RU2118365C1 - Производное гирудина, действующее как ингибитор тромбина, рекомбинантная днк, кодирующая производное гирудина, и способ его получения - Google Patents

Производное гирудина, действующее как ингибитор тромбина, рекомбинантная днк, кодирующая производное гирудина, и способ его получения Download PDF

Info

Publication number
RU2118365C1
RU2118365C1 SU4894968A SU4894968A RU2118365C1 RU 2118365 C1 RU2118365 C1 RU 2118365C1 SU 4894968 A SU4894968 A SU 4894968A SU 4894968 A SU4894968 A SU 4894968A RU 2118365 C1 RU2118365 C1 RU 2118365C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
derivative
hirudin
hirudine
recombinant dna
thrombin inhibitor
Prior art date
Application number
SU4894968A
Other languages
English (en)
Inventor
Шмид Герхард
Хаберманн Пауль
Original Assignee
Консортиум фюр Электрохемише Индустри ГмбХ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Консортиум фюр Электрохемише Индустри ГмбХ filed Critical Консортиум фюр Электрохемише Индустри ГмбХ
Application granted granted Critical
Publication of RU2118365C1 publication Critical patent/RU2118365C1/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12N9/1074—Cyclomaltodextrin glucanotransferase (2.4.1.19)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Получено производное гирудина, действующее как ингибитор тромбина, обладающее специфической активностью не менее 10000 АТ ед/мг с выведенной аминокислотной последовательностью. Установлена также нуклеотидная последовательность рекомбинантной ДНК, кодирующей производное гирудина. Способ получения производного гирудина заключается в конструировании плазмиды, содержащей комбинантную ДНК, в трансформации ею секреторного мутанта Escherichia coli, культивировании трансформированных клеток в среде и в выделении целевого продукта. Производное гирудина обладает специфической активностью ингибитора тромбина. 3 с.п.ф-лы, 5 ил.

