PT87400B

PT87400B - Processo para a preparacao de proteinas estranhas em estreptomicetes e de estruturas geneticas uteis para essa preparacao

Info

Publication number: PT87400B
Application number: PT87400A
Authority: PT
Inventors: Klaus-Peter Koller; Gunther Johannes Riess
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1987-05-05
Filing date: 1988-05-04
Publication date: 1992-09-30
Also published as: DK241688D0; IL86277A0; EP0289936A3; DE3714866A1; NO881942D0; FI97549C; KR970001235B1; DE3884261D1; JPS63301793A; AU1555988A; CA1338338C; ATE94905T1; ES2045004T3; HU204094B; FI882059A; AR241658A1; FI882059A0; FI97549B; NZ224464A; NO881942L

Description

É conhecida a partir do pedido de patente europeia com o número de publicação (EP-A) 0 161 629 ou a partir da patente sul africana 85/3672 a utilização de ADN que codifica para o peptídeo de sinal (pré-peptídeo) inibidor de c(-amilase tendamistat a fim de excretar um polipeptídeo, especialmente o tendamistat, a partir de uma célula de um estreptomicete. O ADN correspondente pode, em princípio, ser obtido a partir de qual- I i quer estirpe produtora de tendamistat, de preferência, porém, !

i utilizando-se um ADN obtido de acordo com o exemplo 3 da publi- ί cação do pedido de Patente Alemã 3 331 860. !

No pedido de patente ..... (correspondente ao pedido !

de patente alemã P 37 07 150.5 de 6 de Março de 1987) foi já j j proposto um processo para excreção de proteínas de fusão a par- I tir de estreptomicetes, o qual se caracteriza por se integrar a sequência que codifica para a proteína desejada no gene de tendamistat eventualmente modificado e por se provocar a expressão do gene recombinante numa célula de estreptomicetes. Para este fim é utilizado também o gene estrutural de tentamistat como portador para um outro gene, obtendo-se deste modo proteínas de fusão, nas quais a sequência de ácidos aminados de outras

proteínas se encontra ordenada dentro da sequência de ácidos ^!aminados de tendamistat. Na cisão química ou enzimática destas proteínas de fusão para libertação das outras proteínas, obtêmse, consequentemente, duas sequências parciais do tendamistat. 0 pedido de patente anteriormente mencionado está relacionado também com derivados de tendamistat, entre os quais se compreendem também, entre outros, os derivados com cadeias de ácidos | aminados significativamente encurtadas. Tais derivados podem ; reagir de maneira reversível com os receptores específicos sob a forma de um mecanismo de inibição competitivo. ί

Foi agora verificado que também podem ser obtidas proteínas estranhas em estreptomicetes por meio da construção de genes para proteínas de fusão, nos quais o gene estrutural foi acoplado à proteína desejada na extremidade 3 (da cadeia de codificação) dos genes de tendamistat eventualmente modifica- i dos. A modificação do gene de tendamistat pode especialmente , ser constituída por um encurtamento na extremidade 3'.

ADN que codifica para tendamistat é reproduzido na EP-A-0 161 629 (sob a designação de sequência C de ADN e no anexo no Quadro 1). Neste gene estrutural encontram-se vários locais de corte para enzimas de restrição, os quais podem ser utilizados para a modificação de sequências de ácidos aminados codificados. São apropriados os locais de corte para BstEII no âmbito do tripleto 31 e 32, para Stul no âmbito do tripleto 43 e 44 bem como para Sau3A no âmbito do tripleto 52 e 53. Através da incorporação dos adaptadores correspondentes podem ser introduzidos nestes locais um ou vários ácidos aminados adicionais, podem ainda ser eliminados segmentos de ADN entre estes locais de corte ou podem-se codificar sequências de ácidos aminados encurtadas através da integração de codões de paragem. Assim podem ser intercalados, permutados ou eliminados ácidos aminados por meio de mutagénese específica para um local. Obtêm-se assim proteínas que mostram capacidades inibidoras de Ok-amilase, ou então proteínas sem esta capacidade, as quais, no entanto, reagem com os respectivos receptores.

A presente invenção diz ainda respeito às respectivas estruturas de genes, aos vectores contidos nestas estruturas de

I

genes, às células de estreptomicetes transformadas por meio destes vectores, às proteínas de fusão excretadas e ao seu emprego ! _z i para a preparação de proteínas estranhas e de derivados de ten- | damistat. As formas de concretização preferidas da presente I invenção são em seguida explicadas mais em pormenor e definidas nas reivindicações.

