CN103059130A

CN103059130A - 一种水蛭素突变体及重组基因工程菌

Info

Publication number: CN103059130A
Application number: CN2012105676859A
Authority: CN
Inventors: 林陈水; 陈微微; 梨小军; 任慧颖
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2012-12-22
Filing date: 2012-12-22
Publication date: 2013-04-24

Abstract

本发明公开了一种水蛭素突变体及重组基因工程菌，所述水蛭素突变体是将水蛭素HV2-Lys47的N端第一个氨基酸突变为Ala获得的水蛭素突变体Ala1-HV2-Lys47，所述水蛭素突变体Ala1-HV2-Lys47的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示；所述水蛭素突变体Ala1-HV2-Lys47和未突变的水蛭素HV2-Lys47相比，比活性相同，但是在周质空间的表达量提高了近一倍。

Description

一种水蛭素突变体及重组基因工程菌

（一）技术领域

本发明涉及一种生物工程新型水蛭素及其生产方法，特别涉及一种水蛭素突变体及其生产方法，即大肠杆菌分泌表达水蛭素突变体。

（二）背景技术

水蛭是我国传统中药，中医认为它有破血、逐淤、通络的疗效，主要用于治疗血瘀、闭经和跌打损伤等。天然水蛭素是从医用水蛭的唾液中提取的活性成分。1955年，Markward从水蛭头部唾液腺中提取水蛭素纯品，针对凝血酶抑制剂的研究迅速开展起来。

水蛭素有多种异构体，其中研究和应用最多的是有65或66个氨基酸组成的三种水蛭素变异体，即 HV-1、HV-2和HV-3，分子质量约为7000kD，等电点在4.2左右。其N 末端富含疏水性氨基酸残基，其中有3对二硫键( Cys6-Cys14，Cys16- Cys28，Cys32-Cys39 )，使N末端肽链绕迭成密集形核心环肽结构，对稳定水蛭素空间结构起着关键作用。C末端富含酸性氨基酸残基，最后9个氨基酸中有6 个为酸性氨基酸。它们的N端球状结构与凝血酶的活性位点相互作用，同时C端的带负电氨基酸残基与凝血酶外表面位点非活性底物识别位点相结合。

水蛭素是迄今发现的作用最强的凝血酶特异性抑制剂，它能与凝血酶以摩尔比为1：1的方式结合形成复合物，使凝血酶失去裂解纤维蛋白原的能力，阻止了纤维蛋白的形成。同时，水蛭素也能阻断凝血酶催化的止血反应及凝血酶诱导的血小板反应。因此，水蛭素在临床上有广泛的应用，如：治疗脑血栓和脑出血、减轻脑出血水肿、用于血液透析过程中抗凝治疗、对心肌梗死和不稳定型心绞痛的治疗等。此外，水蛭还可以口服，这给用药带来了很大的方便。水蛭素比较稳定，胰蛋白酶并不破坏其活性，而且水蛭素的某些水解片段仍有抑制凝血酶的作用。

水蛭素的医疗价值得到了人们的普通重视，然而由于从医用水蛭中提取天然水蛭素产量低、价格昂贵、工艺复杂，使研究和应用受到了限制，故国内外医药界均着重研究通过基因工程取得重组水蛭素。1986年后，重组水蛭素已在大肠杆菌中表达成功。随着基因工程在医药领域的深入应用，水蛭素的研究与开发取得了长足的进步，重组水蛭素在细菌和酵母中得到了大量的表达，为抗凝血、抗血栓药物研究开辟了新的途径。