Description

Изобретение относится к получению производного гирудина с N-концевой последовательностью аминокислот Ала-Тре-Тир-Тре-Асп в секреторных мутантах E.coli.
Гирудин - это полипептид из 65 аминокислот, выделяемый из кровяного геля Hirudo medicinalis. Он действует как высокоспецифический ингибитор тромбина путем образования стабильных комплексов с ним и обладает благодаря этому широкими терапевтическими возможностями, в особенности для антикоагуляционной терапии (F. Markguardt, Biomed. Biochim. Acta. 44 (1985), 1007 - 1013).
После опубликования полной последовательности аминокислот гирудина (J. Dodt и др., FEBS LETTERS 165 (2), (1984), 180 - 184) были созданы предпосылки для получения гирудина с помощью техники рекомбинантных ДНК и экспрессии в микроорганизмах.
В EP-A-О 158564 (Transgene) представлены векторы клонирования для экспрессии гирудина или его аналога в клетке-хозяине, в частности в бактериальной клетке. Ген, кодирующий гирудин, получают при этом синтезом ДНК на матрице mРНК кровяного геля Hirudo medicinalis. Описано также производное гирудина с N-концевой последовательностью Иле-Тре-Тир-Тре-Асп и способ его получения.
В EP-A-O 168342 (Ciba Geigy) представлены ДНК-последовательности, кодирующие аминокислотную последовательность природного гирудина, который имеет N-концевую последовательность аминокислот Вал-Вал-Тир-Тре-Асп. Экспрессию гирудина осуществляют в микроорганизмах E.coli и Saccharomyces cerevisiae внутриклеточно.
В EP-A-O 171024 (Hoechst AG) представлен способ генно-инженерного получения пептидов с активностью гирудина, преимущественно в клетках E.coli, при этом клетки разрушают и из клеточного экстракта получают полипептид с активностью гирудина. Образующийся слитый белок можно разделить путем протеолитического или химического расщепления и очистить освободившиеся молекулы гирудина.
Предметом изобретения WO 86/03517 и DE-OS 3445571 (GEN-BJO-TEC) является последовательность ДНК, которая кодирует белок с биологической активностью гирудина, а также способ получения такого белка из клеток E. coli, которые трансформируют пригодным рекомбинантным вектором, путем лизиса клеток.
В работе Бергмана и др. (Biol. Chem. Hoppe Seyler 367, (1986), 731 - 740) описан синтез гирудина в E. coli. Выделение гирудина из клеток осуществляют путем обработки толуолом, причем достигается лишь незначительный выход около 500 нг/л культуры с плотностью A578 единиц.
В EP-A-O 200655 (Transgene), EP-A-O 252854 (Transgene) и EP-A-O 225633 (Ciba Geigy) представлено получение белка с активностью гирудина путем секреции из эукариотического хозяина, в особенностей дрожжей, трансформированных вектором, который содержит ДНК-последовательность сигнального пептида перед структурным геном. Описана секреция производных гирудина с N-концевой последовательностью Вал-Вал-Тир-Тре-Асп, а также с N-концевой последовательностью Иле-Тре-Тир-Тре-Асп в дрожжах. При этом указан выход до 100 мг/л.
В DE-OS 39 00 626 (Hoechst AG) представлено производное гирудина с N-концевой последовательностью Лей-Тре-Тир-Тре-Асп. Экспрессия преимущественно имеет место в дрожжах, причем применяют промотор и сигнальную последовательность гена феромона дрожжей MFα для экспрессии и секреции производного гирудина.
Все описанные выше способы получения производных гирудина имеют недостатки. Так, при применении дрожжей в качестве хозяина для продукции и секреции гирудина в культуральной среде получают относительно высокий выход, однако культивирование дрожжевых клеток является более длительным процессом, требующим соблюдения определенных условий, чем в случае с бактериями E. coli. В клетках E. coli, наоборот, имеет место относительно низкий выход и/или при увеличении числа клеток усложняется способ выделения.
Задачей изобретения в связи с эти является разработка простого способа получения производных гирудина, при котором эти производные можно получить с высоким выходом из бактериальных клеток, не прибегая к необходимости использования их избытка.
Предметом изобретения является способ получения производных гирудина с использованием секретирующих мутантов E. coli, по которому 1) конструируют рекомбинантный вектор, в котором ген, кодирующий производные гирудина, следует за ДНК-фрагментом, кодирующим в свою очередь бактериальный сигнальный пептид, 2) трансформируют секретирующие мутанты E. coli рекомбинантным вектором, сконструированным по п. 1), 3) трансформированные клетки культивируют в среде и 4) выделяют из среды производные гирудина.
Под понятием производного гирудина согласно изобретению понимают происходящие от гирудина белки, которые действуют как тромбинингибиторы и обладают специфической активностью, равной по меньшей мере 10000 AT-U/мг, где AT-U антитромбиновые единицы (Dodt и др., Biol. Chem. Hoppe Seyler 366 (1985), 379 - 385).
Способом согласно изобретению получают производные гирудина со следующей последовательностью аминокислот:
(X)m-Z-Тре-Tир-Тре-Acп,
где
m = 0 - 50;
X - одинаковые или различные генетически кодированные аминокислоты;
Z - генетически кодированная аминокислота из группы Лей, Иле, Ала, Вал, Гли, Сер, Асп, Глу, Асн, Глн, Гис, Мет, Фен и Тир.
