PT97093B - Processo para a obtencao de derivados de hirudina - Google Patents

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Description

DESCRIÇÃO
A invenção refere-se a um processo para a obtenção de derivados de hirudina a partir de mutantes secretores de E. coli, bem como a um derivado de hirudina com a sequência de aminoácidos N-terminais Ala-Thr-Tyr-Thr-Asp.
A Hirudina e polipeptidio com 65 aminoácidos e foi isolado originalmente da sanguessuga Hirudo medicinalis. Ela age como inibidor altamente especifico para trombina, pois forma com a trombina complexos estáveis e possui assim muitas possibilidades de aplicaçao terapêutica especialmente para a terapia de anticoagulaçao (F. Markquardt, Biomed. Biochim. Acta 44 (1985), 1007 - 1013).
Apos a publicação da sequência de aminoácidos completa de hirudina (J. Dodt et al., FEBS LETTERS 165 (2), (1984), 180-184) pôs-se a hipótese da preparaçao da hirudina por técnica de DNA recombinante e expressão em microorganismos.
A especificação EP-A-0 158 564 (Transgene) revela vectores de clonagem para expressão de hirudina ou análogos de hirudina numa célula hospedeira, especialmente uma célula bacteriana. 0 gene que codifica a hirudina é obtido por síntese de cDNA, partindo de mRNA da sanguessuga Hirudo medicinalis. Ê especialmente descrito um derivado de hirudina com a sequência Ile-Thr-Tyr-Thr-Asp N-terminal, bem como o processo para sua obtenção.
Na Especificação EP-A-0 168 342 (Ciba Geigy) sao reveladas sequências de DNA, que codifica a sequência de aminoâcidos naturais de hirudina, sendo a sequência de aminoâcidos N-terminais Val-Val-Tyr-Thr-Asp. A expressão de hirudina efectua-se nos microorganismos E. coli e Saccharomyces cerevisiae intracelularmente.
Na Especificação EP-A-0 171 024 (Hoechst AG) é revelado um processo para a preparaçao por tecnologia genética de polipeptídios com actividade de hirudina, especialmente em células E. coli, sendo as células abertas e obtendo-se do extracto celular o polipeptidio com actividade de hirudina. Uma parte de proteína de fusão eventuaimente existente pode ser separada por dissociação proteolítica ou química e purifica-se a molécula de hirudina libertada.
objecto da Especificação DE-0S 34 571 (GEN-BIO-TECj é uma sequência de DNA, que codifica uma proteína com a actividade biologica da hirudina, bem como um processo para a obtenção de tais proteínas a partir de células de E. coli, que sao transformadas com um vector recombinante apropriado, por lisagem das células.
Também no trabalho de Bergmaan et al. (Biol. Chem. Hoppe Seyler 367 (1986), 731-740) é descrita a síntese de hirudina em E. coli. A libertação da hirudina das células efectua-se por tratamento com tolueno, produzindose apenas pequenos rendimentos de cerca de 500 ng/1 de unidades ^578 de células.
As Especificações EP-A-0 200
655 (Transgene), EP -A-0 252 854 (Transgene) e EP-Á-0 225 633 (Ciba Geigy) revelam a obtenção por secreção de proteínas com actividade de hirudina de um organismo hospedeiro eucarionte, espeeialmente uma levedura, efectuando-se a expressão sobre um vector que contêm uma sequência de DNA, que contém um peptídio de sinal ascendente do gene estrutural. Ê revelada a secreção de derivados de hirudina com a sequência Val-Val-Tyr-Thr-Asp N-terminal, bem como a sequência Ile-Thr-Tyr-Thr-Asp N-terminal, em levedura. Obtêm-se rendimentos de ate 100 mg/1.
Na Especificação DE-OS 39 00 626 (Hoechst AG) e revelado um deriviado de hirudina com a sequência Leu-Thr-Tyr-Thr-Asp N-terminal. A expressão ocorre de preferência em levedura, empregando-se um promotor e sequência de sianl do gene feromonde levedura MF para expressão e secreção do derivado de hirudina.
Todos os processos acima descritos para a preparaçao de deriviados de hirudina apresentam, contudo, desvantagens. Assim, pelo emprego de levedura como organismo hospedeiro e secreção de hirudina no meio da cultura obtêm-se rendimentos relativamente elevados, contudo o cultivo de células de levedura ê mais demorado e contém mais exigências do que para bactérias, por exemplo E. coli. Nas células de E. coli, contudo, o rendimento é relativamente pequeno e/ou no caso de uma desintegração das células sao necessários processos complicados de isolamento.
problema da presente invenção é, pois, desenvolver um processo simples para obtenção de derivadode hirudina, no qual os derivados de hirudina podem ser obtidos com elevados rendimentos a partir de células bacterianas, sem que seja necessária uma desintegração das células.