当前，水蛭素突变体有多种，研究表明，将天然水蛭素Ⅱ的第47位天冬酰胺(Asn)改变成赖氨酸（Lys）的水蛭素突变体HV2-Lys47，带肽链结构中有一个由Pro-Lys-Pro组成的特殊序列，一般不被蛋白酶降解，具有维持水蛭素分子稳定和引导水蛭素分子正确的方式与凝血酶分子结合的作用，参见发明专利：水蛭素突变体的一种编码基因与高效表达菌株。目前，该种水蛭素突变体在酵母表达系统中产率较低。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种新型水蛭素突变体及其基因工程生产方法，即提供一种N端第一个氨基酸突变为Ala的HV2-Lys47新型水蛭素突变体Ala1-HV2-Lys47，在其编码基因的上游插入DsbA信号肽的编码序列构建重组载体，以方便分泌型表达。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种水蛭素突变体，所述水蛭素突变体是将水蛭素HV2-Lys47的N端第一个氨基酸突变为Ala获得的水蛭素突变体Ala1-HV2-Lys47。

本发明还提供一种含所述水蛭素突变体的重组基因工程菌，所述重组基因工程菌按如下方法获得：将水蛭素突变体Ala1-HV2-Lys47编码基因与DsbA信号肽的编码基因拼接后获得拼接产物，再将拼接产物重组于载体中制备重组载体，最后将重组载体转化入宿主细胞制备含有水蛭素突变体Ala1-HV2-Lys47编码基因的重组基因工程菌。

进一步，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明优选所述水蛭素突变体Ala1-HV2-Lys47的氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示，相应优选水蛭素突变体Ala1-HV2-Lys47的编码基因为SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

本发明将水蛭素HV2-Lys47的N端第一个氨基酸Ile突变为Ala获得新型水蛭素突变体，命名为水蛭素Ala1-HV2-Lys47，即本发明所述新型水蛭素突变体。以大肠杆菌偏爱密码子设计该突变体的编码基因，委托生物技术公司化学合成该基因。通过设计引物，采用重叠延伸拼接（SOE）技术将DsbA信号肽的编码基因与水蛭素突变体Ala1-HV2-Lys47的编码基因进行拼接，将拼接产物用限制性内切酶NdeI和BamHI酶切后重组于pET39载体中，获得重组载体，将重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)，构建周质分泌表达型基因工程菌。DsbA信号肽可以使目标蛋白在周质空间分泌表达，大肠杆菌周质空间具有氧化性环境，易于得到具有正确空间结构的目标蛋白，周质空间杂蛋白少、目标蛋白含量高。在信号肽酶的作用下，信号肽被切除，目标多肽分泌于周质空间。无需破菌，直接进行周质蛋白提取即可得到较高纯度的水蛭素蛋白。构建的重组表达载体pET39-SHV，其物理图谱如图2所示。

本发明提供一种水蛭素突变体Ala1-HV2-Lys47的生产方法，将含水蛭素突变体Ala1-HV2-Lys47编码基因与DsbA信号肽的编码基因拼接产物的重组基因工程菌的细胞接种至含有50 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养16小时，按体积比1 %的接种量接种到发酵养基中，200 r/ min 震荡培养到OD₆₀₀约0.3~ 0.7时，添加终浓度为0.1~0.5mmol/L IPTG 诱导外源基因表达，28℃诱导培养28h。离心收集菌体，用“冷休克-渗透法”提取周质蛋白，方法参见（李振国等，大肠杆菌周质蛋白提取工艺的研究，生物学杂志，28（6），2011,12.）采用凝血酶滴定法测得水蛭素突变体的活性可达900ATU/mL。

本发明的要点在于提供了水蛭素突变体Ala1-HV2-Lys47（优选SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列、SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列），在已知该氨基酸序列和核苷酸序列的情况下，该氨基酸序列和核苷酸序列的获得，以及相关载体、宿主细胞的获得，对于本领域技术人员来说均是显而易见的。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一种水蛭素突变体及重组基因工程菌，所述水蛭素突变体Ala1-HV2-Lys47和未突变的水蛭素HV2-Lys47相比，比活性相同，但是在周质空间的表达量提高了近一倍，水蛭素突变体Ala1-HV2-Lys47活性为113ATU/mL发酵液，未突变的水蛭素HV2-Lys47活性为60ATU/mL发酵液。