Поскольку m>0, то последовательность X содержит протеолитически или химически расщепляемое место, предпочтительно у своего конца. Если, например, последняя аминокислота X - является Арг- остатком, то можно слитую последовательность X отщепить путем триптического переваривания (расщепление после Арг) и очистить активное производное гирудина. Отщепление слитой части, однако, можно проводить с использованием и других известных протеолитических ферментов или химических расщепляющих реагентов. Если, например, аминокислотная последовательность X оканчивается Мет- остатком, то можно слитый белок расщепить с помощью галогенциана (E. Gross и B. Wittkop, J. Am. Chem. Soc., 82 (1961), 1510 - 1517). Если, например, C - конец последовательности аминокислот X включает аминокислотную последовательность Иле-Глу-Глу-Арг, то расщепление можно проводить фактором Xa (EP-A 0025190 и EP-A 0161973).
Если в способе согласно изобретению m = 0, то Z - преимущественно ГЛН, Гис, Фен, Тир, Гли, Сер, Асп или Асн, в особенности Ала, Гли, Сер, Асп или Асн. Наиболее предпочтительно производное гирудина, если m = 0, а Z - Ала.
Таким образом, предметом изобретения являются также производные гирудина с N-концевой последовательностью А-Тре-Тир-Тре-Асп, где А-Ала-Глн, Гис, Фен, Тир, Гли, Сер, Асп или Асн, предпочтительно Ала, Гли, Сер, и Асп или Асн. Наибольшее предпочтение отдают производному с N-концевой последовательностью Ала-Тре-Тир-Тре-Асп. Это производное гирудина можно получить в культуре секреторного мутанта E. coli с выходом активной формы до 2 г/л среды.
Преимущество способа согласно изобретению также состоит в том, что благодаря секреции производного гирудина в среду дисульфидные мостики гирудина легко образуются при создании окислительных условий вне клетки.
Под определением "секреторные мутанты E. coli", согласно изобретению принимают штаммы E. coli, которые дают массовую секрецию белков в культуральную среду. Способ получения этих мутантов представлен в EP-A-O 338410. При получении пригодных мутантов E. coli можно исходить из E. coli DS 410/DSM 4513/ или E/coli BW 7261/DSM 5231/. Штамм E. coli трансформируют сначала плазмидой, которая включает ДНК-последовательность, кодирующую выделяемый белок. Затем трансформированный штамм E. coli подвергают мутагенезу, например, путем обработки N-метил-N'-нитро-N- нитрозогуанидином и проводят селекцию пригодных штаммов-мутантов. Если выбирают в качестве выделяемого белка, например, α -циклодекстрингликозилтрансферазу, то можно обнаружить мутанты по резистентности в D-циклосерину, веществу, проявляющему активность относительно стенок клетки. Далее секреция α -циклодекстрингликозилтрансферазы (CGTase) способствует гидролизу крахмала в окружающей среде, что при использовании амилопектин-азур-среды приводит к дополнительной возможности селекции мутантов.
В качестве рекомбинантного вектора для данного изобретения пригодны векторы, которые могут либо интегрировать в геном E. coli (например, бактериофаги λ), либо существовать в трансформированной клетке E. coli вне хромосомы (например, плазмиды). Преимущественно применяют плазмиды.
В рекомбинантный вектор встраивают ген, который кодирует белок, состоящий из сигнального пептида и производного гирудина, и находится преимущественно под контролем индуцируемого промотора, особенно trp-lac - промотора, который может быть индуцирован добавкой лактозы или ИРТГ (изопропил- β -D-тиогалактозид). Далее в векторе должен быть ген-маркер для селекции, в данном случае ген lac-репрессора.
В качестве бактериальной сигнальной последовательности, способствующей секреции производного гирудина, в принципе пригодны все известные сигнальные пептиды, отвечающие за прохождение через мембрану клеток E. coli. В основном применяют также сигнальные пептиды из грамм-отрицательных бактерий, например сигнальные пептиды следующих белков E. coli: наружный мембранный белок OmpA (DiRienzo и др., 1978 Ann. Rev. Biochem. 47: 481 - 532), щелочная фосфатаза PhoA (Inouye и др. , 1982 J. Bacteriol 149: 434 - 439), LamB - белок (Hedgpeth и др., 1980 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 77: 2621 - 2625), мальтоза - связующий белок MalE (Bedouelle и др., 1980 Nature 285: 78 - 81). Преимущественно применяют сигнальный α -CGTase-пептид.
Вектором, пригодным для способа согласно изобретению, являются, например, плазмида pCM705 (фиг. 1), которую получают из плазмиды pCM703, описанный в EP-A-O 383410, путем выделения Nru I - фрагмента длиной около 1 kb. Этот вектор содержит ген резистентности к ампициллину, ген lac - репрессора и CGTase - ген с участком для кодирования сигнального пептида на 51-конце. Последовательность, кодирующую производные гирудина, интегрируют в вектор pCM705 с тем, чтобы внутри клетки образовались промежуточные молекулы с сигнальным пептидом α -CGTase на его N-конце. Сконструированный ген находится под контролем tac-промотора. Полученной таким образом плазмидой можно трансформировать мутантный штамм E. coli.
Положительно трансформированные клоны культивируют во встряхивающихся колбах или ферментерах. При достижении оптимальной плотности (OD600) около 1 проводят индукцию с помощью ИРТГ или лактозы.
С помощью теста тромбин-инактивация (Griesbach и др., Thrombosis Research 37, (1985), 347 - 350) определяют процесс образования производного пирудина. Накопление слитых белков анализируют с помощью жидкостной хроматографии высокого давления (обратимая фаза). Вспомогательную часть слитых белков потом можно отщепить и очистить образовавшееся активное производное гирудина.
