JPS63301793A - ストレプトミセス菌類における外来性タンパク質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 公開番号第０．１６１，６２９号の欧州特許出願（ＥＰ
−Ａ）明細書および南アフリカ共和国特許第８５７３６
７２号明細書には、ストレプトミセス菌類（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｔｅｓ）の細胞にポリペプチド、とくにテ
ンダミスタット、を分泌させるための、α−アミラーゼ
阻害剤テンダミスタットのシグナルペプチド（プレペプ
チド）をコードするＤＮＡの使用が開示されている。適
当なりＮＡは、原理的には、テンダミスタットを産生ず
るいかなる株からでも得ることができるが、独国特許公
開第３．３３１，８６０号明細書の例３と同様にして得
られるＤＮＡを用いるのが好ましい。

特許出願（独国特許出願第ｐ　３７０７１５０．５．１
９８７年３月６日出願のものに対応）には、コード配列
（必要であれば修飾しておく）を取り込むこと、および
組み込み遺伝子をストレプトミセス菌類細胞で発現する
ことからなる、ストレプトミセス菌類からの融合タンパ
ク質の分泌域が既に提案されている。このように、この
場合には、テンダミスタット構造遺伝子は他の遺伝子の
ための「担体（ｃａｒｒｉｅｒ）　Ｊとして用いられて
、１拝られる融合タンパク質はテンダミスタットのアミ
ノ酸配列の中に位置する他のタンパク質のアミノ酸配列
を含有している。したがって、この融合タンパク質を化
学的または酵素的に切断して他のタンパク質を遊離させ
ると、２＠のテンダミスタット部分配列物が得られろ。

上記の特許出願は、また、テンダミスタット誘導体にも
関し、著しく短縮されたアミノ酸鎖を有する誘導体をも
含んでいることが了解される。このタイプの誘導体は、
可逆的に、競合的阻害メカニズムのかたちで特異的レセ
プターと反応することができる。

外来性タンパク質は、また、テンダミスタット遺伝子（
必要であれは修飾しておく）のくコード鎖の）３“末端
に所望のタンパク質の構造遺伝子を結合させた融合タン
パク質遺伝子を構築して、これを用いてストレプトミセ
ス閉成中で調製されるということが、見出された。テン
ダミスタット遺伝子の修飾としては、とくにＣ末端の短
縮などがある。

テンダミスタットをコードするＤＮＡは、ＥＰ−Ａ第０
．１６１，６２９号明細書に示されている（ＤＮＡ配列
Ｃとして、添付の表１に）。この構造遺伝子は、数個の
制限酵素切断部位を含んでおり、これを用いて、コード
するアミノ酸配列を修飾することができる。適当な切断
部位としては、トリブレット３１および３２領域のＢｓ
ｔＥＩＩ切断部位、トリブレット４３および４４領域の
５ｔｕｌ切断部位、およびトリブレット５２および５３
領域のＳ　ａ　ｕ　３Ａ切断部位がある。適当な。

リンカ−を紺み入れることによってこれらの部位に一つ
以上の追加アミノ酸を挿入すること、これらの切断部位
間のＤＮＡセグメントを削除すること、あるいは停止コ
ードンを組み入れることによって短縮したアミノ酸配列
をコードすることが可能である。さらに、部位特異的（
ｓｉｔ、ｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）突然変異によって、所
望のアミノ酸の挿入、置換または削除が可能である。こ
のようにして得られたタンパク質は、α−アミラーゼ阻
害活性を有するか、あるいはこの活性は有しないけれと
も対応するレセプターとはなお反応する。

本発明は、また、適当な遺伝子構造物、これら遺伝子構
造物を含有するベクター、これらベクターで形質転換さ
せたストレプトミセス菌類細胞、分泌された融合タンパ
ク質、および外来性タンパク質およびテンダミスタット
誘導体の製造のためのこれらの使用、に関する。本発明
の好ましい態様は、以下に詳細に説明され、特許請求の
範囲に定義される通りである。

第１−４図は、本発明に係るプラスミドのいくつかの構
築を示す、説明図である。

第１図は、複合プラスミドｐ　Ｋ　ｉ＜　３１０の調製
過程を示す。この複合プラスミドは、テンダミスタット
アミノ酸配列の部分に７個のアミノ酸のブリッジ員子が
続き、その後にモンキープロインシュリンのアミノ酸配
列が続いてなる、融合タンパク質をコードする。