（四）附图说明

图1 DsbA信号肽编码基因与水蛭素突变体Ala1-HV2-Lys47编码基因的拼接路线；

图2 重组载体pET39-SHV的物理图谱。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

LB固体培养基质量终浓度组成为：0.5%酵母膏、1%胰蛋白胨、1%氯化钠，溶剂为水。

实施例1 水蛭素突变体Ala1-HV2-Lys47编码基因的获得

通过查阅文献得到天然水蛭素Ⅱ型HV2-Lys47的氨基酸序列，将将N末端第一个异亮氨酸（Ile）突变为丙氨酸（Ala），获得水蛭素突变体Ala1-HV2-Lys47，氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示，根据大肠杆菌偏爱密码子设计水蛭素突变体Ala1-HV2-Lys47的全基因序列，委托南京金斯瑞生物科技有限公司化学全合成得到目的基因。水蛭素突变体Ala1-HV2-Lys47的核苷酸全序列为SEQ ID NO：2所示。

实施例2 水蛭素突变体Ala1-HV2-Lys47编码基因与DsbA信号肽编码基因的拼接

按照DsbA信号肽编码基因序列以及水蛭素突变体Ala1-HV2-Lys47的编码基因序列，用引物设计软件DNDSIS设计了以下5个片断（即引物）：

A:5’GTTCATATGAAAAAGATTTGGCTGGCGCTGGCTGGTTTAGTTTTAGCGTTTAGCGC 3’

B:5’ACCCGACTCGGTGCAATCGGTGTAGGTCGCCGCCGATGCGCTAAACGCTAAAACT3’

S-1: 5’ GTTCATATGAAAAAGATTTGGCTG 3’

H-1: 5’ ATTACCTACACCGATTGCACC 3’

H-2: 5’TTTGGATCCTCATTGCAGGTACTCT 3’

其中，A片段的3’端与B片段的3’端有18个碱基互补配对；S-1为A片段5’端的前24个碱基；B片段的5’端与水蛭素突变体Ala1-HV2-Lys47编码基因链5’端的30个碱基反向互补，H-1和H-2片段用于扩增水蛭素突变体Ala1-HV2-Lys47编码基因序列。

首先在pfu DNA聚合酶（购自Sangon）的作用下，以A片段和B片段互为引物，一步退火、延伸合成DsbA信号肽序列AB链。然后以化学合成的水蛭素突变体Ala1-HV2-Lys47全基因序列为模板，以H-1片段和H-2片段为上下游引物，PCR扩增水蛭素突变体Ala1-HV2-Lys47全基因序列片段。PCR参数：94 ℃预变性3 min，进入循环：94 ℃变性30 s，41℃退火30 s，72℃延伸60 s，2个循环；再94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，26个循环；最后72 ℃延伸10 min。再通过重叠延伸拼接（SOE）技术分别将AB链和扩增后的水蛭素突变体Ala1-HV2-Lys47全基因序列拼接。以S-1和H-2为上下游引物，在pfu DNA聚合酶（购自Sangon）作用下进行PCR扩增。PCR条件参数：94 ℃预变性3 min，进入循环：94 ℃变性30 s，41 ℃退火30 s，72℃延伸60 s，2个循环；再94 ℃变性30 s，57 ℃退火30 s，72℃延伸60 s，26个循环；最后72 ℃延伸10 min。得到DsbA信号肽编码基因与水蛭素突变体Ala1-HV2-Lys47编码基因拼接产物，即DsbA信号肽-Ala1-HV2-Lys47的基因全序列（核苷酸序列为SEQ ID NO：3所示，氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示），DsbA信号肽-Ala1-HV2-Lys47拼接过程如图1所示。

实施例3 构建DsbA信号肽- Ala1-HV2-Lys47基因工程菌

（1）将实施例2所得到的拼接产物DsbA信号肽-Ala1-HV2-Lys47基因序列和pET-39b(+)质粒分别用BamHⅠ和NdeⅠ在37 ℃双酶切2 h，经琼脂糖凝胶电泳和3S DNA Gel Purification Kit纯化回收，得到线形DNA和质粒DNA，再用T4 DNA ligase在20℃连接4小时，从而将目的片段克隆入pET-39b(+)质粒的BamHⅠ和NdeⅠ两个酶切位点之间，构成pET39-SHV重组载体，见图2。