На фиг. 1 показана плазмида pCM705; на фиг. 2 - ДНК-последовательность синтетического гена гирудина из pK152; на фиг. 3 - последовательности олигонуклеотидов HJP1, HJP2 и HJP3: на фиг. 4 - плазмида pCM7051; на фиг. 5 - плазмида pCM7053.
Пример 1. Конструирование вектора секреции.
Плазмида pK152 несет синтетический ген гирудина, последовательность которого представлена в EP-A 0171024. Из этой плазмиды выделяют большой ДНК-фрагмент Hinf I - Hind III размером около 200 bp путем гель-электрофореза в агарозе, содержащий большую часть ДНК-последовательности, кодирующей гирудин (фиг. 2). Отсутствующая 51-концевая последовательность регенерируется вновь синтезированным олигонуклеотидом (HJP1). Последовательность олигонуклеотида представлена на фиг. 3. Благодаря слиянию Hinf1- концов получают производное гирудина с N-концевой последовательностью Ала-Тре-Тир-Тре-Асп.
Плазмиду pCM705 (фиг. 1) расщепляют с помощью Pst1 и Hind III. Оба места разрыва находятся в кодирующей области гена CGTase, благодаря чему выделяется ДНК-отрезок размером 1 kb. Pst I расщепляет точно в области, которая кодирует место разрыва для сигнальной пептидазы.
PstI-Hind III фрагмент pCM705, 6,3 kb, Hind I-Hind III фрагмент pK152 0,2 kb и олигонуклеотид HJP1 лигируют друг с другом, благодаря чему образуется плазмида pCM7051 (фиг. 4). Штамм HB101 (DSM 1607) E. coli трансформируют лигирующей смесью. Колонии, которые на селективной среде с аминопектином и азуром (окрашенный амилопектин) не показывают снижения крахмала и, тем самым, α -CGTase-экспрессии выделяют и очищают до однородности. ДНК-плазмиду выделяют из нескольких очищенных клонов и идентифицируют с помощью рестрикционного анализа.
ДНК-плазмиду, которая имеет корректную генную структуру для гирудина, расщепляют с помощью Nru I и Nde I и выделяют фрагмент размером 5,18 kb путем гель-электрофореза в агарозе.
После достраивания Nde I- сайта ферментом Кленова фрагмент циклизуют. Образованная плазмида обозначена как pCM7053 (фиг. 5).
Мутанты E. coli W CM100, которые получают описанным в EP-A-О 338410 методом, трансформируют полученной плазмидой pCM7053.
Пример 2. Тест на секрецию гирудина во встряхиваемых колбах.
В 10 мл αB -среды с 100 мкм/мл ампиллина и оптической плотностью OD420 = 0,1 засеивают свежую суточную культуру WCM100/pCM7053. Культуру взбалтывают при 30oC. По достижении оптической плотности OD420 = 1,0 добавляют индуктор лактозу в конечной концентрации 1%. После 48 ч берут пробу культуры, центрифугированием отделяют клетки и в фильтрате определяют концентрацию гирудина. Определение проводят с помощью теста тромбин-инактивации. Выход составляет до 4000 AT-U/мл или ≅ 250 мг/л.
Пример 3. Получение гирудина в 10-литровом ферментере
Минимально в 7 л среды с 100 мкм/мл ампиллина с оптической плотностью OD600 = 0,1 засевают свежую суточную культуру WCM100/pCM7053.
Условия ферментации: температура 30oC; скорость перемешивания 450 - 500 rpm; разрежение 0,5 - 1,5 Vvm; pH 7,0±0,1.
По достижении оптической плотности OD600 = 1,0 добавляют 0,5 ммоль ИПТГ / изопропил- β -D-тиогалактозид/.
Через 40 ч после добавки ИПТГ в фильтрате определяли 36000 AT-U/мл, или ≅ 2,25 г/л.
Пример 4. Секреция гирудина с N-концевой последовательностью Ала-Тре-Арг-Лей-Тре-Тир-Тре-Асп.
Опыт проводят аналогично примеру 1, но вместо олигонуклеотида HJP1 применяют олигонуклеотид HJP2 (фиг. 3). Получают слитый белок гирудин с N - концевой последовательностью Ала-Тре-Арг-Лей-Тре-Тир-Тре-Асп. Количество слитого белка в фильтрате определяют с помощью ЖХ-хроматографии высокого давления при использовании "обратимой фазы" (C18 -хроматографическая колонна). Ферментация штамма WCM100 с данной генной конструкцией дает выход слитого белка 25 мг/л. Благодаря расщеплению трипсином можно получить активный гирудин с N-концевой последовательностью Лей-Тре-Тир-Тре-Асп.
Пример 5. Секреция гирудина мутантом WCM88.
Мутант WCM88, полученный описанным в EP-A-О 338410 способом, трансформируют плазмидой pCM7053 (пример 1). Получение гирудина благодаря секреции в среду тестируют с использованием способа со встряхиваемыми колбами и ферментацией.
а) Опыт во встряхиваемых колбах.
Штамм WCM88/pCM7053 культивируют аналогично примеру 1. Через 48 ч определяют в фильтрате культуры концентрацию гирудина. Выход 1800 AT-U/мл или ≅110 мг/л.
б) Получение в 10-литровом ферментере.
Свежий штамм обрабатывают, как описано в примере 3. Через 45 ч после добавки ИПТГ в фильтрате установлено 21000 AT-U/мл, или ≅ 1,3 г/л.
Пример 6. Конструирование вектора секреции, резистентного к тетрациклину.
Выделяют 1,1 kb NruI-фермент плазмиды pBR322 (F. Bolivar et al., Gene 2, 95-113 (1977)) и лигируют его с линеаризированной путем Nru I- расщепления плазмидой pCM7051 (фиг. 4). Лигирующей смесью трансформируют E. coli HB101. Трансформанты отбирают по их резистентности к тетрациклину.
ДНК-плазмиду выделенного клона повторно изолируют и расщепляют с Nde I и Ava I. Фрагменты ДНК разделяют электрофорезом в агарозном геле. Больший фрагмент выделяют и достраивают однонитевые участки с помощью энзима Кленова, а затем лигируют.
Получают плазмиду pCMT203.
Пример 7. Секреция гирудина с применением вектора секреции pCMT 203.
Секреторный мутант WCM 100 (пример 1) трансформируют плазмидой pCMT203. Полученный штамм культивируют в 1-литровом ферментере. Через 45 ч после добавки ИПТГ определяли 42000 AT-U/мл гирудина (≅ 2,63 г/л).