第２図は、プラスミドｐＫＫ３１０を出発材料とした発
現プラスミドｐＴＦ１の構築を示す。

第３図は、テンダミスタット遺伝子の部分にｐ　ＵＣ１
８からのポリリンカーが続いて位置しているプラスミド
ｐＲｓ１０の構築、およびこの［）ＲＳＩＯの発現プラ
スミドｐＴＦ１０への再構築を示す。　ｒｍｃｓＪは、
ｐＵｃｌＢのポリリンカー領域（マルチブルクロンーニ
ングサイト）を表す。

最後に、第４図は、プラスミドｐ　Ｋ　Ｋ　４００の調
製方法およびその発現プラスミドｐＧＦ　１への再構築
を示す。このプラスミドｐ　Ｋ　Ｋ　４００は、チンダ
ミスタットの全アミノ酸配列に１１個のアミノ酸のブリ
ッジ貰子が続き、その後にモンキープロインシュリンの
アミノ酸配列が続いてなる、融合タンパク質をコードす
る。

なお、諸図面は、正しい比例尺で示されたものではない
。

本発明の方法によって細胞から放出されて得られる融合
タンパク質は、培養濾液から容易に単離することができ
るという利点を有する。その単離は既知の方法で行うこ
とができるが、吸着またはイオン交換クロマトグラフィ
ーおよび／またはゲル濾過によって行うのが有利である
。

同様に、既知の方法で、所望の外来性タンパク質（融合
相手）を酵素的または化学的切断によって遊離させる。

この点については、切断のタイプは、とくに所望のタン
パク質のアミノ酸配列による。多くの場合、テンダミス
タット配列と所望のタンパク質のアミノ酸配列との間の
切断部位に、連結員子すなわちブリッジ貰子を組み入れ
ることが有利であろう。所望のタンパク質が、例えば、
メチオニンを含有しない場合には、連結員子はＭｅｔで
表され、それから塩化シアンまたは臭化シアンによる化
学的切断が行われる。連結員子がカルボキシル末端シス
ティンを有する場合、または連結員子がＣｙｓである場
合には、システィンに特異的な酵素による切断または、
例えば特異的Ｓ−シアニレ−ジョンの後に化学的切断を
行うことが可能である。ブリッジ貰子がカルボキシル末
端トリプトファンを有する場合、または連結員子がＴｒ
ｐである場合には、Ｎ−プロモサクシンイミドによる化
学的切断を行うことができる。

所望のタンパク質がそのアミノ酸配列中にＡｓｐ−Ｐｒ
ｏを含まず、かつ、酸に対して充分に安定である場合に
は、このブリッジ貰子でタンパク質を融合させれば既知
の方法にて蛋白分解反応で切断することができる。その
結果、Ｎ末端にプロリンを有し、Ｃ末端にアスパラギン
酸を有するタンパク質が得られる。このようにして、修
飾タンパク質を合成することも可能である。

このブリッジ貰子を（Ａｓｐ）　　−ＰｒｏまたはＧｌ
ｕ−（Ａｓｐ）　　−Ｐｒｏにすることによって、Ａｓ
ｐ−Ｐｒｏ結合を酸に対して一層不安定にすることがで
きる。なお、ｎは１〜３の整数を表す。

酵素的切断の例も開示されており、改善された特異性を
有する修飾された酵素を用いることも可能である（Ｃ０
Ｓ、　Ｃｒａｉｋら：　５ｃｉｅｎｃｅ　２２ｉｉ（１
９８５）２９１−２９７を参照されたい）。所望の真核
細胞ペプチドがプロインシュリンの場合には、トリプシ
ンによって除かれるアミノ酸（ＡｒｇまたはＬｙｓ）が
プロインシュリンのＮ末端アミノ酸（Ｐｈｅ）に結合し
ているペプチド配列物、例えばＡｌａ−Ｓ　ｅ　ｔ−Ｍ
ｅ　ｔ−Ｔｈ　ｒ−Ａｒ　ｇ、を選択すれば、蛋白分解
酵素トリプシンを用いるアルギニン特異的切断を行うこ
とができるので有利である。