Nas Figuras 1 a 4 são apresentadas algumas construcções de plasmídeos de acordo com a presente invenção.

A Figura 1 mostra a preparação do plasmideo híbrido pKK310, o qual codifica para uma proteína de fusão na qual se segue a uma parte da sequência de ácidos aminados para tendamistat um elo de sete ácidos aminados e a este uma sequência de ácidos aminados da proinsulina de macaco. í

A Fig. 2 mostra a conversão do plasmideo pKK310 no ί plasmideo de expressão pTFl.

A Fig. 3 mostra a construção do plasmideo pRSIO, no j qual a uma parte do gene de tendamistat se segue o poliadaptador de pUC18, e a respectiva conversão no plasmideo de expressão pTFlO. mcs significa a região poliadaptadora (maltiple cloning site) do plasmideo pUC18.

A Fig. 4 mostra, finalmente, a construção do plasmídeo pKK400, o qual codifica para uma proteína de fusão, no qual a uma sequência global de ácidos aminados do tendamistat se segue um elo de onze ácidos aminados e a este a sequência de ácidos aminados da proinsulina de macaco, mostrando ainda a sua conversão no plasmideo de expressão pGFl.

As Figuras não estão desenhadas à escala.

AS proteínas de fusão segregadas pelas células de acordo com o processo da presente invenção apresentam a vantagem de poderem ser facilmente isoladas a partir do filtrado da cultura. 0 isolamento pode ser levado a efeito de acordo com técnicas conhecidas em si, convenientemente por meio de cromatografia de adsorção ou de permuta iónica e/ou de filtração em gel.

A libertação da proteína estranha à célula pretendida (componente de proteína de fusão) é efectuada por meio de separação enzimática ou química igualmente de acordo com técnicas conhecidas em si.

tipo de separação utilizado para esse fim depende , ί principalmente da sequência de ácidos aminados da proteína pretendida. Em muitos casos é conveniente integrar um elo de ligação ou um elo de ponte no local de cisão entre a sequência de tendamistat e a sequência de ácidos aminados da proteína pretendida. Quando a proteína pretendida não contém, por exemplo, > qualquer metionina, o elo de ligação pode significar uma Met, ; sendo então a cisão química feita por meio de cloreto ou de bro-| meto de cianogénio. Quando no elo de ligação se situa uma cisteína carboxi-terminal ou o elo de ligação representa Cys, pode fazer-se uma cisão enzimática específica para cisteína ou uma cisão química, por exemplo após S-cianilação específica. Quan- | do existe um triptofano carboxiterminal no elo de ponte ou o ' elo de ligação significa Trp, pode efectuar-se uma cisão química com N-bromossuccinimida,

As proteínas desejadas que não contêm na sua sequência de ácidos aminados Asp - Pro e que são suficientemente estáveis perante ácidos podem ser cindidas por via proteolítica como proteínas de fusão com este elo de ponte de modo conhecido em si. Deste modo são obtidas proteínas que contêm uma prolina N-ter- ’ minai ou um ácido aspártico C-terminal. Desta maneira também podem ser sintetizadas proteínas modificadas.

A ligação Asp-Pro pode também ser tornada lábil perante os ácidos quando este elo de ponte significa (Asp)_n~Pro ou Glu-(Asp) -Pro, sendo η 1 a 3.

n

São igualmente conhecidos exemplos de cisões enzimáticas, podendo ser utilizadas também enzimas modificadas com especificidade melhorada (ver C.S. Cra.ik et al., Science 228 (1985) 291-297). Quando o peptídeo pretendido eucariótico é proinsulina, é conveniente seleccionar uma sequência peptídica à qual está ligado um ácido aminado cindível por meio de tripsina (Arg ou Lys) no ácido aminado N-terminal (Phe) da proinsulina, por exemplo Ala-Ser-MetQuando a proteína pretendida não contém a série de ácidos aminados

é possível cindir a proteína de fusão com o correspondente elo de ponte com o factor Xa (EP-A 0 025 190 e 0161 973).