Um objecto da presente invenção e um processo para obtenção de derivados de hirPdina a partir de mutantes secretores de E. coli, no qual (1) se constrói um vector recombinante, no qual se encon3 tra um gene que codofica um derivado de hirudina atrás de um segmento de DNA, que é codificado para um peptídio de sinal hacteriano, (2) com o vector recombinante construído na fase (1) transforma-se um mutante secretor de E. coli, (3) as células transformadas sao cultivadas em um meio e (4) o derivado de hirudina é obtido do meio de cultura.
Pelo significado de derivado de hirudina de acordo com a presente invenção entendem-se proteínas derivadas de hirudina, que agem como inibidores de trombina e apresentam uma actividade específica de pelo menos 10.000 AT-U/mg (unidades de anti-trombina) (Dodt et al., Biol.Chem. Hoppe Seyler 366 (1985), .379-385). 0 significado de derivado de hirudina abrange também proteínas de fusão com uma parte de fusão N-terminal tendo até cerca de 50 aminoácidos, que pode ser separada parcial ou completamente por dissociação química ou proteolítica, formando-se como produto de dissociação um derivado de hirudina com uma actividade específica de pelo menos 10.000 AT-U/mg.
De preferência, sao obtidos através do processo da invenção derivados de hirudina com a seguinte sequência de aminoácido N-terminal:
(X)m - Z -Thr - Tyr - Thr - Asp em que m = 0 a 50,
X representa aminoácidos codificáveis geneticamente, iguais ou diferentes,
Z e um aminoácido codificável geneticamente do grupo Leu, Ile, Ala, Vai, Gly, Ser, Asp, Glu, Asn, Gin, His, Met, Phe e Tyr .
Quando m for maior que 0, a sequencia X contém de preferência uma posição de dissociação proteolitica ou química especialmente de preferência no seu terminal. Quando o último aminoácido da sequência X é um radi-
cal Arg, por exemplo, a sequência de fusão X pode ser dissociada por digestão triptico (dissociação pos Arg) e purifica-se o derivado de hirudina activo. A dissociação da parte de fusão pode, contudo, efectuar-se da mesma forma por outras enzimas proteolíticos cinhecidos, ou reagentes químicos de dissociação. Quando, por exemplo, a sequência de aminoácidos de X termina com um radical Met, pode-se dissociar a proteína de fusão através de uma dissociação de halogenociano (E. Gross e B. Wittkop, J. Am. Chem. Soc. 82 (1961) 1510-1517). Quando, por exemplo, a sequência de aminoácidos C-terminal de X contem a sequência de aminoácios Ile-Glu-Gly-Arg, pode-se efectuar a dissociação com o factor Xa (EP-A 0 025 190 e EP-A 0 161 973)
Quando no processo de invenção m = 0, Z representa de preferência Gin, His, Phe, Tyr, Gly,
Ser, Asp ou Asn, especialmente preferido Ala, Gly, Ser, Asp ou Asn. A maior preferência e um derivado de hirudina, no qual m é 0 e Z é Ala.
Um objecto da presente invenção sao, pois, também os derivados de hirudina com a sequência N-terminal A-Thr-Tyr-Thr-Asp, em que A e Gin, His, Phe, Tyr, Gly, Ser, Asp ou Asn, de preferência Ala, Gly, Ser, Asp ou Asn. A maior preferência e um derivado com a sequência N-terminal Ala-Thr-Tyr-Thr-Asp. Desse derivado de hirudina pode-se obter, surpreendentemente em sobrenadantes de cultura de um mutuante secretor de E. coli, até mais que 2 g/1 do meio de hirudina activa.
Uma outra vantagem do processo da invenção é que pela secreção do derivado de hirudina no meio celular, as pontes de dissulfeto de hirudina sao formadas de modo corecto sob as condiçoes oxidantes do meio
Por mutantes secretores de E. coli, de acordo com a presente invenção, entendem-se raças de E. coli, que mostram uma secreção maciça de proteína no meio de cultura. Um processo para a preparaçao desses mutantes secretores está descrito na Especificação EP-A-0 338 410.