所望タンパク質がアミノ酸配列 １１　ｅ−Ｇ　ｌ　ｕ　−Ｇ　ｌ　ｙ−Ａｒ　ｇを含ま
ない場合には、この配列に対応するブリッジ貰子を含有
する融合タンパク質を、因子Ｘａによって切断すること
ができる（Ｅ　Ｐ　−Ａ第０．０２５，１９０号明細書
および第０．１６１，９７３号明細書）。

切断産物の単離法は、これらタンパク質の性質による。

テンダミスタットおよびその誘導体の単離法については
、強国特許公開第３，３３１，８６０号明細書に引用さ
れた文献が参照されよう。

本発明は、次の諸例によって詳細に説明される。

とくに記載がない限り、パーセント表示は重量表示であ
る。諸例中の番号は、それぞれ同番号を付した図面と対
応する。

例１： 出発材料としては、プラスミドｐＫＡＩ６５０を用いた
。このプラスミドについては、強国特許公開第３，５３
６，１８２号明＊＊およびＥＰ−Ａ第０．２１８，２０
４号明細書に記載がある。このプラスミドは、強国特許
公開第３，３３１，８６０号明細書に記載されているプ
ラスミドｐＫＡ１１から、６５０ｂｐＨｉｎｃＩＩ／５
ｓｔｌフラグメントの単離およびこれらの酵素で開環し
ておいたプラスミドｐＵｃ１９へのクローニングによっ
て、得ることができる。このプラスミド中の単一のＨｉ
ｎｄ■切断部位を（この酵素による切断、突出末端の埋
填および連結反応によって）除去することによってプラ
スミドｐＫＡＩ６５０ａ（１）が得られる。

ＣｓＣｌ濃度勾配遠心分離法によって精製した（１）の
ＤＮＡの２μｓを、Ｓ　ｔ　ＩＩ　Ｉを含む反応混合液
５０μｍ中で酵素製造者の指示に従って２時間で完全消
化させて、酵素はフェノール抽出によって除去する。直
線状にしたＤＮＡをエタノールで沈澱させて、再溶解さ
せて、５′末端を燐酸化しておいた化学合成の二本鎖オ
リゴヌクレオチド（２）０．１μｇを追加反応物として
加えた連結反応混合物に導入する。

■」一旦」Ｌ■− ５’　ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣ；Ｇ　　３’　　　（２
）３’ＧＧＧＴＴＣＣ；ＡＡＣＣＣ５’ 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　Ｊ　Ｍ
　１０９をこの連結反応混合物で形質転換させて、組換
えプラスミドｐＫＫ３ａ（３）を取り込んだクローンを
単離する。単離したプラスミドＤＮＡは、制限酵素Ｈｉ
ｎｄｍの切断部位を有しているので制限酵素による特徴
づけをすることができる。ｐ　Ｋ　Ｋ　３　ａ（３）は
、ｐＫＡＩ６５０ａ　（１）よりも塩基対１２個分だけ
長く、アミノ酸配列としてアミノ酸４個分が延長された
次の様なヌクレオチド配列を有する。

Ｇｌｕ　　Ｇｌｙ　　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　　Ｌｅｕ　Ｇｌ
ｙ　　Ｌｅｕ５’　　ＧＡＡ　　ＧＧ　ＣＣＣＡ　ＡＧ
ＣＴＴＧ　ＧＧ　ＣＣＴＧ　　３’３’　　ＣＴＴ　　
ＣＣＧ　ＧＧＴ　ＴＣＧ　　ＡＡＣＣＣＧ　　ＧＡＣ５
’１１ｉｎｄｌｌｌ 出発材料としては、他に、プラスミドｐＹＥ２４（４）
を用いる。このプラスミドは、ベクターｐＵＣ８をＥｃ
ｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで開環して、直線状にした
プラスミドにモンキープロインシュリンの遺伝子を連結
して、得られる（表２、Ｗａｔｅｋａｍら：　Ｇｅｎｅ
　Ｌｉ２（１９８２）　１７９−１８３を参照されたい
）。