O isolamento do produto de cisão depende das propriedades desta proteína. Com respeito ao isolamento de tendamistat e dos seus derivados é possível referir-se como literatura ! a publicação de pedido de Patente Alemã 3 331 860. I

Nos exemplos que se seguem elucida-se a presente in- ί venção mais em pormenor. Sempre que nada em contrário for indicado, os dados em percentagem referem-se a peso.

Os exemplos são ilustrados por meio das figuras com os mesmos números. Nas figuras os plasmideos e fragmentos de genes não estão representados à escala; especialmente na sequência dos poliadaptadores a escala está dilatada.

Exemplo 1

Para material de partida utiliza-se o plasmideo pKAl65() descrito na publicação de pedido de Patente Alemã 3 536 182 e na EP-A 0 218 204. Este plasmideo pode ser obtido a partir do pias-mídeo pKAIl descrito na publicidade de pedido de Patente Alemã 3 331 860 por meio de isolamento do fragmento Hinc-SstI de 650 pb e clonagem no plasmideo pUC19 aberto com as mesmas enzimas. Neste plasmideo é retirado o local singular de corte HindIII ! (por meio de corte com as mesmas enzimas, preenchimento das extremidades desalinhadas e ligação), obtendo-se assim o plasmídeo pKAl650a (1).

Digerem-se completamente durante 2 horas com Stul 2 pg de ADN de (1) purificado por meio de centrifugação de gradiente com CsCl num volume de 50 μΐ de acordo com as instruções do j fornecedor e despreza-se a enzima por extracção com fenol. O ADN linearizado é precipitado com etanol, dissolvido novamente e retomado numa mistura de ligação, a qual é adicionada para reacção a 0,1 pg do oligonucleótido sintético de dupla cadeia (2) HindIII

5' CCCAAGCTTGGG 3' (2)

3' GGGTTCGAACCC 5'

desfosforilado na extremidade 5¹.

Após transformação de E. coli JM 109 com a mistura de , ligação são isolados os clones que contêm o plasmideo recombi- ; nante pKK3a (3). O ADN plasmídico isolado é reconhecido por um ;

I local de corte para a enzima de restrição HindIII, o que permi- j te uma caracterização por meio de análise de restrição. O plasmideo pKK3a (3) é maior em 12 pares de bases do que o plasmideo pKAl650a (1) e apresenta uma sequência de nucleótidos que corresponde ao seguinte alargamento da sequência de ácidos aminados em 4 ácidos aminados:

43 (44)

	Glu	Gly	Pro	Ser	Leu	Gly	Leu
5'	GAA	GG C	CCA	AGC	TTG	GG C	CTG	3
3'	CTT	CC G	GGT	TCG	AAC	CC G	GAC	5

HindIII

O plasmideo pYE24 (4) pode ser utilizado como um outro material de partida. Este plasmideo é obtido por abertura do vector pUCB com EcoRI e HindIII e integração neste plasmideo linearizado do gene da proinsulina de macaco (Quadro 2; ver We- | tekam et al., Gene 19 (1982) 179-183). i

Fazem-se reagir 2 ug do plasmideo pYE24 (4) com as enzimas de restrição EcoRI e HindIII, isola-se o gene da proinsulina de macaco por electroeluição e após purificação e concentra-

ção por precipitação com etanol liga-se	com o adaptador sinté-
tico de	ADN (5)
		5'	AGC TTG	ATG	GCG	3'
		3^r	AC	TAC	CGC	TTA A 5'	(5)
			(HindIII)			(EcoRI)

produto da ligação (6) é em seguida introduzido no plasmideo pKK31 (7) aberto com HindIII. Através desta construção cria-se em associação com o codão para o ácido aminado Gly 33 do gene de tendamistat o seguinte elo de ponte:

I

Gly Pro

GGC CCA

CCG GGT

I

Ser	Leu	Met	Ala	Asn	Ser	Phe
AGC	TTG	ATG	GCG	AAT	TCT	TTT
TCG	AAC	TAC	CGC	TTA	A GA	AAA

HindIII EcoRI

B 1 significa aqui - como no Quadro 2 - o início da cadeia B da proinsulina de macaco.