Claims (1)

  1. \ \\1 1. Производное гирудина, действующее как ингибитор тромбина, обладающее специфической активностью не менее 10000 АТ ед/мг, имеющее выведенную аминокислотную последовательность I, приведенную ниже, полученное культивированием секреторного мутанта Escherichia coli, трансформированного плазмидой, содержащей рекомбинантную ДНК, кодирующую упомянутое производное гирудина. \\\2 2. Рекомбинантная ДНК, кодирующая производное гирудина, действующее как ингибитор тромбина, и имеющая следующую нуклеотидную последовательность II, приведенную ниже, где Z - кодон для аминокислоты Ала. \\\2 3. Способ получения производного гирудина, действующего как ингибитор тромбина, предусматривающий конструирование плазмиды, содержащей рекомбинантную ДНК, трансформацию ею штамма Escherichia coli, культивирование трансформированных клеток в среде и выделение продукта, отличающийся тем, что трансформируют секреторный мутант Escherichia coli плазмидой, содержащей рекомбинантную ДНК по п.2.
SU4894968A 1990-03-22 1991-03-21 Производное гирудина, действующее как ингибитор тромбина, рекомбинантная днк, кодирующая производное гирудина, и способ его получения RU2118365C1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DEP4009268.2 1990-03-22
DE4009268A DE4009268A1 (de) 1990-03-22 1990-03-22 Sekretion von hirudinderivaten

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2118365C1 true RU2118365C1 (ru) 1998-08-27

Family

ID=6402843

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SU4894968A RU2118365C1 (ru) 1990-03-22 1991-03-21 Производное гирудина, действующее как ингибитор тромбина, рекомбинантная днк, кодирующая производное гирудина, и способ его получения