２μｇのプラスミドｐＹＥ２４　（４）を制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩおよびＨｉｎｄｍと反応させて、モンキープロイ
ンシュリンの遺伝子を電気溶出によって単離し、エタノ
ール沈澱による精製濃縮の後に、これを合成りＮＡリン
カ−（５）と連結させる。

５″ＡＧＣＴＴＧ　ＡＴＧ　ＧＣＧ　　　　　３’３’
　　　　ＡＣＴＡＣＣＧＣＴＴＡ　Ａ　　５’　　　（
５）（Ｂｉｎｄｌ　ｌ　ｌ）　　　　（ＥｃｏＲｌ）連
結反応産物（６）を、ここで、Ｈｉｎｄ［Ｉで開環して
おいたプラスミドｐＫＩ（３ａ（３）に挿入して、その
結果、プラスミドｐＫＫ３１　（７）を得る。この構造
物は、テンダミスタット遺伝子のアミンｒ１１ｃＩｙ４
３のコードンの下流に次のようなブリッジ貰子を有する
ことになる。

３ＢＩ Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ａ
ｓｎ　Ｓｅｒ　ＰｈｅＧＧＣＣＣＡ　ＡＧＣＴＴＧ　Ａ
ＴＧ　ＧＣＧ　ＡＡＴ　ＴＣＴ　ＴＴＴＣＣＧ　ＧＧＬ
肛１ｃ　ＴＡＣＣＧＬＩＩ紅肛Ａ　ＡＡＡｌ（ｉｎｄｌ
ｌｌ　　　　　　ＥｃｏＲ１上記のおよび表２の「Ｂ１
」は、モンキープロインシュリンのＢ鎖の開始点を表す
。

プラスミド（７）において、プロインシュリン配列はテ
ンダミスタット遺伝子中に位置している。

このプラスミドを本発明のプラスミドに再構築するため
に、　（７）を５ｐｈＩおよび５ａｌＩで消化して、フ
ラグメント（８）を単離する。ベクタ−ｐＵｃＩ９を５
ｐｈｉおよび５ａｌｌで開環して得た直線状のプラスミ
ドを、フラグメント（８）と連結させる。その結果得ら
れるプラスミドｐＫＫ３１０（９）は、短縮したテンダ
ミスタット配列および上記のリンカ−にプロインシュリ
ン配列のみが続いてなる融合タンパク質をコードする。

全構築の過程を第１図に示す。

例２： 発現プラスミド中にプラスミドｐＩ（Ｋ３１０（９）を
再構築するために、　（９）を５ｓｔｌおよびＳｐｈ　
ｉと反応させて、フラグメント（１０）を単離する。

市販の発現ベクターｐ　Ｉ　Ｊ７０２　（１１）（Ｊｏ
ｈｎ　Ｉｎｎｅｓ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、　Ｎｏｒｗ
ｉｃｈ　　（英国）から入手可能）を５ｐｈＩおよび５
ｓｔＩで開環して得た直線状のプラスミド（１２）を、
フラグメン）（１０）と連結させる。ストレプトミセス
・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌ　１ｖｉ
ｄａｎｓ）Ｔ　Ｋ　２４株（Ｊｏｈｎ　１ｎｎｅｓ　Ｆ
ｏｕｎｄａｔｉｏｎ）の形質転換の後、所望のクローン
をチオストレプトン耐性を選択指標として同定する。チ
オストレプトン耐性クローンからのプラスミドＤＮＡを
単離して、制限酵素分析によって調べる。遺伝子を所望
の位置方向に有しているプラスミドを、ｐＴＦｌ　（１
３）と称する。

この組換えプラスミドを含むクローンは、分子量１６ｋ
Ｄのタンパク質を培養培地中に分泌する。このタンパク
質は、インシュリン抗体との「イムノブロッティング」
反応で陽性を示す（例５を参照されたい）。

ｐＴＦｌ　（１３）の構築の過程を第２図に示す。

例３ニ プラスミドｐＫＫ３ａ（３）およびベクターｐＵｃ１Ｂ
の各々を別個にＨｉｎｄｍで開環したものを、−緒に連
結させる。連結反応混合物を大腸菌ＪＭＩ　０９株の形
質転換に用いる。クローニングが成功したことが、イソ
プロピル−β−チオ−ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）
および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−
Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）の存在下で形成
される無色のコロニーによって示される。結果として得
られた組換えプラスミドｐＲｓ１　（１４）を既知の方
法で単離する。このプラスミド１１１ｇを制限酵素５ｓ
ｔｒで消化して再連結させると、ポリリンカー配列（ｍ
ｃｓ）およびテンダミスタット遺伝子の残りの部分以外
の、ｐ　ＵＣ１８部分が欠失する。このようにしてプラ
スミドｐＲｓ１０（１５）が得られる。