No plasmideo (7) encontra-se a sequência da proinsulina no interior do gene de tendamistat. A fim de transferir este plasmideo para um plasmideo de acordo com a presente invenção digere-se o plasmideo (7) com Sphl e Sall e isola-se o fragmento (8). 0 vector pUC19 é aberto com Sphl e Sall e o plasmídeo linearizado é ligado com o fragmento (8). 0 plasmideo pKK310 (9) deste modo obtido codifica para uma proteína de fusão na qual se segue ainda a sequência da proinsulina à sequência de ten damistat encurtada e ao adaptador que se segue.

A construção integral é apresentada na Figura 1.

Exemplo 2

A fim de transferir o plasmideo pKK310 (9) para um plasmideo de expressão, faz-se reagir (9) com SstI e Sphl e isola-se o fragmento (10).

Abre-se o vector de expressão comercial pIJ702 (11) (obtenível na John Innes Foundation, Norwich, Inglaterra) com Sphl e SstI e liga-se o plasmideo linearizado (12) com o fragmento (10). Após transformação da estirpe de Streptomyces lividans TK 24 (John Innes Foundation) determina-se qual o clone pretendido por selecção com respeito à resistência perante a tioestreptona. O ADN plasmídico dos clones resistentes à tioestreptona é isolado e verificado por meio de análise de restrição. Os plasmídeos com a orientação pretendida do gene receberam a designação pTFl (13). Os clones que contêm este plasmideo recombinante segregam uma proteína com o peso molecular de 16 KD no meio da cultura. Esta proteína dá reacção positiva com anticorpos de insulina em análise imunológica de mancha (ver Exemplo 5).

A construção do plasmideo pTFl (13) é apresentada na Figura 2.

Exemplo 3 plasmideo pKK3a (3) por um lado e o vector pUC18 por outro lado são abertos ambos com HindlII e são ligados entre si. Com o produto da ligação transforma-se E. coli da estirpe JM 109, verificando-se a clonagem bem sucedida na presença de isopropil-/B-tiogalactopiranosido (IPTG) e de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-^-D-galactopiranosido (X-gal) por meio da formação de colónias incolores. O plasmideo recombinante resultante pRSl (14) é isolado de acordo com técnicas conhecidas em si. Por meio da digestão de 1 μς do plasmideo com a enzima de restrição SstI seguida de nova ligação, suprime-se a fracção de pUC18 até à sequência do poliadaptador (mcs) bem como o resto do gene de tendamistat. Obtêm-se o plasmideo pRSIO (15).

O plasmideo (15) é adequado, em virtude da sua fracção de poliadaptador, para clonagem de qualquer estrutura génica, obtendo-se deste modo plasmideos que codificam para as correspondentes proteínas de fusão com as sequências de tendamistat encurtadas.

Por digestão do plasmideo pRSIO (15) com Sphl e SstI e isolamento do fragmento menor é possivel ligar este no vector de expressão pIJ702 de forma análoga à do Exemplo 2. Obtém-se deste modo o vector de expressão pTFlO (16) que igualmente permite construções variadas em virtude da sua fracção de poliadaptador.

A construção do plasmideo pTFlO (16) é representada na Figura 3.

Exemplo 4

Abre-se o plasmideo pYE24 (4) com EcoRI e integra-se o adaptador

5' AAT TCA AGC TTG 3'

3¹ GT TCG AAC TTA A 5¹ (EcoRI) Hind III (EcoRI)

Obtendo-se deste modo o plasmideo pYE241. Por corte ' com HindIII e ligação em pKK3a (3) cortado com HindIII obtém-se : de modo análogo ao Exemplo 1 o plasmideo pKK32. codifica para damistat está

Este plasmideo uma proteína de fusão na qual a sequência de tenligada à sequência da proinsulina através do seponte:

guinte elo de

43

Gly Pro Ser Leu Asn Phe Ala Arg

GGC CCA AGC TTG AAT TCT GCA AGA TTT

CCG GGT TCG AAC TTA AGA CGT TCT AAA

De modo análogo ao do Exemplo 1 corta-se o plasmideo

pKK32 com Sphl e SstI e clona-se o fragmento de cerca de 650 pb de dimensão no plasmideo pUC19 previamente aberto com as mesmas enzimas. O plasmideo resultante pKK320 corresponde ao plasmídeo pKK310 (9) até ao elo de ponte referido (no qual a sequência introduzida pelo adaptador está sublinhada por tipo mais forte).