Na obtenção de mutuantes apropriados secretores de E. coli pode-se partir especialmente de E. coli DS410 (DSM 4513) ou de E coli BW7261 (DSM 5231). A raça de E. coli correspondente é transformadas primeiramente com um plasmídeo que contem uma sequência de DNA que codifica a proteina secretavel. Posteriormente submete-se a raça de E. coli transformada a uma mutagénese, por exemplo por tratamento com N-metil-N*-nitro-N-nitrosoguanidina. Efectua-se então uma selecção das raças apropriadas de mutuantes secretores. Quando se emprega como proteina secretavel por exemplo ot-ciclodextrinoglicosiltransferase, podem-se reconhecer os mutuantes secretores por uma resistência contra a substância</D-ciclosserina activa nas paredes celulares. Além disso, a secreção de -ciclodextrinoglicosiltransferase (CGTase) promove uma hidrólise do amido no meio ambiente, o que pelo emprego de um meio de amilo-pectina-Azur dá uma possibilidade adicional de selecção para mutantes secretores.
Como vector recombinante para a presente invenção sao apropriados vectores, que podem ser ou integrados no genoma de E. coli (por exemplo bacteriófago 2.) ou se encontram extra cromossomicamente nas células de E. coli transformadas (por exemplo plasmideos). Empregam-se de preferência plasmideos.
A construção do gene sobre o vector recombinante, que codifica uma proteina, constituída pelo peptídio de sinal e pelo derivado de hirudina, encontra-se de preferência sob controle de um promotor induzível, especialmente de preferência de um promotor de fusão trp-lac, que é induzível por adiçao de lactose ou de IPTG (>5-D-tiogalactosido de isopropilo). Sobre o vector deve-se encontrar, além disso, um gene marcador de selecção e eventualmente um gene repressor lac.
Como sequência de sinal bacteriana, que possibilita uma secreção do derivado de hirudina, sao apropriados em princípio todos os peptídios de sinal
conhecidos, que permitem uma permeaçao da membrana das células de E. coli. De preferência, empregam-se também peptidios de sinal de bactérias gram-nagativas (por exemplo, peptidios de sinal das seguintes proteínas de E. coli:
proteína de membrana externa OmpA (DiRienzo et al. , 1978 Ann.
Rev. Biochem. 47: 481-532) fosfatase alcalina PhoA (Inouye et al., 1982 J. Bacteriol.
149: 434-439) proteína LamB (hedgpeth et al., 1980 Proc. Nat. Acad. Sei. Usa 77: 2621-2625) proteína ligante de maltose MalE (Bedouelle H. et al., 1980 Nature 285: 78 - 81). Emprega-se de maneira especialmente preferida o peptídio de sinal -CGTase.
Um vector apropriado para o processo de invenção é por exemplo o plasmídio pCM705 (figura 1), que e obtido do plasmídio pCM703, publicado na Ep-A-0 383 410, por remoção de um fragmento NruI de cerca de 1 kb de comprimento. Esse vector contém um gene resistente a ampicilina, o gene para o repressor lac e o gene CGTase com um segmento que codifica o peptídio de sinal no terminal 5Í Um gene que codifica um derivado de hirudina é integrado de tal forma no vector pCM705, que intracelularmente forma-se uma molécula precursora com o peptídio de sinal de o( -CGTase no seu terminal N. A construção de gene encontra-se sob controle do promotor tac. COm o plasmído obtido desta forma pode-se transformar uma raça de mutuantes secretores de E. coli.
Clones transformados positivamente sao cultivados em balões de agitaçao ou em fermentador. Quando se alcança uma densidade optica de cerca de efectua-se uma indução por IPTG ( 73-D-tiogalactósido de isopropilo) ou lactose.
Por meio de um teste de inactivaçao de trombina (Griesbach et al., Thrombosis Research 37, (1985), 347-350) determina -se então o decurso da produção do derivado de hirudina. A acumulaçao de proteínas de fusão
é analisada por cromatografia HPLC (fase reversa). A fracção prévia de proteínas de fusão pode ser dissociada então e o derivado de hirudina activo formado pode ser purificado.
Os exemplos seguintes devem elucidar mais pormenorizadamente a invenção, conjuntamente com a figuras 1 a 5.
Estas mostram:
A figura 1, o plasmidio pCM705
A figura 2, a sequência de DNA do gene de hirudina sintético de pK152,
A figura 3, as sequências dos oligonucleótidos HIRI, HIR2 e HIR3,
A figura 4, o plasmidio pCM7051 e
A figura 5, Exemplo 1 o plasmidio pCM7053.