プラスミド（１５）は、ポリリンカ一部分を含有してい
るので、いかなる所望の構造遺伝子のクローニングにも
適している。結果として、短縮したテンダミスタット配
列を含有する対応融合タンパク質をコードするプラスミ
ドができる。

ｐＲ５１０（１５）を５ｐｈｉおよび５ｓｔＩて消化し
て、単離した小さい方のフラグメントを例２と同様にし
て発現ベクターｐＩＪ７０２に連結することができる。

このようにして、発現ベクターｐＴＦ　１０　（１６）
が得られる。同様にこのプラスミドもポリリンカ一部分
を含有するので、多能な構造物となっている。

ｐＴＦｌＯ（１６）の構築の過程を第３図に示す。

例４ニ プラスミドｐＹＥ２４　（４）をＥｃｏＲＩで開環して
、リンカ− ５’　ＡＡＴ　ＴＣＡ　ＡＧＣＴＴＧ　　　　３’３’
　　　　ＧＩｆｆｌ鉦ハＣＴＴＡ　Ａ　５’（ＥｃｏＲ
ｌ）　　旧ｎｄｌｌｌ　（ＥｃｏＲｌ）を挿入して、プ
ラスミドｐＹＥ２４１を得る。これをＨｉｎｄｌｌｌで
切断し、Ｈｉｎｄｍで切断しておいたｐＫＫ３ａ　（３
）に連結して、例１と同様にしてプラスミドｐ　Ｋ　Ｋ
　３２を得る。このプラスミドは、テンダミスタット配
列物が次のようなブリッジ貰子によってプロインシュリ
ンに結合してなる融合タンパク質をコードする。

Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ａ
ｌａ　ＡｒｇＧＧＣＣＣＡ　　ＡＧＣＴＴＧ　　ＡＡＴ
　　ＴＣＴ　　ＧＣＡ　　ＡＧＡ　　ＴＴＴＣＣＧ　Ｇ
ＧＴ　　ＴＣＧ　ＡＡＣＴＴＡ　　ＡＧＡ　　ＣＧＴ　
ＴＣＴ　ＡＡＡ例１と同様にして、ｐＫＫ３２を５ｐｈ
Ｉおよび５ｓｔｌで切断し、約６５０ｂｐの大きさのフ
ラグメントを、これら酵素によって開環しておいたｐＵ
ｃ１９でクローニングする。結果として得られるｐ　Ｋ
　Ｋ　３２０は、上記のブリッジ貰子を別にすると、プ
ラスミドｐＫＫ３１０　（９）（リンカ−によって導入
された配列は太線で強調されている）に対応するもので
ある。

例２と同様にして、Ｉ）　Ｋ　Ｋ　３２０からの組換え
遺伝子を有する５ｓｔｌ−５ｐｈＩフラグメントをｐｌ
Ｊ７０２でクローニングして、その結果、発現プラスミ
ド［）ＴＦ２が得られる。１６ｋＤの融合タンパク質が
、ストレプトミセス・リビダンスＴ　Ｋ　２４で発現さ
れて分泌される。このタンパク質はインシュリン抗体と
反応する（例５を参照されたい）。

ｐＴＦ２の構築は、第１図および第２図に示したｐＴＦ
ｌ　　（１３）の構築と相似しているために、図示され
なかった。

例５： ｐＫＫ３１０（９）の２個のＥｃｏＲｆ切断部位のうち
の１個のみを開環させるように、ＥｃｏＲＩにて部分消
化を行う。突出末端をクレノウボリメラーゼを用いて埋
填した後、プラスミドを再連結して、その結果を制限酵
素分析にて調べる。プロインシュリン遺伝子の末端に位
置しているＥｃｏＲ１部位が除去されてなる所望のプラ
スミドを、ｐＫＫ：３１０ａ　（１７）と称する。した
がって、このプラスミドは、短縮したテンダミスタット
遺伝子とプロインシュリン遺伝子との間のリンカ−領域
に、ＥｃｏＲＩの唯一の切断部位を含有している。