De modo análogo ao do Exemplo 2 clona-se o fragmento SstI e Sphl com o gene recombinante do plasmideo pKK320 no plasmídeo pIJ702, obtendo-se deste modo o plasmideo de expressão expressa e segregada para o meio uma kd que reage com anticorpos de insulina pTF2. Em S. lividans é proteína de fusão de 16 (ver Exemplo 5).

Em virtude da similitude de construção dos plasmídeos pTF2 e pTFl (13), Figuras 1 e 2, prescinde-se da representação gráfica.

Exemplo 5

Digere-se parcialmente o plasmideo pKK310 (9) com EcoRI de modo a que apenas um dos dois locais de corte EcoRI seja aberto. Após preenchimento das extremidades desalinhadas por meio de polimerase de Klenow liga-se novamente o plasmideo e verifica-se o resultado por meio de análise de restrição, o plasmideo pretendido, no qual o local EcoRI existente na extremidade do gene da proinsulina foi eliminado, recebe a denominação pKK310a (17). Este plasmideo contém pois daqui em diante um local de restrição singular para EcoRI na região do adaptador

entre o gene de tendamistat encurtado e o gene da proinsulina. | i

Para a construção de um plasmideo que codifica para uma proteína de fusão com a sequência completa do tendamistat, ! introduz-se na sequência de ADN que codifica para o tendamistat (Quadro 1) no domínio dos codões para os ácidos aminados 68/69 um local de corte singular para Kpnl. Para este fim digere-se ( o ADN isolado de pKAl650a (1) com SstI e Sphl e clona-se o frag-| mento de 650 pb de dimensão no RF-ADN do fago M13mpl8 igualmente|

I digerido com as mesmas enzimas e prepara-se de acordo com méto- ; dos conhecidos o ADN de cadeia simples. Integra-se 1 pg deste ADNcs juntamente com 0,1 pg do iniciador mutagénico

5¹ C GAG GTA CCG GGC GT 3' numa mutagénese dirigida (M.J. Zoller e J. Smith, Nucleic Acid Res. 10 (1982) 6487-6500).

A partir do clone M13 isolado com o gene mutado, que pode ser seleccionado por meio do local de corte Knpl adicional, isola-se o RF-ADN e a alteração de base (C em vez de G na ter6 8 ceira posição do codão para a Arg ) é comprovada por sequenciação. A alteração de nucleótidos não causa portanto qualquer mudança na sequência de ácidos aminados mas permite a introdução do novo local de corte singular pretendido no gene estrutural do | tendamistat.

66	67	68	69	70
His	Ala	Arg Tyr	Leu
CAC	GCC	CGC	TAC	CTC
GTC	CGG	GCC	ATC	GAG

Kpnl

A sequência mutada é clonada no plasmideo pUC19 após digestão por SstI e Sphl do RF-ADN de M13mpl8, obtendo-se deste modo o plasmideo pKAl651 (18).

Para comparação integra-se a inserção SstI-Sphl de 650 pb de (18) no plasmideo pIJ702 de modo correspondente ao do Exemplo 2, obtendo-se o plasmideo pAX651. Após transformação de Streptomyces lividans TK 24 com este plasmideo obtém-se a mesma taxa de expressão para o tendamistat que para o plasmideo pAX650

com ο gene de tendamistat não alterado (publicação de pedido de Patente Alemã 3 536 182, Fig. 3).

Para a preparação de um plasmideo de acordo com a pre-i sente invenção para uma proteína de fusão com a sequência de á- i eidos aminados integral do tendamistat digere-se agora o piasmídeo pKAl651 (18) com Sphl e Kpnl e liga-se o fragmento menor J com o adaptador (19) í

69 70

71

72

73

74

1

(Tyr)Leu

Ala

Arg

Cys

Leu

Phe

Asn

Ala

Met

Ala

Thr

Gly 3f

5'

CTC

GCT

CGC

TGC

CTT

TTC

AAT

GCG

ATG

GCC

ACC

GGG

3 '

C ATG GAG

CGA

GCG

ACG

GAA

AAG

TTA

CGC

TAC

CGG

TGG

CCC TTA A5

(Kpnl) (19) (EcoRI) com o plasmideo pKK310a (17) aberto com SpHI e EcoRI.

Transforma-se E. coli JM 109 com a mistura de ligação, isola-se o ADN plasmídico e verifica-se a fusão correcta por meio de sequenciação. O plasmideo com a sequência correcta recebe a designação pKK400 (20).