Country Status (23)

Country Link
US (1) US5919895A (ru)
EP (1) EP0448093B1 (ru)
JP (1) JPH07106157B2 (ru)
KR (1) KR950007510B1 (ru)
CN (1) CN1067104C (ru)
AT (1) ATE135042T1 (ru)
AU (1) AU640212B2 (ru)
BR (1) BR9101104A (ru)
CA (1) CA2038888C (ru)
DE (2) DE4009268A1 (ru)
DK (1) DK0448093T3 (ru)
ES (1) ES2084052T3 (ru)
FI (1) FI100250B (ru)
GR (1) GR3019946T3 (ru)
HU (1) HU214368B (ru)
IE (1) IE71174B1 (ru)
IL (1) IL97323A (ru)
NO (1) NO308543B1 (ru)
NZ (2) NZ237437A (ru)
PH (1) PH30485A (ru)
PT (1) PT97093B (ru)
RU (1) RU2118365C1 (ru)
ZA (1) ZA912013B (ru)

Families Citing this family (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3835815A1 (de) * 1988-10-21 1990-04-26 Hoechst Ag Neue isohirudine
DE4140381A1 (de) * 1991-12-07 1993-06-09 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt, De Neue synthetische isohirudine mit verbesserter stabilitaet
SE9203753D0 (sv) * 1992-12-11 1992-12-11 Kabi Pharmacia Ab Expression system for producing apolipoprotein ai-m
WO1996032409A1 (fr) 1995-04-12 1996-10-17 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Facteur de croissance de cellule vegetale
JP3746847B2 (ja) * 1996-08-02 2006-02-15 協和醗酵工業株式会社 植物細胞増殖因子
DE19915938A1 (de) 1999-04-09 2000-10-19 Aventis Pharma Gmbh Herstellung von pankreatischer Procarboxypeptidase B, Isoformen und Muteinen davon und ihre Verwendung
DE19944870A1 (de) * 1999-09-18 2001-03-29 Aventis Pharma Gmbh Signalsequenzen zur Herstellung von Leu-Hirudin über Sekretion durch E. coli in das Kulturmedium
DE10033195A1 (de) * 2000-07-07 2002-03-21 Aventis Pharma Gmbh Bifunktionale Fusionsproteine aus Hirudin und TAP
US7638618B2 (en) 2001-02-20 2009-12-29 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Nucleic acids encoding a hirudin and pro-insulin as superscretable peptides and for parallel improvement of the exported forms of one or more polypeptides of interest
DE10108211A1 (de) * 2001-02-20 2002-08-22 Aventis Pharma Gmbh Verwendung von Fusionsproteinen, deren N-terminaler Anteil aus einem Hirudinderivat besteht, zur Herstellung rekombinanter Proteine über Sekretion durch Hefen
US7202059B2 (en) 2001-02-20 2007-04-10 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Fusion proteins capable of being secreted into a fermentation medium
DE102006004871A1 (de) 2006-02-02 2007-08-09 Wacker Chemie Ag Mikroorganismenstamm zur Produktion von rekombinanten Proteinen
DE502006006800D1 (de) * 2006-09-22 2010-06-02 Wacker Chemie Ag Verfahren zur fermentativen Herstellung von Proteinen
EP1905839B2 (de) * 2006-09-22 2019-07-10 Wacker Chemie AG Verfahren zur fermentativen Herstellung von Proteinen
EP1903115B1 (de) 2006-09-22 2011-03-09 Wacker Chemie AG Verfahren zur fermentativen Herstellung von Antikörpern
DE102006044841A1 (de) 2006-09-22 2008-04-03 Wacker Chemie Ag Signalpeptid zur Produktion von rekombinanten Proteinen
DE102006050332A1 (de) * 2006-10-25 2008-04-30 Wacker Chemie Ag DNS-Konstrukt und Verfahren zur fermentativen Herstellung von Fusionsproteinen
DE102008063900A1 (de) 2008-12-19 2010-06-24 Wacker Chemie Ag Verfahren zur fermentativen Herstellung von heterologen Proteinen mittels Escherichia coli
CN103848914B (zh) * 2012-11-29 2018-08-28 河北以岭医药研究院有限公司 一种具抗凝活性的菲牛蛭素多肽及其制备方法与用途
CN103059130A (zh) * 2012-12-22 2013-04-24 浙江工业大学 一种水蛭素突变体及重组基因工程菌
CN108220369B (zh) * 2017-12-04 2021-03-12 广东双骏生物科技有限公司 一种生产重组水蛭素的方法
US12084664B2 (en) 2018-07-24 2024-09-10 Wacker Chemie Ag Bacterial lpp mutants and the use thereof for the secretory production of recombinant proteins
CN115572329B (zh) * 2021-06-21 2024-02-06 王大勇 一组活性增强代谢较慢的菲牛蛭基因重组水蛭素及其制备方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0077670B1 (en) * 1981-10-19 1989-06-28 Genentech, Inc. Human immune interferon
EP0352387B1 (en) * 1988-07-26 1992-12-30 The Agency of Industrial Science and Technology Method for preparing a hirudin
DE3445517C2 (de) * 1984-12-13 1993-11-18 Ciba Geigy Für ein Hirudin-ähnliches Protein codierende DNA-Sequenz und Verfahren zur Herstellung eines Hirudin-ähnlichen Proteins
EP0200655B1 (fr) * 1985-05-02 1995-04-26 Transgene S.A. Vecteurs d'expression et de sécrétion de l'hirudine par les levures transformées
EP0252854B1 (fr) * 1986-07-10 1997-05-14 Behringwerke Aktiengesellschaft Bloc fonctionnel d'ADN et plasmide codant pour l'hirudine, levure transformée et procédé de préparation de l'hirudine.