完全なテンダミスタット配列を有する融合タンパク質を
コードするプラスミドを構築するために、テンダミスタ
ットをコードするＤＮＡ１！ｆｆ［！列（表１）のアミ
ノ酸６８／６９のコードン領域に、単一のＫ　ｐ　ｎ　
Ｉ切断部位を導入する。すなわち・ｐＫＡＩ６５０ａ（
１）を５ｓｔｌおよびｓｐｈ　Ｉで消化してＤＮＡフラ
グメントを単離して、６５０　ｂｐの大きさのフラグメ
ントを、これら２種の酵素で同様に消化しておいたファ
ージＭｌ　３ｍｐ　１８　　ＲＦ　　ＤＮＡでクローニ
ングして、既知の方法にて一本鎖ＤＮＡを調製する。こ
の５ｓＤＮＡ１ａｇを、変異原性「ブライマー」５’　
（ＧＡＧ　ＧＴＡ　ＣＣＧ　ＧＧＣＧＴ　　３’０．１
ａｇとともに部位特異性突然変異に用いる（Ｍ、　ｊ、
　ＺｏｌｌｅｒおよびＪ、　Ｓｍ１ｔｈ：　Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ　Ａｃ１ｄＲｅｓ、Ｌｆｌ　　（１９８２）６４８
７−６５００）。

突然変異遺伝子を有する単離Ｍ１３クローンから単離し
たＲＦ　　ＤＮＡは、追加のＫ　ｐ　ｎ　Ｉ切断部位に
よって選択することができ、また、塩基の交（灸（Ａｒ
ｇ６８のコードンの３番目のＧがＣに）が配列決定によ
って確認されろ。このように、ヌクレオチドの交換は、
アミノ酸配列には変化を及ぼさないが、所望の新たな単
一切断部位をテンダミスタット構造遺伝子中に導入する
。

Ｈｉ　ｓ　Ａ　ｌ　ａ　Ａ匡」五１ｅｕＣＴＣＧＣＣＣ
ＧＣＴＡＣＣＴＣ ＧＴＣＣＧＧ　ＧＣＣＡＴＣＧＡＧ ｐｎ　１ ＳｓｔＩ−３ｐｈＩ消化の後、突然変異配列物はＭ１３
ｍｐ１８　　ＲＦ　　ＤＮＡからブラスミ！・ｐＵｃ１
９に移されてそこでクローニングされて、その結果、ｐ
ｌ＜Ａｌ６５１　（１Ｂ）が得られる。

例２と同様にして、　（１８〉からのＧ５０ｂｐＳｓｔ
Ｉ−５ｐｈｌ挿入物がプラスミドｐｌＪ７０２に組み込
まれているのを確認して、その結果、プラスミドｐＡＸ
６５１が得られろ。このプラスミドを用いてストレプト
ミセス・リビダンスＴＫ２４を形質転換させる。得られ
たテンダミスタットの発現収率は、非（１蒼飾のテンダ
ミスタット遺伝子を含有するブラスミｌ”ｐＡＸ６５０
（伸開特許公開第３，５３６，１８２号明細書の第３図
）と同じである。

本発明の方法によって、テンダミスタットの全アミノ酸
配列を含有する融合タンパク質のためのプラスミドを調
製するために、プラスミドｐＫＡＩ６５１　（１Ｂ）を
ｓｐｈ　ＩおよびＫ　ｐ　ｎ　Ｉで消化して、小さい方
のフラグメントを、リンカ−（１９） ６９　　ＴＯ７１７２７３７４ （Ｔｙｒ）Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　
Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｍｅｔ５’　　　　ＣＴ（１
：　ＧＣＴ　ＣＧＣＴＧＣＣＴＴ　ＴＴＣＡＡＴ　ＧＣ
Ｇ　ＡＴＧ３’ＣＡＴＧ　ＧＡＧ　ＣＧＡ　ＧＣＧ　Ａ
ＣＧ　ＧＡＡ　ＡＡＧ　ＴＴＡ　ＣＧＣＴＡＣ（Ｋｐｎ
ｌ） Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　　　　３’ ＧＣＣＡＣＣＧＧＧ ＣＧＧ　ＴＧＧ　ＣＣＣＴＴＡ　Ａ　５’　　　　　　
　（１９）（ＥｃｏＲＩ） および５ｐｈｌおよびＥｃｏＲＩて開環しておいたプラ
スミドｐＫＫ３１０ａ　（１７）に連結させる。