（2）将上述重组载体用CaCl₂法转化克隆宿主E.coli DH5α，方法参见J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔.分子克隆实验指南（第三版）。在含100 μg/mL 卡那霉素抗性的LB固体培养基上挑选分离良好的单克隆，分别以T7正向和H-2为上下游引物进行菌落PCR鉴定。阳性克隆送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，结果证实拼接产物DsbA信号肽-Ala1-HV2-Lys47基因序列（SEQ ID NO：3）已经重组至pET39-SHV重组载体中，测序结果见SEQ ID NO：5所示。将经测序证实为阳性的重组质粒用CaCl₂法转化表达宿主E.coli BL21(DE3)，方法同上。在含100μg/mL Kan抗性的LB固体培养基上挑选分离良好的单菌落分别接种于3mL含50 μg/mL 卡那霉素的液体LB培养基中（0.5%酵母膏、1%胰蛋白胨、1%氯化钠，溶剂为水，自然pH值）。37℃震荡培养过夜。次日按体积比1%接种量分别转接于3mL含50 μg/mL 卡那霉素的LB液体培养基中（成份同上），37℃培养至OD₆₀₀为0.3~0.7时，分别加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，28℃诱导培养28h后通过跑Tricine-SDS-PAGE分析水蛭素突变体蛋白的表达，将有表达的克隆用甘油冷冻法保存，即获得含水蛭素突变体Ala1-HV2-Lys47基因的重组基因工程菌。

实施例4 重组水蛭素的生产方法

（1）培养条件

经实施例3方法筛选后的阳性克隆接种于3个3 mL含50 μg/mL 卡那霉素的 LB液体培养（0.5%酵母膏、1%胰蛋白胨、1%氯化钠，溶剂为水，自然pH值）中，37 ℃培养过夜，次日按体积比1%接种量转接于800mL新鲜的含50 μg/mL 卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.3~0.7时，加入终浓度为0.5 mmol/L的IPTG，诱导28 h，获得诱导培养液。

（2）重组水蛭蛋白的制备

取800mL诱导培养液于4000 r/min离心15 min，去上清；收集菌体，用20mL含20％（w/v）蔗糖的20mmol/L Tris-HCl（pH8.0）缓冲液，重悬菌体，冰浴30 min；加入80mL蒸馏水，冰浴30 min；4000 r/min离心10 min，取上清液，即获得重组水蛭蛋白。

（3）重组水蛭素蛋白的初步纯化

将上一步收集的上清液，以2 mL/min的速度上样于经10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0）平衡过的Q-Sephorase FF柱中，用50 mL含10 mmol/L 的NaCl溶液进行预洗脱；接着用50 mL含40mmol/L 的NaCl的10 mmol/LTris-HCl（pH8.0）溶液进行洗脱，收集含目标组分的洗脱液，得到目标蛋白。

（4）重组水蛭素的抗凝血活性测定

按Markwardt凝血酶滴定法（Markwardt F.Hirudin as an inhibitor of thrombin，1970,69:924~932）所述，取1支小试管加入0.5%（w/v）牛血纤维蛋白原溶液（50mM Tris-HCl缓冲液（pH7.4）配制）200μL，再加50 μL步骤（2）获得的上清（即重组水蛭蛋白）混匀，滴加100NIH/mL凝血酶（购自上海源叶生物科技有限公司）5μL摇匀，37℃恒温水浴下1min不凝，再滴加相同浓度凝血酶5 μL，直到纤维蛋白原溶液在1min内凝结，所用凝血酶总量乘以20即可计算出样品每毫升活性。将步骤（2）获得的上清（即重组水蛭蛋白）进行抗凝血活性测定，突变重组菌的周质提取液上清中抗凝血酶活力达900ATU/mL。未突变的水蛭素HV2-Lys47周质提取液的活性为480ATU/mL。由于周质提取液的体积为发酵液体积的1/8，所以每毫升发酵液中水蛭素的活性为113ATU，而未突变的水蛭素重组菌每毫升发酵液中水蛭素的活性为60ATU。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江工业大学