O adaptador (19) não codifica apenas para os ácidos aminados restantes de tendamistat mas também para uma fracção espaçadora que separa o gene do tendamistat e o da proinsulina um do outro que abrange o conjunto - com a extremidade 5' do gene de acordo com o Quadro 2 - dos codões para os seguintes 11 ácidos aminados:

Phe-Asn-Ala-Met-Ala-Thr-Gly-Asn-Ser-Ala-Arg

A proteína de fusão contém assim neste espaçador entre outros ácidos aminados metionina e arginina que permitem uma cisão com halogeneto de cianogénio ou com tripsina.

A partir do plasmideo pKK400 (20) isola-se a inserção de cerca de 1090 pb por dupla digestão com SstI e Sphl e o ADN é ligado no plasmideo pIJ702 (12) aberto com as mesmas enzimas. Resulta o plasmideo pGFl (21). A mistura de ligação é utilizada para transformação de S. lividans TK 24 e o ADN plasmídico é isolado a partir dos transformantes resistentes à tioestreptona que apresentam actividade de tendamistat. Todos os clones positivos contêm a inserção SstI-Sphl de 1090 pb de dimensão de pGFl.

I!

1«

Α construção do plasmideo pGFl (21) está representada na Figura 4.

A actividade de tendamistat foi determinada por meio I de ensaio de placa descrito em EP-A1 0 161 629 no Exemplo 3 bem I como na publicação de pedido de Patente Alemã 3 536 182, Exem- | pio 2. j j

A expressão da proteína de fusão codificada pelo plasmídeo pGFl pode ser levada a efeito de acordo com técnicas conhecidas. Por incubação da estirpe de S. lividans TK 24 transformada durante 4 dias a 289C em balões agitados num agitador orbital

I e por separação dp micélio do caldo fermentado por meio de cen- j trifugação obtém-se a proteína de fusão na solução límpida, podendo a sua presença ser detectada como se segue:

Tratam-se 10 a 100 pl da solução com 20 a 200 jil de ácido tricloroacético a 15%, concentram-se as proteínas precipitadas por centrifugação, lavam-se e retomam-se em tampão de amostra contendo SD3 (U. Laemmli, Nature 227 (1970) 680-685). Após 2 minutos de incubação a 902C procede-se à separação dos componentes por electroforese num gel de SDS-poliacrilamida a 10 a 17%. Obtém-se uma proteína de peso molecular de 19 kd, portanto na gama de peso molecular esperada para a proteína de fusão do tendamistat com a proinsulina. A proteína de fusão reage tanto com anticorpos contra tendamistat como também com anticorpos contra insulina.

Claims

REIVINDICAÇÕES ia Processo para a preparação de proteínas de fusão caracterizado por se acoplar o gene estrutural para a proteína C-terminal pretendida ao gene de tendamistat eventualmente modificado, provocar a expressão desta estrutura genética em células hospedeiras de um estreptomicete e isolarem-se a partir do sobrenadante as proteínas de fusão segregadas.

- 2â Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a extremidade C-terminal do gene de tendamistat se encontrar encurtada.

- 3â -

Processo para a preparação da estrutura genética utilizada na reivindicação 1, caracterizado por se acoplar em posição C-terminal ao gene de tendamistat eventualmente modificado um gene estrutural para uma outra proteína.

- 4a -

Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a extremidade C-terminal do gene de tendamistat se encontrar encurtada.

- 5a Processo para a preparação de uma proteína a partir de ácidos aminados codificáveis geneticamente caracterizado por se eliminar a fracção de tendamistat a partir de uma proteína de fusão obtida de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2.

A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado na República Federal Alemã em 5 de Maio de 1987 sob o nQ. P 37 14 866.4.

Lisboa, 4 de Maio de 1988 , . ....... ” .íi’·

RESUMO <1

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE PROTEÍNAS ESTRANHAS EM ESTREPTO- I

MICETES E DE ESTRUTURAS GENÉTICAS ÚTEIS PARA ESSA PREPARAÇÃO

A invenção refere-se a um processo para a preparação de proteínas de fusão que compreende acoplar-se o gene estrutural para a proteína C-terminal pretendida ao gene de tendamistat eventualmente modificado, provocar a expressão desta estrutura genética em células hospedeiras de um estreptomicete e isolarem-se a partir do sobrenadante as proteínas de fusão segregadas .