連結反応混合物を用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換さ
せて、プラスミドＤＮＡを単離して、正しい融合をＤＮ
Ａ配列決定によって検出する。正しい配列を有するプラ
スミドをｐ　Ｋ　Ｋ　４００（２０）と称する。

リンカ−（１９）は、テンダミスタットの残りのアミノ
酸だけではなくテンダミスタットおよびプロインシュリ
ン遺伝子を互いに分離させるスペーサ一部分もコードす
るものであって、表２に示すような５′末端の遺伝子を
含む次のｉ１個のアミノ酸のコードンを全体で包含して
いる。

Ｐｈｅ−Ａｓｎ−Ａ　ｌａ−Ｍｅｔ−Ａ　Ｉ　ａ−Ｔｈ
ｒ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ａｓｎ−５ｅｒ−Ａ　Ｉａ−Ａｒｇこ
のように、融合タンパク質はこのスペーサー中に、なか
でもハロゲン化シアンまたはトリプシンによって切断す
ることができるアミノ酸メチオニンおよびアルギニンを
含有している。

約１０９０ｂｐの挿入物をプラスミドｐ　Ｋ　Ｋ２Ｏ２
（２０）から５ｓｔＩおよび５ｐｈＩの二重消化によっ
て単離して、そのＤＮＡを、同じ酵素によって開環して
おいたプラスミドｐＩＪ７０２（１２）に連結させる。

その結果、プラスミドｐＧＦｌ（２１）が得られる。連
結反応物でストレプトミセス・リビダンスＴ　Ｋ　２４
を形質転換させて、プラスミドＤＮＡをテンダミスタッ
ト活性を有するチオストレプトン耐性形質転換体から単
離する。全ての陽性クローンは、１０９０ｂｐの大きさ
のｐＧＦＩ　　５ｓｔＩ−Ｓｐｈｌ挿入物を含有してい
る。

ｐＧＦｌ　（２１）の構築の過程を第４図に示す。

テンダミスタット活性は、ＥＰ−ＡＩＩＯ２１６１，６
２９号明細書の例３および強国特許公開第３．５３６，
１８２号明細書の例２に記載されているプレートアッセ
イ法によって決定する。

ｐＧＦ　１によってコードされている融合タンパク質は
、既知の方法にて発現させることができる。

形質転換させたストレプトミセス・リビダンスＴ　Ｋ　
２４株を振どうフラスコにて２８℃で４日間培養して、
遠心分離によって菌糸体を培養液から除去して、上澄溶
液の融合タンパク質を次のようにして検出することがで
きる。

１０〜１００μｍの溶液を２０〜２００μｍの１５％ト
リクロル酢酸と混合し、沈澱したタンパク質を遠心分離
によフて濃縮し、洗浄して、ＳＤＳを含む試料緩衝液（
Ｕ、　Ｌａｅｍｍｌｉ：　Ｎａｔｕｒｅ１１７　（１９
７０）　６８０−６８５）に移す。９０℃で２分間イン
キュベートした後、試料を１０〜１７％ＳＤＳポリアク
リルアミドゲル上の電気泳動によって分離する。分子量
１９ｋＤ、すなわち、テンダミスタットおよびプロイン
シュリンからなる融合タンパク質に期待される分子量範
囲の分子量を有するタンパク質が得られる。この融合タ
ンパク質は、テンダミスタットに・対する抗体およびイ
ンシュリンに対する抗体の両方と反応する。