<120> 一种水蛭素突变体及重组基因工程菌

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 65

<212> PRT

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 1

Ala Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu Cys Leu Cys

1 5 10 15

Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile Leu Gly Ser

20 25 30

Asn Gly Lys Gly Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro

35 40 45

Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu

50 55 60

Gln

65

<210> 2

<211> 198

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 2

cgcacctaca ccgattgcac cgagtcgggt cagaatctgt gtctgtgcga aggctcgaac 60

gtgtgtggta aaggcaataa atgcattctg ggttcgaacg gcaaaggtaa tcagtgtgtg 120

accggcgaag gtaccccgaa gccggagtcg cataataacg gcgattttga ggaaattccg 180

gaagagtacc tgcaatga 198

<210> 3

<211> 270

<212> DNA

<213> Unknown

<220>

<223> 人工序列

<400> 3

gttcatatga aaaagatttg gctggcgctg gctggtttag ttttagcgtt tagcgcatcg 60

gcgcgcacct acaccgattg caccgagtcg ggtcagaatc tgtgtctgtg cgaaggctcg 120

aacgtgtgtg gtaaaggcaa taaatgcatt ctgggttcga acggcaaagg taatcagtgt 180

gtgaccggcg aaggtacccc gaagccggag tcgcataata acggcgattt tgaggaaatt 240

ccggaagagt acctgcaatg aggatccaaa 270

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<212> PRT

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<223> 人工序列

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Met Lys Lys Ile Trp Leu Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ala Phe Ser

1 5 10 15

Ala Ser Ala Ala Thr Tyr Thr Asp Cys Thr Glu Ser Gly Gln Asn Leu

20 25 30

Cys Leu Cys Glu Gly Ser Asn Val Cys Gly Lys Gly Asn Lys Cys Ile

35 40 45

Leu Gly Ser Asn Gly Lys Gly Asn Gln Cys Val Thr Gly Glu Gly Thr

50 55 60

Pro Lys Pro Glu Ser His Asn Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu

65 70 75 80

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atcatcatca tcatcacagc agcggcctgg tgccgcgcgg cagccatatg aaaaagattt 120

ggctggcgct ggctggttta gttttagcgt ttagcgcatc ggcggcgacc tacaccgatt 180

gcaccgagtc gggtcagaat ctgtgtctgt gcgaaggctc gaacgtgtgt ggtaaaggca 240

ataaatgcat tctgggttcg aacggcaaag gtaatcagtg tgtgaccggc gaaggtaccc 300

cgaagccgga gtcgcataat aacggcgatt ttgaggaaat tccggaagag tacctgcaat 360

gaggatccga attcgagctc cgtcgacaag cttgcggccg cactcgagca ccaccaccac 420

caccactgag atccggctgc taacaaagcc cgaaaggaag ctgagttggc tgctgc 476

Claims

1.一种水蛭素突变体，其特征在于所述水蛭素突变体是将水蛭素HV2-Lys47的N端第一个氨基酸突变为Ala获得的水蛭素突变体Ala1-HV2-Lys47。

2.一种含权利要求1所述水蛭素突变体的重组基因工程菌，其特征在于所述重组基因工程菌按如下方法获得：将水蛭素突变体Ala1-HV2-Lys47编码基因与DsbA信号肽的编码基因拼接后获得拼接产物，再将拼接产物重组于载体中制备重组载体，最后将重组载体转化入宿主细胞制备含有水蛭素突变体Ala1-HV2-Lys47编码基因的重组基因工程菌。

3.如权利要求2所述含权利要求1所述水蛭素突变体的重组基因工程菌，其特征在于所述宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。