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2936543A1 (de) * 1979-09-10 1981-04-09 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Chromogene verbindungen
ATE78294T1 (de) * 1984-03-27 1992-08-15 Transgene Sa Expressionsvektoren fuer hirudin, transformierte zellen und verfahren zur herstellung von hirudin.
DE3438296A1 (de) * 1984-04-18 1985-11-07 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Neue polypeptide mit blutgerinnungshemmender wirkung, verfahren zu deren herstellung bzw. gewinnung, deren verwendung und diese enthaltende mittel
GB8412517D0 (en) * 1984-05-16 1984-06-20 Nagai K Recombinant fusion proteins
EP0168342B1 (de) * 1984-06-14 1991-07-03 Ciba-Geigy Ag Verfahren zur Herstellung von Thrombin-Inhibitoren
DE3429430A1 (de) * 1984-08-10 1986-02-20 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens
US4923808A (en) * 1985-03-12 1990-05-08 Genentech, Inc. Method for identifying mutants secreting high levels of heterologous proteins
ZA89215B (en) * 1985-04-11 1993-12-23 Hoechst Ag A hirundi derivative
MY101203A (en) * 1985-12-12 1991-08-17 Ucp Gen Pharma Ag Production of thrombin iinhibitors.
AU604925B2 (en) * 1988-02-23 1991-01-03 Schering Aktiengesellschaft A hirudin derivative
DE3813107A1 (de) * 1988-04-19 1989-11-02 Consortium Elektrochem Ind Sekretormutante von escherichia coli
GB8817160D0 (en) * 1988-07-19 1988-08-24 Ciba Geigy Ag Novel proteins
FR2636643B1 (fr) * 1988-08-24 1990-12-28 Sanofi Sa Peptide-signal, sequences d'adn codant pour celui-ci, vecteurs d'expression portant l'une de ces sequences et procede de production periplasmique d'un polypeptide
GB8826428D0 (en) * 1988-11-11 1988-12-14 Biopharm Ltd Antithrombin
US5164304A (en) * 1989-05-04 1992-11-17 Sri International Method and vectors for stabilizing hirudin and human laminin b1 expression
CA2072375C (en) * 1990-11-08 2000-01-11 Satoru Misawa Hirudin analog, method of manufacturing thereof and anti-coagulant composition, and secretion vector, transformed microorganisms containing saidvector and manufacturing method of products which is produced from said microorganism