Construção do vector de Secreção
plasmidio pK152 transporta um gene de hirudina sintético, cuja sequência é mostrada na na Especificação EP-A 0 171 014. Partindo-se desse plasmidio isolou-se, através de eletroforese por gel de agarose, um fragmento Hinf I - Hind III de DNA com cerca de 200 bp de tamanho, que contém a maior parte de sequência de DNA codificada para hirudina (figura 2). A sequência 5 -terminal que falta é regenerada por um oligonucleótido (HIR 1) novamente sintetizado. A sequência codificada do oligonucleótido está representada na figura 3. Por fusão das extremidades Hinf I obtém-se um derivado de hirudina com a sequência N-terminal Ala-Thr-Tyr-Thr-Asp.
plasmidio pCM705 (figura 1) é dissociado com PstI e Hind III. Ambos os pontos de corte se encontram em regiões codificadas para o gene de CGTase, com o que se corta um segmento de cerca de 1 kb de tamanho de DNA. 0 PstI dissocia exactamente na região que é codificada para o ponto de corte da peptidase de sinal.
Os fragmentos pCM705 PstI - Hind
III 6,3 kb, pK152 Hind I - Hind III 0,2 kb e o oligonucleotido HIR 1 sao ligados entre si, formando-se assim o plasmídio pCM7051 (figura 4). Com a preparaçao de ligaçao transforma-se a raça de E. coli HB101 (DSM 1607). Colónias, que neo mostram sobre o meio selectivo, com amilopectina Azur (amilopectina tingida) nenhum sinal de decomposição de amido e, assim, nenhuma expressão de of-CGTase, sao isoladas e purificadas ate a uniformidade. Isola-se, de vários clones purificados, o plasmídio de DNA e caracteriza-se por uma análise de restrição. De dois plasmídios, que transportam uma inserção de hirudina, efectua-se uma análise de sequência das regiões de fusão.
Plasmídio de DNA, que transporta uma construção correcta do gene de hirudina, é dissociado com Nru I e Nde I e é isolado por eletroforese por gel de agarose um fragmento de tamanho de 5,18 kb.
Após o preenchimento da sequência restante da dissociação por Nde I com enzima de Klenow, fecha-se um anel o fragmento por ligaçao. 0 plasmídio formado é designado como pCM7053 (figura 5).
Com esse plasmídio pCM7053 transforma-se o mutante secretor de E. coli WCM100, obtido pelo método descrito na Especificação EP-A-0 338 410.
Exemplo 2
Teste sobre Secreção de agitaçao de Hirudina em Experiências de balao ml de meio LB com 100 ug/ml de ampicilina foram inoculados durante a noite com uma cultura recentemente preparada de WGM100 pCM7053, até à densidade ôptica θ^420 = θ’·'·· cultura θ agitada a 30°C. Logo que se tenha alcançado a densidade ôptica θ-^420 = ’ θ adiciona-se ao indutor lactose a uma concentração final de 1%. Após 48 horas retiram-se amostras da cultura, centrifugam-se as células e determina-se a concentração de hirudina no sobrenadante. A determinação efectua-se por meio de um teste de inactivação
de trombina. Determinaram-se rendimentos de até 4000 AT-U/ml (unidades de anti-trombina) (= 250 mg/ml).
Exemplo 3
Produção de hirudina em fermentador de 10 Litros litros de meio minimo com 100 ug/ml de ampicilina sao inoculados com uma cultura recente, formada durante a noite, de WCM7053, até à densidade optica de OD6oq
0,1.
As
Temperatura
Velocidade de agitaçao: Aeraçao:
Valor de pH:
condiçoes de fermentação sao 30°C
450 a 950 rpm 0,5 a 1,5 Vvm 7,0 +_0,l
Quando se alcança a densidade óptica ΟΏθθθ = l50 adiciona-se 0,5 mM de IPTG (/?D-tiogalactósido de isopropilo).
horas após a adiçao de IPTG podem-se determinar no sobrenadante 36.000 AT-U/ml (= 2,25 g/1)
Exemplo 4
Secreção de hirudina com a sequência Ala-Thr-Arg-Leu-Thr-Tyr-Thr-Asp N-terminal
Opera-se analogamente ao exemplo 1, empregando-se contudo em lugar do oligonucleótido HIR 1, o oligonucleotido HIR 2 (figura3), obtendo-se uma proteína de fusão de hirudina após a dissociação do peptídio de sinal com a sequência Ala-Thr-Arg-Leu-Thr-Tyr-Thr-Àsp N-terminal. A ocorrência dessa proteína de fusão no sobrenadante é determinada por analise HPLC com o emprego de condiçoes de fase reversa (coluna de cromatografia C^g). A fermentação da raça WCM100 com esta construção de gene produz um rendimento de 25 mg/1 da proteína de fusão.
Por dissociação de tripsina pode-se produzir hirudina activa com a sequência Leu-Thr-Tyr10
Thr-Asp N terminal.
