Tyr Leu I

25 CAC GCC CGC TAC CTC I

GTC CGC GCC ATC GAG I

Kpnl I

Den muterede sekvens omklones efter Sstl-SphI- I

30 I

-fordøjelse fra M13mpl8-RF-DNA til plasmidet pUC19, hvor- I

ved fås plasmidet pKAI651 (18) . I

Som kontrol indbygges den 650 bp store SstI- I

-SphI-indsatte del fra (18) svarende til eksempel 2 i I

plasmidet pIJ702, hvorved fås plasmidet pAX651. Efter I

35 I

transformation af dette plasmid ·i Streptomyces livi- I

dans TK24 fås de samme ekspressionsrater for tendamistat I

DK 175525 B1 11 som for plasmidet pAX650 med det uforandrede tendamistat--gen (tysk offentliggørelsesskrift nr. 3.536.182, fig. 2).

Til fremstilling af et plasmid ifølge opfindelsen til et fusionsprotein med tendamistats samlede amino-5 syresekvens fordøjes nu plasmidet pKAl651 (18) med Sphl og Kpnl, og det lille fragment med mellemstykket (19) 69 70 71 72 73 74 10 (Tyr)leu A7a Arg Cys Leu Phe Asn Ala Met Ala Thr Gly 3'

5' CTC GCT CGC TGC CTT TTC AAT GCG ATG GCC ACC GGG

3' C ATG GAG CGA GCG ACG GAA AAG TTA CGC TAC CGG TGG CCC TTA A 5' I (l9) (EcoRI) I 15 I og det med Sphl og EcoRI åbnede plasmid pKK310a (17) li- I gateires.

I Med ligateringsblandingen transformeres E.coli I JM 109, plasmid-DNA'et isoleres, og den korrekte fusion ve- I . rificeres ved hjælp af DNA-sekvensbestemmeIse. Plasmidet I 20 I med den korrekte sekvens får betegnelsen pKK400 (20).

I Mellemstykket (19) koder ikke blot for de til- I oversblevne aminosyrer i tendamistat, men også den del i I et afstandsstykke ("spacer”), som skiller tendamistaten I - og proinsulin-genet - fra hinanden,og sammen - med 5'- I 25 I -enden af genet ifølge tabel II - omfatter codonerne for I de følgende 11 aminosyrer: I Phe- Asn- Ala-Met- Ala- Thr- Gly- Asn- Ser- Ala- Arg I 30 I * Fusionsproteinet får altsa i dette afstands- I stykke bl.a. aminosyrerne methionin og arginin, som til- I lader en spaltning med halogencyan eller trypsin.

I · Fra plasmidet pKK400 (20) isoleres ved dobbelt- I fordøjelse med SstI og Sphl den indsatte del på ca. 1090 I 35 I bp, og DNA'et i det med de samme enzymer åbnede plasmid I pIJ702 (12) ligateres. Herved fås plasmidet pGFl (21).

I DK 175525 B1 I 12

Ligateringsblandingen transformeres i S.lividans TK 24,

og fra thiostrepton-resistente transformanter, som ud- I

viser tendamistat-aktivitet# isoleres plasmid-DNA'et. I

Alle positive kloner indeholder den 1090 bp store SstI- I

5 Sphl-indsatte del fra pGFl. I

Konstruktionen af pGFl (21) er gengivet i teg- I

ningens fig. 4. I

Tendamistat-aktiviteten måles ved hjælp af I

H pladeprøven# som er beskrevet i eksempel 3 i EP-A1 I

10 0 161 629 samt i DE offentliggørelsesskrift nr. I

I 3.536.182# eksempel 2. I

Ekspressionen af det af pGFl kodede fusions- I

protein kan ske på kendt måde. Dersom man inkuberer den I

transformerede stamme S. lividans TK 24 i 4 dage ved 28°C I

15 i rystekolbe og skiller myceliet fra kulturopløsningen I

ved centrifugering, kan fusionsproteinet påvises i den I

I klare opløsning på følgende måde: I

I Til 10-100^uliter opløsning sættes 20-200yUli- I

I ter 15%'s trichloreddikesyre, det udfældede protein koncen- I

20 treres ved centrifugering# vaskes og optages i SDS-holdig I

I prøvepuffer (U. Laemmli, Nature 227, 680-685 (1970)). I

I Efter 2 minutters inkubation ved 90°C fraskilles elektro- I

I phoretisk på en 10-17%'s SDS-polyacrylamidgel. Der fås I

et protein med en molekylvægt på 19 kD, altså i det forven- I

I 25 tede molekylvægtområde for fusionsproteinet af tenda- I

I mistat og proinsulin. Fusionsproteinet reagerer både I

I med antistoffer mod tendamistat og med antistoffer mod I

I insulin. I

I 30 I 35

DK 175525 B1 I

13 I

Tabel- I I

DNA-sekvens (kodende streng) og aminosyresekvens i tendamistat I

5'-GAC ACG ACC GTC TCC GAG CCC GCA CCC TCC TGC GT G I

5 NH -Asp Thr Ttor Val Ser Glu Pro Ala Pro Ser Cvs Val 2 ACG CTC TAC CAG AGC TGG CGG TAC TCA CAG GCC GAC Thr Leu Tyr Gin Ser Trp Arg Tyr Ser Gin Ala Asp