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0077670B1 (en) * 1981-10-19 1989-06-28 Genentech, Inc. Human immune interferon
DE3445517C2 (de) * 1984-12-13 1993-11-18 Ciba Geigy Für ein Hirudin-ähnliches Protein codierende DNA-Sequenz und Verfahren zur Herstellung eines Hirudin-ähnlichen Proteins
EP0200655B1 (fr) * 1985-05-02 1995-04-26 Transgene S.A. Vecteurs d'expression et de sécrétion de l'hirudine par les levures transformées
EP0252854B1 (fr) * 1986-07-10 1997-05-14 Behringwerke Aktiengesellschaft Bloc fonctionnel d'ADN et plasmide codant pour l'hirudine, levure transformée et procédé de préparation de l'hirudine.
EP0352387B1 (en) * 1988-07-26 1992-12-30 The Agency of Industrial Science and Technology Method for preparing a hirudin

Also Published As

Publication number Publication date
FI100250B (fi) 1997-10-31
HU214368B (hu) 1998-03-30
FI911009A0 (fi) 1991-02-28
KR950007510B1 (ko) 1995-07-11
NZ237437A (en) 1993-11-25
EP0448093B1 (de) 1996-03-06
NO911137L (no) 1991-09-23
ES2084052T3 (es) 1996-05-01
CN1055010A (zh) 1991-10-02
CA2038888A1 (en) 1991-09-23
JPH07106157B2 (ja) 1995-11-15
PT97093A (pt) 1991-11-29
HU910953D0 (en) 1991-10-28
DE4009268A1 (de) 1991-09-26
KR920018217A (ko) 1992-10-21
PT97093B (pt) 1998-08-31
BR9101104A (pt) 1991-11-05
NO308543B1 (no) 2000-09-25
NZ245885A (en) 1993-11-25
EP0448093A3 (en) 1991-12-04
IE71174B1 (en) 1997-01-29
FI911009A (fi) 1991-09-23
ATE135042T1 (de) 1996-03-15
ZA912013B (en) 1991-12-24
NO911137D0 (no) 1991-03-21
IL97323A (en) 1997-01-10
EP0448093A2 (de) 1991-09-25
CA2038888C (en) 1998-12-29
US5919895A (en) 1999-07-06
GR3019946T3 (en) 1996-08-31
PH30485A (en) 1997-05-28
CN1067104C (zh) 2001-06-13
IE910738A1 (en) 1991-09-25
AU7368091A (en) 1991-10-03
DE59107495D1 (de) 1996-04-11
IL97323A0 (en) 1992-05-25
DK0448093T3 (da) 1996-04-09
AU640212B2 (en) 1993-08-19
JPH04211391A (ja) 1992-08-03
HUT59962A (en) 1992-07-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2118365C1 (ru) Производное гирудина, действующее как ингибитор тромбина, рекомбинантная днк, кодирующая производное гирудина, и способ его получения
US4769326A (en) Expression linkers
JP3085973B2 (ja) 組換え酵母による成熟タンパク質の分泌に関するシグナルペプチドについてコードする配列として新規ｄｎａ断片の適用、発現カセット、形質転換酵母及びそれに対応するタンパク質の製造方法
KR920007666B1 (ko) 변형된 섬유소 용해제의 제조방법
US5391490A (en) Ubiquitin-specific protease
AU673870B2 (en) Hirudin mutant, production thereof, anticoagulant, secretory vector, and production of product from said microorganism
WO1991018101A1 (fr) Procede de production d'une proteine
KR100858833B1 (ko) 효모에 의해 분비되는 재조합 단백질의 제조를 위한,ｎ-말단 부분이 히루딘 유도체인 융합 단백질의 용도
US7455987B1 (en) Signal sequences for preparing leu-hirudin by secretion by E. coli into the culture medium
CA2438935C (en) Supersecretable peptides, processes for their production, and parallel improvement of the secreted form of one or more other polypeptides
AU2002247696A1 (en) Use of supersecretable peptides in processes for their production and for parallel improvement of the exported forms of one or more other polypeptides
US6514730B1 (en) Secretion of hirudin derivatives
KR930003913B1 (ko) 트롬빈 억제 활성을 갖는 폴리펩티드 및 그의 제조방법
PT607080E (pt) Nova sequencia pro que permite a secrecao de proteinas heterologas a partir de uma celula de levedura
JPS63301793A (ja) ストレプトミセス菌類における外来性タンパク質の製造法
RU2130071C1 (ru) Вектор секреции для получения гирудина hv1 (варианты), рекомбинантный штамм escherichia coli - продуцент гирудина hv1 и способ его получения

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20060322