Exemplo 5
Secreção de Hirudina com'o Mutuante Secretor WCM88 mutuante secretor WCM88, que foi obtido da mesma forma da maneira descrita na Especificação EP-A-0 338 410, é transformado com o plasmídio pCM703 (vide exemplo 1). A produção de hirudina por secreção no meio de cultura é testada em experiência de balao de agitaçao e fermentação .
a) Experiência de balao de agitaçao
Analogamente ao exemplo 2, cultiva-se a raça WCM88 pCM7053. Após 48 horas determina-se no sobrenadante da cultura a concentração de hirudina. Obtiveram-se rendimentos de atá 1 800 AT-U/ml (= 110 mg/ml).
b) Produção em Fermentador de 10 litros cultivo da raça efectua-se como foi descrito no exemplo 3. 45 horas após a adiçao de IPTG puderam ser determinados no sobrenadantes 21 000 AT-U/ml (=1,3 g/1).
Exemplo 6
Construção de um vector de secreção com um gene de resistência à tetraciclina fragmento de Nrui, de 1,1 kb, do plasmídio pBR322 (F. Bolivar et al, Gene _2, 95-113 (1977)) foi isolado e foi ligado com o plasmídio PCM7051 (ver fig. 4) linearizado por dissociação de Nrui. Com a mistura de ligaçao transformou-se E. coli HB101. Os transformantes foram selecionados devido à sua resistência à tetraciclina. 0 ADN do plasmídio de um clone seleccionado foi re-isolado e foi disscociado com Ndel e Aval. Os fragmentos de ADN foram separados por electróforese por gel de agarose. 0 maior destes fragmentos foi isolado e as cadeias individuais excedentes foram preenchidas com o enzima de Klenow e depois ligadas.
plasmídio resultante foi o pCMT203.
Exemplo 7
Secreção de hirudina por utilização do vector de secreção pCMT203.
mutuante secretor WCM1OO (ver exemplo 1) foi transformado com o plasmídio pCMT2O3. A raça resultante foi cultivada num fermentador de 10 litros. 45 horas depois da adiçao de IPTG foi possível determinar-se 42 000 AT-U/ml de hirudina (= 2,63 g/1).

Claims (1)

  1. Processo para a obtenção de derivados de hirudina a partir de mutantes secretores de E. coli, caracterizado por (1) se construir um vector recombinante, que compreende o gene que codifica um derivado de hirudina, directamente atrás de um segmento de DNA, codifica um peptídio de sinal bacteriano, (2) se transformar um mutante secretor de E. coli com o vector recombinante construído na fase (1), (3) se cultivarem as células transformadas num meio e (4) se obter o derivado de hirudina do meio de cultura.
    - 2- Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se utilizar como vector recombinante um plasmidio.
    _ 3ã _
    Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por se construir um vector recombinante, sobre o qual se encontram as sequências de DNA que codificam o peptidio de sinal e o derivado de hirudina sob controle de um promotor induzivel.
    - 4^ 12
    Processo de acordo com a revindicaçao 3, caracterizado por se empregar como promotor induzivel um promotor de fusão trp-lac.
    - 5a Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado por se empregar um peptídio de sinal a partir de bactérias gram-negativas.
    - 6a Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por se empregar o peptídio de sinal de -ciclodextrinoglicosiltransferase.
    - 7a Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores, caracterizado por se empregar como mutante secretor de E. coli uma raça de bactérias, que foi obtido por mutagenése e posterior selecçao sobre propriedades de secreção a partir de raças de E. coli DS41O (DSM 4513) ou BW 7261 (DSM 5231) .
    - 8a Processo de acordo com uma das reivindicações anteriores caracterizado por se obter um derivado de hirudina, que possui a seguinte sequência de aminoácidos N-terminal:
    (X)m - Z - Thr - Tyr - Thr - Asp em que m = 0 a 50,
    X repfesenta aminoácidos codificáveis geneticamente, iguais ou diferentes,
    Z e um aminoácido codificável geneticamente do grupo His,
    Leu, Ile, Ala, Vai, Gly, Ser, Asp, Glu, Asn, Gin, Met,
    Phe e Tyr.
    - 9â Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a sequência X conter uma posição de dissociação proteolítica ou química.
    - 10a -
    Processo de acordo com a reivindi- caçao 8, caracterízado por m = 0 e Z representar Ala, Gin, His, PHe, Tyr, Gly, Ser, Asp ou Asn. - 11a - Processo de acordo com a reivindi- caçao 10, caracterízado por Z representar Ala, Gly, Ser, Asp ou Asn. - 12a - Processo de acordo com a reivindi-
    caçao caracterízado por Z representar Ala.
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