表１ テンダミスタットのＤＮＡ配列（コード鎖）およびアミ
ノ酸配列 ５ｌ−ｃｈｃ　ＡＣＣ；　ＡＣＣにＴＣＴＣＣｃＡｃ　
ＣＣＣＣＣＡ　ＣＣＣ４ｃｃ　ＴにＧＣＧＴＧＮＨ−Ａ
ｓｐ　Ｔｈｒ　Ｔｌ１ｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｐ
ｒｏ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｖａ１ＡＣＧ
　ＣＴＣＴＡＣＣＡＧ　ＡＧＣＴＧＧ　ＣＧＧ　ＴＡＣ
ＴＣＡ　ＣＡＧ　ＧＣＣＣＡＣＴｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ
　にｉｎ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　
Ｇｉｎ　Ａｌａ　ＡｓｐＡＡＣＧＧＣＴＧＴ　ＧＣＣＧ
ＡＧ　ＡＣＧ　ＧＴＧ　ＡＣＣＧＴＧ　ＡＡＧ　ＧＴＣ
にＴＣＡｓｎ　Ｃ１ｙ　Ｃｙｓ　Ａｉｍ　Ｇｌｕ　Ｔｈ
ｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｖａｌ
ＴＡＣＧＡＧＧＡＣＣ；ＡＣＡＣＣＧＡＡ　ＧＧＣＣＴ
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ＣＡＣ；　ＡＴＣＡＣＣＡＣＣＧＴＣｃｃｃ　ＧＡＣ（
１；ＧＣ”ｘ＞ｃＡｌａ　Ｐｒｏ　Ｃ１ｙ　にｉｎ　Ｈ
ｌｓ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　にＧｌｙ　Ａｓｐ　に
Ｇｌｙ　ＴｙｒＡＴＣＣ；Ｃ；ＣＴＣＧ　ＣＡＣＧＧＣ
ＣＡＣＧＣＧ　ＣＧＣＴＡＣＣＴＣ；　ＣＣＴ　ＣＧＣ
ｌｌｅ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｈｌｓ　にＧｌｙ　Ｈｌｓ　
Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｉ、ｅｕ　Ａｌａ　ＡｒｇＴ
ＧＣＣＴＴ　ＴＡＧ−３’ Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｓｔｐ 表２ Ｂ１、ＣＩおよびＡ１は、各々、モンキープロインシュ
リンのＢ、　　ＣおよびＡ鎖の開始点を示す。

【図面の簡単な説明】

第１図は、複合プラスミドｐ　Ｋ　Ｋ　３１０の構築を
図示する、説明図である。 第２図は、発現プラスミドｐＴＦ１の構築を図示する、
説明図である。 第３図は、プラスミドｐＲｓｌＯの構築およびこのプラ
スミドの発現プラスミドｐＴＦ　１０への再構築を図示
する、説明図である。 第４図は、プラスミドｐ　Ｋ　Ｋ　４００の構築および
このプラスミドの発現プラスミドｐＧＦ１への再構築を
図示する、説明図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、所望のタンパク質の構造遺伝子をテンダミスタット
   遺伝子（テンダミスタット遺伝子は修飾されたものでも
   よい）のコード鎖の３′末端に結合させ、この遺伝子構
   造物の発現をストレプトミセス菌類（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
   ｙｃｅｔｅｓ）の宿主細胞で行わせ、分泌された融合タ
   ンパク質を上澄液から分離することを特徴とする、融合
   タンパク質の製造法。 ２、結合を、短縮したテンダミスタット遺伝子の３′末
   端で行わせる、請求項１に記載の製造法。 ３、３′末端に追加の他のタンパク質の構造遺伝子が結
   合してなるテンダミスタット遺伝子（修飾されたもので
   もよい）を含む、遺伝子構造物。 ４、テンダミスタット遺伝子がその３′末端において短
   縮されている、請求項３に記載の遺伝子構造物。 ５、請求項３または４に記載の遺伝子構造物を含む、ベ
   クター。 ６、請求項５に記載のベクターを含む、ストレプトミセ
   ス菌類の細胞。 ７、テンダミスタット（修飾されたものでもよい）部分
   のＮ末端部分のみを有する、融合タンパク質。 ８、請求項７に記載の融合タンパク質を切断することを
   特徴とするテンダミスタットまたは修飾されたテンダミ
   スタットおよび追加の他のタンパク質の製造法、または
   、追加の他のタンパク質が該融合タンパク質の融合相手
   である、請求項１または２に記載のようにして得られて
   なる融合タンパク質の製造法。