I 10 AAC GGC TGT GCC GAG ACG GTG ACC GTG AAG GTC GTC

I Asn Gly Cys Ala Glu Thr Val Thr Val Lys Val Val

I TAC GAG GAC GAC ACC GAA GGC CTG TGC TAC GCC GTC

I Tyr Glu Asp Asp Thr Glu Gly Leu Cys Tyr Ala Val I 15

I GCA CCG GGC CAG ATC ACC ACC GTC GGC GAC GGC TAC

I Ala Pro Gly Gin Ile Thr Thr Val Gly Asp Gly Tyr

I ATC GGC TCG CAC GGC CAC CCG CGC TAC CTG GCT CGC

20

Ile Gly Ser His Gly His Ala Arg Tyr Leu Ala Arg I TGC CTT TAG-3'

Cys Leu Stp I 25 I 30 I 35

I DK 175525 B1 I

I 14 I

I Tabel II I

I 5' AAT TCT GCA AGA I

3’ GA CGT TCT I

I (Asn)Ser Ala Arg I

5 (EcoRI) I

I B 1 I

rn TTT.GTG AAC CAG CAC CTG TGC GGC TCC CAC CTA GTG GAA GCT CTC I

AAA CAC TTG GTC GTG GAC ACG CCC AGG GTG GAT CAC CTT CGA GAG ' I

Phe Val Asn Gin His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu I

I 1° I

TAC CTG GTG TGC GGG GAG CGA GGC TTC TTC TAC ACA CCC AAG ACC I

ATG GAC CAC ACG CCC CTC GCT CCG AAG AAG ATG TGT GGG TTC TGG I

Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phé Tyr Thr Pro Lys Thr I

I C 1 I

I 15 CGC CGG GAG GCA GAG GAC CCT CAG GTG GGG CAG GTG GAG CTG GGC I

GCG GCC CTC CGT CTC CTG GGA GTC CAC CCC GTC CAC CTC GAC CCG I

Arg Arg Glu Ala Glu Asp Pro Gin Val Gly Gin Val Glu Leu Gly I

I GGG GGC CCT GGC GCA GGC AGC CTG CAG CCC TTG GCG CTG GAG GGG I

CCC CCG GGA CCG CGT CCG TCG GAC GTC GGG AAC CGC GAC CTC CCC I

20 Gly Gly Pro Gly Ala Gly Ser Leu Gin Pro Leu Ala Leu Glu Gly I

I Al I

TCC CTG CAG AAG CGC GGC ATC GTG GAG CAG TGC TGC ACC AGC ATC I

AGG GAC GTC TTC GCG CCG TAG CAC CTC GTC ACG ACG TGG TCG TAG I

Ser Leu Gin Lys Arg Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile I

I 25 I

I TGC TCC CTC TAC CAG CTG GAG AAC TAC TGC AAC TAA TAG TCG ACC I

I ACG AGG GAG ATG GTC GAC CTC TTG ATG ACG TTG ATT ATC AGC TGG I

I Cys Ser Leu Tyr Gin Leu Glu Asn Tyr Cys Asn I

I Sall ' I

30 I

TGC AGC CA 3’ I

ACG TCG GTT CGA 5' I

PstI (HindiII) I

B 1, C 1 og A 1 betegner begyndelsen af B-, I

C- og A-kæden i abeproinsulin. I

OO

Claims (8)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af fusions- I I proteiner, kendetegnet ved, at strukturge- I I . 5 net for det ønskede protein kobles på 3'-enden (af den I I kodende streng) af det eventuelt modificerede tendami- I I . stat-gen, at denne genstruktur bringes til udtryk i en I streptomycet-værtscelle, og at det udskilte fusionspro- I tein isoleres fra overfasen. I I 10

2. Fremgangsmåde ifølge krav l,kende- I I tegnet ved, at tendamistat-genet er forkortet i I I 31-enden. I

3. Genstruktur, kendetegnet ved, I I at den indeholder det eventuelt modificerede tendamistat- I I 15 -gen, til hvis 3'-ende der er koblet et strukturgen for I I et andet protein. I

4. Genstruktur ifølge krav 3, kendeteg- I I net ved, at tendamistat-genet er forkortet i 3'-enden. I

5. Vektor, kendetegnet ved, at den I I 20 indeholder en genstruktur ifølge krav 3 eller 4. I

6. Streptomycetcelle, kendetegnet I I ved, at den indeholder en vektor ifølge krav 5. I

7. Fusionsprotein, kendetegnet ved, I I at det kun har en N-bestandig del af det eventuelt modi- I I 25 ficerede tendamistat. I

8. Anvendelse af fusionsproteinet ifølge krav I 7 eller fusionsproteinet, der fås ifølge krav 1 eller 2, I til fremstilling af det eventuelt modificerede tendami- I stat og/eller fusionspartneren. I 30 I 35